KR101331787B1

KR101331787B1 - 심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법

Info

Publication number: KR101331787B1
Application number: KR1020110100761A
Authority: KR
Inventors: 송은주; 타누자 다스; 유영숙
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-10-04
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2013-11-21
Also published as: KR20130036588A

Abstract

본 발명은 심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 포함하는 진단 키트 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법에 따르면, 생물학적 시료로부터 심장 부정맥을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있고, 심장 부정맥의 발병 기작을 규명하는 도구로 사용될 수 있다.

Description

심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법{Biomarkers for diagnosing cardiac arrhythmia and method for diagnosis using the same}

본 발명은 심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법에 관한 것이다.

심장 질환은 세계적으로 주요 사망 원인으로 여겨지고 있으며, 급성 심장 마비 환자의 약 50%는 부정맥이 주요 원인이 되어 사망한 것으로 알려져 있다.

심장의 수축은 심장의 흥분-수축 연결(cardiac excitation-contraction coupling)에 의하여 조절되고 있다. 이때 Ca² ⁺은 중요한 2차 메신져(second messenger)로 작용하여 심장의 수축을 일으키는 미오필라멘트(myofilament)의 직접적인 활성인자(activator)로서 작용하게 되며, Ca² ⁺조절에 이상이 생길 경우 심근 수축의 이상과 부정맥을 일으키게 된다. 심장의 활동 전위(action potential) 동안 Ca²⁺은 탈분극-활성화된(depolarization-activated) Ca² ⁺ 채널에 의해 Ca² ⁺이 세포 내로 들어가게 된다. 이것은 다시 근세포의 칼슘 저장고인 근소포체(sarcoplasmic reticulum, SR)으로부터의 Ca² ⁺의 방출을 유도하게 된다. SR에 주로 저장되어 있는 칼슘은 Na⁺/Ca² ⁺ 교환 전류(exchange current)가 활성화 되면 리아노딘 수용체(ryanodine receptor, RyR2)를 통해 SR에서 세포질로 나오게 된다. 세포질로 나온 Ca은 미오필라멘트 단백질인 트로포닌 C(troponin C)에 결합하여 근수축을 일으키게 된다. 그리고, 이때 방출되었던 칼슘이 SR Ca² ⁺-ATPase, sarcolemmal Na⁺/Ca²⁺ 교환 등에 의하여 세포질에서의 농도가 줄어들면서, 트로포닌으로부터 분리되고, 근수축의 이완(relaxation)이 일어난다. 따라서, 비정상적인 SR에서의 Ca² ⁺ 방출은 심근 수축의 이상을 가져오게 된다.

카페인(caffeine)은 RyR2가 개방될 확률을 증가시켜 세포질 내의 칼슘을 증가시키게 되는데, 이때, 지속적인 카페인의 처리는 칼슘 항상성의 이상을 가져오게 되어 세포에 카페인을 지속적으로 처리시 부정맥과 유도할 수 있다.

이를 바탕으로, 본 발명자들은 프로테오믹스 기법을 이용하여 카페인에 의한 HL-1 심근 세포주에서 단백질 프로파일의 변화를 관찰 분석함으로써 카페인에 의해 과발현 또는 저발현되는 단백질을 발굴하여 부정맥을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용하여 부정맥의 진단 방법을 확립하였다.

일 구체예는 심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 포함하는 진단 키트 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법을 제공한다.

일 양상은 하기 군으로부터 선택되는 단백질을 하나 이상 포함하며, 정상 심근 세포와 비교하여 심장 부정맥이 발병된 세포에서 발현이 상대적으로 증가하는 것인 심장 부정맥 진단용 바이오마커를 제공한다:

서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 ATP synthase D chain, mitochondrial;

서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 proteasome beta 4 subunit;

서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 myosin light chain 2;

서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 peripherin;

서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 glutaredoxin 3;

서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 cytochrome b-c1 complex subunit 1; 및

서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 Nogo-A.

다른 양상은 하기 군으로부터 선택되는 단백질을 하나 이상 포함하며, 정상 심근 세포와 비교하여 심장 부정맥이 발병된 세포에서 발현이 상대적으로 감소하는 것인 심장 부정맥 진단용 바이오마커를 제공한다:

서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 aldose reductase-related protein 2;

서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 proteasome subunit MC14;

서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 26S protease regulatory subunit 8 isoform 1 ;

서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 glutamate oxaloacetate transaminase I;

서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 actin-binding LIM protein medium isoform;

서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 tubulin beta-5 chain;

서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 prostaglandin reductase 2;

서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 protein disulfide-isomerase A6 ;

서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 voltage dependent anion channel 2;

서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 heat shock protein cognate 71kDa protein;

서열 번호 18의 peroxiredosin 4;

서열 번호 19의 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K; 및

서열 번호 20의 Ezrin.

다른 양상은 서열번호 21의 Hsp25 단백질을 포함하며, 정상 심근 세포와 비교하여 심장 부정맥이 발병된 세포에서 발현이 상대적으로 증가 또는 감소하는 것인 심장 부정맥 진단용 바이오마커를 제공한다.

또 다른 양상은 상기 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 심장 부정맥 진단 키트를 제공한다.

상기 단백질의 단편은 예를 들어, 면역원성 단편일 수 있으며, 이는 싱기 바이오마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오마커 단백질의 단편을 의미한다. 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으나, 단일클론 항체를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.

상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 적당량(약 10㎍)을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다.

일 구체예에 따른 심장 부정맥 진단 키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 전형적으로 동결 건조 형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

한편, 일 구체예에 따른 단일클론 항체는 면역분석 키트(예를 들어, ELISA, 항체 coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor)에 다양하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통한 다양한 심장 부정맥 검출 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에도 이용될 수 있다.

다른 양상은 심장 부정맥이 의심되는 생물학적 시료로부터 상기 서열 번호 1 내지 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 하나 이상의 단백질의 발현이 정상 심근 세포에 비해 상대적으로 증가하거나, 또는 상기 서열 번호 8 내지 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 하나 이상의 단백질의 발현이 정상 심근 세포에 비해 상대적으로 감소하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 검출 결과로부터 상기 생물학적 시료의 심장 부정맥 여부를 판단하는 단계를 포함하는 심장 부정맥의 진단 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 예를 들어, 포유 동물의 심근 조직, 심근 세포, 심근 조직 또는 심근 세포로부터 추출된 프로테옴(proteome)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 서열 번호 1 내지 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 바이오마커 단백질은 모두 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 인간, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현되며, 호몰로지(homology)가 90% 이상임을 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)에서 확인할 수 있다. 따라서, 상기 바이오마커가 인간을 비롯한 다른 포유 동물의 심장 부정맥을 진단하는 용도로 사용될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

상기 진단 방법에서, 상기 검출 단계는 심장 부정맥이 의심되는 심근 세포 및 정상 심근 세포를 대상으로 2차원 전기영동을 수행하여, 상기 바이오마커 단백질의 발현 정도를 확인하거나, 상기 부정맥이 의심되는 심근 세포를 일 구체예에 따른 항체를 포함하는 키트와 접촉시켜 항원 항체 반응을 통해 바이오마커 단백질의 존재를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2차원 전기영동법을 이용하는 경우, 정상인의 심근 세포 및 부정맥 의심 환자의 심근 세포의 프로테옴을 추출한 다음, 2차원 전기영동법으로 프로테옴의 프로파일을 작성하고, 이로부터 상기 바이오마커 단백질의 발현이 증가하거나 감소하는 것이 확인되는 경우 부정맥으로 판단할 수 있다. 한편, 항원 항체 반응으로서 현재 널리 알려진 면역분석법은 예를 들어, 효소면역측정법(ELISA, Coated tube), 항체가 결합된 자성 입자를 이용한 방법, 항체가 결합된 라텍스 입자를 이용한 방법이 있다.

일 구체예에 따른 심장 부정맥 진단용 바이오마커 및 이를 포함하는 진단 키트 및 이를 이용한 심장 부정맥 진단 방법에 따르면, 생물학적 시료로부터 심장 부정맥을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있고, 심장 부정맥의 발병 기작을 규명하는 도구로 사용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 카페인을 처리하지 않은 경우(도 1a)와 처리한 경우(도 1b)의 세포 반응물을 2차원 전기영동를 이용하여 분리하고 서로 다르게 발현된 스팟을 표시한 것(도 1c)이다.
도 2는 질량 분석기를 이용하여 동정한 단백질들을 기능에 따라 분류한 것이다.
도 3은 차별 발현되는 것으로 동정된 Hsp25와 VDAC2 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블랏법을 이용하여 관찰한 것이다.
도 4는 Hsp25가 카페인의 신호에 따라 인산화되는 양상을 관찰한 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 심근 세포주에서의 카페인에 의한 심장 부정맥 유도

심근 세포주 HL-1(Claycomb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 2979-2984)은 Claycomb 배지(Sigma)에 10% FBS(Sigma), 0.1 mM의 노르에피네프린(Sigma), 100 units/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트랩토마이신(Gibco/BRL) 및 2 mM의 L-글루타민(Life Technologies)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂의 조건으로 매일 배지를 교체하며 배양하였다. 표면을 0.02%의 젤라틴/0.00125% 피브로넥틴(sigma)으로 코팅한 100 mm 페트리디쉬에 2 × 10⁶개의 세포를 배양하고, 하루 후에 4시간 동안 무혈청 DMEM 배지에서 세포 성장을 정지(starvation)시킨 후, 5 mM의 카페인(sigma)을 2차원 전기영동을 통한 단백질의 분리 실험에서는 30분 동안 처리하였고, 웨스턴 블롯팅을 위한 실험에서는 각각 5, 15, 30 또는 60분 동안 처리하여 부정맥을 유도하였다.

실시예 2: 2차원 전기영동을 통한 단백질 분리 및 부정맥에 의한 차별 발현 단백질의 확인

상기 실시예 1와 같이 카페인을 30분 동안 처리한 심근 세포주 HL-1을 차가운 PBS로 3회 씻어준 후, lysis buffer(7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 5% CHAPS, 50 mM DTT, 0.5% IPG buffer, protease inhibitor cocktail (Roche), 10 mM 소듐 오르쏘바나데이트(sodium orthovanadate))에 상기 세포를 첨가한 다음, 초음파 분쇄하였다. 이후, 1시간 동안 상온에서 흔들어주고, 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다.

IPG 스트립(pH 4-7, 13 cm, linear; GE Healthcare)을 밤새 rehydration buffer(8 M 우레아, 2% CHAPS, 0.5% IPG buffer(pH 4-7), 브로모페놀 블루)으로 재수화(rehydration)시켰다. 이후, Isoelectric focusing system(GE Healthcare)을 이용하여 100 V (3시간), 500 V (1시간), 1000 V (1시간), 2500 V (1시간), linear gradient로 8000 V (30분), 이후 100,000 Vh가 될 때까지 8000 V에서 분리하였다. Isoelectric focusing 후, IPG 스트립을 equilibration buffer(6M urea, 2% SDS, 50 mM Tris/HCl[pH8.8], 30% 글리세롤, 0.01% DTT, 0.02% 브로모페놀 블루)에 담근 다음, 25℃에서 15분 동안 흔들어 주었다. 평형화가 끝난 후 IPG 스트립을 10% 폴리아크릴아미드 젤(25 x 35 cm)에 올리고, 0.5%의 아가로즈 용액으로 실링(sealing)한 다음, SE 600 Ruby electrophoresis system(GE Healthcare)에 전기영동 완충액(24 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS)을 넣고, 30분 동안 10 mA, 이후, 브로모페놀 블루가 젤의 가장 아래 부분으로부터 0.5 cm에 해당하는 위치에 올 때까지 30 mA의 조건으로 전기영동을 실시하였다.

이후, 분리한 젤을 Silver staining kit(GE Healthcare)로 염색하였다. 실버 염색 과정은 다음과 같다. 50% 메탄올, 12% 아세트산, 0.05％　포름알데히드로 이루어진 용액에 2시간 이상 반응시켜 고정화(fixation)하고, 50% 에탄올로 20분 동안 3회 세척한 후, 0.2% 소듐 티오술페이트(sodium thiosulfate) 용액으로 1분 동안 반응시켜 민감화(sensitizing)시켰다. 이후, 증류수로 세척한 다음, 0.1% 실버 니트레이트(silver nitrate), 0.075% 포름알데히드(37%) 용액으로 20분 동안 반응시키고, 증류수로 다시 세척한 후, 미리 차갑게 만든 6% 소듐 카르보네이트, 0.075% 포름알데히드(37%) 용액으로 약 7분 동안 반응시켜 가시화(developing)한 다음, 50% 메탄올, 12% 아세트산 용액으로 lfate반응 메탄올시켰다. 이후, 실버 염색된 젤을 이미지 스캐너(GE Healthcare)로 스캔하였다. 엔도테린-1(endothelin-1)을 처리한 젤의 이미지를 I용액geMaster 2D Platinum (GE Healthcare)을 이용하여 분석하였으며, 대조군과 카페인을 처리한 젤을 비교하여 듐 3개씩의 젤로부터 일관되게 변화하는 스팟(spot)을 차별 발현된 단백질로 선정하였다.

상기 결과를 도 1에 나타내었으며, 서로 다르게 발현되는 스팟을 번호로 표시하였다.

실시예 3: 차별 발현된 단백질의 동정 및 분석

실시예 2에서 차별 발현된 것으로 선정한 스팟을 젤로부터 잘라낸 후, 30 mM 포타슘 페리시아니드(potassium ferricyanide)와 100 mM 소듐 티오술페이트를 1:1로 혼합한 용액으로 5분 동안 탈염색(destaining)시키고, 증류수로 5분 동안 4회씩 세척하였다. 세척한 젤 조각을 200 mM 암모늄 비카르보네이트(ammonium bicarbonate) 용액에 30분 동안 37 ℃에서 인큐베이션(incubation)한 다음, 아세토니트릴(acetonitrile)로 10분 동안 2회 탈수시켰다. 상기 탈수된 젤 조각을 25 mM 암모늄 비카르보네이트에 용해된 10 ng/ul의 트립신으로 재수화시키고, 이것을 밤새 37 ℃에서 인큐베이션하여 펩티드로 분해시켰다. 60% 아세토니크릴에 용해된 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)를 10분씩 3회 인큐베이션하여 절단된 펩티드들을 새로운 튜브로 회수하고, 마지막으로 아세토니트릴을 이용하여 젤 조각을 탈수시킨 후, 새로운 튜브에 회수하였다. 수집한 상등액을 진공 원심분리를 통해 건조시켰다.

상기 건조시킨 시료를 60% 아세토니트릴/0.1% TFA에 녹여 있는 α-시아노-4-히드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)의 매트릭스 용액(matrix solution)에 용해시킨 후, MALDI-TOF MS (Voyager-DE STR; Applied Biosystems., Inc.)를 이용하여 분석하고, University of California at San Francisco (http;//prospector.ucsf.edu)에서 만든 MS-Fit 프로그램을 이용하여 단백질을 동정하였다. 이를 아미노산 서열 분석을 통하여 단백질을 확실하게 동정하기 위하여, 같은 시료를 4700 Proteomics Analyzer with TOF/TOFTM optics (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 분석하였다. 이때 얻어진 전구체(precursor) 이온의 MS/MS 스펙트럼로 MASCOT (http://www.matrixscience.com/) 프로그램을 이용하여 단백질을 동정하였으며, 이때 NCBI non-redundant protein database를 사용하였다.

상기 방법으로 검색한 단백질을 하기 표 1에 나타내었으며, accession number, 단백질의 분자량, pI, 2D에서의 강도(intensity)의 변화를 함께 나타내었다.

서열번호	Protein Name	Accession No.	MW/pI	Intensity(+/-)
*Cellular metabolism*
1	ATP synthase D chain, mitochondrial	51980458	18750/5.5	+
2	Proteasome beta 4 subunit	45592932	29088/5.5	+
8	Aldose reductase-related protein 2	6679791	36121/6.0	-
8	Aldose reductase-related protein 2	6679791	36121/6.0	-
9	Psmb7 (proteasome subunit MC14)	29351589	29761/8.2	-
10	26S protease regulatory subunit 8 isoform 1	24497435	45626/7.1	-
11	Glutamate oxaloacetate transaminase 1	6754034	46232/6.7	-
*Cell* *organization*
3	Myosin light chain 2	114326499	19450/4.8	+
12	Actin-binding LIM protein medium isoform	21666433	78961/8.6	-
13	Tubulin beta-5 chain	7106439	49671/4.8	-
4	Peripherin	2253159	52687/5.4	+
*Ion* / *protein* *transport*
14	prostaglandin reductase 2	85719320	38016/5.3	-
5	Glutaredoxin 3	31981269	37779/5.4	+
6	cytochrome b-c1 complex subunit 1	46593021	52769/5.8	+
15	Protein disulfide-isomerase A6	58037267	42858/6.3	-
16	Voltage dependent anion channel 2 (VDAC2)	37514858	31703/7.4	-
*Signaling*
17	Heat shock protein cognate 71kDa protein	74142813	50465/6.2	-
21	Hspb1 protein (Hsp25)	17390597	23014/6.1	+
21	Hspb1 protein (Hsp25)	17390597	23014/6.1	-
18	Peroxiredoxin 4	18044557	31053/6.7	-
*Transcription*
19	Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K	15929044	50977/5.4	-
19	Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K	15929044	50977/5.4	-
*miscellaneous*
7	Nogo-A	30268593	63698/4.7	+
20	Ezrin	83921618	69407/5.8	-

실시예 4: 웨스턴 블롯팅법

상기 실시예 3에서 차별 발현된 단백질로 동정된 스팟의 silver staining 결과를 확인하기 위하여 Hsp25 항체(Chemicon International)와 VDAC2 항체(abCam) 를 이용하여 웨스턴 블롯팅법을 이용하여 확인하였다. 또한 카페인에 따른 Hsp25의 인산화 양상을 확인하기 위하여 세포에 5 mM 카페인을 5, 15, 30 또는 60분 동안 처리하고 phosphoHsp25 항체(millipore)와 Hsp25 항체(chemicon international)로 웨스턴블롯팅법을 수행하였다. 웨스턴블롯팅을 위하여 심근세포주 HL-1을 차가운 PBS로 3회 세척한 다음, lysis buffer(50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% NP-40, PIC, 및 1 mM 소듐 오르쏘바나데이트; pH 7.4)로 용해시키고, 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이후, 상등액은 Micro BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질 정량을 하였다. 동일한 양의 단백질을 PAGE에 의해 분리한 후, 니트로셀룰로즈 멤브레인(Pall Corporation)로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 5%의 탈지 분유를 포함하는 TBS-T (20 mM Tris-Cl, 137 mM NaCl, 및 1% Tween 20; pH 7.6)에서 1시간 동안 블로킹시킨 다음, 1차 항체(anti-pHsp25, anti-Hsp25, anti-VDAC2)와 함께 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 멤브레인을 세척하고, 1시간 동안 2차 항체(Goat Anti-mouse IgG-HRP 또는 Goat Anti-Rabbit IgG-HRP, Santacruz Biotechnology)와 함께 인큐베이션하였다.

차별 발현되는 것으로 동정된 Hsp25와 VDAC2 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블랏법을 이용하여 관찰한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 2차원 전기 영동 후, silver staining 결과에서 Hsp25는 인산화에 의해 이동한 스팟의 크기가 증가하였으며(표 1의 #18), 원래의 스팟은 그 크기가 감소함을 확인할 수 있었으며(표 1의 #19), 웨스턴 블롯팅의 결과 역시 상기 silver staining의 결과와 동일함을 확인할 수 있었다.

또한, Hsp25가 카페인의 신호에 따라 인산화 되는 양상을 관찰한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 카페인의 처리에 의해 인산화된 Hsp25의 단백질 양이 증가함을 확인할 수 있었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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인산화된 서열번호 21의 Hspb1 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 심장 부정맥 진단 키트.
제4항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것인 심장 부정맥 진단 키트.
삭제
삭제
제4항에 있어서,
서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 ATP synthase D chain, mitochondrial;
서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 proteasome beta 4 subunit;
서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 myosin light chain 2;
서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 peripherin;
서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 glutaredoxin 3;
서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 cytochrome b-c1 complex subunit 1;
서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 Nogo-A;
서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 aldose reductase-related protein 2;
서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 proteasome subunit MC14;
서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 26S protease regulatory subunit 8 isoform 1 ;
서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 glutamate oxaloacetate transaminase I;
서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 actin-binding LIM protein medium isoform;
서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 tubulin beta-5 chain;
서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 prostaglandin reductase 2;
서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 protein disulfide-isomerase A6 ;
서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 voltage dependent anion channel 2;
서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 heat shock protein cognate 71kDa protein;
서열 번호 18의 peroxiredosin 4;
서열 번호 19의 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K; 및
서열 번호 20의 Ezrin로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것인 키트.