JP5641486B2

JP5641486B2 - 抗癌性抗モータリンペプチド抗体

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Publication number: JP5641486B2
Application number: JP2011545235A
Authority: JP
Inventors: ワダワ　レヌー; レヌーワダワ; スニルカウル
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: JPWO2011071099A1; US8586042B2; EP2511371B1; EP2511371A4; WO2011071099A1; EP2511371A1; US20120302729A1

Description

本発明は、高い抗癌作用を示す抗モータリンペプチド抗体及び当該抗体産生ハイブリドーマに関する。

モータリン（モータリン２）は、ヒートショックタンパク質のＨｓｐファミリーに属し、熱非応答性タンパク質であるが、腫瘍サプレッサータンパクであるｐ５３に結合してその転写活性機能を不活性化する（非特許文献１）作用などが次第に見出され、発癌に本質的に関与していることが明らかとなってきた（特許文献１など）。最近では、モータリンをターゲットとしてその作用・機能を抑制する物質についての研究開発が活発化してきており、モータリンに結合するモータリン抗体に対しても抗癌剤としての期待が高い（非特許文献２−６）。
本発明者らは以前、モータリンの発現量の増加と発癌との関連と共に、癌細胞に内在化機能をもつ抗モータリン抗体を取得して、当該抗体が癌細胞の増殖抑制機能を有することを見出し、当該抗体を用いた癌治療用医薬組成物、薬剤キャリアなどに関する出願を行った(特許文献１)が、さらに、抗モータリン抗体が認識するモータリンのエピトープ配列を詳細に検討し、癌細胞に内在化機能をもつ抗モータリン抗体が共通に認識するエピトープ配列「LFGRAP」をはじめとする数種類の共通エピトープを決定した（特許文献２）。
癌細胞に内在化機能をもつ抗モータリン抗体に抗癌作用があることから、当該共通エピトープを含むペプチドを免疫原として抗モータリンモノクローナル抗体を作製することにより、それ以上に強力な抗癌作用を有する抗モータリンペプチド抗体が得られることが期待されていたが、未だ前記公知抗体を超える抗癌作用を有するペプチド抗体は提供されるに至っていないのが現状である。

国際公開ＷＯ２００６／０２２３４４Ａ１（特開２００５−２４２０６３号公報）特開２００９−１３６２７５号公報

Wadhwa, R., Takano, S., Robert, M., Yoshida,A., Reddel, R., Nomura, H., Mitsui, Y., and Kaul, S. C.(1998) J Biol Chem 273, 29586-29591 Walker, C., Bottger, S., and Low, B. (2006) Am J Pathol 168, 1526-1530 Wadhwa, R., Sugihara, T., Yoshida, A., Nomura, H., Reddel, R. R., Simpson, R., Maruta, H., and Kaul, S. C. (2000) Cancer Res 60, 6818-6821 Wadhwa, R., Ando, H., Kawasaki, H., Taira, K., and Kaul, S. C. (2003) EMBO Rep 4, 595-601 Deocaris, C. C., Widodo, N., Shrestha, B. G., Kaur, K., Ohtaka, M., Yamasaki, K., Kaul, S. C., and Wadhwa, R. (2007) Cancer Lett (inpress). Wadhwa, et al (2006) Up-regulation of mortalin/mthsp70/Grp75 contributes to human carcinogenesis. Int. J. Cancer. 118: 2973-2980.

本発明は、癌細胞に内在化機能をもつ抗モータリン抗体が共通に認識するエピトープ配列を含むペプチドを免疫原とするペプチド抗体であって、かつ癌細胞に内在化機能をもつ抗モータリン抗体以上に高い抗癌作用を有する抗モータリンペプチド抗体を提供することを目的とする。また、当該抗体を用いた腫瘍細胞増殖抑制作用を有する抗癌剤の提供も目的とする。

本発明者らは、癌細胞に内在化機能を有する抗モータリン抗体の共通認識部位としてのエピトープ「LFGRAP」（配列４０２−４０７、ヒトモータリンアミノ酸配列のＮ末端からの位置を表す。以下同様。）を含む１８アミノ酸ペプチドを設計し、それと共に、他の共通エピトープ「KAMQDAEVSKSDIGEVI」（配列３６８−３８４）にも注目して、当該配列を含む１８アミノ酸ペプチドを設計した。そして、両ペプチドを免疫原カクテルとして併用することとした。
当該免疫原カクテルを用いてマウスを免疫し、常法により多数のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製して、モータリン抗原に対する特異性及び細胞内への内在化試験によって８クローンを選択した。さらに、これら各クローンの産生抗体の癌細胞増殖抑制効果を検討した結果、Ｃ−２６及びＣ−６９クローンが産生するモノクローナル抗体のみが、癌細胞の増殖を顕著に抑制することを見出した。その抑制効果は、公知の内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体の作用を遙かに凌ぐものであった。
以上の知見を得て、本発明を完成した。
上記Ｃ−２６抗体及びＣ−６９抗体を産生するハイブリドーマは、それぞれ（独）産業技術総合研究所特許微生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−２１８７５、及びＦＥＲＭＰ−２１８７６として寄託した。

すなわち、本発明は、具体的には以下の通りである。
［１］配列番号４に示されるペプチド及び配列番号６に示されるペプチドの１：１免疫原カクテルを免疫原として得たハイブリドーマであって、ヒトモータリン抗原を特異的に認識し、かつ癌細胞内在化機能を有するモノクローナル抗体産生能を有するハイブリドーマ株Ｃ−２６株（ＦＥＲＭＰ−２１８７５）又はＣ−６９株（ＦＥＲＭＰ−２１８７６）。
［２］前記［１］に記載のハイブリドーマ株が産生するヒトモータリン抗原を特異的に認識し、かつ癌細胞内在化機能を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
［３］前記［２］に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを有効成分とする、腫瘍細胞増殖抑制作用を有する抗癌剤。
［４］前記［２］に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを用いることを特徴とする、腫瘍細胞検出用試薬。
［５］下記（１）又は（２）のペプチドであって、癌細胞内在化機能を有するヒトモータリン特異的モノクローナル抗体が認識するエピトープとして機能するペプチド；
（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、もしくはその配列中の少なくとも配列番号８に示される部分配列を含むアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、もしくはその配列中の少なくとも配列番号９に示される部分配列を含むアミノ酸配列からなるペプチド。
［６］下記（１）及び（２）のペプチドを組み合わせたことを特徴とする、癌細胞内在化機能を有するヒトモータリン特異的モノクローナル抗体作製用の免疫カクテルのためのエピトープセット；
（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、もしくはその配列中の少なくとも配列番号８に示される部分配列を含むアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、もしくはその配列中の少なくとも配列番号９に示される部分配列を含むアミノ酸配列からなるペプチド。

本発明により、きわめて優れた抗癌作用を有する抗モータリンペプチド抗体を提供することができた。当該ペプチド抗体の抗癌作用は、全長のモータリンを免疫原として得られた癌細胞の内在化機能を有するモノクローナル抗体のうちで最も高い抗癌作用を示した３７−６抗体と比較しても、癌細胞増殖抑制効果として数十倍も高いものである。また、当該抗体を有効成分とすることで、優れた癌細胞増殖抑制活性を有する抗癌剤を提供することができる。さらに、本願発明のモノクローナル抗体は癌細胞の内在化機能を保持しているため、標識することにより、癌細胞の検出剤として用いることもできる。

ペプチド抗体を作製するために用いた２種類の共通エピトープを含むペプチド。抗原に対する特異性の確認：ウェスタンブロッティングによるハイブリドーマのスクリーニング。図中、Ｒは組み換えタンパク抽出液中で、Ｕはヒト癌細胞（Ｕ２ＯＳ）溶解液中での結果を示す。また、反応性の程度を＋の数で示した。左下枠内は選択された８つのクローンを示す。抗原に対する特異性の確認：ヒト癌細胞の免疫染色によるスクリーニング。反応性の程度を＋の数で示した。左下枠内は選択された８つのクローンを示す。細胞内への取り込みの確認。ヒト癌細胞の培養液にハイブリドーマを加え、細胞内への取り込みを免疫染色でスクリーニング。細胞内取り込みの程度を＋の数で示した。左下枠内は選択された８つのクローンを示す。図２〜４をまとめて示す。Ｃ−２６クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−６７クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−６９クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−１３１クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−１３３クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−１３７クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−１５２クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。Ｃ−１７７クローンの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用。８つのハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体の抗癌作用比較。３６種類のペプチドのアミノ酸配列とＣ２６及びＣ６９抗体が認識するエピトープ。抗体のエピトープ解析。モータリンのアミノ酸配列３６８〜４１７位のペプチドについて１アミノ酸ずつずらした１５アミノ酸ペプチドのアレイ解析。縦軸はＥＬＩＺＡにおけるシグナル強度。Ｃ２６及びＣ６９抗体と他の抗原ペプチド抗体との抗癌活性比較。図中、Ｃ１３３は、免疫原は同一であるが３６８〜４１７残基中にエピトープを持たないモノクローナル抗体であり、３７−６はモータリン全長を免疫原とし「LFGRAP」部位を認識するモノクローナル抗体（特許文献１）である。

１．癌細胞への内在化機能を有する抗モータリンモノクローナル抗体に共通するエピトープの決定
本発明において、モータリン（モータリン２）というときは、通常ヒトモータリンを指すが、モータリンは保存性が高くマウスモータリン２（ｍｏｔ−２）とヒトモータリンとの相同性はアミノ酸レベル（ＢＬＡＳＴ法）は９７．９％である。エピトープ配列も同一であるので、マウスモータリンなど他の種由来であってもよい。（マウスモータリンのアセッション番号：NM_010481、ヒトモータリン：AK315177、配列番号１）
本発明者らは、すでに細胞内在化能を有するモータリン抗体が抗癌作用を有することを報告している（特許文献１など）。そして、当該細胞内在化能を有するモータリン抗体が共通に認識するエピトープ領域はヒトモータリンのアミノ酸配列のヒトモータリンの３８１〜４１０位に相当する領域中に存在することを見出し、この３８１〜４１０位を含む３４８〜４５０位に対してエピトープマッピング法を適用して、内在化抗体に特異的な結合配列の共通配列が「LFGRAP（配列番号２）」（共通エピトープ）であることを示した。そして、同時に他の内在化抗体特異的な結合配列を複数見出したが、そのうちの１つが「KAMQDAEVSKSDIGEVI（配列番号３）」である（特許文献２）。

２．ペプチド抗体の作製：免疫抗原カクテル法
「KAMQDAEVSKSDIGEVI（配列番号３）」、及び「LFGRAP（配列番号２）」を含む１７アミノ酸のうち抗原性スコア計算値が最も高かった「QDLFGRAPSKAVNPDEA（配列番号５）」のそれぞれの末端にキャリア蛋白に繋ぐためのシステイン（Ｃ）を付加したペプチド−１（配列番号４）及びペプチド−２（配列番号６）を、１：１の割合でキャリア蛋白と共にマウスを免疫し、常法によりモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。

３．ペプチド抗体の癌細胞増殖抑制活性確認によるハイブリドーマクローンの絞り込み
（１）ウェスタンブロッティングによるハイブリドーマのスクリーニング
（２）ヒト癌細胞の免疫染色によるスクリーニング
（３）ヒト癌細胞の培養液にハイブリドーマ培養上清液を加え、細胞内への取り込みを免疫染色でスクリーニング
これらのスクリーニングを併用して、ハイブリドーマクローンの評価を行い、モータリン抗原に対する特異性が高く、かつ癌細胞内への取り込み能が高いモノクローナル抗体を産生するクローンを、数種類に絞り込んだ。

４．ペプチド抗体の抗癌作用の測定法
ヒト線維肉腫細胞（１０^７）を皮下注射によりヌードマウスの脇腹で腫瘍芽を形成させ、各ペプチド抗体を注射して腫瘍重量変化をモニタリングすることで、腫瘍増殖の抑制活性を観察した。
本発明のペプチド抗体と比較するための抗癌活性を有する抗モータリンモノクローナル抗体（ＣＮＴＬ）は、マウスモータリンの全長によりマウスを免疫することで得られた、癌細胞に内在化する機能を有するモノクローナル抗体３７−６（ハイブリドーマ３７株：ＦＥＲＭ−ＢＰ１０４０８、特許文献１参照）である。
その結果、同じ免疫原、免疫方法を用いても各クローンにおいて抗体能力に大きな差異があり、クローンＣ−２６株及びＣ−６９株のみの産生するモノクローナル抗体が顕著な腫瘍細胞の増殖抑制活性を示した。

５．本発明の「抗モータリンペプチド抗体」について
上記４．で顕著な腫瘍細胞の増殖抑制活性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンＣ−２６株及びＣ−６９株を、それぞれＣ−２６株（ＦＥＲＭＰ−２１８７５）及びＣ−６９株（ＦＥＲＭＰ−２１８７６）として寄託した。
これらのモノクローナル抗体Ｃ−２６及びＣ−６９が、典型的な本発明の「抗モータリンペプチド抗体」であるといえるが、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又は当該抗原結合部位を保持したキメラ抗体、ヒト化抗体なども本発明の「抗モータリンペプチド抗体」に含まれる。具体的には、モノクローナル抗体Ｃ−２６又はＣ−６９をパパインなどにより酵素的に加水分解したＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントなどの抗原結合部位を有する抗体フラグメント、Ｈ鎖及びＬ鎖の１本ずつからなる組換え抗体、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域をリンカーで繋いだ組換え一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用いることができる。また、上記ハイブリドーマＣ−２６株又はＣ−６９株のｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて得られるｃＤＮＡを適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体、抗体フラグメントを産生させてもよい。また、上記ハイブリドーマＣ−２６株又はＣ−６９株由来の抗体可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡから、特許文献２などに記載された手法により、モノクローナル抗体Ｃ−２６又はＣ−６９の可変領域配列及びＣＤＲ配列が決定できるから、これらの配列を利用して、キメラ抗体及びヒト化抗体を作製することができる。
また、特許文献２に記載の手法に従えば、本発明のモノクローナル抗体Ｃ−２６又はＣ−６９が認識するモータリンのエピトープ配列をより詳細に確定することができる。

６．モノクローナル抗体Ｃ−２６又はＣ−６９が認識するモータリンのエピトープ配列の解析
腫瘍細胞に対する増殖抑制効果は、モノクローナル抗体Ｃ−２６及びＣ−６９は極めて高く、またモノクローナル抗体Ｃ−１３１とＣ−１７７は、全２者ほどには高くないものの、公知の単一のエピトープ「LFGRAP」を認識するモノクローナル抗体３７−６（特許文献１）と比較すれば、強力な活性を有している。
これら強力な活性を有するモノクローナル抗体が認識するエピトープ配列を解析するために、モータリンアミノ酸配列の３６８−４１７位に相当する下記のアミノ酸配列についてのペプチドアレイ解析を先の特許文献２の方法に従って行い、２箇所のエピトープ領域を確認できた。
「KAMQDAEVSKSDIGEVILVGGMTRMPKVQQTVQDLFGRAPSKAVNPDEAV」（配列番号７）
その結果から、強力な抗癌作用を有する抗モータリン抗体Ｃ−２６及びＣ−６９が認識するエピトープのアミノ酸配列は、「EVILVG（配列番号８）」と「DLFGR（配列番号９）」の２種類であり、中程度の抗癌作用を持つ抗モータリン抗体Ｃ−１３１及びＣ−１７７のエピトープのアミノ酸配列は、「EVILVGGMT（配列番号１０）」と「DLFGRAP（配列番号１１）」の２種類であることが決定できた（図１５，１６）。
用いた免疫原カクテルの配列が「KAMQDAEVSKSDIGEVI（C）」及び「（C）QDLFGRAPSKAVNPDEA」の配列であったことを鑑みると、いずれもエピトープの中心位置がずれており、特にＮ末側エピトープの「EVILVG」又は「EVILVGGMT」は大幅にシフトしている。この結果から見て「EVILVG」領域は、モータリンのアミノ酸１次配列を認識する「連続エピトープ（直線状エピトープ）」ではなく、モータリンの３次元構造的に構成されたエピトープ（「立体構造エピトープ」又は「不連続エピトープ」）に相当するものと考えられる。
そして、これら２箇所のエピトープ領域を認識するモノクローナル抗体は、いずれも先の出願で検討した単一のエピトープ「LFGRAP」を認識するモノクローナル抗体３７−６（特許文献１）と比較して、強力な活性を有している。
したがって、「EVILVGGMT（配列番号１０）」もしくはその配列中の「EVILVG（配列番号８）」を含むエピトープ領域と、「DLFGRAP（配列番号１１）」もしくはその配列中の「DLFGR（配列番号９）」を含むエピトープ領域は、単独でも高い免疫原性のエピトープであるが、この２箇所のエピトープ領域を組み合わせて免疫原カクテルとして用いることで、さらに強力な抗癌活性を有するモノクローナル抗体を作製できると考えられる。
例えば、配列番号１０及び配列番号１１の１：１の免疫原カクテルを上記２．に記載された「免疫抗原カクテル法」に従って作製してマウスを免疫し、癌細胞内在性機能を有するヒトモータリン特異的なペプチド抗体を産生するハイブリドーマを取得し、上記３．に従って、癌細胞増殖抑制活性確認によりハイブリドーマクローンを絞り込むことで、さらにモータリン抗原に対する特異性が高く、癌細胞内への取り込み能が高いモノクローナル抗体であり、かつ高い腫瘍細胞増殖抑制活性を有するモノクローナル抗体を得ることができる。

７．抗体医薬組成物
本発明の「抗モータリンペプチド抗体」は、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、癌に対する治療又は改善を目的として使用される。その際、周知の抗癌剤と併用してもよい。本発明のペプチド抗体により治療の対象となる癌は特に限定されず、腎臓癌、肺癌、大腸癌、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、胃癌、皮膚癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫など広範に用いることができる。
有効投与量は、例えば一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの投与量を選ぶことができ、その投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。
このような薬理学的に許容される担体、添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類、Ｔｗｅｅｎ８０等の界面活性剤などを挙げることができる。
本発明の抗癌剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
本発明の抗癌剤は、溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。

８．腫瘍細胞検出用試薬
本発明の「抗モータリンペプチド抗体」は腫瘍細胞の内在化機能も優れているから、本発明の「抗モータリンペプチド抗体」を、公知の蛍光試薬、酵素試薬、放射性同位元素などで標識するか、又は標識された２次抗体と併用することで、腫瘍細胞検出用の試薬として用いることもできる。

本発明を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。
なお、特に断りがない場合は、公知の方法、例えばMolecular Cloning 3rd edition Sambrook J ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001年、細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」（秀潤社、2001年）などに記載の遺伝子組換え又はタンパク質操作技術などに従って実施可能であり、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。また、本明細書で引用した文献中の記載は本明細書中の記載として組み入れる。

（実施例１）免疫カクテル法によるペプチド抗体の産生
（１−１）抗原ペプチドの調製
２種類の１８アミノ酸免疫原ペプチド「ペプチド−１」及び「ペプチド−２」を、化学合成により調製した。「ペプチド−１：KAMQDAEVSKSDIGEVIC」は、内在化モノクローナル抗体の共通エピトープ「KAMQDAEVSKSDIGEVI」を含み、Ｃ末端に「Ｃ（Ｃｙｓ）を付加し、「ペプチド−２：CQDLFGRAPSKAVNPDEA」は、同「LFGRAP」を含むモータリン由来アミノ酸配列のＮ末端に「Ｃ（Ｃｙｓ）を付加した配列である。（図１）
なお、ペプチド−１及びペプチド−２の選択にあたっては、あらかじめ抗体３７−６のエピトープとしてのペプチドシーケンスを実行し、疎水性をベースとした抗原性分析を行っている。ペプチド−１に対応する「KAMQDAEVSKSDIGEVI」の抗原性スコアは０．４８６でペプチド−２に対応する「QDLFGRAPSKAVNPDEA」の抗原性スコアは０．６５０という高い値を示した。この２つの抗原性ペプチドをキャリアタンパクー（Frend's adjuvant）につなぐため、「Ｃ（Ｃｙｓ）」を末端に付加したものである。この２種類のペプチドを抗原として用いる場合には、１：１の比率で用いる。

（１−２）免疫カクテルによるマウスへの免疫
（１−１）で調製した「ペプチド−１」及び「ペプチド−２」を、１：１の割合で混合しキャリア蛋白（Frend's adjuvant）と共に、マウスに０．２〜０．３ｍｌを注射して免疫し、常法によりハイブリドーマを得、１ウェルあたり１細胞になるように希釈培養して、ペプチド抗体産生ハイブリドーマの６５個のクローンを得た。

（実施例２）ペプチド抗体産生ハイブリドーマの絞り込み
（２−１）ウェスタンブロッティングによるハイブリドーマのスクリーニング
ヒト由来正常細胞（ＴＩＧ−１細胞）及び癌細胞（Ｈｅｌａ細胞）の細胞融解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ハイブリドーマ培養上清液を用いたウェスタンブロッティング法によりモータリンの検出を行った。
その結果を図２に示すが、図中、Ｒは組み換えタンパク抽出液中で、Ｕはヒト癌細胞（Ｕ２ＯＳ）溶解液中での結果を示す。また、反応性の程度を＋の数で示した。図２の左下枠内は選択された８つのクローンを示す。

（２−２）ヒト癌細胞の免疫染色によるスクリーニング
正常細胞と癌細胞はカバーガラス入りの１２穴細胞培養ティッシュを用いて培養を行った。健康な細胞は６０％の密集度に達したら、メタノールとアセトン（１：１）で固定した後、各クローン由来ハイブリドーマ培養上清液を用いて結合させ、２次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ）を用いて検出を行った。
その結果を図３として示す。反応性の程度を＋の数で表す。図３の左下枠内は選択された８つのクローンを示す。

（２−３）ヒト癌細胞内への取り込みの免疫染色によるスクリーニング
１２穴培養デッシュ内にカバーグラスを置き、その上にヒト癌細胞（ＨｅＬａ細胞）を蒔いた。２４時間後、６０％の密集度に達しティッシュ表面に上手く付着されたことを確認後、各クローン由来ハイブリドーマ培養上清液を添加した。２４時間後に細胞をメタノールとアセトン（１：１）で固定し、２次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ）を用いて染色を行い、細胞を蛍光顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で観察した。
ヒト癌細胞の培養液にハイブリドーマを加え、細胞内への取り込みを免疫染色でスクリーニングする。その結果を図４に示すが、その際、細胞内取り込みの程度を＋の数で示した。左下枠内は選択された８つのクローンを示す。

（実施例３）ペプチド抗体の抗癌作用の測定と比較
実施例２で得られた８種類のハイブリドーマクローンから８種類の抗ペプチドモノクローナル抗体（Ｃ−２６、Ｃ−６７、Ｃ−６９、Ｃ−１３１、Ｃ−１３３、Ｃ−１３７、Ｃ−１５２及びＣ−１７７抗体）を得た。それぞれの抗体の有効性を判定するために、各々３匹ずつのヌードマウスを準備した。ヒト線維肉腫細胞（１０^７）を各ヌードマウスの左と右の脇腹に皮下注射した。五日後腫瘍芽が見えたのを確認し、抗体注射を行った。二日置きに一回１００μｇの抗体を計１０回静脈注射した。６０日まで毎日腫瘍の進行をモニタリングした。具体的には、各個体の体重変化を測定し、体重増加分を腫瘍重量とした（Vernier caliperにより測定）。図５〜１２には、各抗体毎の腫瘍重量を各個体の平均値として示している。図１３は、これらを重ね合わせた図である。コントロール（ＣＮＴＬ）としては、ＰＢＳを用いている。
その結果、同じ免疫原、免疫方法を用いても各クローンにおいて抗体能力に大きな差異があり、クローンＣ−２６株及びＣ−６９株のみの産生するモノクローナル抗体が顕著な腫瘍細胞の増殖抑制活性を示し、有用な抗癌剤となり得ることが示された。

（実施例４）モノクローナル抗体Ｃ−２６及びＣ−６９が認識するエピトープの解析
腫瘍細胞に対する顕著な増殖抑制効果が確認できたモノクローナル抗体Ｃ−２６及びＣ−６９が認識するエピトープ配列を解析するために、モータリンアミノ酸配列の３６８−４１７位に相当する下記ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）についてのペプチドアレイ解析を先の特許文献２の方法に従って行った。
「KAMQDAEVSKSDIGEVILVGGMTRMPKVQQTVQDLFGRAPSKAVNPDEAV」
具体的には、上記アミノ酸配列のＮ末から１アミノ酸ずつずらした１５アミノ酸ペプチドを合成し、各ペプチド含有溶液からなるスポットをガラススライド上に配列されているアレイを作製した（図１５）。当該アレイを用い、モノクローナル抗体Ｃ−２６及びＣ−６９をそれぞれ反応させ、ＨＲＰ接合抗マウス抗体を二次抗体として用い、抗体ＥＬＩＳＡ試験によりシグナル強度を測定し、シグナル強度（Ｙ軸）を、対象抗体と反応したそれぞれのペプチド（Ｘ軸）でプロットした（図１６）。同時に、中程度の抗癌活性を有するモノクローナル抗体Ｃ１３１及びＣ−１７７と共に、この範囲にエピトープを有していないモノクローナル抗体Ｃ−１３３についてのシグナル強度もそれぞれ測定している。なお、ここでのコントロール（ｃｔｒｌ−ｍｏｕｓｅ）は、マウスＩｇＧであり、２次抗体のみを用いたことを示す。結果は、図１６に示される通り、２箇所のエピトープ領域の存在を示すものであり、図１５ではペプチドアミノ酸配列上の共通領域として図示できる。
すなわち、強力な抗癌作用を有する抗モータリン抗体Ｃ−２６及びＣ−６９が認識するエピトープのアミノ酸配列は、「EVILVG」と「DLFGR」の２種類であり、中程度の抗癌作用を持つ抗モータリン抗体Ｃ−１３１及びＣ−１７７のエピトープのアミノ酸配列は、「EVILVGGMT」と「DLFGRAP」の２種類である。「EVILVG」と「DLFGR」の領域が共通して認識され、その認識の強さにおいてＣ−２６及びＣ−６９抗体が最も強かったと解される。
用いた免疫原カクテルの配列が「KAMQDAEVSKSDIGEVI（C）」及び「（C）QDLFGRAPSKAVNPDEA」の配列であったことと比較すると、特にＮ末側エピトープの「EVILVG」又は「EVILVGGMT」は大幅にシフトしており、これらは、モータリンのアミノ酸１次配列を認識する「連続エピトープ（直線状エピトープ）」ではなく、モータリンの３次元構造的に構成されたエピトープ（「立体構造エピトープ」又は「不連続エピトープ」）に相当するものと考えられる。
これら２箇所のエピトープ領域を認識するモノクローナル抗体は、いずれも先の出願で検討した単一のエピトープ「LFGRAP」を認識するモノクローナル抗体３７−６（特許文献１）と比較して、強力な活性を有している。
したがって、「EVILVG」又は「EVILVGGMT」と、「DLFGR」又は「DLFGRAP」との２箇所のエピトープ領域を免疫原とすることで、さらに強力な活性を有するモノクローナル抗体を作製できると考えられる。

受託番号ＦＥＲＭＰ−２１８７５：Mouse hybridoma Ｃ２６株
（２００９年１１月２７日付（独）産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託）
受託番号ＦＥＲＭＰ−２１８７６：Mouse hybridoma Ｃ６９株
（２００９年１１月２７日付（独）産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託）

Claims

配列番号４に示されるペプチド及び配列番号６に示されるペプチドの１：１免疫原カクテルを免疫原として得たハイブリドーマであって、ヒトモータリン抗原を特異的に認識し、かつ癌細胞内在化機能を有するモノクローナル抗体産生能を有するハイブリドーマ株Ｃ−２６株（ＦＥＲＭＰ−２１８７５）又はＣ−６９株（ＦＥＲＭＰ−２１８７６）。
請求項１に記載のハイブリドーマ株が産生するヒトモータリン抗原を特異的に認識し、かつ癌細胞内在化機能を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメント。
請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを有効成分とする、腫瘍細胞増殖抑制作用を有する抗癌剤。
請求項２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含むフラグメントを用いることを特徴とする、腫瘍細胞検出用試薬。