JP5631622B2

JP5631622B2 - 微量物質検出装置

Info

Publication number: JP5631622B2
Application number: JP2010096388A
Authority: JP
Inventors: 洋水島; 彰利齋藤
Original assignee: 協立電機株式会社
Priority date: 2010-04-19
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2030-04-19
Also published as: JP2011226896A

Description

本発明は、例えば、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）等の微量物質を検出するための微量物質検出装置に係り、特に、微量物質の有無や量を電流測定により検出するように構成したものにおいて、電極の電位を「０」Ｖ、又は、略「０」Ｖとしながら、発生する電荷量を検出するように構成し、それによって、検出の精度を高めることができるように工夫したものに関する。

例えば、ＤＮＡ等の微量物質を検出する場合には、電圧測定によって検出すものが一般的であった。
又、電圧測定ではなく電流測定によって検出するものとして、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６等がある。

特開２００８−２３３０５０号公報特開２００７−１０８１６０号公報特開２００６−３２２２号公報特開２００５−６９８３６号公報特開２００８−１３４２５５号公報特開２００６−２７５７８８号公報

上記従来の構成によると次のような問題があった。
まず、ＤＮＡ等の微量物質を電圧測定によって検出する場合であるが、例えば、電極が汚染されている、或いは外部から注入する検体内に不純物が混じっていた場合には、仮に、被検出対象物質（例えば、ＤＮＡ等の微量物質）が存在していなくても、電極間に数１０ｍＶの電圧が発生してしまうことがある。このような電圧を「ケミカルノイズ電圧」と称している。このようなケミカルノイズ電圧が発生した場合には、それによって、本来検出しなければならない発電反応がかき消されてしまい、検体信号とノイズとの分離が困難となり、結局、検出精度が低下してしまうという問題があった。
又、電極間に数１０ｍＶであっても電圧が存在する場合には、酸化還元酵素と被酸化還元物質との反応が阻害されてしまい、その結果、十分な発電反応が抑制されてしまうという問題があった。
又、ＤＮＡ等の微量物質を電流の測定によって検出する装置の場合であるが、実際の電流計は内部抵抗を備えており、その内部抵抗にいわゆる「ドロップ電圧」が発生してしまい、その結果、電極間に電圧が発生してしまうことになる。そのような電圧が発生した場合には、発電反応が遅くなり迅速な検出が困難になるという問題があった。

本発明はこのような点に基づいてなされたものでその目的とするところは、ＤＮＡ等の微量物質を電流測定により検出する際の検出精度の向上を図ることができる微量物質検出装置を提供することにある。

上記目的を達成するべく本願発明による微量物質検出装置は、イオン交換膜又はイオン透過膜を介して区画された一対の室を備え酸化酵素又は還元酵素が結合された検体を収容するとともに被酸化物質又は被還元物質及び電子メディエータが添加されたバッファ液を収容する測定チャンバと、上記測定チャンバの一対の室内に設置された一対の電極と、を具備してなる微量物質検出装置において、上記一対の電極に接続され演算増幅器と抵抗を備えた測定回路が設置されていて、上記測定回路により上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺しながら上記酸化酵素又は還元酵素、被酸化物質又は被還元物質、電子メディエータの作用により発生する電流を計測し、それによって、上記検体としての微量物質を検出するようにしたことを特徴とするものである。
又、請求項２による微量物質検出装置は、請求項１記載の微量物質検出装置において、四端子測定法又は三端子測定法により上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺するようにしたことを特徴とするものである。
又、請求項３による微量物質検出装置は、請求項１又は請求項２記載の微量物質検出装置において、上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺して±１ｍＶ以内にするようにしたことを特徴とするものである。
又、請求項４による微量物質検出装置は、請求項１〜請求項３の何れかに記載の微量物質検出装置において、上記検体を超音波振動により振動させるようにしたことを特徴とするものである。
又、請求項５による微量物質検出装置は、請求項１〜請求項３の何れかに記載の微量物質検出装置において、上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺するような電位を付与するようにしたことを特徴とするものである。

以上述べたように本願発明の請求項１による微量物質検出装置は、イオン交換膜又はイオン透過膜を介して区画された一対の室を備え検体及びバッファ液を収容する測定チャンバと、上記測定チャンバの一対の室内に設置された一対の電極と、を具備してなる微量物質検出装置において、上記一対の電極間に発生する電圧を「０」Ｖ又は略「０」Ｖに能動制御しながら発生する電流を計測し、それによって、微量物質を検出するようにしたので、一対の電極間に発生する電圧に起因した検出精度の低下を防止することができる。
又、請求項２による微量物質検出装置は、請求項１記載の微量物質検出装置において、四端子測定法又は三端子測定法により上記一対の電極間に発生する電圧を「０」Ｖ又は略「０」Ｖに能動制御するようにしたので、上記効果をより確実なものとすることができる。
又、請求項３による微量物質検出装置は、請求項１又は請求項２記載の微量物質検出装置において、上記一対の電極間に発生する電圧を±１ｍＶ以内に能動制御するようにしたので、より簡単な制御で上記効果をえることができる。
又、請求項４による微量物質検出装置は、請求項１〜請求項３の何れかに記載の微量検出装置において、上記検体を超音波振動により振動させるようにしたので、電極に生ずるガスに起因した感度低下の影響をなくすことができる。
又、請求項５による微量物質検出装置は、請求項１〜請求項４の何れかに記載の微量物質検出装置において、逆電位を付与するようにしたので、これによっても、上記と同等の効果を得ることができる。

本発明の一実施の形態を示す図で、微量物質検出装置の全体の構成を示す系統図である。本発明の一実施の形態を示す図で、微量物質検出装置の制御装置の中の測定回路の構成を示す回路図である。本発明の一実施の形態を示す図で、図２に示す測定回路の電流増幅部の構成を詳細に示す回路図である。本発明の一実施の形態を示す図で、一端に磁気ビーズが結合され他端に酸化還元酵素が結合された状態のＤＮＡを模式的に示す図である。本発明の一実施の形態を示す図で、測定チャンバ内における反応の様子を示す図である。

以下、図１乃至図５を参照して本発明の一実施の形態を説明する。図１は本実施の形態による微量物質検出装置の構成を示す系統図であり、まず、チューブ１がある。このチューブ１の一端側（図１中左端）には検体注入部３が設けられていて、この検体注入部３には検体注入器５が設置されている。この検体注入器５によって検体６を注入するものである。この検体６中に被検出対象物質としてのＤＮＡが含まれているものである。又、上記検体注入部３近傍の上記チューブ１には、バッファ液注入部７が設置されていて、このバッファ液注入部７内にはバッファ液９が充填されている。上記バッファ液注入部７は分岐チューブ１１を介して上記チューブ１に接続されていて、この分岐チューブ１１には第１押当バルブ１３が取り付けられている。

上記バッファ液９であるが、例えば、リン酸二水素カリウムの水溶液とリン酸水素二カリウムの水溶液の混合物に、例えば、ジクロロインドフェノールという電子メディエータを添加した液体である。又、上記電子メディエータとは酸化還元酵素と電極との間の電子の移動を媒介するためのものである。

上記チューブ１には第１試薬注入部１５、第２試薬注入部１７が夫々分岐チューブ１９、２１を介して接続されている。上記第１試薬注入部１５内には第１試薬２３が充填されている。又、第２試薬注入部１７内には第２試薬２５が充填されている。上記第１試薬２３であるが、検体６中の被検出対象物質に特異的に接合する部位を備えていて、且つ、磁性体の粒（磁性ビーズ）を有するものである。又、上記第２試薬２５であるが、検体６中の被検出対象物質に特異的に接合する部位を備えていて、且つ、酸化若しくは還元酵素を有するものである。又、上記分岐チューブ１９には第２押当バルブ２７が取り付けられていると共に上記分岐チューブ２１にも第３押当バルブ２９が取り付けられている。

上記チューブ１には反応部３１が設けられていて、この反応部３１には温度制御用ヒータ３３が設置されている。又、反応部３１には超音波振動装置３５が設置されている。上記温度制御ヒータ３３によって反応に適した温度環境を実現するものである。又、上記超音波振動装置３５によって攪拌効果を高めるようにしているものである。又、上記反応部３１には第１磁力制御部３７が設置されている。この第１磁力制御部３７によって、磁気ビーズを付与された検体６内の被検出対象物質（ＤＮＡ）を吸着・保持するようにしている。又、上記温度制御用ヒータ３３の図１中左側のチューブ１には第４押当バルブ３９が取り付けられている。

上記チューブ１の他端には測定チャンバ４１が接続されている。この測定チャンバ４１にはイオン交換膜４３が設置されていて、このイオン交換膜４３によって一対の室４５、４７が区画・形成されている。これら室４５、４７には電極５１、５３が設置されている。又、測定チャンバ４１は反応部３１に設けられた超音波振動装置３５により、又は、別に設けられた超音波振動装置により加振される構成となっている。
尚、この実施の形態の場合にはイオン交換膜４３を使用しているが、イオン透過膜を使用するようにしてもよい。

上記測定チャンバ４１を挟むように分岐チューブ５３、５５が接続されていて、これら分岐チューブ５３、５５は集合されていて、そこにはポンプ５７が接続されている。又、上記分岐チューブ５３、チューブ１、分岐チューブ５５には第５押当バルブ５９、第６押当バルブ６１、第７押当バルブ６３が取り付けられている。又、上記測定チャンバ４１には第２磁力制御部６５が設置されている。

又、制御装置７１が設置されていて、この制御装置７１には測定回路７３が設けられている。既に説明した各種機器、第１押当バルブ１３、第２押当バルブ２７、第３押当バルブ２９、第４押当バルブ３９、第５押当バルブ５９、第６押当バルブ６１、第７押当バルブ６３、温度制御用ヒータ３３、超音波振動装置３５、第１磁力制御部３７、ポンプ５７、第２磁力制御部６５は、全てこの制御装置７１によって制御されるようになっている。又、電極５１、５３を介しての電流測定等は上記制御装置７１の測定回路７３によって制御されるように構成されている。

上記構成によると、まず、第１押当バルブ１３、第４押当バルブ３９、第５押当バルブ５９を開放し、ポンプ５７を駆動する。それによって、チューブ１内に負圧が発生し、バッファ液注入部７内のバッファ液９が吸引されてチューブ1内に充満することになる。その状態で、検体注入部３を介して検体注入器５より検体６が注入される。
次に、第２押当バルブ２７、第３押当バルブ２９、第４押当バルブ３９、第５押当バルブ５９を開放して、ポンプ５７による負圧によって、第１試薬注入部１５、第２試薬注入部１７より、第１試薬２３と第２試薬２５を若干量引き出す。それと同時に、第１押当バルブ１３を開放してバッファ液注入部７よりバッファ液９を引き出す。これによって、反応部３１に、検体６、バッファ液９、第１試薬１５、第２試薬２５を導いて混合させることになる。

次に、第４押当バルブ３９、第５押当バルブ５９を閉じて、検体６と第１試薬１５、第２試薬２５とを反応させる。その際、温度制御用ヒータ３３によって温度調整を行うと共に、超音波振動装置３５によって超音波振動を付与する。それによって、反応に適した温度環境が提供されると共に、攪拌・混合作用が働くことになる。上記検体体６と第１試薬１５、第２試薬２５との反応により、検体としてのＤＮＡの一端に磁気ビーズが結合されると共に他端に酸化還元酵素が結合されることになる。その様子を図４に示す。図４はＤＮＡ８１の一端に磁気ビーズ８３が結合されると共に他端に酸化還元酵素８５が結合されている様子を示す図である。

次に、第１磁力制御部３７を「オン」して、第１押当バルブ１３、第４押当バルブ３９、第５押当バルブ５９を開放し、且つ、温度制御用ヒータ３３によって温度調整を行うと共に、超音波振動装置３５によって超音波振動を付与しながら、バッファ液９を流し続ける。それによって、検体６は第１磁力制御部３７によって吸着・保持され、その他のものは洗い流されることになる。

次に、第１押当バルブ１３、第６押当バルブ６１、第７押当バルブ６３を開放し、ポンプ５７の負圧によって吸引することにより、上記第１磁力制御部３７によって吸着・保持されている反応後の検体６を測定チャンバ４１内に導く。そして、第６押当バルブ６１、第７押当バルブ６３を閉じて計測を行う。計測後は、第１押当バルブ１３と第７押当バルブ６３を開放して、ポンプ５７による負圧によって計測後の検体６等を吸引して洗い流す。それによって、ポンプ５７自身も洗浄されることになる。

ここで、上記測定チャンバ４１内における反応について、図５を参照して説明する。上記酸化還元酵素８５として酸化酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）を用いた場合の、上記測定チャンバ４１内での化学反応を具体的に説明する。上記測定チャンバ４１の上側（図５中上方）の室４５内には、上記ＤＮＡ８１に結合した酸化酵素９６が存在している。また、上記測定チャンバ４１内にはバッファ液に添加された被酸化物質９８と電子メディエータ１００も存在している。上記被酸化物質９８は、上記酸化酵素９６によって酸化され、電子１０２と陽イオン１０４を放出する。上記電子１０２は上記電子メディエータ１００に捕らえられ、その結果、上記電子メディエータ１００は「負」に荷電される。「負」に荷電された上記電子メディエータ１００は、相対的に「正」電位となる上記電極５１側に移動する。一方、上記陽イオン１０４は、イオン交換膜４３を通過して、室４７側に設置され、相対的に「負」電位となる上記電極５３側に移動し、電子１０２を受け取る。その結果、上記室４５と上記室４７との間には上記イオン交換膜４３を隔てて電位差が発生し、上記電極５１と上記電極５３の間に電流が流れる。この電流を測定することにより上記ＤＮＡ８１の検出・定量を行うものである。

又、上記した例に限らず、上記酸化還元酵素８５として上記酸化酵素９５の代わりに還元酵素を使用することも考えられる。この場合は、上記被酸化物質９８の代わりに被還元物質が使用され、上記電極５１から電子メディエータを介して電子が還元酵素へ移動して還元反応が起きる。このため電子を外部から受け取る上記電極５１が「正」極、電子を外部に放出する電極５３が「負」極となる。
尚、この被検出対象物質の測定は、上記電極５１、５３間の電圧を測定することでも行うことができる。

次に、図２を参照して、制御装置７１に設けられた測定回路７３の構成について説明する。まず、電流増幅部９１があり、この電流増幅部９１にはＡ／Ｄ変換器９３が接続されている。上記電流増幅器９１により増幅された信号は上記Ａ／Ｄ変換器９３によってアナログ／デジタル変換され、マイクロコンピュータ９５に入力される。又、上記マイクロコンピュータ９５にはＩ／Ｏ９７、メモリ９９が接続されている。又、上記Ｉ／Ｏ９７には入力手段１０１と投入センサ１０３が接続されている。

上記電流増幅部９１の構成を、図３を参照して、さらに詳しく説明する。上記電流増幅器９１は、演算増幅器１０５と抵抗１０７とから構成されている。上記抵抗１０７は、演算増幅器１０５と協働して発生電流を電圧に変換する機能を発揮する。又、＋側端子Ｓｐは、測定チャンバ４１内の一方の電極５１側に接続されており、又、−側端子Ｓｎは、測定チャンバ４１内の他方の電極５３側に接続されている。又、＋側端子Ｆｐと−側端子Ｆｎは、電流流し込み用の端子である。
尚、図中符号１０９は、図１に示す制御装置７１に組み込まれた表示部であり、測定結果を表示するためのものである。

上記構成によると、測定チャンバ４１において発生するノイズを含んだ電流成分に起因して、外部のインピーダンスが十分に高い場合、略１０〜３０ｍＶの直流電圧が生ずる。本実施の形態の場合には、まず、この電圧を＋側端子Ｓｐ及び−側端子Ｓｎを介して検出する。次に、この発生した電圧を相殺するように、演算増幅器１０５より抵抗１０７を介して＋側端子Ｆｐから−側端子Ｆｎに向かう方向に電流を流す。これによって、上記発生した電圧を相殺して測定精度の低下を防止するようにしたものである。
因みに、＋側端子Ｓｐ及び−側端子Ｓｎ間には微量（数ピコアンペア）の電流が流れるのみであり、よって、いわゆる「ドロップ電圧」が生じるようなこともない。

以上本実施の形態によると次のような効果を奏することができる。
まず、測定チャンバ４１において発生した直流電圧を相殺するように能動制御しているので、電流を高い精度で検出することができ、微量物質の検出精度を高めることができる。
又、相対的にパワーが弱いケミカルノイズは上記能動制御により直ぐに減衰するが、検体６内に被検出物質が存在する場合には、明らかな電流ピークをみることができ、高い精度の検出が可能になる。
又、酸化還元反応が迅速に進行することになるので、検出に要する時間が短縮されることになる。
又、本実施の形態の場合には、電圧を能動的に計測して電流を計測するようにしているので、いわゆる「ドロップ電圧」が発生することはなく、より高い検出精度を実現することができる。

尚、本発明は前記一実施の形態に限定されるものではない。
例えば、前記一実施の形態の場合には、「０」Ｖになるような能動制御の一例を挙げて説明したが、それに限定されるものではなく、略「０」Ｖになるような制御、例えば、±１ｍＶ以内に収まるような制御も考えられる。
又、逆電位を加えるように構成することも考えられる。
又、回路の構成は図２、図３に示した構成のものに限定されることはなく、様々な例が考えられる。
又、前記一実施の形態の場合には、三端子測定法により一対の電極間に発生する電圧を「０」Ｖ能動制御するようにした場合を例に挙げて説明したが、四端子測定法であっても良い。
又、前記一実施の形態の場合には、測定チャンバとして、反応が行われる室と反応が行われない室の両方を兼備したタイプのものを例に挙げて説明したが、それに限定されるものではない。例えば、反応が行われると共に電極を備えた室と、その室内にイオン交換膜又はイオン透過膜の特性を持ち樹脂や膜等によって直接又は間接に覆われていて、且つ、電極を備えたものを配置した構成の測定チャンバであってもよい。
尚、上記直接とは電極にイオン交換膜又はイオン透過膜の樹脂が直接塗布したようなものであり、間接とは上記電極とイオン交換膜又はイオン透過膜の樹脂との間に含水樹脂等が介在しているような構成を意味しているものである。
又、前記一実施の形態の場合には、バッファ液の中に電子メディエータを入れた場合を例に挙げて説明したが、例えば、第２試薬注入部の横に第３試薬注入部を設けそこに電子メディエータをいれておき、押当バルブを開放して注入するように構成してもよい。

本発明は、微量物質を検出するための微量物質検出装置に係り、特に、微量物質の有無や量を電流値を計測することにより検出するように構成したものにおいて、電極の電位を「０」Ｖ、又は、略「０」Ｖとしながら、発生する電荷量を検出するように構成し、それによって、検出の精度を高めることができるように工夫したものに関し、例えば、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の検出に好適である。

４１測定チャンバ
４３イオン交換膜
４５室
４７室
５１電極
５３電極
７１制御装置
７３制御回路
９１電流増幅部
１０５演算増幅器
１０７抵抗

Claims

イオン交換膜又はイオン透過膜を介して区画された一対の室を備え酸化酵素又は還元酵素が結合された検体を収容するとともに被酸化物質又は被還元物質及び電子メディエータが添加されたバッファ液を収容する測定チャンバと、上記測定チャンバの一対の室内に設置された一対の電極と、を具備してなる微量物質検出装置において、
上記一対の電極に接続され演算増幅器と抵抗を備えた測定回路が設置されていて、
上記測定回路により上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺しながら上記酸化酵素又は還元酵素、被酸化物質又は被還元物質、電子メディエータの作用により発生する電流を計測し、それによって、上記検体としての微量物質を検出するようにしたことを特徴とする微量物質検出装置。
請求項１記載の微量物質検出装置において、
四端子測定法又は三端子測定法により上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺するようにしたことを特徴とする微量物質検出装置。
請求項１又は請求項２記載の微量物質検出装置において、
上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺して±１ｍＶ以内にするようにしたことを特徴とする微量物質検出装置。
請求項１〜請求項３の何れかに記載の微量物質検出装置において、
上記検体を超音波振動により振動させるようにしたことを特徴とする微量物質検出装置。
請求項１〜請求項３の何れかに記載の微量物質検出装置において、
上記一対の電極間にノイズを含んだ電流成分に起因して発生する電圧を相殺するような電位を付与するようにしたことを特徴とする微量物質検出装置。