JP5616529B2

JP5616529B2 - ヒト抗菌ペプチド分泌促進用組成物

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Publication number: JP5616529B2
Application number: JP2013525796A
Authority: JP
Inventors: ビョウン−ドグパク; ジョン−フヮンベ; セ−キョージョン; ヒョウン−スブグヮク
Original assignee: ネオファームカンパニー，リミテッド
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2030-08-27
Also published as: WO2012026639A1; CN103221383B; BR112013004676A2; JP2013536221A; DK2617707T3; SG187666A1; MX2013002202A; EP2617707A4; ES2610205T3; EP2617707A1; BR112013004676B1; US20130190397A1; US8809390B2; MX342004B; PL2617707T3; CN103221383A; EP2617707B1

Description

本発明は、ヒト抗菌ペプチドの分泌を促進する化合物に関し、具体的には、ヒト抗菌ペプチドであるヒトβ−デフェンシン−２、−３及びＬＬ−３７の直接発現あるいは間接発現を誘導することができる新規化合物、その製造方法及びこれを有効成分として含有する組成物に関する。

抗菌ペプチド（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ）は、生体内で自然免疫（ｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙ）メカニズムを担当する天然抗菌物質であって、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌（ｆｕｎｇｉ）、ウィルス（ｖｉｒｕｓｅｓ）を含む各種微生物に対して抗菌力を有しており、局所的な感染抑制と全身免疫反応を誘導する特性を有する低分子ペプチド物質である。通常、抗菌ペプチドは、両親媒性の構造を有しており、抗菌作用メカニズムとして抗菌ペプチドのカチオン部位が微生物細胞膜が有しているアニオン性リン脂質に結合して微生物の細胞膜を破壊する原理によって抗菌活性を示す。

デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）は、抗菌ペプチドのうち最も多く研究されたものの一つであり、その構造的特性により、α−デフェンシンとβ−デフェンシンに大別する。β−デフェンシンは、皮膚、肺、内蔵、腎臓、生殖器などの粘膜上皮で発現するペプチド物質であって、従来、ヒトβ−デフェンシンとしては６種類、即ち、ヒトβ−デフェンシン−１（ｈＢＤ−１）、ヒトβ−デフェンシン−２（ｈＢＤ−２）、ヒトβ−デフェンシン−３（ｈＢＤ−３）、ヒトβ−デフェンシン−４（ｈＢＤ−４）、ヒトβ−デフェンシン−５（ｈＢＤ−５）及びヒトβ−デフェンシン−６（ｈＢＤ−６）の分離及び同定が行われている。特に、ｈＢＤ−１が表皮細胞で一定に発現する反面、ｈＢＤ−２は感染部位又は物理的な損傷が現われる部位で発現が増加し、全身免疫反応と炎症反応の調節に重要な機能を果たすと知られている。また、近年、ｈＢＤ−３が乾癬患者の皮膚病変部位で非常に高く発現すると報告されている。さらに、近年、β−デフェンシンは、局所感染防御だけでなく、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ）、Ｔリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）などの細胞を走化性移動（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｍｉｇｒａｔｉｏｎ）させることにより、後天免疫にも係っていると知られている。

カテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）は、広範囲な抗菌作用を示して様々な免疫調節作用の機能を果たす。ヒトカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）の分解生成物の一つであるＬＬ−３７は、α−ヘリックス構造を有しており、広範囲な抗菌活性と共に生体内の炎症調節の機能を有する。即ち、ＬＬ−３７は、バクテリア、真菌、及びウィルスなどに対する直接的な抗菌活性と共に、好中球（ｅｓｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、単核細胞、Ｔ細胞に対する走化性を示し、内皮細胞の増殖を誘導する。特に、皮膚に存在するＬＬ−３７は、外来抗原が浸透した時に迅速に防御することにより抗原抑制の機能を果たす（非特許文献１）。

抗菌ペプチドであるデフェンシンとＬＬ−３７は、皮膚の物理的な損傷、又は感染などが生じた場合、その分泌が促進されて抗菌作用と共に全身免疫反応を誘導する効果を有しており、特に、皮膚では、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の分化と増殖を誘導して傷を治癒する機能も果たしている（非特許文献２）。さらに、近年、アトピー皮膚炎患者の皮膚において抗菌ペプチドであるβ−デフェンシン−２、ＬＬ−３７などの発現が減少しており、ブドウ球菌に対する高い感受性の原因となるとの研究結果が報告されている（非特許文献３）。

従って、生体内における抗菌ペプチドは、外来感染源に対する一次防御及び治療において重要な機能を果たし、特に、皮膚における抗菌ペプチドの発現を誘導することは、皮膚の感染を一次的に抑制し、損傷した部位の回復を促進して外来感染源の浸入を遮断することにより、皮膚を保護し、皮膚健康を維持するために重要な機能を果たす。

従来、生体内抗菌ペプチドの分泌を促進する効果を有する物質が報告されている。特許文献１には、各種有機酸がヒトβ−デフェンシンの分泌を促進する作用をするということが開示されており、特許文献２には、アミノ酸であるイソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）がデフェンシン分泌を促進する作用をするということが開示されている。しかし、一部物質ではその効果が十分に現れず、抗菌ペプチドと炎症性サイトカインの分泌を同時に誘導するなどの限界があった。従って、抗菌ペプチド分泌促進活性においてより優秀で、かつ炎症性サイトカインの分泌を誘導しない化合物が要求されている。

本発明者らは、新しい抗菌ペプチド分泌促進物質を合成するために、長い間、多様な物質を合成してその活性を実験する過程を経た結果、ヒトβ−デフェンシンと、ＬＬ−３７の生体内分泌促進の効果に優れた新規化合物を合成し、本発明を完成した。

韓国特許公開第１０−２００６−００７６７７５号明細書国際特許公開第０１６８０８５号パンフレット

ＢｒａｆｆＭＨ，ＢａｒｄａｎＡ，ＮｉｚｅｔＶら、「Ｃｕｔａｎｅｏｕｓｄｅｆｅｎｓｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｂｙａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ、２００５年、第１２５巻、９頁ＮｉｙｏｎｓａｂａＦ，ＵｓｈｉｏＨ，ＮａｋａｎｏＮら、「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓｈｕｍａｎ β−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｎｄｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ」、ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ、２００７年、第１２７巻、５９４頁ＯｎｇＰＹら、「ＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＳｋｉｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓｉｎＡｔｏｐｉｃＤｅｒｍａｔｉｔｉｓ」、ＴｈｅＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年、第３４７巻、１１５１−１１６０頁

本発明の第一の目的は、ヒト抗菌ペプチドの生体内分泌を促進する新規化合物を提供することにある。

本発明の第二の目的は、前記のヒト抗菌ペプチドの生体内分泌を促進する新規化合物の製造方法を提供することにある。

本発明の第三の目的は、前記のヒト抗菌ペプチドの生体内分泌を促進する新規化合物を有効成分として含有する組成物を提供することにある。

前記の第一の目的を果たすために本発明は、ヒト抗菌ペプチドの生体内分泌を促進する下記の化学式（Ｉ）で表される新規化合物を提供する。

（前記化学式（Ｉ）中、Ｒ_１は炭素数１〜１７の直鎖型及び分岐型アルキル基、フェニル基又はベンジル基であり、Ｒ_２は水素、メチル基又はエチル基である。）

前記化学式（Ｉ）は、ヒト抗菌ペプチド、具体的には、β−デフェンシン及び／又はＬＬ−３７の分泌を促進する効果を有する。本発明において、より好ましい化合物は、前記化合物の化学式（Ｉ）中、Ｒ_１は炭素数５の直鎖アルキル基であり、Ｒ_２はメチル基である化合物であり、下記の化学式（Ｉａ）で表される。

前記の第二の目的を果たすために本発明は、（Ａ）化学式（ＩＩ）の化合物又はその塩酸塩を有機塩基の存在下で有機溶媒に溶解する段階と、（Ｂ）反応温度０℃〜５℃にて化学式（ＩＩＩ）の化合物を添加して撹拌する段階と、を含む前記生体内抗菌ペプチド分泌促進用新規化合物の製造方法を提供する。

化学式（ＩＩ）の化合物

［化学式（ＩＩ）中、Ｒ_２は水素、メチル基又はエチル基である。］

化学式（ＩＩＩ）の化合物

［前記化学式（ＩＩＩ）中、Ｒ_１は炭素数１〜１７の直鎖型及び分岐型アルキル基、フェニル基又はベンジル基である。］

前記の第三の目的を果たすために本発明は、前記化学式（Ｉ）の新規化合物を活性成分として含有する生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物を提供する。

本発明において、前記組成物は活性成分として前記化学式（Ｉ）又は（Ｉａ）の化合物を０．００１〜９０重量％、より好ましくは、０．００１〜５０重量％含有することができる。

また、前記組成物は局所投与剤であって、皮膚や呼吸器、口腔、鼻腔などの粘膜を含む生体に適用可能であれば、その剤形は特に制限されず、液状、乳液状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、ゲル状、ゼリー状、スプレー状に製造することができる。

また、前記組成物は全身投与剤であって、生体に適用可能であればその剤形は特に制限されず、注射剤または経口投与剤などに製造することができる。

ヒト抗菌ペプチドであるデフェンシンとＬＬ−３７が迅速な抗菌作用を有し、皮膚を含む多様な体内組織と内臓から分泌することにより、デフェンシンとＬＬ−３７の分泌を促進する本発明による新規化合物及びこれを含む組成物は、外用又は内用に投与して、従来の抗菌剤が有する限定した投与経路の問題、耐性菌発生の問題、及び安全性の問題などを解消し、様々な部位において効果的な抗菌作用を発揮することができる。

本発明のヒトデフェンシンとＬＬ−３７の生体内分泌促進物質は、それが適用した部位でβ−デフェンシン−２とＬＬ−３７の生体内分泌促進を誘導して生体内の抗菌作用と免疫作用を増強し、生体の防御機能を強化する。従って、本発明の抗菌ペプチド分泌促進物質は、外来抗原である細菌、真菌、ウィルスのような感染が原因で発生する症状の予防及び治療に効果的である。特に、抗菌ペプチドの減少が現われるアトピー皮膚炎の病変部位で抗菌ペプチドの増加を誘導することにより、皮膚感染を効果的に抑制する利点が得られる。

本発明の合成物質が細胞内でヒト抗菌ペプチドであるｈＢＤ−２とＬＬ−３７を発現させる程度を示すグラフである。本発明の合成物質を塗布したマウスにおける皮膚バリア回復能を示すグラフである。本発明の合成物質のアトピー皮膚炎動物モデルにおける抗炎症効果を示すグラフである。本発明の合成物質をアトピー動物モデルに塗布した時に皮膚の角質層でヒト抗菌ペプチドＬＬ−３７の構造と類似したマウス抗菌ペプチドであるＣＲＡＭＰを発現させる程度を示す写真である。本発明の合成物質をアトピー動物モデルに塗布した時の表皮における細胞増殖の程度を示す写真である。本発明の合成物質をアトピー動物モデルに塗布した時の肥満細胞を示すグラフである。本発明合成物質の細胞毒性を示したグラフである。

以下、本発明による生体内抗菌ペプチド分泌促進用新規化合物について詳細に説明する。

本発明の生体内抗菌ペプチド分泌促進用新規化合物は、下記の化学式（Ｉ）の構造を有する。

本発明において、より好ましい化合物は、前記の化合物の式中、Ｒ_１は炭素数５の直鎖アルキル基であり、Ｒ_２はメチル基である化合物であり、下記の化学式（Ｉａ）で表される。

前記化合物（Ｉ）は、次のような方法により製造される。

化学式（ＩＩ）の化合物又はその塩酸塩を有機塩基の存在下で有機溶媒に溶解する段階と、反応温度０℃〜５℃にて化学式（ＩＩＩ）の化合物を添加して撹拌する段階と、前記反応物を抽出、乾燥、濾過する段階と、を経て化学式（Ｉ）の化合物を製造することができる。

化学式（ＩＩ）の化合物

化学式（ＩＩＩ）の化合物

前記反応において、有機塩基は、好ましくは、トリエチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン及びジメチルアミンからなる群から選択され、より好ましくは、トリエチルアミンである。また、前記反応時に用いられる有機溶媒は、好ましくは、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、クロロホルム、アセトニトリル及びアセトンからなる群から選択され、より好ましくは、ジクロロメタンである。前記反応において、（Ｂ）段階は、好ましくは、０℃にて３〜４時間撹拌することにより行われる。

前記化学式（Ｉ）の化合物の代表的な化合物として化学式（Ｉａ）の化合物は、下記反応式のように製造することができる。

（Ｌ）−チロシンメチルエステル（ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）塩酸塩（ＨＣｌｓａｌｔ）にジクロロメタン（ＤＣＭ）を投入し、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；ＴＥＡ）を投入して塩酸塩を溶解する。氷浴（ｉｃｅｂａｔｈ）を用いて反応器の温度を０℃に降温し、ヘキサノイルクロリド（ｈｅｘａｎｏｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）を徐々に添加して３〜４時間撹拌する。反応物に水を投入し、エチルアセテート（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）で抽出する。硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ）で乾燥して、濾過する。回転蒸発法（ｒｏｔａｒｙｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により濾過液から溶媒を除去し、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）とエチルアセテート（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）で凝固（ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）すると、白色の固体［化学式（Ｉａ）の化合物］が得られる。

このように合成した前記化学式（Ｉａ）の化合物を用いてβ−デフェンシン及びカテリシジンの分泌促進を確認する試験を行った結果、本発明の化合物は、培養したヒト細胞でヒトβ−デフェンシン−２及びＬＬ−３７の分泌を促進することを確認することができた。

なお、前記化学式（Ｉａ）の化合物を用いてアトピー皮膚炎動物モデルに適用した結果、皮膚内抗菌ペプチドの発現増加と共に、優れた抗炎の効果と皮膚バリア機能改善の効果を確認することができた。また、急性皮膚バリア損傷動物モデルを用いて実験を行った結果、皮膚バリア回復を著しく促進する効果があることを確認した。

以下、下記の実施例と試験例を参照して本発明を詳細に説明するが、本発明はこの例に限定されるものではない。

実施例１
（Ｓ）−メチル２−（ヘキサンアミド）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエイト（（Ｓ）−Ｍｅｔｈｙｌ２−（ｈｅｘａｎａｍｉｄｏ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）の製造
（Ｌ）−チロシンメチルエステル塩酸塩（２３．１６ｇ、０．１ｍｏｌ）にジクロロメタン（ＤＣＭ）２００ｍｌを投入し、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）２８ｍｌ（０．２ｍｏｌ）を投入し塩酸塩を溶解する。氷浴（ｉｃｅｂａｔｈ）を用いて反応器の温度を０℃に降温し、ヘキサノイルクロリド（１３．８ｍｌ、０．１ｍｏｌ）を徐々に添加して３〜４時間撹拌する。反応物に水（２００ｍｌ）を投入し、エチルアセテート（４００ｍｌ）で抽出する。硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ）で乾燥して、濾過する。濾過液を回転蒸発（ｒｏｔａｒｙｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させて溶媒を除去し、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）とエチルアセテート（ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ）で凝固（ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）すると、白色の固体（２７．１Ｇ、９２．５％の収率（ｙｉｅｌｄ））が得られる（以下、これをＣｏｍｐｏｕｎｄ１ａとする）。

ｍｐ：９６℃
ＮＭＲ（４００ＭＨｚＣＤＣｌ_３）^１Ｈ：０．８７３（３Ｈ，ｔ，ＣＨ _３ＣＨ_２），１．２６１（４Ｈ，ｍ，ＣＨ_３ＣＨ _２ＣＨ _２），１．５８４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯ），２．１７５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯ），２．９５５〜３．１１８（２Ｈ，ｄｄ，ｄｄ，ＣＨＣＨ _２Ｐｈ），３．７４２（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３），４．８８３（１Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ），５．９２２（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），６．７２０（２Ｈ，ｄ，ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ），６．９３３（２Ｈ，ｄ，ＣＨ（ＣＨ_２）ＣＣＨ）

実施例２
（Ｓ）−メチル３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（オクタンアミド）プロパノエイト（（Ｓ）−Ｍｅｔｈｙｌ３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（ｏｃｔａｎａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）の製造
（Ｌ）−チロシンメチルエステル塩酸塩（２３．１６ｇ、０．１ｍｏｌ）にジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）２００ｍｌを投入し、トリエチルアミン（２８ｍｌ、０．２ｍｏｌ）を投入して塩酸塩を溶解する。氷浴を用いて反応器の温度を０℃に降温し、オクタノイルクロリド（ｏｃｔａｎｏｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）１６．６ｍｌ（０．１ｍｏｌ）を徐々に添加して３〜４時間撹拌する。反応物に水（２００ｍｌ）を投入し、エチルアセテート（４００ｍｌ）で抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過する。濾過液を回転蒸発（ｒｏｔａｒｙｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）させて溶媒を除去し、ヘキサンとエチルアセテートでカラムクロマトグラフィー（ｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、Ｈｅｘ：ＥＡ＝２：１）により分離すると、白色の固体（３０．１ｇ、９３．３％の収率（ｙｉｅｌｄ））が得られる。

ｍｐ：７６℃
ＮＭＲ（４００ＭＨｚＣＤＣｌ_３）^１Ｈ：０．８８１（３Ｈ，ｔ，ＣＨ _３ＣＨ_２），１．２６２（８Ｈ，ｍ，ＣＨ_３ＣＨ _２ＣＨ _２ＣＨ _２ＣＨ _２），１．５８１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯ），２．１７７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯ），２．９６０〜３．１１１（２Ｈ，ｄｄ，ｄｄ，ＣＨＣＨ _２Ｐｈ），３．７４０（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３），４．８８８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ），５．９２６（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），６．７２５（２Ｈ，ｄ，ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ），６．９３１（２Ｈ，ｄ，ＣＨ（ＣＨ_２）ＣＣＨ）

実施例３
（Ｓ）−メチル２−（ドデカンアミド）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノエイト（（Ｓ）−Ｍｅｔｈｙｌ２−（ｄｏｄｅｃａｎａｍｉｄｏ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）の製造
（Ｌ）−チロシンメチルエステル塩酸塩（２３．１６ｇ、０．１ｍｏｌ）にジクロロメタン（ＤＣＭ）３００ｍｌを投入し、トリエチルアミン（２８ｍｌ、０．２ｍｏｌ）を投入し塩酸塩を溶解する。氷浴を用いて反応器の温度を０℃に降温し、ドデカノイルクロリド（ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）２１．８８ｇ（０．１ｍｏｌ）を徐々に添加して３〜４時間撹拌する。反応物に水（２００ｍｌ）を投入し、エチルアセテート（５００ｍｌ）で抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過する。濾過液を回転蒸発させて溶媒を除去し、ヘキサンとエチルアセテートでカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥＡ＝２：１）により分離すると、白色の固体（３４．２ｇ、９０．５％の収率（ｙｉｅｌｄ））が得られる。

ｍｐ：８９℃
ＮＭＲ（４００ＭＨｚＣＤＣｌ_３）^１Ｈ：０．８８１（３Ｈ，ｔ，ＣＨ _３ＣＨ_２），１．２６２（１６Ｈ，ｍ，ＣＨ_３（ＣＨ _２） _８），１．５８１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯ），２．１７７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯ），２．９６０〜３．１１１（２Ｈ，ｄｄ，ｄｄ，ＣＨＣＨ _２Ｐｈ），３．７４０（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３），４．８８８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ），５．９２６（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），６．７２５（２Ｈ，ｄ，ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ），６．９３１（２Ｈ，ｄ，ＣＨ（ＣＨ_２）ＣＣＨ）

実施例４
（Ｓ）−メチル３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（パルミトアミド）プロパノエイト（（Ｓ）−Ｍｅｔｈｙｌ３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（ｐａｌｍｉｔａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ）の製造
（Ｌ）−チロシンメチルエステル塩酸塩（２３．１６ｇ、０．１ｍｏｌ）にジクロロメタン３００ｍｌを投入し、トリエチルアミン（２８ｍｌ、０．２ｍｏｌ）を投入して塩酸塩を溶解する。氷浴を用いて反応器の温度を０℃に降温し、パルミトイルクロリド（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）２７．４９ｇ（０．１ｍｏｌ）を徐々に添加して３〜４時間撹拌する。反応物に水（２００ｍｌ）を投入し、エチルアセテート（５００ｍｌ）で抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過する。濾過液を回転蒸発させて溶媒を除去し、ヘキサンとエチルアセテートで凝固すると、白色の固体（３９．４ｇ、９０．８％の収率（ｙｉｅｌｄ））が得られる。

ｍｐ：１００℃
ＮＭＲ（４００ＭＨｚＣＤＣｌ_３）^１Ｈ：０．８８１（３Ｈ，ｔ，ＣＨ _３ＣＨ_２），１．２６２（２４Ｈ，ｍ，ＣＨ_３（ＣＨ _２） _１２），１．５８１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＨ_２ＣＯ），２．１７７（２Ｈ，ｔ，ＣＨ_２ＣＨ _２ＣＯ），２．９６０〜３．１１１（２Ｈ，ｄｄ，ｄｄ，ＣＨＣＨ _２Ｐｈ），３．７４０（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３），４．８８８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ），５．９２６（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），６．７２５（２Ｈ，ｄ，ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ），６．９３１（２Ｈ，ｄ，ＣＨ（ＣＨ_２）ＣＣＨ）

実施例５
（Ｓ）−メチル３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−（フェニルアセトアミド）プロパノエイト（（Ｓ）−Ｍｅｔｈｙｌ３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅの製造
（Ｌ）−チロシンメチルエステル塩酸塩（２３．１６ｇ、０．１ｍｏｌ）にジクロロメタン２００ｍｌを投入し、トラエチルアミン（２８ｍｌ、０．２ｍｏｌ）を投入して塩酸塩を溶解する。氷浴を用いて反応器の温度を０℃に降温し、フェニルアセチルクロリド（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）１５．４６ｇ（０．１ｍｏｌ）を徐々に添加して３〜４時間撹拌する。反応物に水（２００ｍｌ）を投入し、エチルアセテート（４００ｍｌ）で抽出する。硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過する。濾過液を回転蒸発させて溶媒を除去し、ヘキサンとエチルアセテートで凝固（ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）すると、白色の固体（２７．７ｇ、８８．１％の収率（ｙｉｅｌｄ））が得られる。

ｍｐ：１０１℃
ＮＭＲ（４００ＭＨｚＣＤＣｌ_３）^１Ｈ：２．８５２〜３．０３２（２Ｈ，ｄｄ，ｄｄ，ＣＨＣＨ _２Ｐｈ），３．５５４（２Ｈ，ｓ，ＰｈＣＨ _２ＣＯ）３．７０９（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _３），４．８３７（１Ｈ，ｍ，ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ）ＣＯ），５．９１７（１Ｈ，ｄ，ＮＨ），６．６２８（２Ｈ，ｄ，ＣＨＣ（ＯＨ）ＣＨ），６．７２４（２Ｈ，ｄ，ＣＨ（ＣＨ_２）ＣＣＨ），７．１５５〜７．３４８（５Ｈ，ｍ，ＰｈＣＨ_２）

実施例６：クリーム製剤の製造
通常のクリーム製造方法により下記の組成を有するクリームを製造した。

前記実施例６により製造されたクリームは、その貯蔵安定性及び使用感が優秀であることが確認された。

前記実施例１の合成物質（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１ａ）を用いて抗菌ペプチド分泌促進の効果を評価するために、ｉｎｖｉｔｒｏ実験を行った。

試験例１：β−デフェンシン及びＬＬ−３７分泌促進確認試験
ヒトケラチノサイト（ｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＨａＣａＴ）を培養するために、血清を含有せず、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地を用いた。ケラチノサイトは、３７℃、５％のＣＯ_２培養器で培養する。６−ウェルプレートに細胞の濃度が３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように各ウェルに接種した後、４８時間培養し、１．７ｍＭの塩化カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）と前記実施例１で合成した新規物質を添加して２４時間培養した。

評価のために少なくとも一つの未処理対照群と少なくとも一つの陽性対照群を同時に用いる。陽性対照群として、ｈＢＤ−２、ＬＬ−３７の発現を増進する効果があると知られたリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ＬＰＳ）を２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で反応させる。反応が終了した後、上澄液を収集し、細胞をＰＢＳ（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒＳａｌｉｎｅ）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を回収し、チューブに貯蔵する。ｍＲＮＡを抽出するためにトリアゾール試薬を１ｍｌ添加する。常温で１５秒間反応した後、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を２００μｌ添加する。１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上澄液を他のチューブに移した後、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）５００μｌを添加してから１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。沈殿したＲＮＡを７０％のエタノール用いて洗浄する。２回連続して洗浄した後、３回目に蒸留水を用いてＲＮＡを溶解する。希釈したＲＮＡを２６０〜２８０ｎｍで分析して定量する。

このように得たＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲ過程を経てＰＣＲ結果を得る。ＲＴ−ＰＣＲを行うために、ＭｇＣｌ_２２μｌ、ＲＴバッファー１μｌ、ｄＮＴＰｍｉｘ１μｌ、Ｒｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ０．２５μｌ、ＲＴａｓｅ０．５μｌ、ｏｌｉｇｏｄＴ０．５μｌ、蒸留水３．７５μｌ、ＲＮＡ２μgをチューブに投入してから反応させる。ＲＴ−ＰＣＲは、４５℃にて１時間、９５℃にて５分間の反応条件で行う。ＧＡＰＤＨ、ｈＢＤ−２、−３及びＬＬ−３７に対する定性分析であるＰＣＲを行う。使用したプライマーは次の文献から取得した（ＫｉｍＪＥ，ＫｉｍＢＪ，ＪｅｏｎｇＭＳ，ｅｔａｌ，ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＭｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＬＬ−３７ｉｎＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓＨａＣａＴｃｅｌｌｓａｎｄＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＳｋｉｎＤｉｓｅａｓｅｓ．ＪＫｏｒｅａｎＭｅｄＳｃｉ（２００５）２０，６４９；ＰｅｒｎｅｔＩ，ＲｅｙｍｅｒｍｉｅｒＣ，ＧｕｅｚｅｎｎｅｃＡ，ｅｔａｌ，Ｃａｌｃｉｕｍｔｒｉｇｇｅｒｓｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ（ｈＢＤ−２ａｎｄｈＢＤ−３）ａｎｄｃｈｅｍｏｋｉｎｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ−３ａｌｐｈａ（ＭＩＰ−３ａｌｐｈａ／ＣＣＬ２０）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｏｎｏｌａｙｅｒｓｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ＥｘｐＤｅｒｍａｔｏｌ（２００３）１２、７５５）。

使用したプライマーは次のとおりである。

ＧＡＰＤＨセンス：５’−ＧＧＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＧＴ−３’
ＧＡＰＤＨアンチセンス：５’−ＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴ−３’
ｈＢＤ−２センス：５’−ＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＴ−３’
ｈＢＤ−２アンチセンス：５’−ＧＧＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＣＡ−３’
ｈＢＤ−３センス：５’−ＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣ−３’
ｈＢＤ−３アンチセンス：５’−ＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＴＴＣ−３’
ＴＮＦ−αセンス；５’−ＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧ−３’
ＴＮＦ−αアンチセンス：５’−ＡＴＧＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧ−３’
ＬＬ−３７センス：５’−ＴＣＧＧＡＴＧＣＴＡＡＣＣＴＣＴＡＣＣＧ−３’
ＬＬ−３７アンチセンス：５’−ＧＧＧＴＡＣＡＡＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡ−３’

ＰＣＲを行うために、ＰＣＲｐｒｅｍｉｘ１２．５μｌ、プライマーセンス（１０μＭ）２μｌ、プライマーアンチセンス（１０μＭ）２μｌ、ｃＤＮＡ１．５μｌ、蒸留水７μｌを投入してから反応させる。ｈＢＤ−２、−３のＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、５９℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間３０サイクルを循環させてから７２℃にて１０分間の条件下で行う。ＬＬ−３７のＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間３０サイクルを循環させてから７２℃にて１０分間の条件下で行う。増幅後、最終生成物を互いに混合し、最終溶液が紫外線下で読み取り可能な核酸挿入部（臭化エチジウムのような）を１．５％で硬化したアガロースゲルにロードする。前記試料を移動させた後、暗室の紫外線下で読み取り、コンピュータ上で写真を撮る。帯強度を定量化することができる画像処理ソフトウェアで前記ゲル写真を分析する。未処理対照群でデフェンシン及びＬＬ−３７の基礎発現が検出されなかったため、陽性対照群と試料処理群でｈＢＤ−２／ＧＡＰＤＨ、ｈＢＤ−３／ＧＡＰＤＨ及びＬＬ−３７／ＧＡＰＤＨの帯強度の割合を用いて抗菌ペプチド発現誘導を検出することができる。この結果をより明確にするために、リアルタイムＰＣＲを行う。サイバーグリーン（Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ）５μｌ、プライマーセンス（１０μＭ）２μｌ、プライマーアンチセンス（１０μＭ）２μｌ、ｃＤＮＡ１μｌ、蒸留水１μｌを投入した後、反応させる。

前記の結果を図１に示した。図１から分かるように、本発明の化合物は、培養されたヒト細胞でヒトβ−デフェンシン−２及びＬＬ−３７の分泌を促進することを確認することができた。

試験例２：皮膚バリア損傷回復試験
ヌードマウスを用いて急性に皮膚バリアを損傷させた後、前記実施例１で提示した新規物質が急性皮膚バリア回復に及ぼす影響を評価した。６−８週齢のヌードマウスの左側、右側の背中の部位にＤ−Ｓｑｕａｍｅを用いて皮膚バリア損傷を誘導した。この際、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ；ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌｗａｔｅｒｌｏｓｓ）を測定して全体実験群において経表皮水分喪失量の差がほとんどないように維持した後、ｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＥＧ：ＥｔＯＨ＝７：３）と前記実施例で提示した新規物質を塗布する。０時間、３時間、６時間、２４時間後に経表皮水分喪失を測定して皮膚バリアの回復を確認した後、各時間における皮膚組織を生検して組織学的検査及びその他の検査を行う。

前記の結果を図２に示した。前記図２の結果から本発明の新規化合物が皮膚バリア損傷の回復に著しい結果を示すことを確認することができた。

試験例３：アトピー皮膚炎動物モデルに対する効果評価試験
６−８週齢のヌードマウスの腹部に、５％のオキサゾロン（Ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）溶液を１回塗布して経皮感作させた後、一週間後から０．１％のオキサゾロン溶液を二日に一回６回塗布し、１％のオキサゾロン（Ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）を二日に一回４回塗布してアトピー皮膚炎動物モデルを構築した。オキサゾロンを用いたアトピー皮膚炎動物モデルの場合、表皮内抗菌ペプチドの減少が現われると報告されている（ＭａｎＭ−Ｑ，ＨａｔａｎｏＹ，ＬｅｅＳＨ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｈｅｐｔｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ，ｍｕｒｉｎｅｍｏｄｅｌｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｆｅａｔｕｒｅｓｏｆａｔｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｉｎｇｌｅｖｅｒｓｕｓｍｕｌｔｉｐｌｅｏｘａｚｏｌｏｎｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ（２００８）１２８、７９−８６）。以上のように構築したアトピー皮膚炎動物モデルの皮膚にそれぞれｖｅｈｉｃｌｅ（ＰＥＧ：ＥｔＯＨ＝７：３）と０．１％の濃度でｖｅｈｉｃｌｅに希釈した前記実施例１により合成した物質（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１ａ）を午前、午後に１回ずつ計４日間塗布する。最後の日に皮膚の厚さを測定した。効果的な炎症治療剤であるコルチコステロイド系薬物であるデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を陽性対照群として用いた。

得られた結果を図３に示した。このような結果から前記実施例により合成した新規物質がアトピー皮膚炎動物モデルにおいて抗炎効果を有することを確認することができた。

前記実施例１により合成した新規化合物を４日間塗布した後、皮膚組織を生検してパラフィンブロックを形成する。パラフィンカッターを用いてスライド上に組織を付着する。Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓブロッキング試薬（Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓｂｌｏｃｋｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）を５００μｌロードした後３０分間反応させる。ＰＢＳ溶媒を用いて５分ごとに３回洗浄する。Ｐｒｏｔｅｉｎブロッキング試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｃｋｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）を５００μｌロードした後、１５分間反応させる。一次ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＣＲＡＭＰをそれぞれ３０分間２５℃にて反応させる。二次抗体（ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ）としてｄｏｎｋｅｙａｎｔｉ−ｇｏａｔＩｇＧ−ＨＲＰを３０分間２５℃にて反応させる。発色試薬であるＤＡＢを１０分間反応させる。反応終了後、顕微鏡を介して皮膚の角質層でＣＲＡＭＰの発現を測定する。得られた結果を図４に示しており、Ａ）Ｎｏｒｍａｌ、Ｂ）Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ、Ｃ）０．０１％Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｄ）０．１％Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１ａを示した。

また、他のスライドを用いてＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ）を測定した。Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓブロッキング試薬（Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓｂｌｏｃｋｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）を５００μｌロードした後、３０分間反応させる。ＰＢＳ溶媒を用いて５分ごとに３回洗浄する。Ｐｒｏｔｅｉｎブロッキング試薬（Ｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｃｋｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ）を５００μｌロードした後、１５分間反応させる。一次ｒａｂｂｉｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＰＣＮＡを３０分間２５℃にて反応させる。二次抗体（ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ）としてｄｏｎｋｅｙａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧＨＲＰを３０分間２５℃にて反応させる。発色試薬であるＤＡＢを１０分間反応させる。反応終了後、顕微鏡を介して皮膚の表皮層で皮膚細胞の増殖を測定する。得られた結果を図５に示した。

他のスライドを用いて肥満細胞を測定した。スライドのパラフィン除去した後、過マンガン酸カリウム溶液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｅｒｍａｎｇａｎａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に２分間反応させる。蒸留水を用いてスライドを洗浄する。異性重亜硫酸カリウム溶液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｍｅｔａｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に１分間反応させる。蒸留水を用いて３分間スライドを洗浄する。ａｃｉｄｉｆｉｅｄｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅｓｏｌｕｔｉｏｎに５分間反応させる。蒸留水を用いてスライドを洗浄する。反応終了後、顕微鏡を介して皮膚の肥満細胞を測定する。得られた結果を図６に示した。

前記の試験結果から本発明の新規化合物が優れた抗炎効果と皮膚バリア機能の改善及び回復を著しく促進する効果を有することが分かる。

試験例４：細胞毒性試験
ヒトケラチノサイト（Ｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＨａＣａＴ）を培養するために、血清を含有せず、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地を用いて３７℃、５％のＣＯ_２の培養器で培養した。９６−ウェルプレートに２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで接種した後、４８時間培養し、２４時間血清のない培地を用いてさらに培養する。翌日、前記実施例により合成した新規合成物質を濃度別に添加して２４時間反応させる。発色試薬を投入してから４時間後、５９０ｎｍの吸光度で細胞死を測定する。得られた結果を図７に示した。

前記の試験結果から本発明の新規化合物が安全性においても問題がないことが分かる。

Claims

下記化学式（Ｉａ）の化合物を活性成分として含有する、生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物。
活性成分として前記化合物を０．００１〜９０重量％含有することを特徴とする、請求項１に記載の生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物。
前記生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物は、外用剤であって、液状、乳液状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、ゲル状、ゼリー状、スプレー状であることを特徴とする、請求項１に記載の生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物。
前記生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物は、錠剤、液剤、粉末剤、注射剤であることを特徴とする、請求項１に記載の生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物。
前記生体内抗菌ペプチドは、ヒトβ−デフェンシン−２、β−デフェンシン−３又はＬＬ−３７であることを特徴とする、請求項１に記載の生体内抗菌ペプチド分泌促進用組成物。