JP5607896B2 - Cryopreservation, freezing devices, cryopreservation system - Google Patents

Cryopreservation, freezing devices, cryopreservation system Download PDF

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    • A01N1/0268Carriers for immersion in cryogenic fluid, both for slow-freezing and vitrification, e.g. open or closed "straws" for embryos, oocytes or semen

Description

本発明は、細胞や組織を凍結保存するためのデバイス、特にヒトiPS細胞やヒトES細胞、動物やヒトの胚などを凍結保存する場合に好適に用いられる瞬間凍結法を用いてこれらの細胞や組織を凍結保存するに特に好適に用いられるデバイス並びに方法に関する。 The present invention is a device for cryopreservation of cells and tissues, these cells Ya particularly with instant freezing method suitably used in the case of cryopreserved human iPS cells and human ES cells, animals and human embryos and tissue to a device and a method particularly suitable for use in cryopreserving.

細胞を凍結状態で保存するための装置や方法に関する各種の技術が報告されている。 Various techniques for devices and methods for preserving cells in a frozen condition is reported. 例えば霊長類ES細胞などの幹細胞を急速凍結する際に好適に用いられる媒体(凍結液)の組成が、特許文献1に記載されている(以下第1の従来例)。 For example, and (following first conventional example) it described composition, in Patent Document 1 of a medium which is suitably used (frozen liquid) when rapidly frozen stem cells such as primate ES cells. 具体的にはDMSO、プロピレングリコール、培地、アセトアミドを特定の濃度で含むDAP媒体が開示されている。 Specifically DMSO, propylene glycol, medium and DAP medium containing acetamide at a particular concentration are disclosed. またこの媒体を用いる幹細胞の凍結方法である簡易ガラス化法も第1の従来例に開示されている。 The simple vitrification is freezing method of stem cells using this medium is also disclosed in the first conventional example. 簡易ガラス化法は、幹細胞等の凍結すべき細胞を、前記媒体を用いて封入管のような汚染しにくい容器に封入し、封入管を液体窒素中に浸すことにより急速冷凍し、その後、急速解凍する方法である。 Simple vitrification method, the cells to be frozen such as stem cells, encapsulated in a contaminated hard vessel such as a sealed tube using the medium, rapidly frozen by immersing the sealed tube in liquid nitrogen, then rapidly it is a method of thawing. 具体的には、継代操作により回収したヒトES細胞のコロニーを遠心分離し、上清を取り除くことにより、予め細胞をペレット状としておく。 Specifically, colonies of human ES cells recovered by passage operation centrifuged, by removing the supernatant, advance cells and pelleted. 細胞にDAP媒体200μLを加え、穏やかに懸濁し、予め準備した凍結保存用チューブ(容器)に移す。 The DAP medium 200μL added to the cells, gently suspended and transferred in advance to prepare the cryopreservation tubes (containers). (チューブのフタを密栓して封入管状態とした上で、)ピンセットでチューブをつかみ、液体窒素につける。 (On was sealed tube condition was sealed lid of the tube) grasp the tube with forceps, put into liquid nitrogen. 液体窒素中で30〜60秒凍結し、内部まで完全に凍らせた後、液体窒素保存容器に移す。 Frozen 30-60 seconds in liquid nitrogen, after frozen completely into the interior and transferred to a liquid nitrogen storage container.

ここで、DAP媒体は細胞毒性が強いため、細胞に媒体を添加してからチューブを液体窒素に浸すまでの工程を出来る限りすばやく作業すること、目安として15秒以内、と記載されている。 Here, the DAP medium for strong cytotoxicity to the tube after the addition of the medium to the cells to work as quickly as possible a process until immersion in liquid nitrogen, are described within 15 seconds as a standard, and.

また非特許文献1(以下第2の従来例)にも、上記の細胞に媒体を添加してからチューブを液体窒素に浸すまでの時間として15秒以内を目指すこと、この操作をできるだけon−iceで細胞を温めないように行うこと、と記載されている。 Also in the non-patent document 1 (hereinafter the second conventional example), it aims to within 15 seconds tube after the addition of media to the cell as a time until the immersion in liquid nitrogen, on-ice as possible this operation in be carried out so as not warmed cells, it has been described as.

WO2005/045007号公報 WO2005 / 045007 JP

上記従来例は、(i)細胞への媒体の添加、(ii)細胞の懸濁、(iii)チューブへの移し替え、(iv)チューブの密栓、(v)チューブの保持と運搬、(vi)液体窒素中へのチューブの浸漬、という多数のステップからなる一連の工程を短時間で行う必要がある。 The above conventional example, the addition of the medium to (i) cells, (ii) a suspension of cells, (iii) transferred to the tubes, (iv) sealed tube, transportation and retention of (v) tube, (vi ) it is necessary to perform immersion tube into liquid nitrogen, a series of processes consisting of many steps that in a short time. 従って、オペレータはこれら一連のクリティカルな工程の操作に予め十分習熟する必要があり、また操作に当たっては細心の注意を払う必要があり、オペレータの負担が大きい、という問題があった。 Therefore, the operator must advance sufficiently familiar with the operation of the series of critical steps, also when the operation should pay close attention, there is an operator's burden is large, that problem. ここで細胞を密栓容器に封入する前は汚染防止のため安全キャビネット内で取り扱う必要があることから、工程(i)から(v)の途中までは安全キャビネットの中での操作となり、操作上の制約が多い。 Here since before encapsulating the cells sealed container needs to be handled in the safety cabinet to prevent contamination, halfway from step (i) of (v) comprises the operation of in the safety cabinet, operational there are many restrictions. また液体窒素入りの容器は除染しにくいため一般に安全キャビネットの外に設置されることから、(v)の後半の運搬の距離が長くなる制約もある。 The container of liquid nitrogen filled from being installed outside the general safety cabinet for hard to decontaminate, some constraints distance late delivery is longer in (v). この様な制約下で万一操作に手間取って時間がかかったり、逆に時間の制約を気にしすぎて操作手順を間違えたり、不完全な操作をするなどの失敗をすると、細胞への悪影響があり、貴重な幹細胞を劣化させたり、それを死滅させる(失う)リスクがある、という問題があった。 Or takes a long time been slow to such a restriction under the emergency operation, or the wrong operation procedure too much to worry about the constraints of time to reverse, and the failure of such as an incomplete operation, adverse effect on the cell Yes, or to degrade the valuable stem cells, kill it (lose) there is a risk, there is a problem in that.

また上記のクリティカルな工程は時間の制約条件があるため、一度に一つの試料しか処理できず、多数の試料を凍結する場合は作業効率が低い課題があった。 Since the above critical steps have time constraints, not only handle one sample at a time, to freeze a large number of samples had low problem working efficiency. 第2の従来例によると、ヒトiPS細胞やES細胞などのヒト多能性幹細胞は継代数が多くなると、増殖性、分化能、未分化性、核型などに異常を持つ頻度が徐々に上がってくることが多いため、比較的若い継代数のもので実験を行う方が良いとされており、細胞の凍結ストックもできるだけ若い継代数のものをたくさん作っておくとよいとされている。 According to a second conventional example, the human pluripotent stem cells such as human iPS cells and ES cells will have more passages, increased proliferative, differentiation potential, undifferentiated, the frequency with abnormalities such as karyotype gradually in order to come often, there is a relatively young joint are the better to carry out the experiment with those of algebra, may cells frozen stocks also idea to make a lot of things as much as possible young passages. 多数の細胞を凍結することが求められているにも関わらず、作業効率が低いため、オペレータの負担が極めて大きい、という問題があった。 Despite the freezing the number of cells has been required, because of low work efficiency, the operator burden was very large, a problem.

そこで本発明は、上記問題点に着目し、細胞を凍結液に懸濁させて凍結保存する場合において、作業者への負担を軽減し、細胞へのダメージを抑制して短時間で確実に凍結保存を行う、凍結保存方法、凍結デバイス、凍結保存システムを提供することを目的とする。 The present invention focuses on the problem, in the case of cryopreserved suspension of cells frozen solution, to reduce the burden on the worker, reliably frozen in a short period of time by suppressing the damage to the cells for saving, cryopreservation, freezing device, and an object thereof is to provide a cryopreservation system.

上記目的を達成するため、本発明に係る凍結保存方法は、試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結保存方法であって、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画を有する凍結デバイスを形成し、前記第1区画と前記第2区画との境界を、 前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に形成され表面張力により前記凍結液を保持可能なノズルと、を有し、前記凍結液が前記ノズルから出力する加速度を前記凍結デバイスに印加する操作である非接触操作により前記第2区画に収納した凍結液を第1区画に収納した試料に供給可能な供給手段により形成し、前記凍結デバイスに前記非接触操作を行い、前記凍結液を前記供給手段を介して前記試料に供給することを特徴とする。 To achieve the above object, cryopreservation method according to the present invention is a cryopreservation method for cryopreserving said suspension to form a suspension of freeze liquid for the the specimen sample, said sample a first compartment for housing a, a hollow tube frozen device is formed having a second compartment, a boundary between the second compartment and the first compartment, which houses the freeze liquid for housing the freeze liquid, anda nozzle capable of holding the frozen liquid by surface tension are formed in the distal end of the tube, said by the freezing liquid is an operation for applying an acceleration output from the nozzle to the freezing device touchless manipulation first 2 housed in the compartment frozen liquid formed by supplying means capable of supplying the sample accommodated in the first compartment, perform the touchless manipulation on the freezing device, supplying the freezing liquid to the sample through the feed means characterized in that it.

また、前記供給手段は、前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に形成され表面張力により前記凍結液を保持可能なノズルと、を有し、前記非接触操作は、前記凍結液が前記ノズルから出力する加速度を前記凍結デバイスに印加する操作であることを特徴とする。 Further, the supply means includes a hollow tube for housing the freeze liquid, has a nozzle capable of holding the frozen liquid by surface tension are formed in the distal end of the tube, the non-contact operation, the freezing wherein the liquid is an operation for applying an acceleration output from the nozzle to the freezing device.

さらに、 本発明に係る凍結保存方法は、試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結保存方法であって、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画を有する凍結デバイスを形成し、前記第1区画と前記第2区画との境界を、前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に強磁性体で形成された第2のノズルと、前記強磁性体により吸着され、前記第2のノズルを封止する磁石と、を有し、前記磁石が前記第2のノズルから離脱する磁場を印加して前記第2のノズルの封止を解除することにより前記第2のノズルから前記凍結液を出力する操作である非接触操作により前記第2区画に収納した凍結液を第1区画に収納した試料に供給可能な供給手段により形成し、前記凍結デバイス Furthermore, cryopreservation method according to the present invention, a suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a cryopreservation method for cryopreservation, first for accommodating the sample and compartment, wherein the form freezing device having a second compartment for containing the frozen liquid, the boundary between the second compartment and the first compartment, a hollow tube housing the freeze liquid, the tip of the tube a second nozzle formed of ferromagnetic material, the adsorbed a ferromagnetic material, has a magnet which seals the second nozzle, a magnetic field the magnet is disengaged from said second nozzle applied to housing the freeze liquid housed in the second compartment by a non-contact operation that in the operation for outputting the freeze liquid from the second nozzle to the first compartment by releasing the seal of the second nozzle formed by the sample can be supplied supply means, and the freezing device 前記非接触操作を行い、前記凍結液を前記供給手段を介して前記試料に供給することを特徴とする。 Wherein performs non-contact operation, and supplying the frozen liquid to the sample through the feed means.

上記凍結保存方法を具現化する本発明に係る凍結デバイスは、第1には、試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイスであって、前記凍結デバイスは、 開口部を有する容器と、前記開口部を密栓可能な蓋と、前記容器内を、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画と、に区画する境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有し、 前記供給手段は、前記蓋に一体で形成されるとともに前記開口部から挿入可能で前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に形成され表面張力により前記凍結液を保持可能なノズルを有し、前記非接触操作は、前記凍結液が前記ノズルから出力する加速度を印加する操作であることを特徴とする。 Freezing device according to the present invention embodying the cryopreservation method, the first, a frozen device cryopreserving said suspension to form a suspension of freeze liquid for the the specimen sample Te, the freezing device comprises a container having an opening, and the seal plug can lid the opening, the container, a first compartment for housing the sample, and a second compartment for housing the freeze liquid, the boundaries for partitioning formed on, has a supply means for supplying to the sample by a non-contact manipulating the freezing liquid, the supply means, can be inserted through the opening while being formed integrally on the lid a hollow tube for housing the freeze liquid, has a nozzle capable of holding the frozen liquid by surface tension are formed in the distal end of the tube, the non-contact operation, the acceleration which the frozen liquid is outputted from the nozzle characterized in that it is an operation applied to.

第2には、前記凍結デバイスは、開口部を有する容器と、前記開口部を密栓可能な蓋を有し、前記供給手段は、前記蓋に一体で形成されるとともに前記開口部から挿入可能で前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に形成され表面張力により前記凍結液を保持可能なノズルを有するとともに、前記非接触操作は、前記凍結液が前記ノズルから出力する加速度を印加する操作であることを特徴とする。 Secondly, the frozen device is a container having an opening includes a seal plug can lid the opening, the supply means, can be inserted through the opening while being formed integrally on the lid a hollow tube for housing the freeze liquid, which has a nozzle capable of holding the frozen liquid by surface tension are formed in the distal end of the tube, the non-contact operation, the acceleration which the frozen liquid is outputted from the nozzle characterized in that it is an operation applied to.

第3には、前記中空の管または前記ノズルには、メッシュ状の充填材が充填されたことを特徴とする。 Third, the hollow tube or the nozzle, the mesh-like filler, characterized in that it is filled.

第4には、 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイスであって、前記凍結デバイスは、開口部を有する容器と、前記開口部を密栓可能な蓋と、前記容器内を、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画と、に区画する境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有し、前記供給手段は、前記蓋側が開口し前記容器に挿入されて、前記容器の内壁に当接して前記容器に保持され、前記開口部側から前記凍結液を注入可能な中間ユニットと、前記中間ユニットの挿入側に形成された出力孔と、前記出力孔を封止するように形成され、前記凍結液を保持するとともに前記被接触操作により前記凍結液を前記容器に出力する第2の充填材を有す The fourth, a suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a freezing device for cryopreservation, the freezing device comprises a container having an opening, said opening a lid capable stoppered parts, the container, a first compartment for containing said sample, said second compartment for containing the frozen liquid, the boundary defining the form, a non-contact operating the freezing liquid anda supply means for supplying to said sample, said supply means, said cover side is open is inserted into the container is held in said container in contact with the inner wall of the container, said from the opening side and injectable intermediate unit freezing liquid, wherein an output hole formed in the insertion side of the intermediate unit is formed so as to seal said output hole, the frozen by the contacted operator holds the frozen liquid having a second sealing member for outputting a liquid to the container とともに、前記非接触操作は、前記凍結液が前記第2の充填材を介して前記出力孔から出力する加速度を印加する操作であることを特徴とする。 Together with the non-contact operation, characterized in that the freezing liquid is operated to apply an acceleration output from the output port through the second filling material.

第5には、 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイスであって、前記凍結デバイスは、開口部を有する容器と、前記開口部を密栓可能な蓋と、前記容器内を、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画と、に区画する境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有し、前記供給手段は、前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に強磁性体で形成された第2のノズルと、前記強磁性体により吸引され、前記第2のノズルを封止する磁石と、を有し、前記非接触操作は、前記磁石が前記第2のノズルから離脱する磁場を印加して前記第2のノズルの封止を解除することにより前記第2のノズルから前記凍結液を出力する操作である The fifth, the suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a freezing device for cryopreservation, the freezing device comprises a container having an opening, said opening a lid capable stoppered parts, the container, a first compartment for containing said sample, said second compartment for containing the frozen liquid, the boundary defining the form, a non-contact operating the freezing liquid anda supply means for supplying to said sample, said supplying means includes a hollow tube for housing the freeze liquid, and a second nozzle formed of ferromagnetic material on the tip of the tube, the ferromagnetic is sucked by the body, the magnet the second nozzle is sealed, has the non-contact operation, sealing of the second nozzle by applying a magnetic field the magnet is disengaged from said second nozzle It is an operation that outputs the freezing liquid from the second nozzle by releasing the stop とを特徴とする。 And wherein the door.

また本発明に係る試料の前記凍結保存システムは、前記凍結デバイスを保持する容器ホルダと、前記容器ホルダを回転運動及び偏心円運動をさせる駆動装置と、を有し、前記容器ホルダは、前記容器ホルダの周縁において前記供給手段の出力側を前記容器ホルダの外周側に向けた状態で前記凍結デバイスを保持し、前記駆動装置は、前記容器ホルダを回転運動させ、前記凍結デバイスに発生する遠心力により前記供給手段から前記凍結液を出力して前記試料に供給するとともに、前記容器ホルダを偏心円運動させ、前記試料と前記凍結液を攪拌して前記試料を前記凍結液に懸濁し、前記容器ホルダは、前記駆動装置から着脱自在であって、凍結用冷媒に浸漬可能であることを特徴とする。 Also the cryopreservation system of the sample according to the present invention includes a container holder for holding the freezing device, and a driving device for the rotary movement and an eccentric circular motion said container holder, said container holder, said container centrifugal force on the output side of the supply means at the periphery of the holder to hold the frozen device in a state toward the outer peripheral side of the container holder, the driving device, which rotates motion said container holder, generated in the freezing device the supplies to the sample and outputs the freeze liquid from the supply means, said container holder eccentrically circular motion, by stirring the frozen liquid and the sample was suspended the sample to the freezing liquid, the said container holder is a detachable from the drive unit, characterized in that it is a possible immersion in freezing refrigerant.

さらに本発明の試料の凍結保存システムは、前記凍結デバイスを保持する容器ホルダと、前記容器ホルダに搭載され前記磁場を発生させる第2の磁石と、前記容器ホルダを偏心円運動させる第2の駆動装置と、を有し、前記第2の磁石は、前記磁石を前記磁場により前記第2の磁石側に吸引し前記第2のノズルの封止を解除して前記凍結液を前記第2のノズルから出力して前記試料に前記凍結液を供給し、前記第2の駆動装置は、前記容器ホルダに偏心円運動させ、前記試料と前記凍結液を攪拌して前記試料を前記凍結液に懸濁させるとともに、前記容器ホルダは、前記第2の駆動装置から着脱自在であって、凍結用冷媒に浸漬可能であることを特徴とする。 Further cryopreservation system samples of the present invention includes a container holder for holding the frozen device, and a second magnet generating a mounted the magnetic field to the vessel holder, a second driving in which eccentric circular motion said container holder a device and, a, the second magnet, sucks the magnet to the second magnet side by the magnetic field and the second the second nozzle the frozen solution to release the sealing of the nozzle outputs from supplying the freezing liquid to the sample, the second driving device, the eccentrically circular movement to the container holder, suspending the sample in the frozen solution and stirring the frozen liquid and the sample together is, the container holder is a detachable from the second drive device, characterized in that it is a possible immersion in freezing refrigerant.
そして、前記容器ホルダは、前記凍結デバイスを複数保持可能であることを特徴とする。 Then, the container holder is characterized in that the possible multiple holding freezing device.

本発明に係る凍結保存方法及び凍結デバイスによれば、第1には、凍結デバイス内において試料と凍結液が分離され、それぞれ独立に収納が可能である。 According to cryopreservation and freeze device according to the present invention, the first, frozen liquid and sample are separated in a freezing device, it is possible to independently housed. すなわち、凍結デバイスに凍結液を注入する工程と、凍結デバイスに収納された試料に凍結液を供給する工程とが分離される。 That is, a step of injecting a freezing liquid to freezing device, and supplying the frozen solution stored in the freezing device sample are separated. そして、非接触操作により凍結液が試料に供給されるため、上述の(i)、(ii)の工程を自動的、連続的に処理することができる。 Since the freezing solution by non-contact operation is supplied to the sample, the above-mentioned (i), it can be processed in the step of automatically, continuously (ii). なお本発明では凍結デバイスだけを用いて細胞等と凍結液の混合、分散、凍結を一貫して行うため、本発明では工程(iii)に相当する移し替え工程を省略することができる。 Incidentally mixture of frozen liquid and cells, etc. using only freezing device in the present invention, dispersion, for performing freeze consistently, in the present invention it is possible to omit the sorting step corresponding to step (iii). したがって、作業者が凍結液をピペット等で試料に供給する作業等を行う必要がなく、懸濁液の凍結保存までの時間を短縮できるのみならず、その時間のムラも抑制することができるので、試料へのダメージを安定的に抑制することができる。 Thus, the worker does not need to perform such tasks supplied to the sample freezing liquid with a pipette or the like, not only can reduce the time to cryopreservation of the suspension, it is possible to also suppress unevenness of the time , it is possible to stably suppress the damage to the sample.

第2には、供給手段は凍結デバイスの蓋に一体で形成されたため、供給手段を容器から離した状態で凍結液を収納することができる。 The second supply means for that is formed integrally with the lid of the freezing device, can be stored frozen liquid in a state of releasing the feeding means from the container. そして、容器の密栓工程が、細胞等と凍結液とが互いに接触する以前に完了しているため、上述の工程(iv)に相当する容器の密栓工程を、クリティカルな工程の時間カウント外とし、作業効率を向上させることができる。 The sealed process of the container, since the completed before the cells or the like and the frozen liquid are in contact with each other, the sealed process vessel, which corresponds to the above-mentioned step (iv), the time count out critical step, thereby improving the work efficiency. そして、供給手段は中空の管と管の先端に形成されたノズルからなるが、供給手段に加速度、具体的には遠心力を印加することで凍結液を試料に供給することができるので、遠心分離器等の簡易な装置に搭載して人為的作業を伴うことなく容易に凍結液を試料に供給することができる。 The supply means may consist of nozzles formed at the tip of the hollow tube and the tube, the acceleration in the supply means, since in particular it is possible to supply the freezing liquid to the sample by applying a centrifugal force, the centrifugal easily frozen solution without human work mounted on simple apparatus separator or the like can be supplied to the sample.

第3には、中空の管またはノズルにメッシュ状の充填材を充填することで、凍結液の通液抵抗を増加させて、非接触操作前においてノズルから凍結液が漏れることを防止することができる。 Third, by filling the mesh filler hollow tube or nozzle, increasing the resistance to fluid passage of the frozen solution, freeze liquid from the nozzle before the non-contact operation it is possible to prevent the leakage it can.

第4には、凍結液を蓋及び容器とは分離し蓋側が開口した中間ユニットを容器に挿入する構成とすることにより凍結液の供給手段への注入が容易になり作業効率が向上する。 The fourth work efficiency becomes easy injection into the supply means of freezing solution is improved by a configuration in which the lid-side separate from the lid and container frozen solution to insert intermediary unit which opens into the container.

第5には、供給手段は凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に強磁性体で形成された第2ノズルと、前記強磁性体により吸引され、前記第2ノズルを封止する磁石と、を有し、非接触操作は、前記磁石が前記第2ノズルから離脱する磁場を印加して前記凍結液を前記第2ノズルから出力させる操作とすることにより、第2ノズルは凍結液の表面張力を利用する必要はなく、第2ノズルの内径を大きくすることが出来るので、凍結液の試料への供給を短時間で行うことが可能となり、凍結保存までの時間をより短縮することができる。 The fifth, sealing a hollow tube housing the freeze liquid supply means, and a second nozzle formed of ferromagnetic material on the tip of the tube, is sucked by the ferromagnetic body and the second nozzle to a magnet, and non-contact operation, by an operation of said magnet to output the frozen liquid by applying a magnetic field to leave from the second nozzle from the second nozzle, the second nozzle is frozen does not require the use of surface tension of the liquid, since it is possible to increase the inner diameter of the second nozzle, it is possible to perform in a short time the supply of the sample of frozen solution to shorten the time to cryopreservation be able to.

また本発明に係る試料の凍結保存システムによれば、遠心運動に代表される非接触の操作により凍結液を細胞等へ添加する工程(上記(i)に相当する)を実現し、また偏心円運動に代表される非接触の操作により細胞等を凍結液に懸濁する工程(同(ii)に相当する)を実現することができる。 According to cryopreservation system of the sample according to the present invention, to achieve the step of adding the frozen solution into cells or the like by the operation of contactless typified by centrifugal motion (corresponding to the above (i)), also circular eccentric it is possible to realize a step of suspending the cells or the like to frozen solution under a non-contact operation represented by motion (corresponding to the (ii)). ここで非接触の意味は、これらの工程を行うために、容器の蓋を開ける必要が無く、容器内部にピペットを挿入して操作する必要が無い、という意味である。 Meaning of contactless Here, in order to perform these steps, it is not necessary to open the lid of the container, there is no need to operate by inserting a pipette into the container, it is meant that.

さらに本発明に係る試料の凍結保存システムによれば、磁力により第2ノズルの封止を解除することができるので、第2ノズルの内径を大きくすることができ、凍結液の試料への供給を短時間で行うことが可能となり、凍結保存までの時間をより短縮した凍結保存システムとなる。 Furthermore, according to cryopreservation system of the sample according to the present invention, it is possible to release the sealing of the second nozzle by a magnetic force, it is possible to increase the inner diameter of the second nozzle, the supply of the sample of frozen solution a short time it becomes possible to carry out, a cryopreservation system shorten the time until cryopreservation. そして容器ホルダは駆動装置または第2駆動装置から着脱自在であるので、懸濁後速やかに容器ホルダごと凍結デバイスを凍結用冷媒に浸漬することができ、作業効率を向上させることができる。 And because the container holder is removable from the drive unit or the second driving unit, promptly freezing device each container holder was suspended can be immersed in a freezing refrigerant, thereby improving the working efficiency.

また容器ホルダは凍結デバイスを複数保持可能であるので、作業効率を向上させるとともに、各凍結デバイスにおいて試料と凍結液との懸濁液が同時に形成されるため、作業ムラも抑制することができる。 Since the container holder is capable holding a plurality of freezing devices, improves the work efficiency, because the suspension of frozen liquid and the sample in each freezing devices are formed simultaneously, it is possible to also suppress work unevenness.

本発明の第1の実施例による凍結デバイスの断面を模式的に示す概略図である。 The cross-section of a freezing device according to a first embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第1の実施例による凍結デバイスの構成を模式的に示す概略図である。 The structure of the freezing device according to a first embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第1の実施例による撹拌遠心機の容器ホルダのワンタッチ脱着機構の構成を模式的に示す概略図である。 The configuration of the first one-touch detachment mechanism of the container holder of the stirring centrifuge according to an embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第1の実施例による容器ホルダの形状を模式的に示す概略図である。 The shape of the container holder according to a first embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第1の実施例による凍結デバイスの動作を模式的に示すフローチャートである。 The operation of the freezing device according to a first embodiment of the present invention is a flow chart illustrating schematically. 本発明の第1の実施例、並びに従来例に従って凍結した細胞の、解凍後の生細胞率を評価した結果の例である。 The first embodiment of the present invention, as well as frozen cells in accordance with the prior art, an example of a result of evaluating the cell viability after thawing. 本発明の第1の実施例の第1の変形例による容器ホルダの断面を模式的に示す概略図である。 The first of the first modification section of the container holder according to the embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第1の実施例の第2の変形例による容器ホルダの断面を模式的に示す概略図である。 The first second modification section of the container holder according to the embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第3の実施例による凍結デバイスの断面を模式的に示す概略図である。 The cross-section of a freezing device according to a third embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第3の実施例によるホルダの断面及びその使用方法を模式的に示す概略図である。 The third section and their use of the holder according to an embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第4の実施例による凍結デバイスの構成を模式的に示す概略図である。 The structure of the freezing device according to a fourth embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第4の実施例による凍結デバイスの使用方法を模式的に示す概略図である。 The use of freeze device according to a fourth embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing. 本発明の第4の実施例による凍結デバイスの使用前の構成と準備手順を模式的に示す概略図である。 A fourth configuration and preparation procedures before use of the freeze device according to an embodiment of the present invention is a schematic diagram schematically showing.

以下、本発明を図に示した実施形態を用いて詳細に説明する。 It will be described in detail with reference to embodiments shown the present invention in FIG. 但し、この実施形態に記載される構成要素、種類、組み合わせ、形状、その相対配置などは特定的な記載がない限り、この発明の範囲をそれのみに限定する主旨ではなく単なる説明例に過ぎない。 However, components described in this embodiment, the kind, combination, shape, unless there is specific relative positions and so forth are merely illustrative examples and not intended to limit the scope of the invention thereto .

図1に凍結デバイスの模式図を示す。 It shows a schematic diagram of a freezing device in FIG. 本発明に係る凍結保存方法は、試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結保存方法であって、前記試料を収納する第1区画2と、前記凍結液を収納する第2区画3を有する凍結デバイス1を形成し、前記第1区画2と前記第2区画3との境界を、非接触操作により前記第2区画3に収納した凍結液を第1区画2に収納した試料に供給可能な供給手段により形成し、前記凍結デバイス1に前記非接触操作を行い前記凍結液を前記試料に供給するものであり、これを具現化する凍結デバイス1は、試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイス1であって、凍結デバイス1は、前記試料を収納する第1区画2と、前記凍結液を収納する第2区画3と、前記第1区画2 Cryopreservation method according to the present invention, a suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a cryopreservation method of cryopreservation, the first compartment accommodating the sample 2 When the form freezing device 1 having a second compartment 3 for housing a freezing liquid, the boundary between the first compartment 2 and the second compartment 3, and stored into the second compartment 3 by a non-contact operation frozen liquid is formed by the supply means capable of supplying the sample accommodated in the first compartment 2, and the frozen liquid performs the non-contacting operation with the freezing device 1 to supply to the sample, freeze embodying this device 1 is a freezing device 1 cryopreserving said suspension to form a suspension of freeze liquid for the the specimen sample, freezing device 1, the first compartment accommodating the sample 2 When, a second compartment 3 for housing the freeze liquid, the first compartment 2 前記第2区画3との境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有するものである。 The second to form a boundary between the compartment 3, and has a supply means for supplying to the sample by a non-contact manipulating the freezing liquid.

本実施例に係る凍結デバイス1においては、前記供給手段は、前記凍結液を収納する中空の管である液収納部13と、前記管の先端に形成され凍結液の表面張力により前記凍結液を保持可能なノズル13aを有するとともに、前記非接触操作は、前記凍結液が前記ノズル13aから出力する加速度(遠心力)を印加する操作である。 In freezing device 1 according to this embodiment, the supply means includes a liquid storage portion 13 is a hollow tube for housing the freeze liquid, the frozen liquid by the surface tension of the tip to be formed frozen solution of said tube and it has a holdable nozzle 13a, the non-touch operation is an operation of the freezing liquid is applied acceleration (centrifugal force) output from the nozzle 13a.

図1は本実施例による凍結デバイス1の断面の模式図である。 Figure 1 is a schematic cross-sectional view of a freezing device 1 according to this embodiment. 図2は本実施例による凍結デバイス1の主要構成要素である上部ユニット10と、下部ユニット20の断面の模式図である。 Figure 2 is an upper unit 10 which is a main component of the freezing device 1 according to this embodiment, a schematic sectional view of the lower unit 20. この供給手段を構成する液収納部13とノズル13aとで凍結デバイス1において第1区画2、及び第2区画3の境界を形成する。 In freezing device 1 in the liquid storage portion 13 and the nozzle 13a constituting the supply means forms the boundary of the first compartment 2, and a second compartment 3. そして、本実施例に係る凍結デバイス1は、上部ユニット10、下部ユニット20により構成される。 The freezing device 1 according to this embodiment, the upper unit 10, constituted by a lower unit 20.

上部ユニット10の構成概略は以下の通りである。 Schematic configuration of the upper unit 10 is as follows. 11はキャップ、12はパッキン、13は液収納部、14は開口部、15は充填剤である。 11 cap, 12 is a packing, 13 a liquid storage portion, 14 opening, 15 is a filler. 液収納部13は基本的に中空の管であり、その先端(図の下方向)に内径約0.3mmの毛細管状のノズル13aを有し、キャップ11と一体に形成され、液収納部13及びノズル13aは下部ユニット20(後述の容器本体21)の開口部20aから挿通可能となっている。 Liquid containing portion 13 is basically a hollow tube, the tip having a capillary nozzle 13a having an inner diameter of about 0.3mm (the downward direction in the figure), are formed in the cap 11 integral with the liquid storage portion 13 and the nozzle 13a is adapted to be inserted through the opening 20a of the lower unit 20 (container main body 21 to be described later). 開口部14は液収納部13の側壁に設けた貫通孔であり中空管の内外を連通する。 Opening 14 to communicate the inside and outside of the hollow is a through hole provided in the side wall of the liquid storage portion 13 pipe. 充填剤15は液収納部13の先端内部に充填されている。 Filler 15 is filled to the tip inside the liquid storage portion 13. 充填剤15としては、日本石英硝子(現東ソー)製のスーパーファイン級の石英ウールを用いた。 As the filler 15, using a super-fine grade quartz wool manufactured by Nippon quartz glass (Genhigashi saw). パッキン12は扁平なドーナツ状のシリコンゴムからなり、図中ではキャップ11とは独立に記したが、両者は一体で用いられるため、以下ではキャップ11はパッキン12を含むものとして説明する。 Packing 12 consists flat donut-like silicon rubber, has been noted independently of the cap 11 in the figure, since both are used in integral cap 11 in the following will be described as including a packing 12.

下部ユニット20の構成概略は以下の通りである。 Configuration outline of the lower unit 20 is as follows. 21は容器本体、22は容器底部、23はネジ部である。 21 container body 22 is the container bottom 23 is threaded portion. 容器底部22は容器本体21の内側面の一部であり、ネジ部23は容器本体21の外側面の一部である。 Container bottom portion 22 is a portion of the inner surface of the container body 21, the threaded portion 23 is a portion of the outer surface of the container body 21. 従って、本実施例では下部ユニット20は容器本体21と同義である。 Thus, in this embodiment the lower unit 20 has the same meaning as the container body 21. なおネジ部23(雄ねじ)に対応する雌ねじがキャップ11の内側に形成されているが、その図番は省略した。 Incidentally internal thread corresponding to the threaded portion 23 (male screw) is formed inside the cap 11, but the drawing number is omitted.

ちなみに凍結デバイス1の上部ユニット10から液収納部13を除いたキャップ部と、下部ユニット20(即ち容器本体21)は、従来技術によるクライオチューブのキャップと容器本体にそれぞれ対応する。 Incidentally the cap portion from the upper unit 10 of the freezing device 1 except the liquid storing portion 13, the lower unit 20 (i.e. the container main body 21), the prior art corresponding to the cap and the container body of the cryo tube by. 従来のクライオチューブのキャップを以下従来のキャップ11'と記す(不図示)。 The cap of conventional cryotubes hereinafter referred to as conventional cap 11 '(not shown). 従って、本実施例による凍結デバイス1は、従来のクライオチューブを元に、液収納部13をキャップ部分に新たに設けた構成を採用したということもできる。 Therefore, freezing device 1 according to this embodiment, based on the conventional cryotubes, it is also possible that employing the configuration newly provided the liquid storage portion 13 to the cap portion.

本実施例において好適に用いられる撹拌遠心機について説明する。 It is described suitably agitated centrifuge used in the present embodiment. 本実施例では撹拌遠心機として、(株)日伸理化製の撹拌遠心機NSD−12Jを使用した。 As stirrer centrifuge in this example was used, Ltd. Nissin Rika stirrer centrifuge NSD-12 J. この装置は12個(複数)の容器を保持可能な容器ホルダを有し、遠心動作と、撹拌動作の両方の機能を有する。 This device has 12 container holder capable of holding the container (s), with a centrifugal operation, both the stirring operation of the function. 標準の容器ホルダは2mLの遠沈管に対応するが、凍結デバイス1の下部ユニット外径に適合する容器ホルダ穴を有する特注の容器ホルダを用いることにより、凍結デバイス1を容器ホルダ穴に収納して使用した。 Although standard container holder corresponds to the centrifuge tubes 2 mL, by using a custom container holder having a compatible container holder hole in the lower unit OD freezing device 1, it houses a freezing device 1 to the container holder hole used. この撹拌遠心機は容器ホルダを固定ネジにより装置本体に固定する。 The stirrer centrifuge is fixed to the apparatus body by a fixing screw of the container holder. 固定ネジを取り外せば容器ホルダも取り外し可能であるが、固定ネジの取り外しには手間と時間がかかる。 Although the container holder by removing the fixing screw is also removable, it is troublesome and time for removal of the fixing screw. そこで本実施例ではこの製品における容器ホルダの固定機構を改良し、容器ホルダを瞬時に取り外し可能なワンタッチ脱着機構を新たに開発して採用した。 In this embodiment improves the fixing mechanism of the container holder in the product, was adopted container holder a one-touch detachable mechanism removable instantaneously newly developed.

図3は、本実施例における撹拌遠心機の容器ホルダのワンタッチ脱着機構の断面の模式図である。 Figure 3 is a schematic sectional view of a one-touch detachment mechanism of the container holder stirrer centrifuge according to this embodiment. 100は容器ホルダ、110は固定具、120はCリング、 130と140はナットである。 100 container holder, 110 fixture 120 C rings, 130 and 140 is a nut. 図4は、本実施例で採用した撹拌遠心機の容器ホルダ100の形状概略を示す上面図である。 Figure 4 is a top view showing the shape outline of the container holder 100 of the stirrer centrifuge employed in this embodiment. 101は容器用穴、102はセンター穴、103は容器ホルダ穴である。 101 holes container, 102 center hole, 103 is a container holder hole.

よって、本実施例の凍結保存システムは、凍結デバイス1を保持する容器ホルダ100と、容器ホルダ100を回転運動及び偏心円運動をさせる駆動装置となる攪拌遠心機、を有し、容器ホルダ100は、容器ホルダ100の周縁において前記供給手段(液収容部13、ノズル13a)の出力側を容器ホルダ100の外周側に向けた状態で凍結デバイス1を保持し、前記駆動装置は、容器ホルダ100を回転運動させ、凍結デバイス1に発生する遠心力により前記供給手段から前記凍結液を出力して前記試料に供給するともに、容器ホルダ100を偏心円運動させ、前記試料と前記凍結液を攪拌して前記試料を前記凍結液に懸濁し、容器ホルダ100は、前記駆動装置から着脱自在であって、凍結用冷媒に浸漬可能である構成を有する。 Therefore, cryopreservation system of this embodiment includes a container holder 100 for holding the frozen device 1 has a stirrer centrifuge, comprising a drive device for the rotary movement and an eccentric circular movement of the container holder 100, the container holder 100 , the supply means (liquid storage portion 13, a nozzle 13a) at the periphery of the container holder 100 holding the freezing device 1 an output side being directed to the outer peripheral side of the container holder 100, the drive apparatus, the container holder 100 rotate movement, both supplied from said supply means by a centrifugal force generated in freezing device 1 to the sample and outputs the freezing liquid, the container holder 100 is eccentric circular motion, by stirring the frozen liquid and the sample suspending the sample in the frozen liquid, the container holder 100 is a detachable from said driving unit, has a configuration which is immersible in freezing refrigerant.

次に実施例1に基づく凍結デバイスを用いた凍結保存システムの動作の概略を説明する。 Then the outline of the operation of the cryopreservation system is described using a freezing device according to the first embodiment. 図5は、本実施例の動作を模式的に示すフローチャートである。 Figure 5 is a flow chart schematically showing the operation of this embodiment. ステップ1001は準備工程、ステップ1002は遠心工程、ステップ1003は撹拌工程、ステップ1004は液体窒素等の凍結用冷媒への浸漬工程である。 Step 1001 preparatory step, step 1002 is centrifugation step, step 1003 stirring step, the step 1004 is a dipping process to freezing refrigerant such as liquid nitrogen. 本発明による凍結デバイスの動作の概略は、準備工程(ステップ1001)において凍結デバイス1の下部ユニット20の容器底部22に細胞等のペレットを収納し、凍結液を液収納部13に収納し、上部ユニット10を下部ユニット20にはめ込むことにより凍結デバイス1を密栓状態とし、それを撹拌遠心機の容器ホルダ100に設置した。 Outline of the operation of the freezing device according to the invention, the cell pellet or the like accommodated in the container bottom 22 of the lower unit 20 of the freezing device 1 in the preparation process (step 1001), housing the freeze liquid to the liquid storage portion 13, an upper frozen device 1 and sealed state by fitting the unit 10 to the lower unit 20, which was placed in a container holder 100 of the stirrer centrifuge. 遠心工程(ステップ1002)において撹拌遠心機の遠心動作により、凍結液に対し遠心加速度を作用させることにより、非接触で(換言すると凍結液や細胞などを直接操作することなく)、凍結液を液収納部13から容器底部22に落下させた。 By centrifugation operation of stirring the centrifuge in centrifugation step (step 1002), by the action of centrifugal acceleration to freezing solution, (without operating the freeze liquid and cells directly in other words) in a non-contact, liquid-freezing liquid It was dropped from the housing 13 to the container bottom 22. 撹拌工程(ステップ1003)において撹拌遠心機の撹拌動作により、細胞等のペレットを凍結液と混合して懸濁した。 The stirring operation of the stirring centrifuge at stirring step (step 1003), the pellet was suspended in the cell such as by mixing with freezing solution. 液体窒素への浸漬工程(ステップ1004)において容器ホルダごと凍結デバイス1を撹拌遠心機からワンタッチで取り外し、液体窒素浴に浸漬して細胞等を凍結した。 In the immersing step in liquid nitrogen (step 1004) Remove one-touch freezing device 1 each container holder from stirrer centrifuge and frozen immersed in a cell such as a liquid nitrogen bath.

次に実施例1の凍結デバイスを用いた凍結保存システムについて詳細に説明する。 Then freezing device of Example 1 will be described in detail cryopreservation system using.
事前準備として、まず撹拌遠心機NSD−12Jの遠心調節つまみ(Spindown)を5.3メモリ、撹拌調節つまみ(Speed)を7.5メモリに設定し、容器ホルダ100を撹拌遠心機に設置し、容器ホルダ100にバランス容器(細胞や凍結液を入れていない新品の凍結デバイス1など)を、定法に従って適宜設置した。 As advance preparation, firstly stirred centrifuge NSD-12 J centrifugal adjustment knob (SpinDown) 5.3 memory, set stirring adjusted knob (Speed) 7.5 memory, set up a container holder 100 to the stirring centrifuge, the balance container into the container holder 100 (such as a freezing device 1 a new have not been put cells and freezing solution) were appropriately placed in accordance with a conventional method. また撹拌遠心機のそばに液体窒素浴を準備した。 The prepared liquid nitrogen bath near the stirrer centrifuge. 遠心調節つまみ5.3メモリは、回転数にして約2400rpm、遠心力換算で約400xgの条件に相当する。 Centrifugal adjustment knob 5.3 memory is about 2400rpm in the rotational speed, which corresponds to the condition of approximately 400xg in centrifugal force terms. また撹拌調節つまみ(Vortex)は偏心円運動の回転数にして約1200rpmに相当する。 The stirring adjustment knob (Vortex) corresponds to approximately 1200rpm in the rotational speed of the eccentric circular movement.

準備工程(ステップ1001)の第1手順として、凍結デバイス1から上部ユニット10を取り外し、代わりに従来のキャップ11'を用いて、細胞等のペレットを得た。 As a first procedure of preparation process (step 1001), remove the upper unit 10 from freezing device 1, using a conventional cap 11 'instead, to obtain pellets of the cells. 具体的には、凍結デバイス1の下部ユニット20に細胞等の懸濁液を収納し、従来のキャップ11'により密栓し、遠心分離機に設置して170xgの遠心力により5分間遠心分離を行い、キャップ11'を外し、上清を概ね除去した。 More specifically, the lower unit 20 of the freezing device 1 of a suspension of cells, such as houses, and sealed by conventional cap 11 ', and centrifuged for 5 minutes by a centrifugal force of 170xg to mounted on the centrifugal separator , remove the cap 11 ', it was roughly the supernatant removed. キャップ11'により密栓し、再度1分間遠心分離を行い、キャップ11'を外し、上清を完全に除去することにより、下部ユニット20の容器底部22に細胞等のペレットを得た。 Cap 11 'and sealed by, and centrifuged for 1 minute again, the cap 11' disconnect, by completely removing the supernatant to obtain a pellet of cells such as container bottom 22 of the lower unit 20. なお下部ユニット20は使用開始前に4℃に冷却しておき、遠心分離工程に冷却遠心機を4℃に設定して使用し、上清除去操作や操作完了後の保管を4℃に設定した電子冷却プレート等の上で行うことにより、細胞等を保冷したまま操作することが好ましい。 Note the lower unit 20 is allowed to cool to 4 ° C. prior to the start of use, set and use refrigerated centrifuge in the centrifugal separation step 4 ° C., was set storage after supernatant removal operation and operation completion 4 ° C. by performing on such electronic cooling plate, it is preferred to operate while cold the cells.

準備工程(ステップ1001)の第2手順として、凍結液を液収納部13に収納した。 As a second procedure of preparation process (step 1001), and stored frozen liquid to the liquid storage portion 13. 第2手順は第1手順の遠心分離を行っている間に実行可能である。 The second procedure is feasible while performing centrifugation first procedure. 具体的には前記第1手順で取り外した上部ユニット10の液収納部13に、凍結液(リプロセル社製霊長類ES細胞用凍結液)200マイクロリットルを、開口部14を通して微量分注ピペッターを用いて注入した。 The liquid storage portion 13 of the upper unit 10 is specifically removed in the first procedure, freezing solution (ReproCELL Co. primate ES cell freezing solution) 200 microliters using microdispensing pipetter through the opening 14 It was injected Te. 注入の際は開口部14が鉛直上向きとなるように上部ユニット10の中心軸を水平に保持した。 During injection opening 14 holds the central axis of the upper unit 10 horizontally so that the vertically upward. また液収納部13先端の毛細管状のノズル部13aの内部に気泡と凍結液とをピペッターを用いて交互に注入した。 The injected alternately using pipettor and bubble freeze liquid inside the liquid storage portion 13 tip of capillary of the nozzle portion 13a.

次に、凍結液を収納した液収納部13について、液漏れの確認試験を行った。 Next, the liquid storage unit 13 housing a freezing solution, was confirmed test liquid leakage. 液漏れとは凍結液が遠心工程以前に液収納部13から落下することを指す。 The leakage refers to freeze liquid drops from the liquid storage portion 13 previously centrifugation step. 液漏れの確認試験には、凍結液を液収納部13に収納した上部ユニット10を、細胞等のペレットを収納したものとは別の(空の)下部ユニット20の上に、キャップ11が鉛直上向きに、ノズル13aが鉛直下向きになるようにかぶせてはめ込み、密栓動作の繰り返しや、軽い振動を加えたり、放置などしても、凍結液が液収納部13の先端のノズル13aから下部ユニット20へ落下しないことを確認した。 The confirmation test for leakage, the upper unit 10 housing a freezing liquid to the liquid storage portion 13, on the other (empty) lower unit 20 from those stored pellets of cells, etc., the cap 11 is vertically upward, fitted covered so that the nozzle 13a is vertically downward, repeated or sealed operation, light vibrate or make, even if such left, lower unit freezing liquid from the tip of the nozzle 13a of the liquid storing portion 13 20 it was confirmed that not fall to.

上記方法で凍結液を収納した液収納部13を準備すると、ほとんどの個体は液漏れを起こさなかった。 When preparing a liquid accommodating portion 13 accommodating the frozen solution in the above process, most of the individuals did not cause leakage. これはノズル13aが毛細管状であって表面張力により凍結液を保持可能であることや、毛細管の内部に気液が交互に存在する状況や、先端内部に充填されている充填剤15、などの相乗効果によって、表面張力や通液抵抗が高い状況が達成され、凍結液が重力等により落下することを防止できたと考えられる。 This and that nozzle 13a is capable of holding the capillary in a by freeze liquid by surface tension, conditions and present alternately liquid inside the capillary, filler 15, such as being filled with the tip a synergistic effect, the surface tension and resistance to fluid passage is achieved a high status, considered freezing liquid is possible to prevent the falling by gravity or the like. ノズル13aの毛細管径をより狭くし、充填剤15として石英ウールよりも表面積の大きい微粒子状の充填剤、あるいは微粒子を焼結して作成した目皿状の充填剤を用いる、などの方法により液の流通抵抗を上昇させることにより、毛細管の内部に気液を交互に形成しなくても、凍結液の落下を防止できる。 More narrowly the capillary diameter of the nozzle 13a, using quartz large particulate filler surface area than wool or perforated plate-like filler to create the fine particles by sintering as a filler 15, the liquid by a method such as by increasing the flow resistance of, even without forming alternately liquid inside the capillary can be prevented from falling frozen liquid.

なお極めて低い確率で液漏れを起こす個体があったが、それら不良品はこの確認工程で排除し、確認試験をパスした良品のみを次の工程に使用した。 Although there is an individual to cause leakage at an extremely low probability, they defective eliminated with this confirmation process, using only non-defective passed the verification test in the next step. もちろん確認試験と良品の選別を製造工程の途中で行うことにより、準備工程における確認試験は省略できる。 By performing the screening of the confirmation test and good in the course of the manufacturing process, of course, confirmed in the preparation step test can be omitted. 本実施例では凍結液を液収納部13に収納する際に開口部14を通して注入する方式を例にとって説明したが、凍結液は液収納部13の先端のノズル部から微量分注ピペッターで(先が太いピペットチップを用いて)注入することもできる。 In the present embodiment has been described as an example a method of injecting through the opening 14 in housing the freeze liquid to the liquid storage portion 13, freezing solution (earlier in microdispensing pipettor from the nozzle portion of the distal end of the liquid storage portion 13 it is also possible that using a thick pipette tip) is injected. この場合は開口部14の位置は図2における上方、即ち液収納部13のキャップ11との接続部により近い位置に設けることが出来る。 In this case, the position of the opening 14 can be provided at a position near the upper, i.e. the connection between the cap 11 of the liquid storage portion 13 in FIG. 2. この場合、液収納部13の長さは短縮可能である。 In this case, the length of the liquid storing portion 13 can be shortened. 極端な例としては、開口部14は液収納部13側面の貫通孔としてではなく、液収納部13の(キャップ11との接続部における)切り込みとしても形成可能である。 As an extreme example, the opening 14 is not a through-hole of the liquid storage portion 13 side, it is also possible to form a notch in the liquid storage portion 13 (the connecting portion of the cap 11).

準備工程(ステップ1001)の第3手順として、上記第1手順で準備した細胞ペレットを収納する下部ユニット20の上に、第2手順で準備した上部ユニット10をはめ込み、密栓して、凍結デバイス1を得て、それを撹拌遠心機の容器ホルダ100に設置し、撹拌遠心機のフタを閉じた。 A third procedure of preparation process (step 1001), on the lower unit 20 for accommodating the cell pellets prepared in the first procedure, snap the upper unit 10 prepared in the second step, and sealed, frozen device 1 It was obtained, and placed it in a container holder 100 of the stirrer centrifuge, closed lid of the stirring centrifuge. この凍結デバイス1の内部には、細胞等のペレットが容器底部22に収納され、また凍結液が液収納部13に収納され、両者は互いに独立の区画に存在する。 Inside the freezing device 1 is housed in the pellet container bottom 22 of the cell, etc., and is housed in freezing solution liquid storage portion 13, both present in the compartments of one another. 換言するとここまでの準備工程において凍結液と細胞等は互いに接触も混合もしていない。 Frozen liquid and cells, and the like are not even mixed even contact with each other in the preparation steps up to here other words. 従ってここまではクリティカルな工程時間にはカウントされないため、時間的制約を受けずに操作できる。 Thus far because it is not counted in the critical process time, it can be operated without being time constraints.

次に、遠心工程(ステップ1002)において、撹拌遠心機の遠心スイッチ(Spindown)を1秒間入れ、その後スイッチを切って、3秒間放置した。 Then, in the centrifugation step (step 1002), placed in a centrifugal switch stirrer centrifuge (SpinDown) 1 seconds and then switched off and allowed to stand for 3 seconds. このとき供給手段(液収納部13、ノズル13a)の出力側(ノズル13a側)が容器ホルダ100の外周側を向く配置となっている。 At this time supply unit (liquid storage portion 13, a nozzle 13a) output of the (nozzle 13a side) is a arranged facing the outer periphery of the container holder 100. 400xgで1秒間の遠心動作により、凍結デバイス1内の液収納部13に収納した凍結液は遠心力によりノズル13bから出力して容器底部22に落下し、細胞等のペレットと接触した。 By centrifugation operation for one second at 400 x g, frozen liquid housed in the liquid housing portion 13 of the freezing device 1 is dropped to the bottom of the container 22 and outputs from the nozzle 13b by centrifugal force, in contact with the cell pellet and the like. 従って、本実施例においてはクリティカルな工程時間のカウントは、この時点から始まる。 Therefore, the count of the critical process time in this embodiment begins this time. ここで遠心調節つまみのメモリは所定の遠心力が得られるよう、容器の数等に応じて適宜選択可能である。 Here centrifugation adjustment knob of the memory so that the predetermined centrifugal force can be obtained, can be appropriately selected according to the number of containers. また、本実施例では遠心動作終了後、回転がほぼ停止するまでの待ち時間として3秒を採用したため、本工程時間は4秒である。 Also, after centrifugation operation is completed in this embodiment, since the rotation is almost adopted three seconds as the waiting time until the vehicle stops, the process time is 4 seconds.

次に、撹拌工程(ステップ1003)において、撹拌遠心機の撹拌スイッチ(Vortex)を2秒間入れ、その後スイッチを切った。 Then, in the stirring step (step 1003), stirred switch stirring centrifuge (Vortex) placed 2 seconds, then switched off. また撹拌動作の間に、撹拌遠心機のふたを開けた。 Also during stirring operation, he opened the lid of the stirring centrifuge. 2秒間の撹拌動作により、凍結液が細胞等のペレットと混合し、細胞等の懸濁液を得た。 The stirring operation of two seconds, frozen liquid is mixed with pellets of cells, etc., to obtain a suspension of cells. 本工程時間は2秒である。 This process time is 2 seconds.

次に、液体窒素への浸漬工程(ステップ1004)において、凍結デバイス1を容器ホルダ100ごと撹拌遠心機から取り外し、液体窒素浴まで移動し、液体窒素浴に浸漬した。 Then, in the immersing step in liquid nitrogen (step 1004), remove the frozen device 1 from the container holder 100 by stirring centrifuge, it moved to a liquid nitrogen bath and immersed in a liquid nitrogen bath. これにより、細胞等を瞬間的に凍結した。 Thus it was momentarily frozen cells. 前述の通り、本実施例では容器ホルダ100をワンタッチで脱着可能な機構を用いたため、容器ホルダ100は瞬時に撹拌遠心機から取り外せる。 As described above, in the present embodiment for a container holder 100 using the detachable mechanism with one-touch, the container holder 100 is removed from the instantaneously stirred centrifuge. 本工程(液体窒素に浸漬するまで)の時間は約2秒である。 Time of this step (to immersion in liquid nitrogen) is about 2 seconds. 以下、このワンタッチ脱着機構の詳細な構造と動作を説明する。 Hereinafter, a detailed structure and operation of the one-touch detachable mechanism.

固定具110の断面は凸状であり、横長の下部と縦長の上部は一体に形成され、上部側面には雄ねじが形成されている。 Section of the fixture 110 is convex, the lower the elongated upper part of the landscape is integrally formed, the male screw is formed on the upper side surface. 固定具110は撹拌遠心機の遠心機構と連結しており、図3の垂直方向の中心線を中心に固定具110ごと回転する。 Fixture 110 is connected to the centrifugal mechanism of the stirrer centrifuge, rotates each fastener 110 about a vertical center line of Figure 3. また撹拌遠心機の遠心機構は撹拌機構と連結しており、固定具110を偏心円運動させる。 The centrifugal mechanism of the stirring centrifuge is connected to the stirring mechanism, it is decentered circular fixture 110. 固定具110に設けられた容器ホルダー用ボス(不図示)は容器ホルダ穴103にかん合する。 Boss container holder provided in a fixture 110 (not shown) is mated to the container holder hole 103. またCリング120はナット130、140により固定具110上部の中心軸の周囲に固定される。 The C-ring 120 is secured around the central axis of the fixture 110 the upper by a nut 130 and 140. Cリング120の下部斜面は、容器ホルダ100のセンター穴102の上縁と圧接するため、容器ホルダ100は固定具110に固定される。 Lower slopes of the C-ring 120 to edge and pressed over the center hole 102 of the container holder 100, the container holder 100 is fixed to the fixture 110. 従って固定具110の回転や偏心円運動は容器ホルダ100に伝達され、容器ホルダ100の容器用穴101に収納した容器に対し、遠心や、撹拌の作用を及ぼす。 Thus rotation and eccentric circular movement of the fastener 110 is transmitted to the container holder 100, to the container housed in the container hole 101 of the container holder 100, it exerts a centrifugal or, the effect of agitation.

ちなみに図3の状態で撹拌遠心機あるいは固定具110の上部を固定した上で、容器ホルダ100を上方に引き上げる力を加えると、Cリング120が縮んで、容器ホルダ100のセンター穴102はCリング120の周囲を滑り抜けて、容器ホルダ100は固定具110から外れる。 Incidentally the top of the stirrer centrifuge or fixture 110 on which is fixed in a state of FIG. 3, when a force pulling the container holder 100 upward, shrinks C-ring 120, center hole 102 of the container holder 100 is C-ring and slip through the periphery of 120, the container holder 100 is disengaged from the fixture 110. 即ち容器ホルダ100は撹拌遠心機からワンタッチで脱着可能である。 That container holder 100 is detachable with one touch from stirrer centrifuge. 逆に、容器ホルダ100を撹拌遠心機の固定具110とCリング120の間に押し込むことにより、ワンタッチで撹拌遠心機に装着可能である。 Conversely, by pushing the container holder 100 between the fixture 110 and the C-ring 120 of the stirrer centrifuge can be inserted into the one-touch a stirred centrifuge.

本実施例では容器ホルダ100を撹拌遠心機からワンタッチで脱着可能とするための機構部品としてCリング120を用いたが、この目的に利用可能な機構はCリング方式に限定されない。 Was used C-ring 120 as a mechanism part for detachable with one touch the container holder 100 from stirrer centrifuge in this embodiment, mechanisms available for this purpose is not limited to C-ring scheme. 他の採用可能な機構の例としては、弾性体で形成したツメを用いる方式に代表される、光学式ディスクを軸に固定する目的で使用される各種の方式、電磁チャック方式、エアバルーンチャック方式、電磁石や永久磁石などの磁力により容器ホルダを固定具に着脱自在に固定する方式、Oリング方式、などがある。 Examples of other adoptable mechanisms, typified by the method using a pawl which is formed of an elastic body, various methods that are used for the purpose of fixing the optical disc to the shaft, an electromagnetic chuck type, air balloon chuck system , a method of removably fixing a fixture of the container holder by a magnetic force, such as an electromagnet or a permanent magnet, O ring method, and the like. これら各種の方式を採用することにより、容器ホルダ100を撹拌遠心機からワンタッチで脱着可能とすることができる。 By employing these various methods can be detachable with one touch the container holder 100 from stirrer centrifuge.

本実施例で採用した容器ホルダ100は図4に示したとおり容器用穴101を12個備える。 Container holder 100 employed in this embodiment comprises twelve container hole 101 as shown in FIG. 従って、上記準備工程(ステップ1001)において、複数の(最大12の)試料についてそれぞれ独立の凍結デバイス1を準備し、それぞれを1つの容器ホルダに設置することができる。 Therefore, in the preparing step (step 1001), it is possible to respectively prepare the frozen device 1 independently for a plurality of (up to 12) samples are placed each into one container holder. また遠心工程(ステップ1002)、撹拌工程(ステップ1003)、液体窒素への浸漬工程(ステップ1004)はいずれも容器ホルダ100を単位として行うため、これら複数試料を一括操作可能である。 The centrifugation step (step 1002), stirring step (step 1003), the immersion process (step 1004) to the liquid nitrogen for performing units of both container holder 100, is a plurality samples simultaneously operational. 即ち、本実施例ではクリティカルな工程について複数試料を一括処理可能である。 That is, it is possible to collectively process multiple samples for critical steps in the present embodiment. より多くの容器用穴101を備える容器ホルダ100を採用することにより、一括処理可能な試料数を12以上に増やすことが可能である。 By employing the container holder 100 with more container hole 101, it is possible to increase the batch number of possible samples to 12 or more. 撹拌遠心機としてより大型のものを採用することにより、同時処理可能な試料数をさらに増やすことも可能である。 By employing those from large as stirrer centrifuge, it is possible to further increase the concurrency possible number of samples.

本実施例におけるクリティカルな工程の時間、即ち凍結液と細胞等が互いに接触してから液体窒素に浸漬されるまでの時間は、ステップ1002からステップ1004までの時間の合計、即ち約8秒である。 Time critical step in the present embodiment, i.e., the time until freezing liquid and cells and the like are immersed from in contact with each other in liquid nitrogen, total time from step 1002 to step 1004, or about 8 seconds . つまり、従来例に記載されているクリティカルな工程時間の目安である15秒の約半分であるため、細胞への悪影響が少ない。 That is, because, less adverse effect on the cells is about half of 15 seconds is a measure of the critical process time described in the prior examples. また、本実施例におけるクリティカルな工程の操作は、スイッチ2つの操作と、ふた開け、容器ホルダのワンタッチ取り外しと、液体窒素浴への投入という単純な操作だけであり、熟練や注意は不要で、失敗のリスクもほとんど無いため、オペレータの負担が少なく、細胞への悪影響のリスクも低い。 Moreover, critical steps of the operation in this embodiment is a switch of two operations, open cover, and one-touch removal of the container holder, only simple operation of introduction into the liquid nitrogen bath, skilled and careful not required, for risk of failure is also very little, less operator of the burden, even a low risk of adverse effects on the cells.

本実施例では毛細管状のノズル13aや充填剤15の表面張力により凍結液を保持したが、他の原理を用いて凍結液を保持することも可能である。 Holding the frozen liquid by the surface tension of the capillary nozzle 13a and the filler 15 in the present embodiment, it is possible to hold the frozen solution using other principles. 例えば、弾性体で支持した弁(不図示)をノズル13aに設け、通常は弁(不図示)が閉じた状態とし、強い遠心加速度が作用した場合のみ弁(不図示)が開いて凍結液が落下する構成を採用することも可能である。 For example, provided a valve which is supported by an elastic member (not shown) to the nozzle 13a, usually a state in which the valve (not shown) is closed, a strong if the centrifugal acceleration acts only valve (not shown) is frozen liquid open it is also possible to adopt a configuration in which falling.

本実施例の効果について、細胞を用いて評価した。 The effect of this example was evaluated using a cell. 細胞として接着性のヒトセルライン(HT−29)をATCCのプロトコルに従って培養し、播種4日後に剥離、回収した細胞200万個を実験材料として使用した。 Adhesion of human cells line (HT-29) were cultured according to ATCC protocol as cells were used seeded four days after the release, the recovered cells 2 million as experimental materials. それを本実施例あるいは第2の従来例のいずれかの方法で凍結した。 It was frozen in any of the methods of the present embodiment or the second conventional example. これらの凍結細胞を第2の従来例の10頁に記載の方法により解凍し、細胞の生細胞率を評価した。 These frozen cells were thawed according to the method described in page 10 of the second conventional example was evaluated cell viability of the cell. 結果の一例を図6に示す。 An example of the results is shown in FIG. ちなみに実験に用いた細胞は、剥離回収後、培地中に氷温で約6時間保冷したものであり、実験に供する直前の生細胞率は98.3%であった。 By the way, cells used in the experiment, after peeling the recovery, which was approximately 6 hours cold at ice temperature in the medium, cell viability immediately before subjected to the experiment was 98.3%. 本発明方法による凍結実験は3回行い、うち後二者は複数試料を同時に凍結処理した。 Freezing experiments according to the method of the present invention was performed three times, two parties latter of froze processing multiple samples simultaneously. 図6から明らかなとおり、いずれの試料についても、解凍後の生細胞率は従来法と同等以上であった。 As apparent from FIG. 6, for any of the samples, cell viability after thawing were conventional method equal to or higher than. 同様の実験を複数回繰り返したが、いずれの場合も同様の結果が得られた(不図示)。 Was repeated a plurality of times the same experiment, similar results in both cases were obtained (not shown). 本発明方法によって凍結した細胞は解凍後の生細胞率が高いことから、本発明方法は細胞に対する悪影響が少なく、信頼性が高い方法であることが確認された。 Cells were frozen by the method of the present invention from that higher cell viability after thawing, the method of the present invention has less adverse effect on the cells, it was confirmed higher reliability methods. この理由は、本発明のクリティカル工程時間が約8秒と、従来法の約半分であるため、常温において毒性の高い凍結液の影響を受けにくいためと考えられる。 This is because the critical process time of the present invention is about 8 seconds, since about half of the conventional method, presumably because less susceptible to highly toxic freezing liquid at room temperature.

従って、本実施例は、従来よりも短時間かつ簡便な操作で、複数試料について同時に、高い信頼性をもって、凍結を行えるという特有の効果がある。 The present embodiments are, therefore, a short time than conventional a simple operation, at the same time for multiple samples, with high reliability, there is a unique advantageous effect that allows the freezing.
なお、本実施例では撹拌遠心機に標準で付属する容器ホルダ100を用いたが、本発明の目的のためにやや異なる形状の容器ホルダを製作して用いることも可能である。 In the present embodiment was used container holder 100 that comes standard with stirring centrifuge, it can be used to fabricate a slightly different container holder shaped for the purposes of the present invention. この第1の変形例による容器ホルダ100'の断面概略図を図7に示す。 It shows a cross-sectional schematic view of a container holder 100 'according to the first modification in FIG. 図示の通り、容器ホルダ100'は実施例1の容器ホルダ100と類似であるが、容器を保持する部分の傾斜が急であり、容器を水平に近い角度で保持する点が異なる。 As shown, the container holder 100 'is similar to the container holder 100 of the first embodiment, a steep slope of the portion holding the container, that holds the container in a horizontal angle close differ. また凍結デバイス1のキャップ11に、開口部14の位置を示すマークを付記した点も異なる。 The cap 11 of the freezing device 1, even points are indicated by the mark indicating the position of the opening 14 varies.

本変形例を用いる場合の動作は実施例1と概ね同等であるが、以下の点が異なる。 Operation in the case of using the present modification is a substantially same as in Example 1, the following points are different. まず準備工程(ステップ1001)の第2手順において、凍結デバイス1の液収納部13に凍結液を収納する際、液収納部13先端の毛細管状のノズル部の内部に気泡と凍結液とを交互に注入する工程を省略した。 Alternately first second procedure of preparation process (step 1001), when receiving a freeze liquid to the liquid storage portion 13 of the freezing device 1, the interior of the capillary of the nozzle portion of the liquid storage portion 13 tip and a bubble freeze liquid omit the step of injecting into. また凍結液を液収納部13に収納後、開口部14が鉛直上向き、換言すると上部ユニット10の中心軸を水平に保持したままとした(液漏れの確認試験を行わなかった)。 Also after storing the freeze liquid to the liquid storage portion 13, the opening 14 (not carried out confirmatory test leakage) vertically upward, in other words a central axis of the upper unit 10 and remains held horizontally. 次に準備工程(ステップ1001)の第3手順において、上記第2手順で準備した(凍結液入りの)上部ユニット10を、第1手順で準備した(細胞ペレット入りの)下部ユニット20をはめ込んで密栓して、凍結デバイス1を得て、それを撹拌遠心機の容器ホルダ100'に設置した。 In a third procedure of the next preparation step (step 1001), prepared in the second procedure (frozen liquid containing) the upper unit 10, prepared in the first procedure (the cell pellet containing) Fit the lower unit 20 and sealed to obtain a freeze device 1 was placed it into the container holder 100 'of the stirring centrifuge. この間、開口部14が常に鉛直上向きとなるように姿勢を維持した。 During this period, maintaining the orientation such that the opening 14 is always vertically upward. 即ち凍結デバイス1中に凍結液を入れた後に、先端ノズル部は水平に維持され、鉛直下向きを向くことが無いため、凍結液が液漏れを起こす虞がない。 I.e. after putting the frozen solution during freezing device 1, the tip nozzle portion is maintained horizontally, because never facing vertically downward, freezing solution is no possibility to cause liquid leakage.

本変形例特有の効果は、凍結液が液漏れを起こす虞がないため、凍結デバイス1の液収納部13、特にその先端のノズル13aの形状の尤度が高く、作成が容易であることと、凍結液を収納する際に、ノズル13aの内部に気泡と凍結液とを交互に注入する必要が無いため、操作が簡便であることである。 And that this modification specific effect, since freezing liquid there is no possibility of causing leakage, freezing device 1 of the liquid storage portion 13, particularly high likelihood of the shape of the nozzle 13a at the tip, it is easy to create , when receiving a freeze liquid, there is no need to inject alternately inside the bubble and freezing liquid nozzle 13a, is that the operation is simple.

第2の変形例として、容器ホルダとしてスイングローター式の容器ホルダを用いることも可能である。 As a second modification, it is also possible to use the container holder swing rotor type as the container holder. 特にスイングローターとして、回転前においては、図8(a)に概念的に示す様に、容器を概ね水平に保持可能な初期状態に設定できるものを採用することが好ましい。 Particularly a swing rotor, before rotation, as shown conceptually in FIG. 8 (a), it is preferable to adopt those which can be set containers generally horizontal holdable initial state. このスイングローターは、回転時には図8(b)に概念的に示す様に、遠心力により通常のスイングローターの状態に遷移する。 The swing rotor, the as conceptually shown in FIG. 8 (b) during rotation, a transition to a state of normal swing rotor by centrifugal force. 即ち容器を保持する部分が遠心力と重力加速度との兼ね合いで自由な角度を取る。 That portion holding the container take any angle in view of the centrifugal force and the gravitational acceleration. 本第2の変形例は第1の変形例同様、先端ノズル部の表面張力や通液抵抗が少ない液収納部13を有する凍結デバイス1と組み合わせることが可能である。 Modification of the second can be combined with the freezing device 1 having a first variant similar, the tip nozzle portion of the surface tension and the resistance to fluid passage is less liquid housing portion 13. さらに、図8(b)の状態では凍結液の落下に重力加速度を用いることが出来るため、遠心を極めて短時間行うだけでよい(図8(a)から同(b)の状態に遷移させるだけでよい)、という特有の効果がある。 Furthermore, since it is possible to use the gravitational acceleration to fall frozen solution in the state in FIG. 8 (b), only shifts to the state of the (b) from centrifugation need only perform a very short time (see FIG. 8 (a) in may), there is a peculiar effect that.

よって本実施例に係る凍結保存方法及び凍結デバイスによれば、第1には、凍結デバイス1内において試料と凍結液が分離され、それぞれ独立に収納が可能である。 Therefore, according to cryopreservation and freeze device according to the present embodiment, the first, frozen liquid and sample are separated in the freezing device 1, it is possible to independently housed. すなわち、凍結デバイスに凍結液を注入する工程と、凍結デバイスに収納された試料に凍結液を供給する工程とが分離される。 That is, a step of injecting a freezing liquid to freezing device, and supplying the frozen solution stored in the freezing device sample are separated. そして、非接触操作により凍結液が試料に供給されるため、従来技術で述べた(i)、(ii)の工程を自動的、連続的に処理することができる。 Since the freezing solution by non-contact operation is supplied to the sample, described in the prior art (i), it can be processed in the step of automatically, continuously (ii). なお本実施例では凍結デバイス1だけを用いて細胞等と凍結液の混合、分散、凍結を一貫して行うため、本発明では従来技術で述べた工程(iii)に相当する移し替え工程を省略することができる。 Incidentally mixture of frozen liquid and cells, etc. using only freezing device 1 in the present embodiment, dispersion, in order to perform freeze consistently omitted sorting process in the present invention which corresponds to the step (iii) described in the prior art can do. したがって、作業者が凍結液をピペット等で試料に供給する作業等を行う必要がなく、懸濁液の凍結保存までの時間を短縮できるのみならず、その時間のムラも抑制することができるので、試料へのダメージを安定的に抑制することができる。 Thus, the worker does not need to perform such tasks supplied to the sample freezing liquid with a pipette or the like, not only can reduce the time to cryopreservation of the suspension, it is possible to also suppress unevenness of the time , it is possible to stably suppress the damage to the sample.

第2には、供給手段(液収納部13、ノズル13a)は凍結デバイス1の蓋である上部ユニット10に一体で形成されたため、供給手段を容器から離した状態で凍結液を収納することができる。 The second supply means (liquid storage portion 13, a nozzle 13a) because that is formed integrally with the upper unit 10 is a lid of freezing device 1, able to house the frozen solution in a state of releasing the feeding means from the container it can. そして、容器である下部ユニット20の密栓工程が、細胞等と凍結液とが互いに接触する以前に完了しているため、従来技術で述べた工程(iv)に相当する容器の密栓工程を、クリティカルな工程の時間カウント外とし、作業効率を向上させることができる。 The sealed process of the lower unit 20 is a container, since the completed before the cells or the like and the frozen liquid are in contact with each other, the sealed process vessel that corresponds to the step (iv) described in the prior art, the critical a time count out of a process, it is possible to improve work efficiency. そして、供給手段は中空の管である液収納部13とその先端に形成されたノズル13aからなるが、供給手段に加速度、具体的には遠心力を印加することで凍結液を試料に供給することができるので、遠心分離器等の簡易な装置に搭載して人為的作業を伴うことなく容易に凍結液を試料に供給することができる。 The supply means may consist of a nozzle 13a formed in its front end a liquid storage portion 13 is a hollow tube, supplying frozen liquid sample by acceleration, in particular to apply a centrifugal force to the feed means it is possible, easily frozen solution without human work mounted on a simple device such as a centrifuge can be supplied to the sample.

第3には、中空の管である液供給部13またはノズル13aにメッシュ状の充填剤15を充填することで、凍結液の通液抵抗を増加させて、非接触操作前においてノズルから凍結液が漏れることを防止することができる。 Third, by filling the mesh filler 15 to the liquid supply section 13 or the nozzle 13a is a hollow tube, increasing the resistance to fluid passage of the frozen solution, freeze liquid from the nozzle before the non-contact operation it is possible to prevent the leakage.

また本実施例の凍結デバイスを用いた凍結保存システムによれば、遠心に代表される非接触の操作により凍結液を細胞等へ添加する工程(従来技術の(i)に相当する)を実現し、また偏心円運動に代表される非接触の操作により細胞等を凍結液に懸濁する工程(同(ii)に相当する)を実現することができる。 According to cryopreservation system using a freezing device of the present embodiment, to realize the step of adding the frozen solution into cells or the like by the operation of contactless typified by centrifugation (corresponding to (i) of the prior art) , also it is possible to realize a step of suspending the cells or the like to frozen liquid by the operation of the contactless typified by an eccentric circular motion (corresponding to the (ii)). また凍結保存システムを構成する容器ホルダ100は凍結デバイス1を複数保持可能であるので、作業効率を向上させるとともに、各凍結デバイス1において試料と凍結液との懸濁液が同時に形成されるため、作業ムラも抑制することができる。 Since the container holder 100 constituting the cryopreservation system can hold multiple freezing device 1, thereby improving the working efficiency, since the suspension of the sample and the frozen liquid in the freezing device 1 is formed at the same time, work unevenness can also be suppressed. そして容器ホルダ100は駆動装置から着脱自在であるので、懸濁後速やかに容器ホルダ100ごと凍結デバイスを凍結用冷媒に浸漬することができるので作業効率を向上させることができる。 The container holder 100 is because it is detachable from the drive unit, it is possible to improve work efficiency since it is possible to immerse the rapidly freezing device each container holder 100 was suspended in freezing refrigerant.

実施例2による凍結デバイス及び凍結保存システムの構成は実施例1と類似であるが、撹拌遠心機として、遠心動作終了後に機械的にブレーキをかける機構を有するものを採用し、遠心後の待ち時間を短縮した点と、撹拌工程における撹拌強度設定を高めて撹拌時間を短縮した点、撹拌遠心機の動作をPLC(ロジックコントローラ)で制御することにより、操作を自動化した点などが異なる。 Although the configuration of the freezing device and cryopreservation system according to a second embodiment which is similar to Example 1, as a stirrer centrifuge adopted what has a mechanism for applying the mechanical brake after centrifugation operation completion, the waiting time after centrifugation and a point having a shortened, that was shorter stirring time by increasing the stirring intensity set in stirring step, by controlling the operation of the stirrer centrifuge at PLC (logic controller), and a point where the automated operation different.

具体的には、撹拌遠心機NSD-12Jのカバー部分を改造し、容器ホルダに対してスポンジなどの弾性体を押しつけることができる電動のブレーキ機構を設けた。 Specifically, remodeled cover part of the stirrer centrifuge NSD-12 J, provided the electric brake mechanism which can be pressed against the elastic member such as sponge with respect to the container holder. 従来は遠心後容器ホルダが概ね停止するまでに約3秒の待ち時間が必要であったが、遠心動作終了後に電動ブレーキを作動させることにより、容器ホルダの回転は1秒以内に停止した。 Conventionally, after centrifugation container holder it was generally require a delay of approximately 3 seconds before stopping, by operating the electric brake after centrifugation operation completion, the rotation of the container holder stopped within one second. また、撹拌遠心機の遠心スイッチ、撹拌スイッチ、電動ブレーキのスイッチをPLCに配線し、撹拌遠心機の動作をPLCにより自動制御するシーケンスを組むことにより、起動スイッチ一つで、遠心工程(ブレーキ動作を含む)と撹拌工程を全自動で実行可能とした。 Further, the centrifugal switch stirrer centrifuge stirred switch, wire a switch of the electric brake PLC, by Crossed sequence the operation of the stirrer centrifuge automatically controlled by PLC, the startup switch one, centrifugation step (brake operation the the included) and stirring step and executable by full automation.

事前準備の段階において、撹拌調節つまみ(Speed)をMAXメモリに設定して使用した。 In the stage of preliminary preparation it was used to set stirring adjusted knob (Speed) the MAX memory.
遠心工程(ステップ1002)において、遠心動作終了後に電動ブレーキをかけることにより、容器ホルダが概ね停止するまでの待ち時間を約1秒に短縮し、工程時間を2秒とした。 In centrifugation step (step 1002), by applying the electric brake after centrifugation operation completion, and reduce the waiting time until the container holder is generally stopped in about 1 second, and the process time and 2 seconds.
撹拌工程(ステップ1003)において、撹拌を1秒間とした。 In stirring step (step 1003), it was stirred for 1 second.
それ以外は実施例1と同様の構成と手順を採用した。 Otherwise it employs the same configuration as the procedures as in Example 1.

本実施例ではクリティカルな工程時間は合計5秒である。 Critical process time in this embodiment is a total of 5 seconds. これは従来例の1/3であり、従来よりもクリティカルな工程時間が極めて短いため、細胞への悪影響が極めて少なく、また時間的な余裕があり、起動スイッチ1つの操作だけで撹拌までの工程が完了するため、操作者の負担も少ない、という特有の効果がある。 This is a 1/3 of the conventional example, since a very short critical process time than the conventional, very little adverse effect on the cells and there is enough time, steps up stirring only start switch one operation to but complete, less burden on the operator, there is a peculiar effect that.

なお本実施例では撹拌遠心機としてNSD−12Jを改造して使用する例を説明したが、他の撹拌遠心機、例えばBiosan社MSC−3000を用いることもできる。 In the present embodiment has been described an example of using by modifying NSD-12 J as stirrer centrifuge, other stirrer centrifuge, for example can also be used Biosan company MSC-3000. MSC−3000が装備するブレーキは強力なためか遠心後容器ホルダが概ね停止するまでの時間が短い。 Brake equipped the MSC-3000 is short time until the stop generally strong after centrifugation container holder or for. また遠心と撹拌の動作をプログラム可能であるため、PLCを外付けすることなしに自動化が可能である。 Since programmable operation of agitation and centrifugation, it is possible to automate without connecting an external PLC. 本発明に使用可能な撹拌遠心機はNSD−12Jに限定されず、市販の各種の装置を目的に応じて選定したり、改造して使用することができる。 Stirrer centrifuge that can be used in the present invention is not limited to NSD-12 J, or selected according to the purpose of the various commercially available apparatus can be used to remodel.

実施例3による凍結デバイス及び凍結保存システムの構成は実施例1と類似であるが、液収納部13の構造が異なり、それに付随して凍結液を細胞に落下させる機構が異なる。 Although the configuration of the freezing device and cryopreservation system according to Example 3 is similar to example 1, unlike the structure of the liquid storage portion 13, the mechanism for dropping the frozen solution in the cell is different Concomitantly.

実施例3において、供給手段は、凍結液を収納する中空の管である液収納部13と、管の先端に強磁性体で形成された第2のノズル13bと、第2のノズル13bに吸着され、第2のノズル13bを封止する磁石の小球16と、を有し、非接触操作は、磁石の小球16が第2のノズル13bから離脱する磁場を印加して第2のノズル13bの封止を解除することにより第2のノズル13bから凍結液を出力する操作である。 In Example 3, the supply means includes a liquid storage portion 13 is a hollow tube housing the freeze liquid, and a second nozzle 13b formed of ferromagnetic material on the tip of the tube, adsorbed on the second nozzle 13b is, globules 16 of the magnet for sealing the second nozzle 13b, has a non-contact operation, the second nozzle by applying a magnetic field globules 16 of the magnet is released from the second nozzle 13b by releasing the 13b sealing of an operation for outputting a frozen liquid from the second nozzle 13b.

具体的には、本実施例で採用した凍結デバイス1bは、図9に模式的に示すとおり、上部ユニット10bの構成要素である液収納部13先端の毛細管状のノズル13bが、テフロン(登録商標)で被覆したニッケル等の強磁性体で形成され、また新規構成要素として、ノズルの先端に、テフロン(登録商標)で被覆した磁石の小球16を有する。 Specifically, freezing device 1b employed in the present embodiment, as shown schematically in Figure 9, a capillary nozzle 13b of the liquid storing portion 13 tip is a component of the upper unit 10b is, Teflon (registered trademark ) in the form of a ferromagnetic material such as nickel coated, also as a new component, the tip of the nozzle, with small balls 16 of the magnet coated with Teflon. また、図10上部に模式的に示すとおり、容器ホルダ30を設けた。 Further, as shown schematically in FIG. 10 the top, provided with a container holder 30. 容器ホルダ30は、凍結デバイス1bを収納可能な窪みを有する収納部32と、強力なアルニコ磁石により形成された第2の磁石31を有する側壁部33とから構成される。 Container holder 30 is composed of a freezing device 1b and the housing portion 32 having a recess capable of accommodating a side wall 33 having a second magnet 31 which is formed by a strong alnico magnet. 図10下部((a)、(b))に模式的に示すとおり、収納部32と側壁部33は互いに着脱自在であり、側壁部33が内蔵する第2の磁石31は凍結デバイス1bの小球16に対向する位置に設置される。 10 lower ((a), (b)) as shown schematically in, housing portion 32 and the side wall portion 33 is detachable from each other, a second magnet 31 which incorporates side wall portion 33 is small freezing device 1b It is placed at a position facing the ball 16. また本実施例では撹拌遠心機ではなく、遠心機構を持たない単なる撹拌装置を第2の駆動装置として用いた。 Further instead of a stirrer centrifuge in this embodiment, a mere stirring apparatus having no centrifugal mechanism as a second driving device.

実施例3の動作の概略は第3の実施例と同様であるが、以下の点が異なる。 Although an outline of the operation of the third embodiment are the same as in the third embodiment, the following points are different. 磁石の小球16は磁力によりノズル13b(ニッケル)に吸着し、ノズル13bの先端を封止するため、凍結デバイス1bの液収納部13に凍結液を収納する際、液漏れを起こすことがない。 Globules 16 of the magnet is attracted to the nozzle 13b (nickel) by magnetic force, for sealing the tip of the nozzle 13b, when receiving a freeze liquid to the liquid storage portion 13 of the freezing device 1b, it does not cause liquid leakage . 本実施例では遠心工程(ステップ1002)の代わりである凍結液添加工程(ステップ1002')において、予め凍結デバイス1bを(側壁部33を外した)容器ホルダ30の収納部32に設置した(図10(a))。 In centrifugation step in the present embodiment, instead a is frozen solution addition step (step 1002) (step 1002 '), was placed in advance freezing device 1b (removing the side wall portion 33) in the housing portion 32 of the container holder 30 (FIG. 10 (a)). 次に容器ホルダ30の側壁部33を、収納部32に着合した。 Then the side wall portion 33 of the container holder 30, was Chakugoshi the housing section 32.

すると、第2の磁石31の作用により、磁石の小球16は液収納部13先端のノズルから離脱し、容器ホルダ30の第2の磁石31近傍の容器本体21の壁面に吸着する(図10(b))。 Then, by the action of the second magnet 31, small balls 16 of the magnet detached from the nozzles of the liquid storage portion 13 tip, adsorbed on the wall surface of the second magnet 31 near the container body 21 of the container holder 30 (FIG. 10 (b)). ノズル13bの先端を封止する磁石の小球16が無くなったため、液収納部13から凍結液が細胞に落下する。 Since the globules 16 of the magnet for sealing the tip of the nozzle 13b is exhausted, frozen liquid drops into the cell from the liquid storage unit 13. 撹拌工程(ステップ1003')において、凍結デバイス1bを容器ホルダ30ごと撹拌装置により撹拌した。 In stirring step (step 1003 '), and the frozen device 1b stirred by the container holder 30 by a stirring device. 最後に、液体窒素への浸漬工程(ステップ1004')において、凍結デバイス1bを容器ホルダ30ごと液体窒素浴まで移動し、液体窒素浴に浸漬した。 Finally, in the immersing step in liquid nitrogen (step 1004 '), to move the frozen device 1b to each container holder 30 liquid nitrogen bath and immersed in a liquid nitrogen bath. なお図9には容器ホルダ30としてひとつの凍結デバイス1bを収納するものを例示したが、複数の凍結デバイス1bを収納可能な複数の窪みを有する収納部と、複数の第2の磁石31を有する側壁部とを組み合わせて用いることも可能である。 Although exemplified ones for housing one freezing device 1b as the container holder 30 in FIG. 9, has a housing portion having a plurality of recesses capable of housing a plurality of freezing devices 1b, a plurality of second magnet 31 it is also possible to use in combination with the side wall portion. この構成により多数の凍結デバイス1bを同時に並行処理することが可能となる。 Be simultaneously processed in parallel multiple freezing device 1b This configuration allows.

本実施例は、磁力を契機として、非接触で、凍結液の保持と落下を制御する。 This embodiment, in response to force, in a non-contact, to control the fall and freezing liquid retention. 従って、遠心機構が不要であり、また液漏れの不具合を起こしにくい、という特有の効果がある。 Therefore, the centrifugal mechanism is unnecessary, and less prone to failure of liquid leakage, there is a peculiar effect that.

また本実施例に係る凍結デバイス及び凍結保存システムによれば、磁力により第2のノズル13bの封止を解除することができるので、第2のノズル13bの内径を大きくすることができ、凍結液の試料への供給を短時間で行うことが可能となり、凍結保存までの時間をより短縮することができる。 According to the freezing device and cryopreservation system according to the present embodiment, it is possible to release the sealing of the second nozzle 13b by the magnetic force, it is possible to increase the inner diameter of the second nozzle 13b, frozen liquid the supply to the sample becomes possible to perform in a short time, it is possible to further reduce the time to cryopreservation. そして実施例1と同様に、容器ホルダ100は第2の駆動装置から着脱自在であるので、懸濁後速やかに容器ホルダ100ごと凍結デバイスを凍結用冷媒に浸漬することができ、作業効率を向上させることができる。 And in the same manner as in Example 1, the container holder 100 is removable from the second driving device, can be dipped quickly frozen devices each container holder 100 was suspended in freezing refrigerant, improving working efficiency it can be. また容器ホルダ100は凍結デバイス1を複数保持可能であるので、作業効率を向上させるとともに、各凍結デバイス1において試料と凍結液との懸濁液が同時に形成されるため、作業ムラも抑制することができる。 Since the container holder 100 can hold multiple freezing device 1, thereby improving the working efficiency, since the suspension of the sample and the frozen liquid in the freezing device 1 are formed at the same time, also be suppressed work uneven can.

実施例4による凍結デバイスの構成は実施例1と類似であるが、液収納部13の構造が異なる。 Although the structure of the freezing device according to Embodiment 4 is similar to Example 1, it is different from the structure of the liquid storage portion 13. 実施例4において凍結デバイス1cは、開口部を有する容器となる下部ユニット20cと、前記開口部を密栓可能な蓋となる上部ユニット10cを有し、供給手段は、上部ユニット10c側が開口し前記下部ユニット20cに挿入されて、下部ユニット20cの内壁に当接して下部ユニット20cに保持され、開口部側から凍結液を注入可能な中間ユニット40と、中間ユニット40の挿入側に形成された出力孔となる第2のノズル13dと、第2のノズル13dを封止するように形成され、凍結液を保持するとともに被接触操作により凍結液を下部ユニット20cに出力する第2の充填剤15cを有するとともに、非接触操作は、凍結液が第2の充填剤15cを介してノズル13dから出力する加速度を印加する操作である。 Freezing device 1c in Example 4 has a lower unit 20c comprising a container having an opening, the upper unit 10c to be sealed can lid the opening, feeding means, said lower open upper unit 10c side is inserted into the unit 20c, held by the lower unit 20c in contact with the inner wall of the lower unit 20c, an intermediate unit 40 can be injected frozen liquid from the opening side, an output hole formed in the insertion side of the intermediate unit 40 It is formed so as to seal the second nozzle 13d comprising, a second nozzle 13d, a second filler 15c for outputting a frozen liquid in the lower unit 20c by the touch operation holds the frozen solution together with the non-contact operation is to apply an acceleration freezing liquid is outputted from the nozzle 13d via the second filler 15c. このように、凍結液を上部ユニット10c及び下部ユニット20cとは分離し上部ユニット10c側が開口した中間ユニット40を下部ユニット20cに挿入する構成とすることにより凍結液の供給手段への注入が容易になり作業効率が向上する。 Thus, frozen liquid upper unit 10c and the lower unit 20c and be easily injected into the supply means of freezing liquid with the configuration for inserting the intermediate unit 40 in which the upper unit 10c side is open and separated into the lower unit 20c is will work efficiency is improved.

図11は、本実施例による凍結デバイス1cを構成する、上部ユニット10c、中間ユニット40、下部ユニット20cの断面の模式図である。 Figure 11 constitutes a freezing device 1c according to this embodiment, the upper unit 10c, the intermediate unit 40 is a schematic sectional view of a lower unit 20c. 上部ユニット10cは、実施例1におけるキャップ11(パッキン12を含む)と同等である。 Upper unit 10c is the same as the cap 11 in the first embodiment (including the packing 12). 中間ユニット40は実施例1における液収納部13cに対応するが、中空管の下部の先端には毛細菅状のノズル部の代わりにより口径の大きなノズル13dを有する点、第2の充填剤15cとして石英ウールの代わりに目皿を有する点、開口部14(図2参照)を持たない点、中間ユニット40がキャップ(上部ユニット10c)とは独立に構成され、下部ユニット20cに着脱自在に装着される点、管の内壁に翼状に形成したツマミ17を有する点、などが異なる。 The intermediate unit 40 corresponds to the liquid accommodating portion 13c in the first embodiment, a point at the bottom of the tip of the hollow tube with a large nozzle 13d caliber by instead of capillary Kan-like nozzle portion, the second filler 15c that it has a perforated plate instead of quartz wool as a point having no openings 14 (see FIG. 2), the intermediate unit 40 is configured independently of the cap (upper unit 10c), detachably mounted on the lower unit 20c is the point, that it has a tab 17 formed on the wing on the inner wall of the tube, and the like differ. 下部ユニット20cは突起24を備える点以外は実施例1のそれと同等である。 Lower unit 20c, except that it includes a protrusion 24 which is equivalent to that of Example 1.

実施例4の動作の概略は実施例1と類似である。 Outline of an operation of the fourth embodiment is similar to Example 1. 準備工程(ステップ1001)において凍結デバイス1cの下部ユニット20cの容器底部22に細胞等のペレットを収納した後、中間ユニット40を下部ユニット20cに収納した(図12下)。 Preparation step after storing pellets such as cells in the container bottom 22 of the lower unit 20c of the freezing device 1c (Step 1001), housing the intermediate unit 40 in the lower unit 20c (FIG. 12 below). ここで中間ユニット40は突起24により支持されるため、容器底部22には落下しない。 Here the intermediate unit 40 is to be supported by the projections 24, it does not fall to the bottom of the container 22. 液収納部13cの上部の開口部から凍結液を内部(目皿の上)に注入し、(中間ユニット40を収納した)下部ユニット20cに上部ユニット10をはめ込むことにより凍結デバイス1cを密栓状態とし、それを撹拌遠心機の容器ホルダに設置した。 Injecting a frozen liquid from the top of the opening of the liquid accommodating portion 13c in the interior (above the perforated plate), the frozen device 1c and sealed state by fitting the upper unit 10 (the housing the intermediate unit 40) lower unit 20c It was placed it into the container holder of the stirring centrifuge. 遠心工程以降の動作は実施例1と同様である。 Centrifugation step subsequent operation is the same as in Example 1. なお解凍時には上部ユニット10cを緩めて外した後、ツマミ17を(滅菌済みの)ピンセットなどで保持して引き上げることにより、下部ユニット20cから中間ユニット40を引き抜き、容器底部22に凍結細胞を収納する下部ユニット20cを得た上で、解凍操作を行った。 Note After Unscrew the upper unit 10c at the time of thawing, by pulling the tab 17 held in such (sterile) tweezers, pulling the intermediate unit 40 from the lower unit 20c, for accommodating the frozen cells on the bottom of the container 22 upon obtaining lower unit 20c, it was thawed operation.

上部ユニット10cと下部ユニット20cは予め組み合わせて(図13(a))一対の梱包とし、また中間ユニット40はそれに外接する円筒41、ピストン42と組み合わせて(図13(b))梱包し、両方の梱包ともにガンマ線などにより滅菌した上で、使用者に提供することができる。 Upper unit 10c and the lower unit 20c is combined in advance (FIG. 13 (a)) the pair of packaging, also cylindrical 41 intermediate unit 40 is circumscribed thereto, in combination with piston 42 (FIG. 13 (b)) packed, both packing both in terms of sterilized by gamma rays, may be provided to the user. この場合、準備工程の詳細は下記のとおりとなる。 In this case, the details of the preparation process becomes as follows. まず、準備工程の第1手順において、上部と下部のユニットの組み合わせを用いて細胞ペレットを下部のユニット20cに形成する。 First, in the first procedure of preparing process, to form a cell pellet at the bottom of the unit 20c using a combination of units of the top and bottom. 準備工程の第2手順において、ピストン42を用いて円筒41から中間ユニット40を下部ユニット20cに無菌的に圧入する(図13(c))。 In the second procedure of preparation process, aseptically press fitting the intermediate unit 40 in the lower unit 20c from the cylindrical 41 with piston 42 (FIG. 13 (c)). 以下、凍結液の収納以降の手順は前述のとおりである。 Hereinafter, steps after the storage of frozen liquid are as described above.

充填剤15cとして用いた目皿にはポリスチレンの微粒子を焼結して平板状に形成した物を使用した。 The perforated plate was used as a filler 15c was used a material obtained by forming fine particles of polystyrene and sintered into a flat plate. 目皿の材質、空隙率、断面積、厚みなどは任意に選択することが可能である。 Perforated plate material, porosity, cross sectional area, such as thickness may be arbitrarily selected. 適切な選択により、準備工程では凍結液が液漏れしない、かつ、遠心工程では凍結液が迅速に落下する、という2つの条件を両立することができる。 By appropriate selection, freezing liquid dripless the preparation step, and freezing liquid to quickly fall in a centrifugal process, that it is possible to achieve both the two conditions.

本実施例では、液収納部13を中間ユニット40として、上部ユニット10cとは独立に形成したが、本実施例における中間ユニット40と類似の形状を有する液収納部を、上部ユニットと一体に形成することも可能である。 In this embodiment, form a liquid accommodating portion 13 as an intermediate unit 40 has formed independently of the upper unit 10c, a liquid containing portion having an intermediate unit 40 a similar shape in the present embodiment, the upper unit and integral it is also possible to.

本実施例は液収納部13cに毛細菅状のノズル部や貫通孔、石英ウールを用いないため、構造が簡単、作製が容易、コストが低い、という特有の効果がある。 This embodiment is not used capillary Kan-like nozzle portion and the through-hole in the liquid storage portion 13c, quartz wool, structure simple, easy, cost is low, there is a unique effect that the manufacturing. 凍結液は口径の大きい液収納部13cの上部開口部から注入すれば良いため、開口部14(図2参照)を通して注入する必要がなく、また毛細菅に気泡と凍結液とを交互に注入する必要もないため、操作性が高いという特有の効果がある。 Freezing liquid for may be injected from the upper opening of a large liquid storage portion 13c of the bore, there is no need to inject through the opening 14 (see FIG. 2), also injects a bubble freeze liquid alternately capillary Kan because need not be, there is a specific effect of high operability.

本発明を適用することにより、細胞や組織などを急速凍結する際、クリティカルな工程時間を短縮し、操作を簡略化、自動化し、オペレータの負担を軽減でき、また操作の失敗や、細胞等への悪影響のリスクを低減でき、さらに複数試料を同時に処理可能とし、効率を向上できる、という特長がある。 By applying the present invention, when rapidly frozen cells or tissues, etc., to shorten the critical process time, simplifying the operation, automated, can reduce the burden on the operator, also fail and operation, to the cell, etc. of can reduce the risk of adverse effects, further at the same time able to process multiple samples, can improve the efficiency, there is a feature that. 従って、本発明による細胞凍結デバイス及び方法を用いることにより、細胞や組織を低コストかつ高品質に維持できる、という産業上の利用可能性がある。 Accordingly, by using the frozen cell device and method according to the present invention can maintain the cells and tissues at low cost and high quality, there is industrial applicability that.

1………凍結デバイス、1b………凍結デバイス、1c………凍結デバイス、10………上部ユニット、10b………上部ユニット、10c………上部ユニット、11………キャップ、11'………従来のキャップ、12………パッキン、13………液収納部、13a………ノズル、13b………ノズル、13c………液収納部、13d………第2のノズル、14………開口部、15………充填剤、15c………第2の充填剤、16………磁石の小球、17………ツマミ、20………下部ユニット、20a………開口部、20c………下部ユニット、21………容器本体、22………容器底部、23………ネジ部、24………突起、30………容器ホルダ、31………第2の磁石、32………収納部、33………側壁部、40………中間ユニッ 1 ......... freezing device, 1b ......... freezing device, 1c ......... freezing device, 10 ......... upper unit, 10b ......... upper unit, 10c ......... upper unit, 11 ......... cap, 11 ' ......... conventional cap, 12 ......... packing, 13 ......... liquid storage portion, 13a ......... nozzles, 13b ......... nozzle, 13c ......... liquid storage portion, 13d ......... second nozzle, 14 ......... opening 15 ......... fillers, 15c ......... second filler, 16 ......... globules magnet 17 ......... knob, 20 ......... lower unit, 20a ......... opening, 20c ......... lower unit, 21 ......... container body 22 ......... container bottom, 23 ......... threaded portion 24 ......... projections 30 ......... container holder, 31 ......... second magnets, 32 ......... housing portion, 33 ......... sidewall section, 40 ......... intermediate unit ト、41………円筒、42………ピストン、100………容器ホルダ、101………容器用穴、102………センター穴、103………容器ホルダ穴、110………固定具、120………Cリング、130………ナット、140………ナット、ステップ1001………準備工程、ステップ1002………遠心工程、ステップ1003………攪拌工程、ステップ1004………液体窒素への浸漬工程。 DOO, 41 ......... cylinder, 42 ......... piston, 100 ......... container holder, 101 ......... container hole, 102 ......... center hole, 103 ......... container holder hole 110 ......... fixture , 120 ......... C-ring, 130 ......... nut, 140 ......... nut, step 1001 ......... preparation step, step 1002 ......... centrifugation step, step 1003 ......... stirring step, step 1004 ......... liquid immersion step to the nitrogen.

Claims (9)

  1. 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結保存方法であって、 The suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a cryopreservation method for cryopreservation,
    前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画を有する凍結デバイスを形成し、 A first compartment for containing said sample, to form a frozen device having a second compartment for housing the freeze liquid,
    前記第1区画と前記第2区画との境界を、 前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に形成され表面張力により前記凍結液を保持可能なノズルと、を有し、前記凍結液が前記ノズルから出力する加速度を前記凍結デバイスに印加する操作である非接触操作により前記第2区画に収納した凍結液を第1区画に収納した試料に供給可能な供給手段により形成し、 The boundary between the second compartment and the first compartment comprises a hollow tube for housing the freeze liquid, and a nozzle capable of holding the frozen liquid by surface tension are formed in the distal end of the tube, the frozen liquid formed by a non-contact operation by the supply means capable of supplying to the sample accommodating the frozen solution housed in the second compartment to the first compartment is in operation to apply an acceleration output from the nozzle to the freezing device,
    前記凍結デバイスに前記非接触操作を行い、前記凍結液を前記供給手段を介して前記試料に供給することを特徴とする凍結保存方法。 Wherein the freezing device performs non-contact operation, cryopreservation method the frozen liquid and supplying the sample through the feed means.
  2. 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結保存方法であって、 The suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a cryopreservation method for cryopreservation,
    前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画を有する凍結デバイスを形成し、 A first compartment for containing said sample, to form a frozen device having a second compartment for housing the freeze liquid,
    前記第1区画と前記第2区画との境界を、前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に強磁性体で形成された第2のノズルと、前記強磁性体により吸着され、前記第2のノズルを封止する磁石と、を有し、前記磁石が前記第2のノズルから離脱する磁場を印加して前記第2のノズルの封止を解除することにより前記第2のノズルから前記凍結液を出力する操作である非接触操作により前記第2区画に収納した凍結液を第1区画に収納した試料に供給可能な供給手段により形成し、 The boundary between the second compartment and the first compartment, a hollow tube housing the freeze liquid, and a second nozzle formed of ferromagnetic material on the tip of the tube, is adsorbed by the ferromagnetic the magnet for sealing the second nozzle has a said magnet is said second by releasing the seal of the second nozzle by applying a magnetic field to leave from the second nozzle the frozen solution was formed by non-contact operation by the supply means capable of supplying to the sample accommodating the frozen solution housed in the second compartment to the first compartment is in operation for outputting from the nozzle,
    前記凍結デバイスに前記非接触操作を行い、前記凍結液を前記供給手段を介して前記試料に供給することを特徴とする凍結保存方法。 Wherein the freezing device performs non-contact operation, cryopreservation method the frozen liquid and supplying the sample through the feed means.
  3. 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイスであって、 The suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a freezing device for cryopreservation,
    前記凍結デバイスは、 The freezing device,
    開口部を有する容器と、 A container having an opening,
    前記開口部を密栓可能な蓋と、 A lid capable sealed the opening,
    前記容器内を、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画と、に区画する境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有し、 The container, a first compartment for containing said sample, said forming a second compartment for containing the frozen liquid, the boundary that divides the a supply means for supplying to the sample by a non-contact operating the freezing liquid , has a,
    前記供給手段は、前記蓋に一体で形成されるとともに前記開口部から挿入可能で前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に形成され表面張力により前記凍結液を保持可能なノズルを有し、 It said supply means includes a hollow tube for housing the freeze liquid can be inserted through the opening while being formed integrally on the lid, a nozzle capable of holding the frozen liquid by surface tension are formed in the distal end of the tube have,
    前記非接触操作は、前記凍結液が前記ノズルから出力する加速度を印加する操作であることを特徴とする凍結デバイス。 The non-contact operation, freezing device, characterized in that the freezing liquid is operated to apply an acceleration output from the nozzle.
  4. 前記中空の管または前記ノズルには、メッシュ状の充填材が充填されたことを特徴とする請求項に記載の凍結デバイス。 Wherein the hollow tube or the nozzle, freezing device according to claim 3 in which a mesh-like filler, characterized in that it is filled.
  5. 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイスであって、 The suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a freezing device for cryopreservation,
    前記凍結デバイスは、 The freezing device,
    開口部を有する容器と、 A container having an opening,
    前記開口部を密栓可能な蓋と、 A lid capable sealed the opening,
    前記容器内を、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画と、に区画する境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有し、 The container, a first compartment for containing said sample, said forming a second compartment for containing the frozen liquid, the boundary that divides the a supply means for supplying to the sample by a non-contact operating the freezing liquid , has a,
    前記供給手段は、 It said supply means,
    前記蓋側が開口し前記容器に挿入されて、前記容器の内壁に当接して前記容器に保持され、前記開口部側から前記凍結液を注入可能な中間ユニットと、 The lid side is open is inserted into the container, in contact with the inner wall of the container held in the container, and injectable intermediate unit the frozen liquid from the opening side,
    前記中間ユニットの挿入側に形成された出力孔と、 An output hole formed in the insertion side of the intermediate unit,
    前記出力孔を封止するように形成され、前記凍結液を保持するとともに前記被接触操作により前記凍結液を前記容器に出力する第2の充填材を有するとともに、 Is formed so as to seal said output hole, and having a second sealing member that outputs the freezing liquid to the container by the contacted operator holds the frozen liquid,
    前記非接触操作は、前記凍結液が前記第2の充填材を介して前記出力孔から出力する加速度を印加する操作であることを特徴とする結デバイス。 The non-contact operation, freezing device, characterized in that the freezing liquid is operated to apply an acceleration output from the output port through the second filling material.
  6. 試料と前記試料用の凍結液との懸濁液を形成して前記懸濁液を凍結保存する凍結デバイスであって、 The suspension the suspension to form a freeze liquid for the the specimen sample a freezing device for cryopreservation,
    前記凍結デバイスは、 The freezing device,
    開口部を有する容器と、 A container having an opening,
    前記開口部を密栓可能な蓋と、 A lid capable sealed the opening,
    前記容器内を、前記試料を収納する第1区画と、前記凍結液を収納する第2区画と、に区画する境界を形成し、前記凍結液を非接触操作により前記試料に供給する供給手段と、を有し、 The container, a first compartment for containing said sample, said forming a second compartment for containing the frozen liquid, the boundary that divides the a supply means for supplying to the sample by a non-contact operating the freezing liquid , has a,
    前記供給手段は、前記凍結液を収納する中空の管と、前記管の先端に強磁性体で形成された第2のノズルと、前記強磁性体により吸引され、前記第2のノズルを封止する磁石と、を有し、 It said supply means includes a hollow tube for housing the freeze liquid, and a second nozzle formed of ferromagnetic material on the tip of the tube, is sucked by the ferromagnetic body encapsulating the second nozzle It has a magnet that, the,
    前記非接触操作は、前記磁石が前記第2のノズルから離脱する磁場を印加して前記第2のノズルの封止を解除することにより前記第2のノズルから前記凍結液を出力する操作であることを特徴とする結デバイス。 The non-touch operation is an operation for outputting the freeze liquid from the second nozzle by the magnet releases the sealing of the second of said second nozzle by applying a magnetic field leaves the nozzle freezing device, characterized in that.
  7. 請求項乃至5のいずれか1項に記載の前記凍結デバイスを用いた凍結保存システムであって、 A cryopreservation system using the freeze device according to any one of claims 3 to 5,
    前記凍結保存システムは、 The cryopreservation system,
    前記凍結デバイスを保持する容器ホルダと、 A container holder for holding the frozen device,
    前記容器ホルダを回転運動及び偏心円運動をさせる駆動装置と、を有し、 Anda driving device for the rotary movement and an eccentric circular movement the container holder,
    前記容器ホルダは、 Said container holder,
    前記容器ホルダの周縁において前記供給手段の出力側を前記容器ホルダの外周側に向けた状態で前記凍結デバイスを保持し、 The output side of the supply means at the periphery of the container holder to hold the frozen device in a state toward the outer peripheral side of the container holder,
    前記駆動装置は、 The driving device,
    前記容器ホルダを回転運動させ、前記凍結デバイスに発生する遠心力により前記供給手段から前記凍結液を出力して前記試料に供給するとともに、前記容器ホルダを偏心円運動させ、前記試料と前記凍結液を攪拌して前記試料を前記凍結液に懸濁し、 Wherein the container holder is rotational movement, and supplies to the sample and outputs the freeze liquid from said supply means by a centrifugal force generated in the freezing device, the container holder is eccentric circular movement, the frozen liquid and the sample the stirred to suspend the sample in the freezing liquid,
    前記容器ホルダは、 Said container holder,
    前記駆動装置から着脱自在であって、凍結用冷媒に浸漬可能であることを特徴とする凍結保存システム。 Cryopreservation system characterized in that a detachable from the drive unit, can be immersed in the freezing refrigerant.
  8. 請求項に記載の凍結デバイスを用いた凍結保存システムであって、 A cryopreservation system using a freezing device according to claim 6,
    前記凍結保存システムは、 The cryopreservation system,
    前記凍結デバイスを保持する容器ホルダと、 A container holder for holding the frozen device,
    前記容器ホルダに搭載され前記磁場を発生させる第2の磁石と、 A second magnet generating said magnetic field being mounted on said container holder,
    前記容器ホルダを偏心円運動させる第2の駆動装置と、を有し、 And a second driving device for eccentric circular movement the container holder,
    前記第2の磁石は、 Said second magnet,
    前記磁石を前記磁場により前記第2の磁石側に吸引し前記第2のノズルの封止を解除して前記凍結液を前記第2のノズルから出力して前記試料に前記凍結液を供給し、 The magnet and outputs the frozen solution was sucked into the side the second magnet to release the sealing of the second nozzle by said magnetic field from said second nozzle supplying the freezing liquid to the sample,
    前記第2の駆動装置は、 The second driving device,
    前記容器ホルダに偏心円運動させ、前記試料と前記凍結液を攪拌して前記試料を前記凍結液に懸濁させるとともに、 Made eccentric circular movement to the container holder, with suspending the sample in the frozen solution and stirring the frozen liquid and the sample,
    前記容器ホルダは、 Said container holder,
    前記第2の駆動装置から着脱自在であって、凍結用冷媒に浸漬可能であることを特徴とする凍結保存システム。 Cryopreservation system characterized in that a detachable from the second drive unit, which is immersible in freezing refrigerant.
  9. 前記容器ホルダは、前記凍結デバイスを複数保持可能であることを特徴とする請求項またはに記載の試料の凍結保存システム。 It said container holder, cryopreservation system of a sample according to claim 7 or 8, characterized in that the freezing device is more maintainable.
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