JP5598772B2

JP5598772B2 - 複屈折色彩ビーム整形装置を有する蛍光走査顕微鏡

Info

Publication number: JP5598772B2
Application number: JP2012511296A
Authority: JP
Inventors: ロイス，マティアス; エンゲルハート，ヨハン
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュングスツェントルムシュティフトゥングデスエッフェントリッヒェンレヒツ
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2010-05-20
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2030-05-20
Also published as: EP2433342B1; US20120104279A1; WO2010133678A1; EP2433342A1; JP2012527634A; US8586945B2; DE202009007250U1

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、（特許文献１）に対する優先権を主張する。

本発明は、蛍光走査顕微鏡に関する。より詳しくは、本発明は蛍光の自然放出に対して画像形成されるべきサンプル内のフルオロフォアを励起するための励起光のビーム、および、フルオロフォアによる蛍光の自然放出を抑制するための抑制光の成形ビームが、焦点のまわりの焦点体積部分に焦点合わせされ、抑制光のビームが、焦点で強度０を有する焦点のまわりで抑制光の強度分布を生成するために形状化され、および励起光のビームが焦点で最大を有する焦点のまわりで励起光の強度分布を生成する、および、検出器がフルオロフォアによって自発的に放出される蛍光を検出する、蛍光走査顕微鏡に関する。さらにより詳しくは、本発明はＳＴＥＤ顕微鏡に関する。

蛍光顕微鏡法は、細胞の内部の構造上の調査および機能的調査のための最も広範囲に用いられるツールの１つである。その人気は、それが光の波長の約半分（〜２００ナノメートル）より小さい構造を画像形成することに悪評のとおり失敗する、すなわちそれが、いわゆる回折障壁によって限定されるという事実にもかかわらず、着実に増大してきた。電子、Ｘ線および走査プローブ顕微鏡検査が実質的により良い空間分解能を提供するとはいえ、それらの全てが３次元（３Ｄ）で無傷のまたは生きていさえする細胞を画像形成するのに不十分である。１９９４年の誘導放出制御顕微鏡法（ＳＴＥＤ）の発明は、通常のレンズを用いて可視光線を焦点合わせする顕微鏡において、空間分解能に対する回折障壁が効果的に克服されることができるその時予想外の事実を目立たせた（非特許文献１，２）。ＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭおよび構造化照明のような他の回折限界以下の解像技法が、同様に出てきた（非特許文献３−５）。ＳＴＥＤ顕微鏡法は、生物学的および非生物学的サンプルに現在ナノメータスケール分解能（非特許文献６−８）を与えるとともに、３Ｄで細胞を非侵襲的に画像形成する能力のような、遠方場光学動作の大部分の利点を保つ（非特許文献９）。

走査ＳＴＥＤ顕微鏡法の原理が共焦顕微鏡のそれらに基づかないとはいえ、ＳＴＥＤは大きな効果に至るまで走査共焦顕微鏡で実現されることができる。このために、ドーナツ形状のＳＴＥＤビームと、走査（共焦）顕微鏡の集束励起ビームを重ね（非特許文献１０，１１）、その役割は、それらが励起フォトンにさらされる時でさえ、フルオロフォアを暗く保つことであり、および、それは上で参照される抑制光のビームの特定の変形である。ＳＴＥＤビームの波長および強度が潜在的に励起状態のフルオロフォアを誘導放出によってすぐに励起を止めるように調整されるのでフルオロフォアは暗いままである。従って、強度Ｉ＞３Ｉ_ＳのＳＴＥＤビームに従うフルオロフォアは実際的には基底状態に閉じ込められておよびそれゆえに、消される。これは、励起状態で時間を費やす分子の正規化確率が〜ｅｘｐ（−Ｉ／Ｉ_Ｓ）に従うという事実の結果であり、Ｉ_Ｓは分子の特性である。蛍光状態がＳＴＥＤビームの存在によって許されないのでＩ＞＞Ｉ_Ｓに従ういかなる分子も蛍光を発するその能力を奪われる。Ｉがドーナツの中央から外側にドーナツ冠まで増大するので、分子が消される確率はドーナツ冠で最も高い。ドーナツ中央に位置する分子は、蛍光性のままである。Ｉ＞３Ｉ_Ｓである中央から特定の距離で、事実上全ての分子（９５％）が消される。閾値３Ｉ_ＳがＳＴＥＤビームの全体的な強度を増大することによって中央の方へ動かされることができるので、フルオロフォアが、なお信号伝達が可能である領域はドーナツ最小の物理的幅よりはるかに下に、すなわち回折障壁よりはるかに下に減少されることができる。

具体的には、波長λおよび対物レンズの開口数ＮＡに対して、フルオロフォアが信号を送ることが可能であるスポットは、直径ｄ≒λ（２ＮＡ（１＋Ｉ_ｍ／Ｉ_ｓ）^１／２）を有する（非特許文献７，１２）。Ｉ_ｍは、ドーナツ冠でのＳＴＥＤビームの強度である。Ｉ_ｓは、通常１から１０ＭＷ／ｃｍ^２のオーダーである。ｄより更に離れているフルオロフォアの信号は時間順に記録されるので、２本の重ねられたビームを走査することはｄの空間分解能での構造を明らかにする。いくつかの現在の染料によって、ｄはしたがって、〜２０ナノメートルまで縮小されることができ（非特許文献６，７）、特定の種類の無機フルオロフォア（結晶色中心）に対して、５．８ナノメートルさえ報告されている（非特許文献８）。

ＳＴＥＤ顕微鏡を準備して動作させる際に重要なポイントは、ビーム位置合わせである。最大性能のために、ドーナツは偏移＜５０ナノメートルで、励起スポットで中央に置かれるべきである。さらに、ビーム位置合わせは測定および適切な視野にわたって安定しているべきである。これが原理的に障害でないとはいえ、標準多色共焦顕微鏡において、いくつかのビームが匹敵する精度で重畳されることを前提として、また、予め位置合わせされたビームを有することによって動作の安定性および容易さを改善することが望ましい。固有の位置合わせは、励起および制御ビームの両方に対して共通のレーザ光源を用いることによって達成されることができる。これは、２つの別々のレーザを共通光ファイバに連結することによって、または、さらにより都合の良いことに、超連続性光源を用いて達成されることができる（非特許文献１３）。しかしながら、予め位置合わせされたビームを有することは、それがドーナツを形成するような方法で、ＳＴＥＤ波長を処理すると共に、励起波長を、影響を受けないままに残すビーム整形装置を必要とする。現在のドーナツ形状化装置は、しかしながら渦位相マスクを用いて波長間を十分に区別することができない。それらはまた、励起ビームをドーナツに近い何かに作り上げ、したがって、予め結合されたビームを使用するのに適していない。（非特許文献１４）内に提案される解決策は、事前位置合わせされたビームの環状分離に依存するが、相当な量のＳＴＥＤ光を遮断する。（非特許文献１５）内に提唱される方法は、知りうる限り、今までのところ実践で実現されていない。

近年、Ｗｉｌｄａｎｇｅｒ他（非特許文献１６）が異なる光学材料の異なる分散特性に依存する方式を提唱した。その屈折率が励起波長でマッチするがＳＴＥＤ波長に対して異なる２つの光学ガラスを選ぶことによって、それらが、両方のビームによって共有されることができる位相板を設計することが可能であった。この方式では、しかしながら、検出ビーム経路はダイクロイックミラーを用いて対物レンズと位相板との間で外へ連結される。

一般に、ＳＴＥＤ顕微鏡法に関連する上にリストされる同じ点はさらにＧＳＤ（基底状態制御）顕微鏡法にもあてはまる。ＧＳＤ顕微鏡法では、抑制または制御光のビームが、フルオロフォアの基底状態を減少させ、それからフルオロフォアが例えば三重項状態であることができる暗状態に変えられるという点で、それが励起光によって蛍光に対して励起可能である。

（特許文献２）が、ＳＴＥＤおよびＧＳＤ顕微鏡法に用いられる光学系を提唱し、それが、２つの光学的に異なる光成分を投影空間に投影するための対物レンズ、および投影空間内の光成分の１つの強度分布が、それ自体との干渉に起因して、投影空間内の対応する他の光成分の強度分布、両方の光成分の波面、同じく、投影空間から放出され、かつ光学部品を通過する対物レンズによって集められる光とは異なるように、通過する光成分の１つの波面を選択的に変形させる光学部品を備える。２つの光成分は、波長および／または偏光で異なることができる。

ドイツ実用新案第２０２００９００７２５０号、名称「ＦｅｌｄｖｅｒａｎｄｅｒｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌｚｕｒＥｒｚｅｕｇｕｎｇｋｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｅｒＬｉｃｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔａｔｓｍｕｓｔｅｒ」、２００９年５月２０日出願、２００９年１１月１１日登録、国際特許出願公開ＷＯ２００８／１４５３７１Ａ２ＷＯ／２００６／１０８５２６ＷＯ２００９／０４７１８９Ａ１

Ｓ．Ｗ．ＨｅｌｌおよびＪ．Ｗｉｃｈｍａｎｎ「誘導放出：誘導−放出−制御蛍光顕微鏡法による回折解像限界の打破」Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．１９（１１），７８０−７８２（１９９４））Ｔ．Ａ．Ｋｌａｒ，Ｓ．Ｊａｋｏｂｓ，Ｍ．Ｄｙｂａ，Ａ．ＥｇｎｅｒおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「誘導放出によって打破された回折分解能障壁を伴う蛍光顕微鏡法」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１５），８２０６−８２１０（２０００）Ｅ．Ｂｅｔｚｉｇ，Ｇ．Ｈ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｓｏｕｇｒａｔ，Ｏ．Ｗ．Ｌｉｎｄｗａｓｓｅｒ，Ｓ．Ｏｌｅｎｙｃｈ，Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｍ．Ｗ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＨ．Ｆ．Ｈｅｓｓ「ナノメータ分解能での細胞内蛍光タンパク質の画像形成」Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３（５７９３），１６４２−１６４５（２００６）Ｍ．Ｊ．Ｒｕｓｔ，Ｍ．ＢａｔｅｓおよびＸ．Ｗ．Ｚｈｕａｎｇ「確率論的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）による回折限界以下の画像形成」Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ３（１０），７９３−７９５（２００６）Ｍ．Ｇ．Ｌ．Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ「構造化照明顕微鏡法を用いた横方向解像限界の２倍超越」Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１９８（Ｐｔ２），８２−８７（２０００）Ｇ．Ｄｏｎｎｅｒｔ，Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍｅｄｄａ，Ｍ．Ａ．Ａｎｄｒｅｉ，Ｓ．Ｏ．Ｒｉｚｚｏｌｉ，Ｒ．Ｌｕｅｈｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｊａｈｎ，Ｃ．ＥｇｇｅｌｉｎｇおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「生物学的蛍光顕微鏡法における高分子規模分解能」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３（３１），１１４４０−１１４４５（２００６）Ｖ．ＷｅｓｔｐｈａｌおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「光学顕微鏡の焦平面内のナノスケール分解能」、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．９４（１４），１４３９０３（２００５）Ｅ．Ｒｉｔｔｗｅｇｅｒ，Ｋ．Ｙ．Ｈａｎ，Ｓ．Ｅ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃ．ＥｇｇｅｌｉｎｇおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「Ｓｔｅｄ顕微鏡法がナノメートル分解能で結晶色中心を明らかにする」、Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ３（３），１４４−１４７（２００９）Ｄ．Ｗｉｌｄａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍｅｄｄａ，Ｌ．ＫａｓｔｒｕｐおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「３Ｄナノスケール分解能を与える小型ＳＴＥＤ顕微鏡」、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．２３６（１），３５−４３（２００９）Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「遠方場光学ナノスコピー」、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１６（５８２８），１１５３−１１５８（２００７）Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ａ．ＳｃｈｏｎｌｅおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「ＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡法の効率的蛍光阻害パターン」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１５（６），３３６１−３３７１（２００７）Ｂ．Ｈａｒｋｅ，Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｋ．ＵＩＩａＩ，Ｖ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ａ．ＳｃｈｏｎｌｅおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「ＳＴＥＤ顕微鏡法における分解能スケーリング」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１６（６），４１５４−４１６２（２００８）Ｄ．Ｗｉｌｄａｎｇｅｒ，Ｅ．Ｒｉｔｔｗｅｇｅｒ，Ｌ．ＫａｓｔｒｕｐおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「超連続性レーザ光源によるＳＴＥＤ顕微鏡法」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１６（１３），９６１４−９６２１（２００８）Ｎ．Ｂｏｋｏｒ，Ｙ．Ｉｋｅｔａｋｉ，Ｔ．ＷａｔａｎａｂｅおよびＭ．Ｆｕｊｉｉ「集積光学素子を用いた小型蛍光制御顕微鏡システム」、Ｏｐｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１（７），１８５０−１８５４（２００８）Ｒ．Ｍｅｎｏｎ，Ｐ．ＲｏｇｇｅおよびＨ． −Ｙ．Ｔｓａｉ「位相特異性のない光学ヌルを生成する回析レンズの設計」、Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ２６（２），２９７−３０４（２００９）Ｄ．Ｗｉｌｄａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｂ？ｃｋｅｒｓ，Ｖ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｓ．Ｗ．ＨｅｌｌおよびＬ．Ｋａｓｔｒｕｐ「設計的に位置合わせされるＳＴＥＤ顕微鏡」Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１７（１８），１６１００−１６１１０（２００９）Ｇ．Ｍａｃｈａｖａｒｉａｎｉ，Ｙ．Ｌｕｍｅｒ，Ｉ．Ｍｏｓｈｅ，Ａ．ＭｅｉｒおよびＳ．Ｊａｃｋｅｌ「径方向および方位角方向偏光ビームの効果的な共振器外生成」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３２（１１），１４６８−１４７０（２００７）Ｍ．Ｄｙｂａ，Ｊ．ＫｅｌｌｅｒおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「位相フィルタ強化ＳＴＥＤ−４Ｐｉ蛍光顕微鏡法：理論と実験」、Ｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．７，１３４（２００５）Ｎ．Ｂｏｋｏｒ，Ｙ．Ｉｋｅｔａｋｉ，Ｔ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｄａｉｇｏｋｕ，Ｎ．ＤａｖｉｄｓｏｎおよびＭ．Ｆｕｊｉｉ「蛍光制御顕微鏡法における偏光効果に関して」、Ｏｐｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２（１），２６３−２６８（２００７）Ｖ．Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｃ．Ｍ．Ｂｌａｎｃａ，Ｍ．Ｄｙｂａ，Ｌ．ＫａｓｔｒｕｐおよびＳ．Ｗ．Ｈｅｌｌ「レーザダイオード誘導放出制御顕微鏡法」、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８２（１８），３１２５−３１２７（２００３）Ｐ．ＴｏｒｏｋおよびＰ．Ｍｕｎｒｏ「ＳＴＥＤ顕微鏡法におけるＧａｕｓｓ−Ｌａｇｕｅｒｒｅベクトルビームの使用」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１２（１５），３６０５−３６１７（２００４）Ｉ．Ｔｅｓｔａ，Ａ．Ｓｃｈｏｎｌｅ，Ｃ．ｖｏｎＭｉｄｄｅｎｄｏｒｆｆ，Ｃ．Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｒ．Ｍｅｄｄａ，Ｃ．Ａ．Ｗｕｒｍ，Ａ．Ｃ．Ｓｔｉｅｌ，Ｓ．Ｊａｋｏｂｓ，Ｍ．Ｂｏｓｓｉ，Ｃ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｓ．Ｗ．ＨｅｌｌおよびＡ．Ｅｇｎｅｒ「分子種の回転可動性に基づくナノスケール分離」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１６（２５），２１０９３−２１１０４（２００８）Ｍ．Ａ．Ｌｉｅｂ，Ｊ．Ｍ．ＺａｖｉｓｌａｎおよびＬ．Ｎｏｖｏｔｎｙ「直接放出パターン画像形成によって決定される単一分子配向性」Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ｂ２１（６），１２１０−１２１５（２００４）Ｍ．ＢｏｈｍｅｒおよびＪ．Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ「広視野エピフロレッセンス顕微鏡法による単一分子の配向性画像形成」、Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ｂ２０（３），５５４−５５９（２００３）Ｐ．Ｄｅｄｅｃｋｅｒ，Ｂ．ＭｕＩｓ，Ｊ．Ｈｏｆｋｅｎｓ，Ｊ．ＥｎｄｅｒｌｅｉｎおよびＪ．Ｉ．Ｈｏｔｔａ「ドーナツモードレーザビームと相互作用する単一分子の励起および下方遷移における配向性効果」Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ１５（６），３３７２−３３８３（２００７）Ｄ．Ｐａｔｒａ，Ｉ．ＧｒｅｇｏｒおよびＪ．Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ「三次元分子配向性研究のための焦点を外された単一分子画像の画像解析」、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ１０８（３３），６８３６（２００４）Ｔ．Ｈａ，Ｔ．Ｅｎｄｅｒｌｅ，Ｓ．Ｃｈｅｍｌａ，Ｒ．ＳｅｌｖｉｎおよびＳ．Ｗｅｉｓｓ「偏光変調によって研究された単一分子力学」Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．７７（１９），３９７９−３９８２（１９９６））Ｂ．Ｓｉｃｋ，Ｂ．ＨｅｃｈｔおよびＬ．Ｎｏｖｏｔｎｙ「環状照明による単一分子の配向性画像形成」、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．８５（２１），４４８２−４４８５（２０００）

本発明は、蛍光走査顕微鏡であって、蛍光の自然放出に対して画像形成されるべきサンプル内のフルオロフォアを励起するための励起波長の励起光のビームを供給し、かつ励起光および抑制光のビームの共通光軸上でフルオロフォアによる蛍光の自然放出を抑制するための抑制波長の抑制光のビームを供給し、抑制波長が励起波長と異なる、光源と、焦点のまわりの焦点体積部分に励起光のビームおよび抑制光のビームの両方を焦点合わせする対物レンズと、フルオロフォアによって自発的に放出される蛍光を検出するように適応される検出器と、励起光および抑制光のビームの共通光軸上に配置され、かつ焦点で強度０を有する焦点のまわりで抑制光の強度分布を生成するために抑制光のビームを形状化するように、かつ焦点で最大値を有する焦点のまわりで励起光の強度分布を生成するために励起光の形状を残すように、適応される色彩光学素子を含む、色彩ビーム整形装置と、を備え、色彩光学素子がそのビーム断面にわたって抑制光のビームの偏光分布を形成するように適応される複屈折色彩光学素子である、ことを特徴とする、顕微鏡を提供する。

本発明の他の特徴および効果は、以下の図面および詳細な説明の考察の際に当業者に明白になるであろう。全てのこの種の追加的な特徴および効果が請求項に記載の本発明の有効範囲内で本願明細書に含まれることを意図される。

本発明は、以下の図面を参照してよりよく理解される。図面内の構成要素が必ずしも一定の比率であるというわけではなく、強調がその代わりに本発明の原理を明らかに例示する点に置かれる。図面では、同様な参照番号はいくつかの図面の全体にわたって対応する部分を示す。

以下の記述において、用語「セグメント」または「セグメント化」は特に円形またはパイ形状の領域のセクターに対してまたはリング形状の要素に対して用いられる。光学系の分野の専門家はしかしながら、適切な領域、局部強度および偏光方向が用いられるならば、その他もまたビーム断面の一般的な任意に形状化された細分において類似の結果に至ることに直ちに気がつくであろう。

この文書では、明示された記述が焦点領域内の同じ位置で励起ビームの最大強度および強度０を備えた単一焦点領域を参照する。例えばこの新規な蛍光走査顕微鏡内に生成されるビームの複数コピーを生成することが可能な、（特許文献３）として公開された国際特許出願内に開示されるように、本発明が複数スポット配置と有利に組み合わせられることは、光学系の分野の専門家にとって明らかである。

さらに、新規な蛍光走査顕微鏡は抑制ビームのスポット形状の強度０に制限されず、むしろ一まとまりのスポットおよび最小値として考えられることができる励起および抑制ビームのその他の基本的に相補の強度パターンに制限される。その意味で、例えば、ラインが対応する隣接するゼロに伴われる一組の隣接スポットによって形成される。ただ１つの簡単な例をここで与える：蛍光走査顕微鏡法の分野の専門家は、焦点領域内のライン形状の強度最大値およびゼロを生成するために半円形形状の複屈折色彩要素を用いることを本開示によって直ちに可能にされる。

新規な蛍光走査顕微鏡の文脈において、抑制光の用語「０」または「強度０」は、数学的に正確な意味で理解されるべきでない。その代わりに、それは低い、好ましくはできる限り低い、実験的に生成できかつ典型的に数パーセントのオーダーの、または抑制光の周囲強度より下の強度である。典型的に、抑制光の周囲の強度の１％の強度０は、適度な努力で達成可能で良い結果を、すなわち、強度０のフルオロフォアからの蛍光の自然放出のごくわずかな望まない抑制だけで生成する。

その対物レンズのすぐ後ろに複屈折ビーム整形装置を用いる新規なＳＴＥＤ顕微鏡の模式的なセットアップを示す。中央：原理ビーム経路。励起光のビーム（太線）および抑制光のビーム（ＳＴＥＤ−ビーム）（白抜き線）同じく放出された蛍光（破線）がビーム整形装置を通過する。好ましくは、ＳＴＥＤおよび励起光は固有のビーム位置合わせを容易にするために同じ光源によって供給される。左側：３波長板からなる、ビーム整形装置の概略図面で、ここで示されるように、最後の２枚の波長板が単一セグメント化された１枚に組み合わせられることができる。右側：ビーム整形装置内の異なるステージでの、および周波の２つの代表点での、励起光のビーム（太線）の、および抑制光（ＳＴＥＤ−ビーム）のビーム（白抜き線）の偏光状態。２つのビームは、セグメント化波長板の色彩性質に起因して異なって処理される。ＳＴＥＤビームは、ドーナツに焦点合わせし、一方、励起光のビームは装置を円形に偏光されたままに残し、垂直に焦点合わせした光点にする。ｅａｓｙＳＴＥＤ（ａ）および分子配向性ＳＴＥＤ顕微鏡法（ＭＯＭ−ＳＴＥＤ）（ｂ、ｃ）に従うビーム断面にわたって異なる偏光分布による蛍光分子上のＳＴＥＤビームの効果を示す。（ａ）：位相０およびπ／２に対するＳＴＥＤドーナツ内の偏光分布（最上行）および、ダイポールの上のＳＴＥＤ場の投影を考慮に入れて、第２行の、結果として生じる実効ＳＴＥＤビーム焦点スポット（ＳＴＥＤ−ＰＳＦ）。φ＝０およびφ＝π／２に対する実効ＳＴＥＤＰＳＦは、互いに補完して全方向の高分解能に至る。（ｂ）：ＭＯＭ−ＳＴＥＤによって、得られる実効ＳＴＥＤＰＳＦは全てのφに対して同じであり、分解能増大はダイポールと平行だけである。（ｃ）内に、異なる配向性の分子が示され、またこの場合に、分子はＳＴＥＤ場がダイポールと平行であるそれらの領域だけで、ＳＴＥＤ場に従う。ＭＯＭ−ＳＴＥＤによって、これが常に、その実際の配向性に関係なく、ダイポールに対して垂直な方向における場合であることが分かる。セグメント化色彩λ／２板によって形状化するＳＴＥＤビームを例示する。左側：励起光（上部）およびＳＴＥＤビーム（下部）のビームの焦点強度分布。両方のビームが、同時にｅａｓｙＳＴＥＤビーム整形装置を通過した。５３２ナノメートルの励起ビームが通常のスポットに焦点合わせされる一方、６４７ナノメートルＳＴＥＤビームはドーナツになる。右側：左側の矢印によって示される方向に沿ったラインプロフィール。ｅａｓｙＳＴＥＤによる新規なＳＴＥＤ顕微鏡内に達成される分解能増大を例示する。標準共焦モード（左）内におよび高分解能ｅａｓｙＳＴＥＤ（中央）で画像形成される蛍光ビード。プロット（右）は、二重ガウスフィッテングと共に中央のｅａｓｙＳＴＥＤ画像に示す矢印に沿ったラインプロフィールを示す。目盛バー＝５００ナノメートル、計数率は、カウント／２００μｓ滞留時間である。この新規なＳＴＥＤ顕微鏡によって撮られた生物学的サンプルの画像を示す。標準共焦モードで観測される海馬マウスニューロン内のタンパク質バスーン（左）。対照的に、ｅａｓｙＳＴＥＤ（中央）は共焦点像で観察不可能な詳細を明らかにする。両方の画像は、生データを示す。右側：ガウスフィッテングと共にｅａｓｙＳＴＥＤ画像内の矢印によって示されるラインに沿ったプロフィールが、４０ナノメートルより下の分解能を明らかにする。目盛バーは１μｍであり、計数率はカウント／２００μｓ滞留時間である。分子配向性顕微鏡法（ＭＯＭ）モードでの新規なＳＴＥＤ顕微鏡によって撮られたほぼ単一分子レベルに至るまで漂白されたナイル赤蛍光性ビードの画像を示す。右側の拡大図から明白であるように、ＳＴＥＤによる分解能は分子のダイポールに対して垂直な方向にだけ高められる。大部分垂直に位置合わせされる分子が、好ましくはこの方向に沿って分子遷移ダイポールに働く直線偏光励起ビームの結果である。矢印：それらの得られるスポットが配向性の異なる事実だけによって、３分子が副ＳＴＥＤ焦点体積部分内にさえ分離されることができる。目盛バーは５００ナノメートルであり、計数率はカウント／１０００μｓ滞留時間である。後焦点面内のまたはその近くのその断面にわたるＳＴＥＤビームの３つの基本的偏光分布を示す。中央内のパイセグメントおよびパイセグメントを取り囲むリングセグメントを有するセグメント化色彩λ／２板を示す。およびセグメント化複屈折板のスタックおよびＳＴＥＤビームの得られる偏光分布を示す。

ＳＴＥＤビームが以下の抑制光のビームであるＳＴＥＤ顕微鏡に、本発明が特定の参照によって記載されるとしても、本発明はＳＴＥＤ顕微鏡に限定されず、例えば、ＧＳＤ顕微鏡または他のＲＥＳＯＬＦＴ技法のような、励起光のビームに加えて抑制光のビームを用いる全ての他の蛍光走査顕微鏡にも関する（非特許文献１０）。

この新規な蛍光走査顕微鏡は、それが、位相差を導入することに依存せず、むしろ抑制光のビームの断面にわたって偏光を変更することに依存する事実によって目立つビーム整形装置を備える。偏光で動作して、有利には下位光学リターダとして高品質の市販の複屈折結晶を用いることができる。好ましくは、下位波長板の色彩特性は励起およびＳＴＥＤビームのスペクトル分離に正確にマッチする。したがって、新規な蛍光走査顕微鏡の複屈折色彩光学素子は、適切なレーザ光源と共に、特に共焦検出配置を備えているならば、ほとんど任意の標準走査蛍光顕微鏡を経済的に改造し、かつ、それを回折限界以下の分解能を与える完全ＳＴＥＤ顕微鏡に変えることができる簡単な、エラーに耐える使いやすいビーム整形装置を提供する。この種の改造された走査共焦蛍光顕微鏡が、以下でｅａｓｙＳＴＥＤと称される。

さらに、小幅な変更によって、単一フルオロフォアの画像がフルオロフォアの遷移ダイポール配向性に強く依存するように、同じビーム整形装置が調整されることができる。その結果、ＳＴＥＤによるこの分子配向性顕微鏡法（ＭＯＭ−ＳＴＥＤ）は、空間内の分子の遷移ダイポールの配向性を評価することを可能にする。最も興味をそそるように、分子の配向性は（ライン形状の）蛍光パッチによって画像内に直接再現される。加えて、分子配向性のかすかな変化を検出することによって、ＳＴＥＤ顕微鏡法のこの単純なその上強力なバージョンが隣接する個々のフルオロフォアの認識およびそれゆえに分離を改善する。同じ理由で、ＭＯＭ−ＳＴＥＤはさらに回折限界以下のサンプル体積部分内の分子の計数を改善することを可能にする。

蛍光走査顕微鏡の複屈折色彩光学素子は、それらの速波軸の異なる配向性を特徴とするセグメントを含むセグメント化色彩λ／２板を備えることができる。この種のセグメント化波長板を作成するために、高品質で利用可能である標準波長板が、単にそれらの速波軸の望ましい配向性によってセグメントに切られることができる。これらの個々のセグメントは、単純に互いに付着されるかまたは接着されることができる。好ましくは、しかしながら、セグメントは共通基板上に並んで接着される。

セグメント化波長板の色度は、それが抑制光のビームの偏光を変更するだけのことを確実にする一方、それは励起光のビームの偏光をそのままに残す。新規な蛍光走査型顕微鏡のビーム整形装置は、また、励起光のビームの偏光、すなわち色収差補正波長板を変更する色収差補正波長板を含むことができる。しかしながら、好ましくはセグメント化色彩波長板として作られる少なくとも１個の複屈折色彩光学素子がある。さらにより好ましくは、それはセグメント化色彩λ／２板である。

セグメント化色彩λ／２板は、共通光軸のまわりでパイセグメントからパイセグメントまで速波軸の配向性で同じサイズおよび同じ差異を有する共通光軸の方へ漸減するパイセグメントを含むことができる。セグメント化色彩波長板のこの変形において、各パイセグメントは共通光軸のまわりの特定の角度を包含する。速波軸の配向性は、パイセグメントからパイセグメントまで一般に同等のステップで変化し、共通軸線のまわりの１回の旋回にわたる配向性の合計変化は１８０°または１８０°の倍数である。

共通光軸に関するパイセグメントの中央の横向きのオフセットが焦点での抑制光の強度分布の強度０に影響を及ぼさず、共通光軸に関して抑制光のドーナツ形状の強度分布をただ傾け、かつ強度０を幾何学的な焦点に関して横にわずかにシフトする点に留意する必要がある。しかしながら、強度０は焦点に残る。

好ましくは、セグメント化色彩λ／２板は、共通光軸のまわりのパイセグメントからパイセグメントまで４５°の速波軸の配向性の、同じサイズのおよびある差異の、４個のパイセグメントを含む。セグメント化色彩λ／２板のパイセグメントの最小数は、２である。特に適切な数は、４である。速波軸の配向性の変化の等しいステップによって、セグメントのこの数はパイセグメントからパイセグメントまで４５°の速波軸の配向性の変化に対応する。パイセグメントの数が４を越えるならば、偶数のパイセグメントがまた、好まれる。

対応するセグメントが共通光軸のまわりに配置されるのと、回転の同じ向きで速波軸がパイセグメントからパイセグメントまで回転することができる。励起光のビームおよび抑制光のビームがその時セグメント化色彩λ／２板を通過する前に直線偏光されるならば、自発的に放出された蛍光の抑制はフルオロフォアの分子配向性に影響されやすくなり、およびフルオロフォアの分子遷移ダイポールの方向が調査されることができる。新規な蛍光走査型顕微鏡のこの動作モードは、ここでＭＯＭ（分子配向性顕微鏡法）またはＭＯＭ−ＳＴＥＤ（ＳＴＥＤによる分子配向性顕微鏡法）と称される。

しかしながら、フルオロフォアの分子ダイポールの方向は関心を引かないが、しかし、新規な蛍光走査顕微鏡の最大空間分解能が、達成されるべきであるならば、対応するセグメントが共通光軸のまわりに配置される回転の向きと比較して、回転の対向する向きでパイセグメントからパイセグメントまで速波軸を回転させることが好ましい。（同じ効果は、対応するセグメントが共通光軸のまわりに配置されるのと回転の同じ向きで速波軸が回転するセグメント化λ／２板の下流にλ／２板を追加することによって達成されることができる。）励起光のビームおよび抑制光のビームがその時色収差補正λ／４板によって達成されることができるセグメント化色彩λ／２板を通過する前に円形に偏光されるならば、フルオロフォアによって自発的に放出される蛍光の抑制はフルオロフォアの遷移ダイポールの分子配向性に無関係である。新規な蛍光走査型顕微鏡のこの主動作モードは、ここでｅａｓｙＳＴＥＤと称される。

共通光軸の方向の抑制光の強度によって焦点での励起光の強度最大値を封じ込めるために、セグメント化色彩λ／２板は加えて、パイセグメントを取り囲むリングセグメントを含むことができる。これらのリングセグメントは、共通光軸のまわりでリングセグメントからリングセグメントまで速波軸の配向性の同じサイズおよび同じ差異を有することができる。

好ましくは、ビーム整形装置の複屈折色彩光学素子が、対物レンズの瞳孔平面に沿ってそのビーム断面にわたって抑制ビームの偏光分布を形成するように適応される。このために、複屈折色彩光学素子は対物レンズの瞳孔平面内にまたはその近くに配置されることができる。複屈折色彩光学素子が配置される瞳孔平面は、（光源から見て）対物レンズのすぐ前方のものであることができる。複屈折色彩光学素子の配置に対して対物レンズ内に瞳孔平面を選ぶこともまた、可能である。特に、検出されるべき蛍光が対物レンズによって集められるならば、対物レンズと複屈折色彩光学素子との間で検出経路を外へ連結する必要はない。その代わりに、新規な蛍光走査型顕微鏡の検出器は、フルオロフォアによって自発的に放出され、対物レンズによって集められ、かつ複屈折色彩光学素子を通過する、蛍光を検出するように配置されることができる。

新規な蛍光走査顕微鏡の光源が励起光のビームおよび抑制光のビームの両方を供給するための共通レーザ光源を備えるならば、励起光のビームおよび抑制光のビームの固有の位置合わせが達成される。この種の共通レーザ光源は、共通光ファイバに２台の別々のレーザを連結することによってまたは超連続性光源もしくは励起光および抑制光の両方を供給する別の光源を用いて実現されることができる（例えば（特許文献４）を参照）。

複屈折色彩光学素子は、焦点で強度０を有する抑制光の望ましい強度分布を達成するためにそのビーム断面にわたって抑制ビームの異なる偏光分布を提供することができる。これらの偏光分布の大部分は、いつでも、共通光軸のまわりの方位角偏光の複素線形結合（図７ａ）、場ベクトルが共通光軸のまわりに配置される対向するセクターの対から対まで逆にされる共通光軸のまわりの方位角偏光（図７ｂ）、および場ベクトルが共通光軸のまわりに配置される対向するセクターの対から対まで逆にされる共通光軸に関する径偏光（図７ｃ）によって表せる。図７ｃに従う後者の場合では、半径方向内部指向ベクトルの合計は半径方向外部指向ベクトルの合計に等しい。しかしながら、共通光軸のまわりの単純な半径方向の偏光分布は、抑制光の強度分布の望ましい強度０が達成されないように、焦点での抑制光の共通光軸に沿ったｚ成分に結びつく。用語「複素線形結合」は、線形係数が必ずしも実際に複素数である、すなわち、両方が実数部および虚数部を有するということを意味するわけではない。それらの実数および虚数の部分の両方が（少なくとも１つの線形係数の少なくとも１つの部分以外）ゼロであることができるので、それらは実数または虚数の部分だけを有することができる。

すでに示されたように、新規な蛍光走査顕微鏡の複屈折色彩光学素子は１を超えるまたは複数の複屈折板のスタックさえ備えることができる。また、複屈折色彩光学素子がまた、少なくとも１枚の色彩複屈折板の他に単数または複数の色収差補正複屈折板を備えることができることは、すでに示された。

新規な蛍光走査顕微鏡の更なる変形において、複屈折色彩光学素子が複数の複屈折色彩板のスタックを備える。偏光分布が共通光軸に関して横にオフセットされる少なくとも２つの偏光副分布を備えるように、複数の複屈折色彩板のこの種の配置は特にそのビーム断面にわたって抑制ビームの偏光分布を形成するために用いられることができ、それが、焦点のまわりの抑制光の少なくとも２つのドーナツ形状の強度副分布に結びつき、それが共通光軸に沿って伸ばされ、共通光軸に関して異なる方向に傾けられる。

新規な蛍光走査型顕微鏡内の複屈折色彩光学素子によって達成される適切な偏光分布の大部分は、抑制光のビームのビーム断面にわたって平均偏光がいつでもゼロであるようなものである。これは特に図７に示すそれらの偏光分布にあてはまるが、しかし、それはまた図９を参照して更に説明されるセグメント化複屈折板のスタックによって達成される偏光分布にもあてはまる。

すでに示されたように、例えば（特許文献３）として公開された国際特許出願内に開示されるように、新規な蛍光走査顕微鏡は複数スポット配置を備えることができる。複数スポット配置は、対応する焦点領域内に抑制光のおよび励起光の基本的に相補の強度パターンを生成する。特に、それは複数の強度０を呈する抑制光の強度分布、および各々が強度０のものに位置する複数の最大値を有する励起光の強度分布を生成する。この配置の有効利用をするために、検出器は個々の強度０に位置するフルオロフォアによって自発的に放出される蛍光を別々に検出することが可能でなければならない。

次に図面の図１をより詳細に参照して、新規な蛍光走査顕微鏡２の複屈折色彩ビーム整形装置１の中央部が、示すように向けられる４個のパイセグメント６の速波軸５によるセグメント化下位波長板３である。４個のパイセグメント６は、一定の全体的な厚さを確実にするために単一のより大きい波長板から切り分けられた。その後、４個のパイセグメント６が速波軸５の適切な配向性を順守する一方、共通基板（ＢＫ７）上にそれらを接着することによって一緒にまた集約された。速波軸５の配向性は方位角方向に偏光されるビームを生成するための（非特許文献１７）内に提案される配向性と類似であるが、セグメントの数に差異がある。２台の装置、６４７ナノメートル（アルゴンクリプトンレーザからのライン）でＳＴＥＤを実行するためのもの、および５９２ナノメートル抑制波長（周波数を２倍にされたファイバーレーザによって生成される）のＳＴＥＤのためのものが製作された。利用された励起波長はそれぞれ５３２ナノメートルおよび５０４ナノメートルである。いずれの場合においても、それぞれの波長板３の遅延はＳＴＥＤビームに対して２．５λおよび励起ビームに対して〜３λである。したがって、波長板３は事実上ＳＴＥＤビームだけを形状化する色彩λ／２板である。その結果、ＳＴＥＤビーム７が偏光平面の回転に至る半波遅延を経験する一方、励起ビーム８は影響を受けない。色収差補正半波長板９と組み合わせて、ドーナツ焦点合せがＳＴＥＤ波長に対して達成され、一方励起ビーム８が通常のほぼ回折限定の焦点スポットに焦点合わせされる。

その上、色収差補正四分の一波長板１０はそれらの配向性に関係なく、全ての分子が事実上励起されて、消光されることを確実にする（ｅａｓｙＳＴＥＤ）。セグメント化波長板３だけが使用され、かつ２個の色収差補正リターダ９および１０が残されると仮定するならば、抑制または制御プロセスは分子配向性に影響されやすくなり、および、分子ダイポールの方向が調査されることができる。このように、単純な変換によって、ビーム整形装置は等方性の分解能増大のためにおよび指向性分析のために用いられることができる。後者が求められないならば、セグメント化色彩波長板３および単純な色収差補正半波長板９は単一セグメント化色彩半波長板１３に組み合わせられることができる。

図１の右側は、ビーム整形装置１内のいくつかの位置でのおよび周波の２つの異なるポイントｅ^ｉ０およびｅ^ｉπ／２でのビーム断面１２にわたるＳＴＥＤビーム７および励起ビーム８の偏光方向を表す。第１に、両方の直線偏光されたビームが色収差補正四分の一波長板１０によって円形に偏向される。次いで、偏光がセグメント化波長板３によってＳＴＥＤビーム７だけに対して選択的に回転される。この段階で、ＳＴＥＤビーム７は位相φ＝０に対して半径方向に偏光され、φ＝π／２に対して方位角方向に偏光され、両方の偏光状態はＳＴＥＤ顕微鏡法にとって好ましくない。最終的なλ／２リターダ９が、両方のビーム７および８の水平に偏光される成分を選択的に反転させ、励起ビーム８の円偏光を逆転させ、かつＳＴＥＤビーム７を周波の全てのポイントに対してドーナツに変える。

図２ａは、焦平面内のＳＴＥＤドーナツ内の偏光分布１７の電場を示す（最上行）。φ＝０に対して強度分布が中央のゼロ（良いＳＴＥＤ性能を示す）を備えた環様である一方、場分布によって実効励起状態制御パターンまたはＳＴＥＤ−ＰＳＦ１５が消光されようとしているフルオロフォアの配向性または分子遷移ダイポール１４に依存するようになる。この例では、４５°で向けられる分子の状態は、１７内の電場が遷移ダイポール１４と平行であるＳＴＥＤビームの左上部分によっておよび右下部分によって最も効果的に減らされる。対照的に、１７内の電場が垂直に偏光される領域は、分子に作用しない。これは、ダイポールの左側および右側の領域内だけで高分解能に至る。しかしながら、φ＝π／２によって、第１の四分の一波長板の動作から得られる、偏光分布は９０°だけ回転され、分解能はダイポール配向に沿った方向に高められる。したがって多くのサイクルにわたって平均すると、結果として生じる放出１６が焦平面の全ての方向のスポットに境界を決められるという点で全ての方向に高い光学分解能を得る。

図２ａ内に示される電場分布が原理的に、ＳＴＥＤ顕微鏡法に対する準標準になった渦位相要素を用いて作り出されるドーナツと同じである点に注意する。加えて、見られることができるように、偏光の異なる配向性によって図１の右側をたどる時、このビーム整形装置は第１の色収差補正四分の一波長板の後で到着ＳＴＥＤ光が左右の両方に円形に偏光されることを可能にする。それが利用可能なＳＴＥＤパワーを２倍にするために偏光ビームスプリッタ経由で２台のＳＴＥＤ光源を容易に組み合わせることを可能にするので、これは重要なポイントである。標準渦位相板および（非特許文献１６）内に記載されている位相板は、両方の得られる偏光方向をドーナツに作り上げることができず、その代わりに、ＳＴＥＤビーム経路がビーム位置合わせに関する全ての負の効果によって再び分割されなければならない。対照的に、セグメント化波長板３（同じくセグメント化波長板１３）は到着偏光を問わずドーナツを生成する。

一見して、図１および２ａ内に示されるドーナツに対する偏光パターンは、不必要に複雑に見える。後焦点面内の方位角偏光が、中央の最小値によって焦点強度分布に変化するので、（非特許文献１７）内に提案されるように、方位角方向に偏光されたビームを使用することが、非常に簡単に見える。実際には、しかしながら、基底状態への遷移、すなわち、方位角方向に偏光されるドーナツの励起状態の制御が、蛍光分子の配向性に依存するので、焦平面内の電場のこの分布は、ＳＴＥＤにとって好ましくない（非特許文献１８−２１）。他方では、これはこの種のドーナツが分子ダイポールの実際の方向を見いだすことに関しては有用なことを意味する。

実際には、図１内の２つの色収差補正非セグメント化波長板９および１０を省くことによって、ＳＴＥＤは分子配向性に影響されやすくなる。焦平面内の電場の得られる分布は、検出ＰＳＦ１５に関する効果と共に図２ｂ、ｃ内に検討される。すべての分子は、そのダイポール１４に対して垂直な方向にだけ消光される。ダイポール１４に沿った方向には、その実際の配向性に関係なく、ＳＴＥＤ場１７はダイポール１４と平行の成分を持たず、およびしたがって、分子遷移を引き出すことができない、すなわち、励起した状態制御を遂行しない。図２ａとは対照的に、分子が減らされることができないドーナツの部分は、全ての位相に対して同じである。それゆえに、得られる分解能増大は等方性でなく、この装置はダイポール１４が検出器の単一フレームの間に回転可能に静止していると仮定するならば、サンプル内の蛍光分子の配向性を調査するために用いられることができる。したがって、新規な蛍光走査顕微鏡は分子配向性を直接にマップするのに適している。

図３は、焦平面内におよびラインプロフィールとしてＳＴＥＤ−ＰＳＦ１５および励起ＰＳＦ１８を示す。画像は、焦点領域を通して８０ナノメートルの金ビードを走査することによって得られた（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、（非特許文献１２）内の蛍光ビードサンプルと同様に準備された）。明らかに、励起が予想通りに単純な焦点スポットであると共に、ＳＴＥＤビームがドーナツに作り上げられる。ＳＴＥＤ−ＰＳＦは、セグメント化波長板の４個のパイセグメントに起因するかすかな４葉の外観を有する。ドーナツ冠に沿った変調は＜２０％であって、後述のように、ＳＴＥＤ性能に関する実際的な影響を有しない。

図４では、フルオロフォアナイル赤によって着色された蛍光ビード（２０ナノメートルのＦｌｕｏｒｏＳｐｈｅｒｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国、（非特許文献１２）内のようなサンプル準備）が、標準共焦モードおよびｅａｓｙＳＴＥＤの両方で画像形成された。励起波長は５３２ナノメートルであった、ＳＴＥＤビームは焦平面内で〜２００ＭＷ／ｃｍ２の強度のモードロックの６４７ナノメートルのＡｒ／Ｋｒビーム（８０ＭＨｚの繰返しレート、〜２００ｐｓパルス幅）であった。ＳＴＥＤによって与えられた分解能増大は、明らかであり、ガウスフィッテングからラインプロフィールに対して推定されることができるように、画像内の最も小さいフィーチャーは、〜３０ｎｍの分解能を示す（図４、右側を参照）。分解能は、利用可能なＳＴＥＤパワーによっておそらく限定される。最も注目に値する、他の点では同じセットアップおよび同じサンプル上の標準渦位相板によって得る分解能もまた３０ナノメートルの範囲である。さらに、ＳＴＥＤ−ＰＳＦが純粋なドーナツモードでない事実に起因して予想されるかもしれない、実効ＰＳＦのなんの非対称性も目立たない（図３を参照）。要するに、これはｅａｓｙＳＴＥＤの背後の技術的な単純化が実際に性能の犠牲で起こらないことを示す。

その最大値が励起ラインに近い蛍光放出が、大部分はビーム整形装置にも影響を受けないままに残され、さもなければ、信号は共焦検出ピンホールでかなり低下する。重要なことに、これは装置が第一に対物レンズのすぐ背後に設置されることを可能にする。３Ｄ切出しが必要とされる場合だけ、共焦ピンホールが必要である点に注意する、蛍光が起こる領域がＳＴＥＤビームの最小値の位置によってあらかじめ定義されるので、ＳＴＥＤ原理は共焦点性を必要としない。

図５は、海馬マウスニューロンから標準共焦モードでおよびこの偏光ビーム整形装置を用いてＳＴＥＤによって撮られた画像を示す。シナプス前部活性ゾーンタンパク質バスーンが、Ａ５６５染料（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ、ドイツ）によってラベルをつけられた。ビームパラメータは図４内に同じであった。再び、ｅａｓｙＳＴＥＤは〜４０倍で実効焦点の領域を減少させる。ｅａｓｙＳＴＥＤ画像に対して、不明瞭に境界づけられた単一抗体の見かけのサイズは約３５ナノメートルのＳＴＥＤ顕微鏡の横向きの分解能を示す。タンパク質フィーチャーの平均サイズは、８０ナノメートルである。したがって、タンパク質バスーンの実際の分布および活性ゾーンの形状が、完全に評価されることができる。

図６は図２ｂ、ｃ内に検討されたようなＭＯＭ−ＳＴＥＤを示す。単一ナイル赤分子が、上記のビードサンプルを用いて準備をされかつ十分に低い数の染料分子がビード内に残されるまで励起レーザによって領域を漂白する。したがって、ポリスチレンによって取り囲まれて配向の固定された個々の分子を得て、明るさおよび光安定性に関して有利であることを見いだした。さらに、これらのビードは、ＭＯＭの第１のデモンストレーションに対する明確な環境を与える。このサンプルは次いで、共焦で、および純粋な方位角偏光を用いてＳＴＥＤによって画像形成された。得られる分子画像は、それらの遷移ダイポールの配向性に依存する。目に見える分子の数を更に減少させるために、垂直ダイポール成分を備えた分子だけを励起することによって（図６内に垂直に）直線偏光された励起を用いた。これは、図６内の分子の優先配向性を説明する。励起ビームの偏光が回転される時、見かけ上の分子の優位な方向は同様に回転する。

緑のボックス内の拡大図は、おそらく、そのダイポール方向に対して４０ナノメートルまで垂直に分解された単一分子であることを示し、そのうえ、それはダイポールに沿って標準共焦スポット画像の１８０ナノメートルの幅を有する。この非対称画像から、焦平面内のダイポールの配向性が、推定されることができる。さらに、それらの配向性の異なる分子を識別する能力は、それらの分子間距離がほんの数ナノメータまたはより下である時でさえ、それらが個々に画像形成され計数されることができることを意味する。回折限界以下の距離で分離される分子の配向性を評価することは、それらが放出光の偏光に依存するので、今までのところ大部分は現行の技法で不可能であった。対照的に、照明の偏光によって動作する、ＭＯＭは分離に対する追加的なパラメータを開く。

図６内の矢印は、分子が共に非常に近いために、おそらく、それらが４０ナノメートルの等方性の分解能によって分解されることができなかった状況を示す。対照的に、ＭＯＭは明らかに異なった画像形状に起因してそれらの区別を可能にする。エミッタの正確な位置を見いだすためにいくつかの細長い適切に回転される画像に適合する限り続けることができる。生物学的標本に関しては、例えば完全にアセンブルされたアクチンフィラメントおよびバンドルにおいて、それらが実際に固定された分子の少なくとも一部分を含有する無視できない証拠（非特許文献２２）があり、分子配向性を画像形成することが重要になるはずであることを示す。

新規な蛍光走査顕微鏡の波長感受型ビーム整形装置が励起−、放出−およびＳＴＥＤ−ビームに関して異なる効果を有するので、全てのビームが同時に装置を通過することができる。共通光源が励起のためにおよびＳＴＥＤのために使用される時、または両方のビームが同じ光ファイバを通して供給される時、これは固有の位置合わせを容易にする。このように、それは従ってＳＴＥＤ顕微鏡の組立、保守および動作を簡単化する。

ビーム整形装置それ自体は、主に標準手続きを用いて２つのステップで既製のリターダから容易に製作されることができるセグメント化半波長板から成る。製作中に同じく動作中に簡単で強い、このビーム整形装置は対物レンズの背後に装置を置いてＳＴＥＤビームを供給するレーザを追加することによって標準走査蛍光（共焦）顕微鏡をアップグレードするために用いられることができる。

さらに、提示された結果は明らかに、特定のＳＴＥＤ対物レンズが、位相コントラスト顕微鏡法のためのレンズと類似の、すでに組み込まれたセグメント化波長板によって製作されることができることを示す。

その上、小幅な変更によって、新規な蛍光走査顕微鏡は蛍光分子の配向性に関する調査のために用いられることができる。配向性を決定するための報告された方法は、大部分は（むしろ複雑な）焦点を外された回折パターンを理論上の予測と比較することにおよび／または特別な照明／検出方式（非特許文献２３−２６）（非特許文献２７，２８）、たとえば環状照明に依存する。いずれにせよ、これらの方法は良い信号対雑音比を要求してむしろ間接的である。対照的に、ＭＯＭはサンプル内の分子配向性を直接選別し、焦平面内の配向性が画像からすぐ見られることができる。ＭＯＭの将来の用途が、分子モータの分野にあることができる。多くがそれらの線形ステッピングについて公知であるとはいえ、ＭＯＭはまた、それがその軌道に沿って移動するにつれて、モータがどのようにねじれるかについて、見つけ出すことを可能にする。

ＳＴＥＤが当然、もちろん、分子配向性を確立するこの方法に必須でない点に注意する。実際には、２つの状態の間で任意の飽和可能な光学遷移が、この方法で分子配向性を確立するために用いられることができる（非特許文献１０）。換言すれば、ＳＴＥＤを用いるＭＯＭは、誘導放出が電子スピンフリップ（三重項状態遷移）またはシス‐トランス光異性化、化学結合の可逆な形成、その他のような原子の再配置によって置き換えられるＭＯＭ−ＲＥＳＯＬＦＴ概念に直ちに拡張されることができる（非特許文献１０）。明らかに、同じドーナツおよびそれの関連するバージョンがＲＥＳＯＬＦＴアプローチで利用されることができる。座標標的となる切換え（ＲＥＳＯＬＦＴ）によってフィーチャーを分離することに基づいてナノスコピー概念の極小値を作り出す重要性は、本願明細書に報告される複屈折素子および特定の最小値の重要性を強調する（非特許文献１０）。さらに、空間分解能が空間内の分子を分解するために十分でないならば、それらのダイポール配向性が異なる限り、分子が高感度で、体積部分で分離されて計数されることができる。

図７はＳＴＥＤビームまたは抑制光のビームの３つの基本的偏光分布を示し、各々が焦平面内の抑制光の強度のドーナツによって取り囲まれる焦点で抑制光の強度のゼロ点に結びつく。共通光軸４のまわりのこれらの３つの偏光分布は、また、焦点で強度０に影響を及ぼさずに線形に結合されることができる。図７内に表される３つの分極分布の中で、図７Ｂ，Ｃのものだけがそのようなものとして新規な蛍光走査顕微鏡のｅａｓｙＳＴＥＤモードに属する、一方、図７Ａの分布はそのようなものとしてＭＯＭモードに属する。しかしながら、また、ｅａｓｙＳＴＥＤ動作モードに属する図７Ａ、ＢおよびＣに従うそれぞれの対物レンズの瞳孔にわたる偏光分布の追加的な複素線形結合がある。

図８は、板３の中央内のｓ１からｓ４の番号をつけられた４個のパイセグメント６に加えてｓ５からｓ８の番号をつけられた４個のリングセグメント２４を備えるセグメント化λ／２板３を示す。パイセグメント６は、共通光軸４の方へ漸減し、それらの各々が９０°の光軸４のまわりの角度についてわたる。リングセグメント２４は、パイセグメント６のまわりで広がる。焦点での抑制光の強度分布の強度０が焦平面内の抑制光の強度のドーナツによって取り囲まれてかつ共通光軸４に沿って焦平面の両方の側に配置される抑制光の強度の２つの最大によって封じ込められるという方法で、セグメントｓ１からｓ８内の速波軸の配向性が選ばれる。

図９は、直線水平偏光だけで抑制光のビームの偏光分布３０から始まる新規な蛍光学顕微鏡の対物レンズの瞳孔にわたる、３枚の複屈折色彩波長板３１、３２および３３のスタックおよび抑制光の対応する偏光分布３４、３５および３６を例示する。表されるように、全ての波長板３１から３３がセグメントに分けられ、セグメントは示された速波軸５を特徴とする。偏光分布３４から３６の表現は、最後に達成される偏光分布３６の説明の目的でセグメントに分けられるだけである。複屈折色彩波長板３１は、３セグメントのλ／２板である。２個のパイセグメント各々が、共通光軸４のまわりの約９０°を包含し、および、１個のパイセグメントが光軸４のまわりの１８０°を包含する。複屈折色彩波長板３２は、両方とも共通光軸のまわりに１８０°にわたって広がる２個のリングセグメントによって取り囲まれる円形中央セグメントを備えるλ／２板である。頂冠ビームプロフィールおよび軸傍状態を想定して、円形中央の直径は０．７０７１であるだろう。ビームプロフィールが通常ガウスの、および高開口ビームが軸偏光を生成するので、内径は、実際問題としてより小さく、到着ガウスビームの幅に依存して、瞳孔直径のうちの約０．６２５に選ばれなければならない。

最終的な複屈折色彩波長板３３は、それらの速波軸の半径方向の配向性を備えた４個のパイセグメントからなるλ／４板である。最後に得られる偏光分布３６がそれぞれ、セクター４１から４４および４５から４８にわたる２つの副分布を備え、各々が、同じ焦点のまわりの中央内のゼロ点で、しかし共通光軸４に沿って広がるチューブ形の強度分布で、強度のドーナツを生成し、かつ焦点のゼロ点が実際には共通光軸の方向を含む全ての空間方向に抑制光の強度によって取り囲まれるように共通光軸に関して異なる方向に傾けられる。図９に従う全ての波長板３１から３３は、抑制光のビームの偏光分布に影響を及ぼすだけであるが、一方、それらは、焦点で強度最大値をしたがってなお備える励起光の偏光分布に影響を及ぼしていない。

図９に従う波板スタックが、それぞれ、６４７ナノメートルおよび７５５ナノメートルの抑制波長の抑制ビームおよび５３１および６４０ｎｍの励起波長の励起ビーム用に構築されて試験された。

１ビーム整形装置
２蛍光走査顕微鏡
３セグメント化色彩λ／２板
４光軸
５速波軸
６パイセグメント
７ＳＴＥＤビーム
８励起ビーム
９色収差補正λ／２板
１０色収差補正λ／４板
１１蛍光
１２ビーム断面
１３セグメント化色彩λ／２板
１４ダイポール
１５ＳＴＥＤ−ＰＳＦ
１６放出
１７ドーナツ内の偏光分布
１８励起−ＰＳＦ
１９対物レンズ
２０サンプル
２１検出器
２２光源
２３電場方向
２４リングセグメント
２５セグメント化色彩λ／２板
３０偏光分布
３１セグメント化色彩λ／２板
３２セグメント化色彩λ／２板
３３セグメント化色彩λ／４板
３４偏光分布
３５偏光分布
３６偏光分布
４１第１の副分布のセクター
４２第１の副分布のセクター
４３第１の副分布のセクター
４４第１の副分布のセクター
４５第２の副分布のセクター
４６第２の副分布のセクター
４７第２の副分布のセクター
４８第２の副分布のセクター

Claims

蛍光走査顕微鏡であって、
−蛍光の自然放出に対して画像形成されるべきサンプル内のフルオロフォアを励起するための励起波長の励起光のビームを供給し、かつ励起光および抑制光の前記ビームの共通光軸上で前記フルオロフォアによる蛍光の自然放出を抑制するための抑制波長の抑制光のビームを供給し、前記抑制波長が前記励起波長と異なる、光源と、
−焦点のまわりの焦点体積部分に前記励起光のビームおよび前記抑制光のビームの両方を焦点合わせする対物レンズと、
−前記フルオロフォアによって自発的に放出される蛍光を検出するように適応される検出器と、
−前記励起光および抑制光のビームの前記共通光軸上に配置され、かつ前記焦点で強度０を有する前記焦点のまわりで前記抑制光の強度分布を生成するために前記抑制光のビームを形状化するように、かつ前記焦点で最大値を有する前記焦点のまわりで前記励起光の強度分布を生成するために前記励起光の形状を残すように、適応される色彩光学素子を含む色彩ビーム整形装置と、を備え、前記色彩光学素子が、そのビーム断面にわたって前記抑制光のビームの偏光分布を形成するように適応される複屈折色彩光学素子である、ことを特徴とする顕微鏡。
前記複屈折色彩光学素子が、それらの速波軸の異なる配向性を特徴とするセグメントを含むセグメント化色彩λ／２板を備える、ことを特徴とする請求項１の蛍光走査顕微鏡。
前記セグメント化色彩λ／２板が、前記共通光軸のまわりでパイセグメントからパイセグメントまで前記速波軸の配向性の同じサイズおよび同じ差異を有する前記共通光軸の方へ漸減するパイセグメントを含む、ことを特徴とする請求項２の蛍光走査顕微鏡。
前記セグメント化色彩λ／２板が、前記共通光軸のまわりでパイセグメントからパイセグメントまで４５°前記速波軸の配向性の同じサイズのおよびある差異の４個のパイセグメントを含む、ことを特徴とする請求項３の蛍光走査顕微鏡。
前記速波軸が、前記対応するセグメントが前記共通光軸のまわりに配置されるのと、回転の同じ向きでパイセグメントからパイセグメントまで回転する、ことを特徴とする請求項３または４の蛍光走査顕微鏡。
前記励起光のビームおよび前記抑制光のビームが、前記セグメント化色彩λ／２板を通過する前に直線偏光される、ことを特徴とする請求項５の蛍光走査顕微鏡。
前記対応するセグメントが前記共通光軸のまわりに配置される回転の向きと比較して、前記速波軸が回転の対向する向きでパイセグメントからパイセグメントまで回転し、そして、前記セグメント化色彩λ／２板が２つの直交偏光方向を含有するビームによって照明される、ことを特徴とする請求項３または４の蛍光走査顕微鏡。
前記複屈折色彩光学素子が、前記対物レンズの瞳孔平面に沿ってそのビーム断面にわたって前記抑制ビームの前記偏光分布を形成するように適応される、ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
前記複屈折色彩光学素子が、前記対物レンズの瞳孔平面内に配置される、ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
前記検出器が、前記フルオロフォアによって自発的に放出され、かつ前記対物レンズによって集められる、蛍光を検出するために配置される、ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
前記検出器が、前記複屈折色彩光学素子を通過した蛍光を検出するために配置される、ことを特徴とする請求項１０の蛍光走査顕微鏡。
前記光源が、前記励起光のビームおよび前記抑制光のビームの両方を供給するための共通レーザ光源を備える、ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
請求項１〜１２のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡であって、前記偏光分布がいつでも、
−前記共通光軸のまわりの方位角偏光の、
−前記場ベクトルが前記共通光軸のまわりに配置される対向するセクターの対から対まで逆にされる前記共通光軸のまわりの方位角偏光の、および
−前記場ベクトルが前記共通光軸のまわりに配置される対向するセクターの対から対まで逆にされる前記共通光軸に関して径偏光の、複素線形結合であるように、前記複屈折色彩光学素子がそのビーム断面にわたって前記抑制ビームの前記偏光分布を形成するように適応される、ことを特徴とする顕微鏡。
前記セグメント化色彩λ／２板が、前記パイセグメントを取り囲むリング形状の領域のセグメントを含む、ことを特徴とする請求項２〜７のいずれか一項、または、請求項２を引用する請求項８〜１３のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
前記複屈折色彩光学素子が、複数の複屈折板のスタックを備える、ことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
前記複屈折色彩光学素子が、少なくとも１枚の色彩複屈折板および少なくとも１枚の色収差補正複屈折板を備える、ことを特徴とする請求項１５の蛍光走査顕微鏡。
前記複屈折色彩光学素子が、複数の複屈折色彩板のスタックを備える、ことを特徴とする請求項１５の蛍光走査顕微鏡。
前記共通光軸に沿って伸ばされ、かつ前記共通光軸に関して異なる方向に傾けられる前記焦点のまわりで前記抑制光の少なくとも２つのドーナツ形状の強度副分布に結びつく前記共通光軸に関して横にオフセットされる少なくとも２つの偏光副分布を前記偏光分布が備えるように、前記複屈折色彩光学素子がそのビーム断面にわたって前記抑制ビームの前記偏光分布を形成するように適応される、ことを特徴とする請求項１７の蛍光走査顕微鏡。
そのビーム断面にわたって平均偏光がいつでもゼロであるように、前記複屈折色彩光学素子が前記抑制ビームの前記偏光分布を形成するように適応される、ことを特徴とする請求項１〜１８のいずれか一項の蛍光走査顕微鏡。
請求項１〜１９のいずれか一項の、かつさらに、複数の強度０を呈する前記抑制光の強度分布および各々が前記強度０の１つに位置する複数の最大値を有する前記励起光の強度分布を生成するように適応される複数スポット配置、を備え、前記検出器が、前記個々の強度０に位置する前記フルオロフォアによって自発的に放出される蛍光を別々に検出するように適応される、ことを特徴とする蛍光走査顕微鏡。