JP5590683B2 - Tnik阻害剤およびその使用 - Google Patents
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Description
また、本発明は新規なアミノチアゾール誘導体に関する。
大腸癌の80%以上は大腸腺腫様ポリポーシス(APC)遺伝子の変異を示し、残りの2分の1はCTNNB1遺伝子における変異を示し、結果としてβ−カテニンの蓄積およびWntシグナリングの構成的活性化を生じる。β−カテニンは、T細胞因子(TCF)/リンパ球エンハンサー因子(LEF)ファミリーDNA結合タンパク質との複合体の形成によって、およびそれらの標的遺伝子のトランス活性化によって、その腫瘍形成活性を発揮する。TCF4は、大腸癌細胞において共通して発現され、大腸の発癌性に関わる、TCF/LEFファミリーのメンバーである。我々は、以前に、2つの大腸癌細胞株(DLD1およびHCT−116)において、抗TCF4抗体および抗β−カテニン抗体により共通して免疫沈降される70のタンパク質のうちの1つとしてTNIKを同定した(非特許文献1)。DLD1はAPC遺伝子における短縮型変異および他方の対立遺伝子の消失を有しており、HCT−116はCTNNB1遺伝子中にミスセンス変異を有している。TNIKは抗TCF4抗体または抗β−カテニン抗体による免疫沈降物中に検出されるが、対照のIgGによる免疫沈降物中には検出されない。反対に、β−カテニンタンパク質およびTCF4タンパク質は抗TNIKの抗体により免疫沈降され、TCF4タンパク質、β−カテニンタンパク質およびTNIKタンパク質が大腸癌細胞において複合体を形成することを示す。2−ハイブリッド分析により、TNIKは、キナーゼドメインを含む1〜289位のアミノ酸を介してTCF4と相互作用することが明らかにされた。TCF4の100〜216位のアミノ酸がTNIKとの相互作用のために必要であった。
次に、我々は、β−カテニンおよびTCF4複合体の転写活性に対するTNIKの効果を調べた。HEK293細胞およびHeLa細胞は、野生型のAPC遺伝子およびCTNNB1遺伝子を有する。N末端グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)リン酸化部位の欠失によって安定化させたβ−カテニン(β−カテニンΔN134)によるこれらの細胞の一過性トランスフェクションは、モックトランスフェクションと比較して、標準TCF/LEFのレポーター(TOP−FLASH)のルシフェラーゼ活性を増加させたが、変異レポーター(FOP−FLASH)のルシフェラーゼ活性を増加させなかった。血球凝集素(HA)を標識化した野生型TNIK(WT)によるコトランスフェクションは、β−カテニンに誘発される転写活性、ならびにHEK293細胞およびHeLa細胞によるコロニー形成をさらに促進したが、TNIK(K54R)によるコトランスフェクションでは促進しなかった。TNIKは、β−カテニンΔN134の非存在下において、転写活性またはコロニー形成に有意には影響することはなく、TNIKの効果がWntシグナリングの活性化に依存することがわかる。TNIKによるDLD1細胞およびHCT−116細胞の一過性トランスフェクションもまた、それらのTCF/LEFの転写活性およびコロニー形成を促進したが、TNIK(K54R)による一過性トランスフェクションは促進しなかった。
5−(3−メチルベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(2−フルオロベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(4−メトキシベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(3−メトキシベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(フェニルアミノ)−5−(2−(チオフェン−2−イル)アセトアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(3−メチルブタンアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(2−シクロペンチルアセトアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(2−フルオロベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(4−アセトアミドベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(2−クロロベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(3−ブロモベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(2,6−ジフルオロベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(3,4−ジメトキシベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(チオフェン−2−カルボキサミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(p−トルイジノ)−5−(2−エチルブタンアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
2−(エチルアミノ)−5−(8−メチル−2−フェニルキノリン−4−カルボキサミド)チアゾール−4−カルボキサミド
置換基を有するアミノチアゾール(IV’)はスキーム4に示すように、アニリンもしくはアミノヘテロ芳香族化合物(VII’)と2−ハロゲノチアゾール化合物(VI’)のパラジウム触媒反応によって製造することができる。
式(I’)で示される化合物として、具体的な化合物を表1−1〜表1−22に示す。
試験例1
ヒトTNIK(NM_015028.1)のキナーゼドメインを含むN末端セグメント(TNIK_N、残基1〜314)をコードするcDNAを、以下のプライマーを用いて、PCRによってヒト組織(バイオチェイン(Biochain)社)から合成したcDNA混合物から増幅した:
5’−ATTCGAAAGCGGCCGCTCATCCTCGCTTCTTCTTTGTTCTAT−3’([配列番号2]リバースプライマー、下線を引いたヌクレオチドはNotI部位の位置を示す)。
キナーゼ分析は384ウェルプレート(グライナー(Greiner)社)を用いて20μlの体積で行った。反応混合物は、化合物または賦形剤(1%DMSO)、0.08ng/μl TNIK_N、1μM FITC標識基質ペプチドのFITC−x−Lys−Tyr−Lys−Thr−Leu−Arg−Gln([配列番号3]x:ε−アミノカプロン酸)、20mMヘペス(pH7.5)、0.01%トリトンX−100、5mM MgCl2、25μM ATPおよび2mM DTTからなる。ブランクとしては、TNIK_Nを賦形剤(1%DMSO)の反応混合物から除外した。キナーゼ反応は室温で1時間行ない、60μlの終結バッファー(127mMヘペス(pH7.5)、26.7mM EDTA、0.01%トリトンX−100、1%DMSOおよび0.13%コーティング試薬3(キャリパー・ライフサイエンス(Caliper Life Sciences)社))を添加することによって停止させた。非リン酸化FITC標識基質ペプチドおよびリン酸化FITC標識基質ペプチドの量は、モビリティシフトマイクロフルイディックテクノロジー(Mobility Shift Micro−Fluidic Technology)(キャリパーLC3000システム、キャリパー・ライフサイエンス社)によって検出した。
化合物の阻害は以下のように計算した;
阻害(%)=(1−(A−C)/(B−C))×100
A:化合物ウェルの平均のP/(P+S);
B:賦形剤ウェルの平均のP/(P+S);
C:ブランクのウェルの平均のP/(P+S)
結果:
試験結果を表2−1〜表2−4中に示す。
選択性プロファイリングテスト:
20のチロシンキナーゼおよび30のセリン/スレオニンキナーゼに対する化合物1の抑制効果を、クイックスカウト(QuickScout)(商標)TKおよびSTKスクリーニングパネル(カルナ・バイオサイエンス(Carna Biosciences)社、神戸、日本)を用いて調べた。化合物1のIC50値を表3中に示す。この結果は、化合物1が他の50のキナーゼよりも強力に(IC50;9nM)TNIK_Nを阻害することを明らかにした。
化合物1の選択性プロファイリング
TCF/リンパ球エンハンサー因子(LEF)レポーター遺伝子分析:
ヒト大腸癌細胞株のDLD−1およびHCT−116を、ヒューマンサイエンス研究資源バンクおよび米国培養菌保存施設からそれぞれ入手した。pCIneo−HAベクター(プロメガ社)の中へ挿入した全長ヒトTNIKは、ケンイチ・カリヤ(Kenichi Kariya)博士(琉球大学)から快く贈られた。DLD1細胞およびHCT−116細胞を、標準TCF/LEFルシフェラーゼレポーター(TOP−FLASH)または変異体TCF/LEFルシフェラーゼレポーター(FOP−FLASH)、phRL−TK(プロメガ社)(内部標準)、およびpCIneo−HA−TNIKまたはpCIneo−HA(対照プラスミド)により三回コトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に、化合物1または賦形剤を、0.078125μM、0.15625μM、0.3125μMおよび0.625μMの最終濃度で細胞に加えた。続く24時間後に、レポーター活性を、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(プロメガ社)を用いることによって、取扱説明書に従って分析した。テスト結果を図1中に示す。結果を各サンプルのウミシイタケ属の値に対して正規化した。レポーター分析結果は、三回の分析の平均および標準偏差を表わす。化合物1は、濃度依存的様式でDLD1およびHCT−116においてβ−カテニン/TCF4仲介性転写を阻害した。
以下の実施例は、例を挙げたのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の説明で使用される略語、記号の意味は次の通りである。
D2O: 重水
DCM: ジクロロメタン
DMA: ジメチルアセトアミド
DMF: ジメチルホルムアミド
DMSO: ジメチルスルホキシド
EtOH: エタノール
EtOAc: 酢酸エチル
HCl: 塩酸
K2CO3: 炭酸カリウム
MeOH: メタノール
MgSO4: 硫酸マグネシウム
NaHCO3:炭酸水素ナトリウム
Na2SO4: 硫酸ナトリウム
NH4Cl: 塩化アンモニウム
NH3: アンモニア
N2: 窒素
POCl3: オキシ塩化リン
THF: テトラヒドロフラン
TFA: トリフルオロ酢酸
Xantphos: 4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン
EDC: 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
HOBT: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
min.: 分
h or hr(s): 時間
RT or rt: 室温
sat.: 飽和
aq.: 水溶液
TLC: 薄層クロマトグラフィー
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
Prep HPLC: 分取HPLC
LC/MS: 高速液体クロマトグラフ質量分析計
MS: 質量分析計
NMR: 核磁気共鳴
5−(4−アセタミドベンズアミド)−2−(4−フルオロフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
(a)5−アミノ−2−(4−フルオロフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(4−アセタミドベンズアミド)−2−(4−ハイドロキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
tert−ブチル−4−[5−(4−アセタミドベンズアミド)−4−カルバモイルチアゾール−2−イルアミノ]フェニルカーバメート
下記表5−1〜表5−2に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例18の方法に従い合成した。
5−(4−アセトアミドベンズアミド)−2−(4−アミノフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(4−フルオロベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
下記表6に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例21の方法に従い合成した。
2−(4−メトキシフェニルアミノ)−5−[4−(4−メチルピペラジン−1−イル)ベンズアミド]チアゾール−4−カルボキサミド
下記表7−1〜表7−6に示される化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例22の方法に従い合成した。
5−(4−アセトアミドベンズアミド)−2−(4−アセトアミドフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(4−アミノベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(4−ヒドロキシベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−[4−(2−ヒドロキシアセトアミド)ベンズアミド]−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−{4−[2−(ジメチルアミノ)アセトアミド]ベンズアミド}−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
下記表8に示す各化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例38の方法に従い合成した。
2−(4−メトキシフェニルアミノ)−5−{4−[(4−メチルピペラジン−1−イル)メチル]ベンズアミド}チアゾール−4−カルボキサミド
下記表9に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例44の方法に従い合成した。
2−(4−メトキシフェニルアミノ)−5−{4−[2−(ピロリジン−1−イル)エトキシ]ベンズアミド}チアゾール−4−カルボキサミド
下記表10に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例45の方法に従い合成した。
5−(4−メトキシベンズアミド)−2−(ピリジン−4−イルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
表11に示す各化合物は、適当な出発物質を用いて実施例47の方法に従い合成した。
2−(4−メトキシフェニルアミノ)−5−{4−[N−(メチルスルホニル)メチルスルホンアミド]ベンズアミド}チアゾール−4−カルボキサミド
2−(4−メトキシフェニルアミノ)−5−[4−(メチルスルホンアミド)ベンズアミド]チアゾール−4−カルボキサミド
5−(3−アミノ−4−メチルベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
下記表12に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例64の方法に従い合成した。
5−(4−メトキシベンズアミド)−2−[4−(2−メトキシエトキシ)フェニルアミノ]チアゾール−4−カルボキサミド
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.31 (s, 3H), 3.69 (t, 2H, J = 4.4 Hz), 4.25 (t, 2H, J = 4.1 Hz), 7.16 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 9.0 Hz). LCMS m/z [M+H] + 198.4.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) 3.4 (s, 3H), 3.6-3.7 (m, 2H), 4.0-4.1 (m, 2H), 6.60 (br, 1H), 6.75-6.90 (m, 4H), 7.49 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 9.33 (s, 1H).
2−(6−アミノピリジン−3−イルアミノ)−5−(4−メトキシベンズアミド)チアゾール−4−カルボキサミド
表13に示す実施例79は、適当な出発物質を用いて上記実施例70の方法に従い合成した。
5−(3−アミノ−4−メトキシベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
5−(3−アミノ−4−フルオロベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
下記表14に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例83の方法に従い合成した。
表15に示す実施例91は、適当な出発物質を用いて下記実施例94の方法に従い合成した。
5−(4−メトキシベンズアミド)−2−[4−(2−プロピニルオキシ)フェニルアミノ]チアゾール−4−カルボキサミド
mL)を3時間還流した。反応混合物を濃縮して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、5%メタノール−DCM溶液で溶出して0.2 g(収率36%)の標記化合物を得た。
5−(3,4−ジアミノベンズアミド)−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
下記表16−1〜表16−2に示す化合物は、適当な出発物質を用いて上記実施例103の方法に従い合成した。
5−[3−アミノ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)ベンズアミド]−2−(4−メトキシフェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
表17に示す実施例128は、適当な出発物質を用いて上記実施例120の方法に従い合成した。
5−[3−アミノ−4−(2−メトキシエトキシ)ベンズアミド]−2−(2−フルオロピリジン−4−イルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド
錠剤の調製:
各々100mgの5−(4−アセトアミドベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド(化合物1)を含む錠剤は、以下の手順によって得る。
化合物1、コーンスターチおよび微結晶性セルロースを混合し、混合物を、50重量部の水中に溶解したヒドロキシプロピルセルロースに加え、続いて十分に混練する。混練した混合物は、粒状にするためにふるいにかけ、乾燥し、ステアリン酸マグネシウムと混合し、次に各々が250mgの錠剤になるように圧縮する。
顆粒剤の調製:
5−(4−アセトアミドベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド(化合物1)を含む顆粒剤を、以下の手順によって得る。
化合物1、ラクトースおよびコーンスターチを混合し、混合物は、120重量部の水中に溶解したヒドロキシプロピルセルロースに加え、続いて十分に混練する。混練した混合物を粒状にするために20メッシュのふるいにかけ、乾燥し、次に大きさを調整して500mgの顆粒あたり200mgの化合物1を含む顆粒剤を得た。
カプセル剤の調製:
各々が100mgの5−(4−アセトアミドベンズアミド)−2−(フェニルアミノ)チアゾール−4−カルボキサミド(化合物1)を含むカプセルを、以下の手順によって得る。
化合物1、ラクトース、コーンスターチおよびステアリン酸マグネシウムを十分に混合し、200mgの粉末混合物の各々をカプセル化してカプセル剤を得る。
参照方法
方法の要約
免疫沈降、イムノブロット、免疫蛍光顕微鏡、免疫組織化学、質量分析、2−ハイブリッド分析、ルシフェラーゼレポーター分析、コロニー形成、リアルタイムRT−PCR、体軸形成分析およびアニマルキャップ分析の方法論の詳細は、「詳細な方法」において記載されている。この研究で用いられる抗体は商業的に入手可能である。マウスおよびツメガエル属の実験は、国立がんセンター研究所(National Cancer Center Research Institute)(東京、日本)の、日本の法律によって規定された倫理的要件をすべて満たすガイドラインに従って実行した。信頼できる結果を得るために必要な最少数のマウスを用い、安楽死させた。患者は、研究目的のための材料の収集および使用に権限を与える明文化されたインフォームドコンセントを受けた。実験的プロトコールは、施設内の倫理および組換え安全委員会によって検閲および承認された。
ヒト胎児腎臓細胞株HEK293およびヒト大腸癌細胞株DLD1は、ヒューマンサイエンス研究資源バンク(Health Science Research Resources Bank)(大阪、日本)から得た。ヒト子宮頸癌細胞株HeLaは理研細胞バンク(Riken Cell Bank)(筑波、日本)から得た。ヒト大腸癌細胞株のHCT−116およびWiDrは米国培養菌保存施設(American Type Culture Collection)(ロックヴィル、メリーランド)から購入した。
以前に記述されたように、全細胞溶解物を調製した。溶解物を表示された抗体または関連の対照IgGと共に4℃で一晩インキュベートし、ダイナビーズ(Dynabeads)プロテインG(ダイナル・バイオテク(Dynal Biotech)社、オスロ、ノルウェー)により沈殿させた。
タンパク質サンプルをSDS−PAGEによって分画し、イモビロンPメンブレン(ミリポア(Millipore)社、ビレリカ、マサチューセッツ)上にブロットした。一晩4℃での一次抗体を用いたインキュベーション後に、ブロットを、関連のホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体、およびECLウェスタンブロッティング検出試薬(GEヘルスケア(GE Healthcare)社、ジャイルズ、イギリス)により、検出した。ブロットの強度は、LAS−3000スキャナーおよびサイエンス・ラボ(Science Lab)2003ソフトウェア(富士フィルム(Fuji Film)社、東京、日本)を用いて定量した。
SDS−PAGEゲルにおけるタンパク質バンドをクマシーブルー染色によって可視化し、以前に記述されたように修飾トリプシン(プロメガ(Promega)社)を用いて消化した。トリプシンペプチドを濃縮し、500−μm i.d.×1mm HiQ sil C18−3トラッピングカラム(KYAテクノロジーズ(KYA Technologies)社、東京、日本)により脱塩した。次にペプチドを150−μm i.d.×5cm C18W−3分離カラム(KYA)を用いて、0〜80%のアセトニトリル勾配(1時間、200nL/分)により分画し、ナノスプレーイオン源(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社、フォスターシティー、カリフォルニア)を装備したQ−スターパルサー−i(Q−Star Pulsar−i)質量分析計により分析した。タンパク同定の信頼性は、ProIDソフトウェア(アプライド・バイオシステムズ社)を用いて、信頼値を計算することによって推定した。
ヒトTNIK(Traf2−およびNck相互作用キナーゼ)発現コンストラクト[pCIneoHA−TNIKおよびその変異体(K54R)]は、M.ウミカワ(Umikawa)博士およびK.カリヤ(Kariya)博士(琉球大学、西原町、日本)によって快く提供された。TNIKタンパク質の異なる部分をコードするcDNA配列を、pBind(プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン)中へサブクローン化した。ヒトTCF4(T細胞因子−4)(スプライシング型E)およびNH2末端の134のアミノ酸配列を欠くβ−カテニンcDNAを、pFLAG−CMV4(シグマ・アルドリッチ(Sigma−Aldrich)社、セントルイス、ミズーリ)中へサブクローン化した。全長ヒトTCF4のcDNAおよびその短縮型をpAct(プロメガ)中へサブクローン化した。TCF4S154Aと称されたTCF4の変異型は、セリン(S)154残基をアラニン(A)に変化させるために、オリゴGGCCCCATCACCGGCACACATTGTCTCTA([配列番号4])およびGGGGCATCCTTGAGGGCTTGTCTACTCTG([配列番号5])により、クィックチェンジ(QuikChange)変異誘発キット(ストラタジーン(Stratagene)社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア)を用いて構築された。全長ヒトTCF4のcDNAおよびTCF4S154AのcDNAを、pEU−E01−MCS(セルフリー・サイエンス(CellFree Science)社、松山、日本)中へサブクローン化した。
TNIKタンパク質とTCF4タンパク質との間の物理的相互作用は、チェックメイトマンマリアン2−ハイブリッドシステム(CheckMate Mammalian Two−hybrid system)(プロメガ社)を用いて、供給業者によって提供される指示に従って評価した。HEK293細胞を、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000試薬(インビトロジェン(Invitrogen)社、カールスバード、カリフォルニア)を用いて、pBind、pActおよびpG5luc(プロメガ社)プラスミドにより三回コトランスフェクションした。
核タンパク質は、NE−PER核および細胞質抽出試薬(Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents)(ピアース(Pierce)社、ロックフォード、イリノイ)を用いて抽出した。
グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質は、ENDEXTコムギ麦芽発現キット(ENDEXT Wheat Germ Expression Kit)(セルフリー・サイエンス社、松山、日本)を用いて合成した。HA(血球凝集素)標識化組換えTNIKタンパク質は、ウサギ網状赤血球溶解物(TnT T7クイックカップル転写/翻訳システム(Quick Coupled Transcription/Translation System))(プロメガ社、マディソン、ウイスコンシン)を用いて合成した。
カバーグラス(旭テクノグラス(Asahi Technoglass)社、東京、日本)上に培養した細胞を、室温で10分間4%パラホルムアルデヒドにより固定し、0.2%トリトンX−100により透過性にした。10%正常ブタ血清(ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)社、バーリンゲーム、カリフォルニア)によるブロッキング後に、細胞を一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、続いてアレクサフルオル(Alexa fluor)−594抗マウス抗体およびアレクサフルオル−488抗ウサギ抗体(インビトロジェン社)と共にインキュベートした。標本は、レーザー走査顕微鏡(LSM5 PASCAL;カール・ツァイス(Carl Zeiss)社、イェーナ、ドイツ)により検査した。
2本鎖低分子干渉RNA(siRNAs)、TNIK−J−004542−12(センス:[配列番号6]5’−CGACAUACCCAGACUGAUAUU−3’;アンチセンス:[配列番号7]5’−PUAUCAGUCUGGGUAUGUCGUU−3’)およびTNIK−J−004542−13(センス:[配列番号8]5’−GACCGAAGCUCUUGGUUACUU−3’;アンチセンス:[配列番号9]5’−PGUAACCAAGAGCUUCGGUCUU−3’)は、ダーマコン(Dharmacon)社(シカゴ、イリノイ)によって合成およびアニールされた。2つの対照RNA(XおよびIX)をダーマコン社から購入した。
次の段落で示される「T」の文字は、「U」を意味する。便宜上、RNA配列中の「U」の変わりに、「T」が用いられることがある。
ヒトTNIK(T1、[配列番号10]ACACACTGGTTTCCATGTAAT;T2、[配列番号11]AGAGAAGGAACCTTGATGATT;T3、[配列番号12]AGAAAGATTTCGGTGGTAAAT)および陰性対照(C、[配列番号13]GGAATCTCATTCGATGCATAC)のための、ショアサイレンシング(SureSilencing)短鎖ヘアピン(sh)RNAプラスミドを、スーパー・アレイ・バイオサイエンス(SuperArray Bioscience)社(フレデリック、メリーランド)から購入した。
1対のルシフェラーゼレポーターコンストラクト(TOP−FLASHおよびFOP−FLASH(アップステート(Upstate)社、シャーロッツヴィル、バージニア))を、TCF/LEF(リンパ球エンハンサー因子)の転写活性の評価のために用いた。細胞を、ルシフェラーゼレポーターのうちの1つおよびphRL−TK(プロメガ社)により三回一過性トランスフェクションを行なった。ルシフェラーゼ活性を、内部対照としてウミシイタケルシフェラーゼ活性を用いて、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Dual−luciferase Reporter Assay system)(プロメガ社)により測定した。
トランスフェクションの24時間後に、750、400、300および1000μg/mlのG418(ジェネティシン、インビトロジェン社)を、HEK293細胞、HeLa細胞、DLD1細胞およびHCT−116細胞の培養培地にそれぞれ加えた。細胞は8日間の選択後にギムザ液(和光純薬社(Wako)、大阪、日本)により染色した。
全RNAをRNイージーミニキット(RNeasy Mini Kit)(キアゲン(Qiagen)社、バレンシア、カリフォルニア)により調製した。DNase I処理したRNAはランダムプライミングし、スーパースクリプトII(SuperScript II)逆転写酵素(インビトロジェン社)を用いて逆転写した。タックマン(TaqMan)ユニバーサルPCRマスターミックス、ならびにあらかじめデザインしたタックマン遺伝子発現プローブおよびプライマーセットは、アプライド・バイオシステムズ社から購入した。レポーター蛍光の増加として測定された増幅データーは、プリズム(PRISM)7000配列検出システム(アプライド・バイオシステムズ社)を用いて収集した。内部対照[ヒトについてはβ−アクチン(ACTB)またはツメガエル属についてはオルニチンデカルボキシラーゼ(odc)]と比較したmRNA発現レベルを、比較閾値サイクル(CT)方法によって計算した。
0.1mlのPBS中に懸濁した5×106のHCT116細胞、DLD1細胞またはWiDr細胞を、5週令メスBALB/c nu/nuヌードマウス(SLC社、東京、日本)の横腹へ皮下接種した。1週間後に、発達した腫瘍を、アテロコラーゲン(アテロジーン(AteloGene);高研(KOKEN)社、東京、日本)と共にsiRNAにより処理した(Takeshita, F. et al. Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12177 (2005))。siRNAの最終濃度は30μMであり、アテロコラーゲンの最終濃度は0.5%であった。0.2mlの体積のsiRNA溶液を、各腫瘍へ直接注入した。腫瘍体積は、V=A×B2π/6(式中、AおよびBは最大および最小の寸法を表わす)として決定されたBergers, G. et al. Effects of angiogenesis inhibitors on multistage carcinogenesis in mice. Science 284, 808 (1999))。
50症例の散発性結腸直腸癌を、国立がんセンター病院(National Cancer Center Hospital)(東京、日本)の病理アーカイブパネルから選択した。免疫ペルオキシダーゼ染色を、以前に記述されたようなアビジンビオチン複合体法を用いて実行した。
アフリカツメガエル胚の調製ならびに顕微注入は以前に記述された。卵をインビトロで受精させ、1%チオグリコール酸ナトリウム溶液により脱ゼリーした。胚はニュークープ(Niewkoop)およびファーバー(Faber)に従ってステージングした。キャッピングしたmRNAは、インビトロの転写(mMESSAGE mMACHINEキット;アンビオン(Ambion)社、オースティン、テキサス)によって合成した。5%フィコールを含むスタインバーグ氏液中で注入を実行した。
pCS2−FLAG−ツメガエル属β−カテニン(Xβ−カテニン)はS.ソコール(Sokol)博士(マウントサイナイ医科大学(Mount Sinai School of Medicine)、ニューヨーク、ニューヨーク州)によって快く提供され、pCS2−nβ−GalはD.ターナー(Turner)博士、R.ルップ(Rupp)博士およびJ.リー(Lee)博士(フレッドハッチンソンガン研究センター(Fred Hutchinson Cancer Research Center)、シアトル、ワシントン)によって快く提供された。pCS2+−MycおよびpCS2+−HAは、M.タイラ(Taira)博士(東京大学(University of Tokyo)、東京、日本)によって快く提供された。
LOC443633(XTNIK)のオープンリーディングフレーム(ORF)および5’−非翻訳領域(5’UTR)(アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド(MO)のXTNIK−MO1またはXTNIK−MO3によって認識される)を、アフリカツメガエルイメージ(IMAGE)cDNAクローンMXL1736−98358477(オープン・バイオシステムズ(Open Biosystems)社、ハンツヴィル、アラバマ)からPCR増幅し、pCS2+−Mycの中へサブクローン化した(pCS−XTNIK−WT−Myc)。リジン(K)54残基をアルギニン(R)へ変化させるために、pCS−XTNIK−WT−Mycの変異型(pCS−XTNIK−K54R−Myc)を、[配列番号14]オリゴのAGGGTCATGGATGTCACAGGGGATGおよび[配列番号15]AATAGCTGCAAGCTGTCCGGTTTTAACによる変異誘発によって構築した。
XTNIKのORF配列(XTNIK−MO1またはXTNIK−MO3によって認識されない)を、オリゴの[配列番号16]ATGGCcAGtGAtTCtCCGGCTCGTAGCCTGGATGA(小文字は修飾を示す)および[配列番号17]ATCGATGGGATCCTGCAAAAAGAACAAによる変異誘発によって構築した(pCS2−XTNIKORF−HA)。
ツメガエル属TNIKについてのアンチセンスMO(XTNIK−MO1およびXTNIK−MO3)、および対応する対照MO[XTNIK−MO1およびXTNIK−MO3の配列内に5つのヌクレオチド置換を保有する(5mis−Controls−1および5mis−Controls−3)]は、ジーン・ツールズ(Gene Tools)社(フィロマス、オレゴン)から得た。データベース検索により、アフリカツメガエルにおいて、XTNIK−MO1およびXTNIK−MO3の相補物に対する有意な相同配列が存在しないことが確認された。この研究において用いられるMOの配列は、XTNIK−MO1([配列番号18];5’−GGGAGTCGCTCGCCATGTTTCCTTT−3’)、XTNIK−MO3([配列番号19];5’−CCCCGTTCTTTCCACCTTGCGGCTG−3’)および5mis−Control−1([配列番号20];5’−GGCAGTGGCTCCCCATCTTTCGTTT−3’)および5mis−Control−3([配列番号21];5’−CCGCGTTGTTTCGACCTTCCGCCTG−3’)であった。
5’UTR、5’−非翻訳領域;AC、アニマルキャップ;APC、大腸腺腫様ポリポーシス;Atelo、アテロコラーゲン;β−Cat、β−カテニン;CML、慢性骨髄性白血病;CNH、シトロン相同性;Cont、対照;GSK3β、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β;GST、グルタチオンS−トランスフェラーゼ;HA、血球凝集素;IP、免疫沈降;LEF、リンパ球エンハンサー因子;MO(s)、モルホリノオリゴヌクレオチド;N.D.、検出されない;n−βgal、核のβ−ガラクトシダーゼ;NLS、核移行シグナル;N.S.、有意でない;ORF、オープンリーディングフレーム;pSer、フォスフォセリン;RT、逆転写;shRNA、短鎖ヘアピンRNA;siRNA、低分子干渉RNA;TCF(4)、T細胞因子(−4);TNIK、Traf2−およびNck相互作用キナーゼ;WT、野生型。
Claims (3)
- 有効成分として下記一般式(I’)
- 有効成分として、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を含有する医薬組成物。
- 前記治療目的が大腸癌である、請求項2に記載の医薬組成物。
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