JP5562886B2 - 生体分子計測システム及び生体分子計測方法 - Google Patents
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Description
蛍光分子の光吸収遷移にかかわる電気双極子を遷移双極子(モーメント)と呼び、その方向を、次で定義する。すなわち、蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が励起光の偏光方向と一致したとき最大の励起光吸収が起き、最大の蛍光が生じるが、最大の蛍光が得られた時の偏光方向を遷移双極子モーメントの方向と定義する。なお、パルスレーザを用いて励起したとき、最大吸収の偏光方向と蛍光の偏光方向は一致しないが、これは、分子の回転によって遷移双極子モーメントが回転するために生じる。
[実施例1]
この実施例は、溶液中に分散したDNA又はRNAのうち特定の配列を持つものを定量対象分子として定量するために、この配列の一部と相補的な配列を持つ蛍光プローブを用いる例である。
次に、蛍光分子と結合分子から形成した蛍光プローブを定量対象分子と結合させて複合体を形成するのではなく、3種類の役割の分子を混合することによって定量対象分子の定量を行う実施例について説明する。
基板表面に定量対象分子を捕捉した状態で定量する実施例について説明する。本実施例では、定量対象分子と特異的に結合する結合分子を基板表面に固定し、基板表面上で蛍光分子との複合体を振動させ、蛍光の変調成分のみを計測することによって、SB比を向上させる。本実施例では定量対象分子を基板表面に捕捉するため、定量対象分子に結合していない蛍光分子が基板表面に非特異的に吸着し、これを完全に洗浄することが困難である。そのため、基板表面に吸着した蛍光分子からの蛍光と複合体からの蛍光とを分離して計測することが重要である。
受光する蛍光の偏光成分についての情報を得て、複合体と非結合の蛍光体の分離能を向上する本実施例について説明する。
本実施例は、混合溶液中に含まれる複数種類の定量対象分子を同時に計測するために実施例4の方法を応用する例である。
2 励起光
3 光学素子
4 視野レンズ
5 ダイクロイックミラー
6 対物レンズ
7 容器
8 サンプル溶液
9 計測領域
11 定量対象分子
12 蛍光プローブ
13 複合体
14 結像レンズ
15 撮像素子
16 遷移双極子モーメントの方向
20,21 信号発生器
22 位相シフタ
23〜26 電極
27 演算部
51 蛍光分子
52 結合分子
53 複合体
71 石英基板
72〜75 電極
76 直流電源
81 定量対象分子
90 複合体
Claims (15)
- 蛍光を利用して生体分子を定量する生体分子計測システムであって、
定量対象となる生体分子、蛍光分子、並びに前記生体分子及び前記蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液を保持する保持部と、
偏光した励起光を前記溶液に照射する励起光源と、
前記溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光を検出する受光部と、
前記受光部による蛍光検出信号を処理する演算部とを有し、
前記受光部は撮像素子を有し、前記蛍光検出信号は蛍光スポット像であり、
前記複合体は電気双極子モーメントを持ち、前記変調電界の印加によって前記複合体中の前記蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が前記励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化し、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第1の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第2の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。 - 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、蛍光の特定の偏光成分を前記受光部に入射させる手段、あるいは偏光状態によって蛍光を分離する手段を設けたことを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、異なる波長の蛍光スポット像を同時に取得する手段を有することを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、前記撮像素子の前に前記蛍光分子からの蛍光を増幅する増幅手段を有し、前記増幅手段は、前記変調電界の変調周期に同期して前記蛍光を増幅することを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、前記変調電界の変調周期に同期して前記励起光の強度を変調する手段を有することを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、前記溶液中で、前記生体分子の電荷の符号と前記結合分子の電荷の符号又は前記蛍光分子と前記結合分子とからなる蛍光プローブの電荷の符号が異なることを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、前記演算部は、前記変調電界の印加から検出された蛍光の強度ピークまでの時間遅延を測定することを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、前記電界印加部は、前記複合体の共鳴周波数で前記電界の方向を周期的に変化させることを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項1に記載の生体分子計測システムにおいて、前記電界印加部は、電界を変化させる周波数を前記複合体の緩和振動周波数より高い周波数と低い周波数の2種類の周波数とし、前記演算部は、前記2種類の周波数に対する蛍光強度変化の応答の差を測定することを特徴とする生体分子計測システム。
- 蛍光を利用して生体分子を定量するための生体分子計測システムであって、
定量対象となる生体分子を捕捉するための分子が固定された基板を備え、前記生体分子、蛍光分子、並びに前記生体分子及び前記蛍光分子と複合体を形成するための結合分子を含有する溶液とを保持する保持部と、
偏光した励起光を前記溶液に照射する励起光源と、
前記溶液に方向が周期的に変化する変調電界を印加する電界印加部と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光スポット像を検出する撮像素子と、
前記蛍光スポット像を処理する演算部とを有し、
前記生体分子と前記蛍光分子と前記結合分子の複合体が電気双極子モーメントを持ち、
前記変調電界の印加によって、前記複合体中の前記蛍光分子の遷移双極子モーメントの方向が前記励起光の偏光方向又は偏光面に対して周期的に変化し、
前記演算部は、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第1の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第2の蛍光スポット像を減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに前記生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。 - 請求項10に記載の生体分子計測システムにおいて、前記積算画像から一分子ずつカウンティングによって前記生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測システム。
- 請求項10又は11に記載の生体分子計測システムにおいて、前記励起光は複数の偏光成分を含むことを特徴とする生体分子計測システム。
- 蛍光を利用して生体分子を定量するための生体分子計測方法であって、
定量対象となる生体分子と、遷移双極子モーメントを有する蛍光分子と、結合分子とを含み電気双極子モーメントを有する複合体を形成する工程と、
前記複合体を含有する溶液に、方向が周期的に変化する変調電界を印加した状態で、偏光した励起光を照射する工程と、
前記励起光照射によって前記蛍光分子から発生された蛍光信号を検出する検出工程と、
前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングの蛍光信号から最小になるタイミングの蛍光信号を減算した値を複数周期にわたって積算する処理工程と、を有し、
前記検出工程では撮像素子によって蛍光スポット像を検出し、
前記処理工程では、前記変調電界の変調周期に同期して変化する成分が最大になるタイミングで取得した第1の蛍光スポット像から最小になるタイミングで取得した第2の蛍光スポット像を対応する画素毎に減算した差分画像を複数周期にわたって積算する処理を行い、得られた積算画像をもとに生体分子を定量することを特徴とする生体分子計測方法。 - 請求項13に記載の生体分子計測方法において、前記結合分子を別の分子として前記生体分子を含む溶液に混合する工程を有することを特徴とする生体分子計測方法。
- 請求項13に記載の生体分子計測方法において、
複数種類の生体分子を前記定量対象とし、蛍光分子と結合分子からなる複数種類の蛍光プローブを溶液中に混合する工程と、
前記複数種類の蛍光プローブから発生される複数の蛍光波長の前記変調電界に対する周波数応答の違いを計測して、各蛍光プローブの定量対象分子内での結合位置を測定する工程とを有し、
複数の生体分子を同時に定量することを特徴とする生体分子計測方法。
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