JP5550026B2

JP5550026B2 - Transgenic non-human animal capable of producing heterologous antibody

Info

Publication number: JP5550026B2
Application number: JP2012107022A
Authority: JP
Inventors: ロンバーグニルス; エム．カイロバート
Original assignee: ジェンファームインターナショナル，インコーポレイティド
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 2012-05-08
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2029-07-16
Also published as: CA2161351C; EP0754225A4; JPH08509612A; JP5099405B2; CA2161351A1; JP2012143252A; JP2007054076A; AU6819494A; EP0754225A1; WO1994025585A1

Description

本発明によって以下が提供される。 The present invention provides the following.

図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を表す。FIG. 1 shows complementarity determining regions CDR1, CDR2 and CDR3 and framework regions FR1, FR2, FR3 and FR4 in unrearranged genomic DNA and in mRNA expressed from a rearranged immunoglobulin heavy chain gene. Represents. 図２はヒトλ鎖遺伝子座を表す。FIG. 2 represents the human λ chain locus. 図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。FIG. 3 represents the human kappa chain locus. 図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。FIG. 4 represents the human heavy chain locus. 図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５ｋｂ断片に次いでラット鎖３’エンハンサー配列を含む７００ｂｐ断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。FIG. 5 represents a transgene construct containing a rearranged IgM gene linked to a 25 kb fragment containing human γ3 and γ1 constant regions followed by a 700 bp fragment containing the rat chain 3 'enhancer sequence. 図６は、生体内相同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。FIG. 6 is a restriction map of the human kappa chain locus representing fragments that can be used to form light chain transgenes by in vivo homologous recombination. 図７はｐＧＰ１の作製を示す。FIG. 7 shows the preparation of pGP1. 図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカーの構成を示す。FIG. 8 shows the structure of the polylinker contained in pGP1. 図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。FIG. 9 shows the fragments used to make the human heavy chain transgenes of the present invention. 図１０はｐＨＩＧｌおよびｐＣＯＮ１の作製を示す。FIG. 10 shows the production of pHIG1 and pCON1. 図１１は、ｐＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。FIG. 11 shows the human Cγ1 fragment inserted into pRE3 (rat enhancer 3 ′) to form pREG2. 図１２は、ｐＨＩＧ３’およびｐＣＯＮの作製を示す。FIG. 12 shows the production of pHIG3 'and pCON. 図１３は、本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。FIG. 13 shows a fragment containing the human D region segment used to produce the transgene of the invention. 図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。FIG. 14 shows the production of pHIG2 (D segment-containing plasmid). 図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントを包含する断片を示す。FIG. 15 shows a fragment encompassing the human Jκ and human Cκ gene segments used to make the transgene of the present invention. 図１６はｐＥμの構造を示す。FIG. 16 shows the structure of pEμ. 図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。FIG. 17 shows the production of pKapH. 図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。FIG. 18 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。FIG. 19 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。FIG. 20 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。FIG. 21 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。FIG. 22 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 図２３は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。FIG. 23 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin light chain locus. 図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブーネガティブ選択ベクターの作製を示す。FIG. 24 shows the creation of a positive-negative selection vector for functional disruption of the mouse endogenous immunoglobulin heavy chain locus. 図２５はκ鎖標的用ベクターの構造を示す。FIG. 25 shows the structure of the kappa chain targeting vector. 図２６はマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。FIG. 26 shows the structure of a mouse heavy chain targeting vector. 図２７はマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。FIG. 27 shows the structure of a mouse heavy chain targeting vector. 図２８はベクターｐＧＰｅの地図を示す。FIG. 28 shows a map of the vector pGPe. 図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。FIG. 29 shows the structure of vector pJM2. 図３０はベクターｐＣＯＲｌの構造を示す。FIG. 30 shows the structure of vector pCOR1. 図３１はｐＩＧＭｌ，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す。FIG. 31 shows the transgene constructs of pIGM1, pHC1 and pHC2. 図３２はｐγｅ２の構造を示す。FIG. 32 shows the structure of pγe2. 図３３はｐＶＧＥｌの構造を示す。FIG. 33 shows the structure of pVGEl. 図３４はｐＨＣｌトランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。FIG. 34 shows the assay results of human Ig expression in pHCl transgenic mice. 図３５はｐＪＣＫｌの構造を示す。FIG. 35 shows the structure of pJCKl. 図３６は合成重鎖可変領域の作製を示す。FIG. 36 shows the production of a synthetic heavy chain variable region. 図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＣＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。FIG. 37 is a schematic representation of the heavy chain small locus constructs pICM1, pHC1 and pHC2. 図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１，ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。FIG. 38 is a schematic representation of the heavy chain small locus component pIGG1 and the kappa light chain small locus components pKC1, pKVe1 and pKC2. 図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。FIG. 39 represents a strategy for rearranging functionally rearranged light chain genes. 図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。FIG. 40 represents the serum ELISA results. 図４１は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。FIG. 41 represents the results of an ELISA assay of sera from 8 transgenic mice. 図４２はプラスミドｐＢＣＥｌの略図である。FIG. 42 is a schematic representation of plasmid pBCE1. 図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（３７Ａ），ＫＬＨ（３７Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（３７Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。FIG. 43 shows the immune response of the transgenic mice of the present invention against KLH-DNP by measuring IgG and IgM levels specific for KLH-DNP (37A), KLH (37B) and BSA-DNP (37C). Represent. 図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免役処萱後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。FIG. 44 shows ELISA data demonstrating the presence of an antibody that binds to human carcinoembryonic antigen (CEA) and comprises human μ chain; each panel was obtained from mice on the indicated date after immunization Shown are reciprocal serial dilutions from pooled serum samples. 図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。FIG. 45 shows ELISA data demonstrating the presence of an antibody that binds to human carcinoembryonic antigen (CEA) and comprises a human gamma chain; each panel was obtained from mice at the indicated date after immunization Shown are reciprocal dilutions from pooled serum samples. 図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に麦示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。FIG. 46 shows the aligned variable region sequences of 23 randomly selected cDNAs generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of HC1 transgenic mice immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). Shown relative to germline transgene sequence (top row). In each row, nucleotide changes to the germline sequence are indicated above the changes in the deduced amino acid sequence (if any). Regions corresponding to heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 are shown. Nucleotides that are not encoded by germ cells are shown in capital letters. The deduced amino acid sequence is given below the nucleotide sequence using conventional single letter notation. 図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。FIG. 47 shows an aligned variable region sequence of 23 randomly selected cDNAs generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of HC1 transgenic mice immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). Shown relative to germline transgene sequence (top row). In each row, nucleotide changes to the germline sequence are displayed above the changes in the deduced amino acid sequence (if any). Regions corresponding to heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 are shown. Nucleotides that are not encoded by germ cells are shown in capital letters. The deduced amino acid sequence is given below the nucleotide sequence using conventional single letter notation. 図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組識から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。FIG. 48 shows the aligned variable region sequences of 23 randomly selected cDNAs generated from mRNA obtained from lymphoid tissues of HC1 transgenic mice immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). , Shown relative to germline transgene sequence (top row). In each row, nucleotide changes to the germline sequence are displayed above the changes in the deduced amino acid sequence (if any). Regions corresponding to heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 are shown. Nucleotides that are not encoded by germ cells are shown in capital letters. The deduced amino acid sequence is given below the nucleotide sequence using conventional single letter notation. 図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣｌトランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。FIG. 49 shows an aligned variable region sequence of 23 randomly selected cDNAs generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of HCl transgenic mice immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). Shown relative to germline transgene sequence (top row). In each row, nucleotide changes to the germline sequence are displayed above the changes in the deduced amino acid sequence (if any). Regions corresponding to heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 are shown. Nucleotides that are not encoded by germ cells are shown in capital letters. The deduced amino acid sequence is given below the nucleotide sequence using conventional single letter notation. 図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行にわいて、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。FIG. 50 shows an aligned variable region sequence of 23 randomly selected cDNAs generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of HC1 transgenic mice immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). Shown relative to germline transgene sequence (top row). Over each row, nucleotide changes to the germline sequence are displayed above the changes in the deduced amino acid sequence (if any). Regions corresponding to heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 are shown. Nucleotides that are not encoded by germ cells are shown in capital letters. The deduced amino acid sequence is given below the nucleotide sequence using conventional single letter notation. 図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。FIG. 51 shows an aligned variable region sequence of 23 randomly selected cDNAs generated from mRNA obtained from lymphoid tissue of HC1 transgenic mice immunized with human carcinoembryonic antigen (CEA). Shown relative to germline transgene sequence (top row). In each row, nucleotide changes to the germline sequence are displayed above the changes in the deduced amino acid sequence (if any). Regions corresponding to heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 are shown. Nucleotides that are not encoded by germ cells are shown in capital letters. The deduced amino acid sequence is given below the nucleotide sequence using conventional single letter notation. 図５２は、ヒストグラム形式での図４０のデータを示す；推定アミノ酸残基位置が縦座標として示され（左がアミノ末端方向であり、右がカルボキシ末端方向である）そして配列変異の頻度が横座標として示される。FIG. 52 shows the data of FIG. 40 in histogram format; putative amino acid residue positions are shown as ordinates (left is amino terminal direction, right is carboxy terminal direction) and the frequency of sequence variation is horizontal Shown as coordinates. 図５３は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。FIG. 53 shows the nucleotide sequence of a human DNA fragment named vk65.5 containing the Vκ gene segment; the Vκ coding region deduced amino acid sequence is also shown; the splicing sequence and the recombination signal sequence (heptamer / nonamer) are framed. Shown in 図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。FIG. 54 shows the nucleotide sequence of a human DNA fragment named vk65.8 containing the Vκ gene segment; the Vκ coding region deduced amino acid sequence is also shown; the splicing sequence and the recombination signal sequence (heptamer / nonamer) are in frame Shown in 図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。FIG. 55 shows the nucleotide sequence of a human DNA fragment named vk65.15 containing the Vκ gene segment; the Vκ coding region deduced amino acid sequence is also shown; the splicing sequence and the recombination signal sequence (heptamer / nonamer) Shown in 図５６は、同時に注入された２つの弔複断片の問での相１司組換えによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。FIG. 56 shows the formation of a light chain small locus by phase 1 recombination between two co-injected multiple fragments. 抗原結合の特異１生を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクローナル抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。The ELISA results for monoclonal antibodies reactive with CEA and non-CEA antigens showing a specific life of antigen binding are shown. ヒトＶＤＪ及びマウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。10 shows the DNA sequence of 10 CDNA amplified by PCR to amplify a transcript with human VDJ and mouse constant region sequences. ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピトープを有する抗体を表わしている。Shows ELISA results for various dilutions of sera from mice supporting both human heavy chain minilocus and human kappa minilocus transgenes; mice immunized with human CD4 And the data shown represent antibodies reactive with human CD4 and having human κ, human μ, or human γ epitopes, respectively. ３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウスμについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。Shown is the relative distribution of lymphocyte staining for human μ or mouse μ as determined by FACS for the three mouse genotypes. ３つのマワス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウスκについてのリンパ球染色の杣対的分布を示す。Shown is the opposite distribution of lymphocyte staining for human or mouse kappa as determined by FACS for the three Mawas genotypes. ３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対的分布を示している。Shows the relative distribution of lymphocyte staining for mouse λ as determined by FACS for the three mouse genotypes. ４つのマウス遺Ｅ子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒトκについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。Shown is the relative distribution of lymphocyte staining for mouse λ or human κ, as determined by FACS for the four mouse ectotypes. 免疫化されていない血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。The amounts of human μ, human γ, human κ, mouse μ, mouse γ, mouse κ, and mouse λ chain in the non-immunized serum are shown. さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示している。Shown is a scatter plot showing the amount of human μ, human γ, human κ, mouse μ, mouse γ, mouse κ, and mouse λ chains in the sera of unimmunized 0011 mice of various genotypes. ００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。1 shows anti-human CD4 titer in 0011 mice. ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗一ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗体力価を示す。Shows antibody titers containing human mu, human gamma, or human kappa chains in anti-CD4 antibodies in sera collected 3 or 7 weeks after immunization following immunization of 0011 mice with human CD4 . ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、及び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣｌ，ｐＫＣｌｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の問の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。Human heavy chain minilocus transgenes PHC1 and PHC2, and light chain minilocus transgenes pKCl, pKCle and light chain minilocus transgenes produced by homologous recombination of PKC2 and Co4 at the indicated sites. FIG. Ｓｔｏｒｂｅｔａ１．（１９８９）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。Storbeta1. (1989) shows a linkage map of the murine lambda light chain locus taken from above. The dotted box represents a pseudogene. 相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。4 schematically represents inactivation of the mouse λ locus by homologous gene targeting. 「免疫グロブリン遺伝子」、Ｈｏｎｊｏ，Ｔ，ＡＩｔ，ＦＷ，及びＲａｂｂｉｔｓＴＨ（ｅｄｓ）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）ｐ１２９から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。A map of the BALB / c mouse heavy chain locus taken from "Immunoglobulin Gene", Honjo, T, AIt, FW, and Rabbits TH (eds) Academic Press, NY (1989) p129 is shown. The structural gene is shown in a closed box in the upper line. The second and third lines indicate the restriction sites with the displayed symbols. マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。The nucleotide sequence of the mouse heavy chain locus α constant region gene is shown. マウス重鎖遺伝子座Ｊ_４遺伝子内に２つのｂｐフレームシフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。It shows the construction of a frameshift vector (plasmid B) for introducing a two bp frameshift into the murine heavy chain locus J ₄ gene. 高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ一軸）によって示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対するプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を描いている。Figure 3 shows isotype-specific responses of transgenic animals undergoing hyperimmunity. The relative levels of reactive human μ and γ1 are shown by a colorimetric ELISA assay (y uniaxial). We have injected 3 male 7- to 10-week-old male HC1 line 57 transgenic animals (# 1991, # 2356, # 2357) in a homozygous JHD background by intraperitoneal injection of CEA in Freund's adjuvant. ). The figure depicts the binding of 250-fold dilutions of pooled serum (collected prior to each injection) to CEA-coated microtiter wells. クラススイッテ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の問の組換えと一貫性をもつ。図７５は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃＩ／ＳｆｉＩ消化されたＤＮＡのサザンプロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ一５Ｈｌ−５、ヒトγ１／μ；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１／μ；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１，μ。３つのハイブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。プロットは、ヒトγ１スイッチ領域の３’半部分にまたがる２．３ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＳｆｉＩＤＮＡフラグメントから誘導されたプローブでハイブリッド形成される。μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つのγ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２−２は、それぞれ、５．１ｋｂ及び５．３ｋｂのＰａｃＩ／ＳｒｉＩフラグメントを結果としてもたらすスイッチ産物を含む。FIG. 5 shows the expression of the transgene-encoded γ1 isotype mediated by class switch recombination. The genomic structure of the integrated transgene in two different human γ1-expressing hybridomas is consistent with recombination of the μ and γ1 switch regions. FIG. 75 shows a Southern plot of PacI / SfiI digested DNA isolated from three transgene expressing hybridomas. From left to right: clone 92-09A-5Hl-5, human γ1 / μ; clone 92-90A-4G2-2, human γ1 / μ; clone 92-09A-4F7-A5-2, human γ1, μ. All three hybridomas are derived from 7 month old mice (mouse # 1991) hemizygous for HC1-57 integration and homozygous for JHD disruption. The plot is hybridized with a probe derived from a 2.3 kb BglII / SfiI DNA fragment spanning the 3 'half of the human γ1 switch region. Although no switch products can be found in the μ-expressing hybridomas, the two γ1-expressing hybridomas 92-09A-5H1-5 and 92-09A-4G2-2 are 5.1 kb and 5.3 kb PacI / SriI, respectively. Contains the switch product that results in the fragment. 図７６は、μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを欠失するべく組換えできる４００ｂｐの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。このメカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４ｋｂのＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の問の組換えによるクラススイッチは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、４ｋｂと７ｋｂの問のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッチ領域の間で組換えを受けていると思われる。FIG. 76 is a diagram of two possible deletion mechanisms that can produce a class switch from μ to γ1. The human μ gene is flanked by 400 bp direct repeats (σμ and Σμ) that can recombine to delete μ. Class switching by this mechanism always produces a 6.4 kb PacI / SfiI fragment, whereas class switching by recombination of the μ and γ1 switch regions shows a variation in size between individual switch events, Generate 4 kb and 7 kb PacI / SfiI fragments. The two γ1-expressing hybridomas studied in FIG. 75 appear to have undergone recombination between the μ and γ1 switch regions. トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣｌトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ節のＲＮＡの混合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。Figure 2 shows a chimeric human / mouse immunoglobulin heavy chain produced by a transswitch. Transswitch product cDNA clones were a mixture of spleen and lymph node RNA isolated from hyperimmunized HCl transgenic-JHD mice (# 2357; see legend to FIG. 74 for description of animals and immunization regimes) Was generated by reverse transcription and PCR amplification. Partial nucleotide sequences of 10 randomly picked clones are shown. Lowercase letters represent the encoded germline, and uppercase letters indicate nucleotides that cannot be assigned to known germline sequences. These may be somatic mutations, N nucleotides or truncated D segments. The double-sided type represents a mouse gamma array. 再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。It shows that the rearranged VH251 transgene undergoes somatic mutation in the hyperimmunized one. 図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クローンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も１司定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列内の小文字はＨＣ１トランスジーン内に含まれている既知のＤセグメントに対する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表Ｄされている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらは単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１一γｌｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は０．０６％（２／３，１９８ｂｐ）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γｌｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対しで１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頻度は１．６％（５２／３，１９８ｂｐ）。78. Partial nucleotide sequence of IgG heavy chain variable region cDNA clone from CH1 strain 26 mouse showing primary response to antigen in FIG. 78 and secondary response in FIG. 79. Germline sequences are shown at the top; nucleotide changes from germline are represented for each clone. One cycle indicates identity with the germline sequence and capital letters indicate that no germline source is determined. The arrangement is organized according to the use of the J segment. The germline sequence for each of the J segments is shown. Lower case letters in the CDR3 sequence represent identity to known D segments contained within the HC1 transgene. The assigned D segments are listed at the end of each array. Unassigned sequences can be derived from N region additions or somatic mutations. Or, in some cases, they are simply too short to distinguish random N nucleotides from known D segments. Figure 78 Primary Response: 13 randomly picked VH251 single γl cDNA clones. Four weeks old female HCl strain 26-JHD mice (# 2599) were injected once with KLH and complete Freund's adjuvant. Spleen cell RNA was isolated after 5 days. The overall frequency of somatic mutations within the V segment is 0.06% (2/3, 198 bp). Secondary response of FIG. 79: 13 randomly picked VH251-γl cDNA clones. Two-month-old female HCl strain 26-JHD mice (# 3204) were injected with HEL and Freund's adjuvant three times over a month (the primary injection was complete adjuvant, and boosters were given at 1 and 3 weeks). Spleen and lymph node RNA were isolated after 4 months. The overall frequency of humoral mutations within the V segment is 1.6% (52/3, 198 bp). 広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団内で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図６８参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６ｂｐのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４ｂｐ）である。Extensive somatic mutations have been shown to be restricted to the γ1 sequence: somatic mutations and class switches occur within the same population of B cells. Partial nucleotide sequence of VH251 cDNA clone isolated from spleen and lymph node cells of HC1 line 57 transgenic-JHD mice (# 2357) immunized to CEA (see FIG. 68 for immunization plan). FIG. 80: Randomly picked VH251-μ cDNA clone of IgM: 23. Nucleotide sequence of a 156 bp segment containing CDRs 1 and 2 surrounding residues. The overall level of somatic mutation is 0.1% (5 / 3,744 bp). 図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１一γ１ｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５，６５８ｂｐ）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８ｂｐである）。記号の説明については、図８０及び８１の凡例を参照のこと。FIG. 81: Randomly picked VH251-γ1 cDNA clone of IgG: 23. Nucleotide sequence of a segment containing CDRs 1-3 and surrounding residues. The overall frequency of somatic mutations within the V segment is 1.1% (65/5, 658 bp). For comparison with the μ sequence in FIG. 80; the mutation frequency for the first 156 nucleotides is 1.1% (41/3, 588 bp). See legends in FIGS. 80 and 81 for explanation of symbols. ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニックーＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐｌセグメントでの体細胞突然変異の全体的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４ｂｐ）である。単一一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６ｂｐ）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照。VH51P1 and VH56P1 show extensive somatic mutations in mice that have not been immunized. Partial nucleotide sequence of an IgG heavy chain variable region cDNA clone from a female HC2 line 2550 transgenic JHD mouse (# 5250) 9 weeks after immunization. The overall frequency of somatic mutations in the 19VH56pl segment is 2.2% (101/4, 674 bp). The overall frequency of somatic mutations within a single VH51p1 segment is 2.0% (5/246 bp). See legend to Figures 78 and 79 for explanation of symbols. 分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ＋／−，ＪＣκ＋／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウスの重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ一軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマウスの重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０＋，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマウスの重鎖及びκｋ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒトμ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細胞のヒストグラム（対数螢光：ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱に基つくｅ一パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示されている試料の各々におけるＢ２２０＋細胞の分１由１は、リンパ球光散乱ゲートの白分率として与えられている。Double transgenic mice with the endogenous Ig locus analyzed contain human IgMκ positive B cells. FACS of cells isolated from the spleens of 4 mice with different genotypes. Left column: control mice (# 9944, females 6 weeks old, JH +/−, JCκ +/−; heterozygous wild type mouse heavy chain and κ single light chain loci, non-transgenic). Column 2: Human heavy chain transgenic (# 9877, female JH − / −, JCκ − / −, HC2 strain 2550 ± at 6 weeks of age; homozygous for split mouse heavy chain and κ single light chain loci Junction, semi-junction for HC2 transgene). Column 3: Human κ single light chain transgenic (# 9878, female JH − / −, JCκ − / −, KCo4 strain 4437+ at 6 weeks of age; for the heavy and κ single light chain loci of the disrupted mice Homozygous, semi-joint for KCo4 transgene). Right column: double transgenic (# 9879, 6 weeks old female, JH − / − mJCκ − / −, HC2 line 2550+, KCo4 line 4437+; About the heavy chain and κk single light chain locus of the divided mice Homozygous, semi-junction for HC2 and KCo4 transgenes). Top: Splenocytes stained for expression of mouse λ light chain (x axis) and human κ light chain (y axis). Second stage: splenocytes stained for expression of human μ heavy chain (x axis) and human kappa light chain (y axis), third stage: mouse μ heavy chain (x axis) and mouse kappa light chain ( Spleen cells stained for expression on the y-axis). Bottom: Histogram of splenocytes stained for expression of mouse B220 antigen (logarithmic fluorescence: x axis: cell number: y axis). For each of the two color illustrations, the relative number of cells in each of the displayed inlaids is given as a percentage of the e-parameter gate based on propidium iodide staining and light scattering. The fractions 1 to 1 of B220 + cells in each of the samples displayed in the lower row are given as the white fraction of the lymphocyte light scattering gate. ２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。内因性重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ＫＣｏ４２重トランスジェニックマウスからのマウスＴ及びλ及びヒトμ，γ及びκ。マウス：（＋）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピー）；（○）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個のＫＣｏ４コピー）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３（組込み一一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７。Secreted immunoglobulin levels in the sera of double transgenic mice. Mouse T and λ and human μ, γ and κ from 18 individual HC2 / KCo42 double transgenic mice homozygous for endogenous heavy chain and κ single light chain locus disruptions. Mice: (+) HC2 strain 2550 (up to 5 HC2 copies per integration), KCo4 strain 4436 (1-2 KCo4 copies per integration); (◯) HC2 strain 2550, KCo4 strain 4437 (single integration) (×) HC2 line 2550, KCo4 line 4583 (up to 5 KCo4 copies per integration); (□) HC2 line 2572 (30-50 HC2 copies per integration, KCo4 line 4437; (Δ) HC2 line 5467 (20-30 HC2 copies per integration, KCo4 line 4437). ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免疫化後（●）の血清について報告されている。1 shows a human antibody response to a human antigen. FIG. 85: Primary response to recombinant human soluble CD4. Human IgM and human kappa light chain levels have been reported for sera before bleeding (O) and after immunization (●) from four double transgenic mice. 図８６：インビボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／ｍ１の余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使川されたペルオキソダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検山した。ヒトκ軽鎖（正方形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でペルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４４；ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。Figure 86: A switch to human IgG occurs in vivo. Using peroxodase conjugated polyclonal anti-human IgG used in the presence of 1.5 μ / ml extra IgE, κ and 1% normal mouse serum to inhibit non-specific cross-reactivity, Human IgG (circle) was examined. Human kappa light chains (squares) were detected using a polyclonal anti-human kappa reagent conjugated with peroxidase in the presence of 1% normal mouse serum. Representative results from one mouse (# 9344; HC2 line 2550, KCo4 line 4436) are shown. Each point represents the average of duplicate wells minus background absorption. ヒトＣＤ８十リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。Figure 2 shows FACS analysis of human PBL using hybridoma supernatants that discriminate human CD4 + lymphocytes from human CD8 lymphocytes. トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４１ｇＭａｎｆＩｇＧを示す。Figure 2 shows human α-CD41gManfIgG in the sera of transgenic mice. トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃｌｌ−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結合実験を示す。Shown is a competitive binding experiment comparing transgenic mouse α-human CD4 hybridoma monoclonal, 2Cll-8 with RPA-TA and Leu-3A monoclonals. 培養された２Ｃｌｌ−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示す。Production data for Ig expression of cultured 2Cll-8 hybridomas is shown. 重鎖恒常領域遺伝子といった遺伝子を欠失させるための相同組換えターゲッティングトランスジーンの構造を概略的に示す。本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。1 schematically shows the structure of a homologous recombination targeting transgene for deleting genes such as heavy chain constant region genes. The transgenic mice of the invention are immunized with a human antigen selected from Tables B and C below. The transgenic mouse produces a human antibody that binds to the human antigen. Hybridomas that secrete monoclonal antibodies against the selected human antigens are produced using B cells from the immunized transgenic mice.

Claims

A method for obtaining a nucleic acid molecule encoding a human heavy chain capable of binding to a predetermined antigen, comprising:
(A) a transgenic mouse comprising a non-rearranged human heavy chain immunoglobulin variable region comprising a plurality of human _VH gene segments, a plurality of human D gene segments, and a plurality of human _JH gene segments, Immunizing with an antigen;
(B) obtaining a chimeric antibody comprising a human variable region and a mouse constant region that binds to the predetermined antigen from B lymphocytes extracted from the mouse; and (c) encoding the human heavy chain variable region of the chimeric antibody. Isolating the nucleic acid molecule to be operably linked to a nucleic acid molecule encoding a human heavy chain constant region.

The method of claim 1, wherein the mouse further comprises an unrearranged human light chain immunoglobulin variable region.

The method of claim 2, wherein the light chain variable region comprises a plurality of _VL gene segments and a plurality of _JL gene segments.

4. The heavy chain immunoglobulin variable region comprises from 2 to about 10 _VH gene segments, at least 10 _DH gene segments, and at least 6 _JH gene segments. the method of.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mouse immunoglobulin heavy chain constant region comprises a γ constant region.

4. The method of any one of claims 1-3, wherein the human heavy chain immunoglobulin variable region further comprises a cis-acting transcriptional regulatory region comprising at least one promoter.

A method for obtaining a nucleic acid molecule encoding a human light chain capable of binding to a predetermined antigen, comprising:
(A) immunizing a transgenic mouse with a predetermined antigen, wherein the transgenic mouse comprises the following (i) and (ii):
(I) a non-rearranged human heavy chain immunoglobulin variable region comprising a plurality of human _VH gene segments, a plurality of human _DH gene segments, and a plurality of human _JH gene segments; and (ii) a plurality of V _An unrearranged human light chain immunoglobulin variable region comprising an _L gene segment and a plurality of J _L gene segments;
(B) obtaining a chimeric antibody comprising a human variable region and a mouse constant region that binds to the predetermined antigen from B lymphocytes extracted from the mouse; and (c) encoding the human light chain variable region of the chimeric antibody. Isolating the nucleic acid molecule to be operably linked to a nucleic acid molecule encoding a human light chain constant region.

8. The method of claim 7, wherein the human light chain is operably linked to a human kappa light chain constant region.

8. The method of claim 7, wherein the human light chain is operably linked to a human lambda light chain constant region.

A method for obtaining a first nucleic acid molecule encoding a human heavy chain capable of binding to a predetermined antigen and a second nucleic acid molecule encoding a human light chain capable of binding to the predetermined antigen. And
(A) immunizing a transgenic mouse with a predetermined antigen, wherein the transgenic mouse comprises the following (i) and (ii):
(I) a non-rearranged human heavy chain immunoglobulin variable region comprising a plurality of human _VH gene segments, a plurality of human _DH gene segments, and a plurality of human _JH gene segments; and (ii) a plurality of V _An unrearranged human light chain immunoglobulin variable region comprising an _L gene segment and a plurality of J _L gene segments;
(B) obtaining a chimeric antibody consisting of a human variable region and a mouse constant region that binds to the predetermined antigen from B lymphocytes taken from the mouse;
(C) isolating a first nucleic acid molecule encoding a human heavy chain variable region of the chimeric antibody and operably linking the nucleic acid molecule to a nucleic acid molecule encoding a human heavy chain constant region; and (d ) Isolating a second nucleic acid molecule encoding a human light chain variable region of the chimeric antibody and operably linking the nucleic acid molecule to a nucleic acid molecule encoding a human light chain constant region.

11. The method of claim 10, wherein the human light chain is operably linked to a human kappa light chain constant region.

11. The method of claim 10, wherein the human light chain is operably linked to a human lambda light chain constant region.

13. The heavy chain immunoglobulin variable region comprises from 2 to about 10 _VH gene segments, at least 10 _DH gene segments, and at least 6 _JH gene segments. the method of.

The method according to any one of claims 10 to 12, wherein the mouse immunoglobulin heavy chain constant region comprises a γ constant region.

13. A method according to any one of claims 10 to 12, wherein the human heavy chain immunoglobulin variable region further comprises a cis-acting transcriptional regulatory region comprising at least one promoter.