JP5526971B2

JP5526971B2 - 液体クロマトグラフィ用送液装置

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Description

本発明は、液体クロマトグラフィで使用する送液装置に関する。特に本発明は反応液体クロマトグラフィで使用する反応試薬を送液する装置およびそれを備えた液体クロマトグラフィに関する。

液体クロマトグラフィは様々な試料成分の分離・分析に用いられている。試料成分の検出または定量を行なう場合、その成分に適した検出器が用いられる。最も多く用いられるのが、紫外／可視吸収検出器である。これは、試料成分と溶離液との紫外／可視吸収の差に基づき、試料成分の検出または定量を行なうものである。また、試料成分が紫外／可視吸収を有しない場合は、試料成分の屈折率と溶離液の屈折率との差に基づき検出または定量を行なう示差屈折計などが用いられる。しかしながら、これらの検出器は特異性が低いため、試料中に夾雑物が多い場合など、目的の試料成分のみを検出または定量するのが困難な場合がある。このような場合、試料成分を分析カラムで分離後、検出または定量したい試料成分と特異的に反応する試薬とを混合し、加熱などにより誘導体化した後、前記誘導体化した試料成分の紫外／可視吸収や蛍光を測定する方法がある。この方法は一般的にポストカラム反応液体クロマトグラフィと呼ばれている。

図１にポストカラム反応液体クロマトグラフィの流路構成の一態様を示す。試料注入バルブ（３）により注入された試料（５）は分析カラム（７）により各成分に分離される。分析カラム（７）から溶出した成分に、送液ポンプ（１０ａ）により送液された反応試薬Ａ（１１ａ）および送液ポンプ（１０ｂ）により送液された反応試薬Ｂ（１１ｂ）が添加され、その後、適切な温度に温調された反応オーブン（９）内に設けた反応コイル（８）内を通ることで、検出または定量する成分に対して特異的な誘導体を生成する反応が進行する。その後、前記誘導体を特異的に検出する検出器（１２）により主に目的成分を高感度に検出することで、検出または定量を行なう。

一般的に、ポストカラム反応液体クロマトグラフィで使用する溶離液（２）は検出器（１２）に対するバックグラウンドが低い傾向にあり、反応試薬Ａ（１１ａ）および反応試薬Ｂ（１１ｂ）は検出器（１２）に対するバックグラウンドが比較的高い傾向にある。そのため、溶離液（２）と反応試薬Ａ（１１ａ）および反応試薬Ｂ（１１ｂ）との混合物、または反応試薬Ａ（１１ａ）と反応試薬Ｂ（１１ｂ）との混合物の組成に変化が生じると、検出器（１２）のバックグラウンドが変動することになる。

特開２０００−０４６８１９号公報

前述した課題の解決策として、いくつかの対策が検討されている。たとえば、分析カラム（７）から溶出した成分に反応試薬Ａ（１１ａ）および反応試薬Ｂ（１１ｂ）を添加する際に、まず反応試薬Ａ（１１ａ）と反応試薬Ｂ（１１ｂ）とを一旦合流させた後、ミキシングコイル（２５）を通過することで反応試薬混合物をある程度均一化した後、分析カラム（７）から溶出した成分に添加して反応させる方法がある（図２参照）。

また特許文献１には、溶離液の送液ポンプおよび反応試薬の各送液ポンプのすべてを単一のクロック信号に基づいた信号で制御することで送液の周期に規則性をもたせ、溶離液や反応試薬の組成変動を抑える方法を開示している。しかしながら、溶離液送液ポンプおよび反応試薬送液ポンプは、図３に示すプランジャポンプを通常用いるため、組成を均一にするのは困難である。

プランジャポンプ（図３）は主にポンプヘッド（２４）、プランジャ（１６）、入口側／出口側逆止弁（１８ａ、１８ｂ）から構成される。プランジャ（１６）を引く（図３では左方向に移動する）操作により入口側逆止弁（１８ａ）を経由してチャンバ（１７）内に液体が吸引され（図３ａ）、プランジャ（１６）を押す（図３では右方向に移動する）操作によりチャンバ（１７）から出口側逆止弁（１８ｂ）を経由して液体が吐出される。通常は送液の安定性を向上させるため、吸引操作はできるだけ短時間で完了し吐出操作は一定速度で行なうよう制御を行なう。

ポストカラム反応液体クロマトグラフィでは反応試薬を２種類用いることが多く、反応試薬を送液するポンプも２台必要となる。そのため、反応試薬の送液ポンプとしてプランジャポンプを用いた場合、送液パターンは例えば図４に示すようなパターンとなる。なお、図４では反応試薬Ａと反応試薬Ｂの流速がともに同じ（具体的には反応試薬Ａと反応試薬Ｂの流速がともに毎分２０μＬ）場合の流速パターンである。反応試薬Ａと反応試薬Ｂの流速がともに同じである場合、理論的には合算したときの流速パターンは図４ｃに示すように同一周期となる。しかしながら、図５に示すように反応試薬Ａと反応試薬Ｂとで流速が僅かに異なる（具体的には反応試薬Ａの流速が毎分２０μＬ、反応試薬Ｂの流速が毎分１９μＬ）場合、合算したときの流速パターンの周期は一定とはならない（図５ｃ）。合算した時の送液パターンに周期性がないと、その後のミキシングコイルによる混合を行なっても均一な混合は非常に困難となり、その結果、検出器の安定性を損ね、検出精度の低下を招く。また、図４ｃのように合算したときの送液パターンの周期が一定であったとしても、混合試薬の組成を完全に一定にするにはポンプの周期の数倍容量のミキシングコイルが必要となる。プランジャポンプ（図３）の場合、プランジャ容量（すなわちチャンバ（１７）の容量）は通常５０μＬから数百μＬであり、流速が低くなるにつれてポンプの周期が長くなる。そのため、反応試薬の流速が比較的速い場合はポンプの周期を合わせる方法はある程度有効であるが、反応試薬の流速が遅い場合はポンプの周期を合わせる方法では混合が不十分であり検出器の安定性を損ねる問題点がある。

次に反応試薬送液ポンプとして、低流量の送液に適すると考えられる図６に示す電磁式ダイアフラムポンプを用いる場合について検討する。電磁式ダイアフラムポンプ（図６）は、電磁コイル（２８）に通電／遮断することで筒状のピストン（２７）が上下運動し、前記上下運動と連動してダイアフラム（２６）が収縮／膨張することで、送液を可能にしている。ダイアフラム（２６）にはポートを２箇所（液体の入口用と出口用）設けており、各ポートにはそれぞれ簡易型の逆止弁（２９ａ、２９ｂ）を設けている。これにより、ダイアフラム（２６）の収縮／膨張による送液が一方向に制御される。流量はピストン（２７）のストロークにより決まり、ストロークの調整はストローク調整止具（３０）の調整によりピストン（２７）の戻る位置を制限することで行なう。電磁式ダイアフラムポンプを、２種類の反応試薬を使用するポストカラム反応液体クロマトグラフィにおける反応試薬送液ポンプに適用した場合、例えば図７に示す流路構成であれば反応試薬Ａ（１１ａ）と反応試薬Ｂ（１１ｂ）を交互に、かつ同じ周期で送液することが可能であり、前記２試薬の混合も容易に行なうことができる。反応試薬Ａと反応試薬Ｂの流速がともに同じ場合における各反応試薬を送液するポンプの吐出パターンを図８に示す。なお、図６に示す電磁式ダイアフラムポンプの場合、前記２試薬の送液量が異なっていても、ストローク調整止具（３０）を調整してピストン（２７）の戻る位置を調整することで流量を変更することができるため、反応試薬Ａを送液するポンプＡと反応試薬Ｂを送液するポンプＢの送液周期とが同期するように（図９に示す吐出パターンとなるように）調整することで、前記２試薬の混合は容易に行なうことが可能である。

電磁式ダイアフラムポンプを用いて反応試薬Ａと反応試薬Ｂとを交互に吐出する設定の場合、図１１に示すようなポンプの下流側に負荷のない流路構成であれば、理論上、反応試薬は、試薬Ａ−試薬Ｂ―試薬Ａ―試薬Ｂ―試薬Ａ―試薬Ｂ・・・の順で等量かつ規則的に液が流れる（図１３ａ）。以上より電磁式ダイアフラムポンプは、ポストカラム反応液体クロマトグラフィの反応試薬用送液ポンプとして有用と思われる。

しかしながら電磁式ダイアフラムポンプは、ピストンの駆動が電磁コイルへの通電／遮断により行なわれており、ダイアフラムの材質も通常は樹脂製であることから、耐圧性は０．２ＭＰａ以下とプランジャポンプ（図３）に比べると極端に低い。そのため、負荷圧が大きくなると電磁式ダイアフラムポンプで得られる流速が大きく変動する。つまり、同じ設定であっても負荷が大きくなるにつれ実際の流速が大きく減少してしまう問題がある（図１０）。よって、図１２に示すようなポンプの下流側に負荷がある流路構成の場合、反応試薬Ａ（１１ａ）と反応試薬Ｂ（１１ｂ）とをそれぞれの電磁式ダイアフラムポンプ（１０ａ、１０ｂ）を用いて連続供給しようとすると、指定した流速が得られない状態が発生する。反応試薬Ａを送液するポンプＡ（１０ａ）と反応試薬Ｂを送液するポンプＢ（１０ｂ）とで負荷圧に対する流量特性が異なる場合、図１３ｂに示すように反応試薬Ａと反応試薬Ｂとが不均一に流れたり、場合によっては反応試薬のどちらかが全く流れない状態となり得る。したがって、電磁式ダイアフラムポンプをポストカラム反応液体クロマトグラフィにおける反応試薬送液ポンプとして適用しようとする場合、単純に適用するだけでは、検出および定量精度の優れた液体クロマトグラフィを提供するのは困難である。

そこで本発明の目的は、２種類以上の反応試薬を添加する液体クロマトグラフィにおいて、前記反応試薬の混合が容易であり、低流速域における正確な送液が可能であり、かつ検出器において安定したベースラインが得られる送液装置を提供することである。また本発明は、液体の吸引／吐出周期の制御がしやすい電磁式ダイアフラムポンプの特徴を生かしながら、耐圧性の低さを補うことで、反応試薬送液ポンプとして使用可能な装置を提供することを目的とする。さらにまた本発明は、そのような送液装置を備えた液体クロマトグラフィを提供することを目的とする。

前記目的を達成するためになされた本発明は、以下の発明を包含する。

第一の発明は、
２種類以上の試薬を混合し、前記混合した試薬を送液する、液体クロマトグラフィ用送液装置であって、
前記２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプと、
前記ポンプにより送液された試薬を混合し貯留する混合容器と、
前記混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプと、
を備えた、液体クロマトグラフィ用送液装置である。

第二の発明は、２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプおよび／または混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプが電磁式ダイアフラムポンプである、第一の発明に記載の送液装置である。

第三の発明は、
混合容器が、
２種類以上の試薬を受け入れるポートと、
貯留した混合試薬を送液するためのポートと、
混合試薬の貯留容量を一定に保つための試薬排出ポートと、
を備えた混合容器である、第一または第二の発明に記載の送液装置である。

第四の発明は、
試料を導入する導入手段と、
導入手段から導入した試料を分離する分析カラムと、
分析カラムから溶出した成分を検出または定量する検出手段と、
を備えた液体クロマトグラフィであって、
分析カラムの上流側、または分析カラムの下流側から検出手段までの間に、第一から第三の発明に記載の送液装置を備えた、液体クロマトグラフィである。

第五の発明は、
送液装置を分析カラムの下流側から検出手段までの間に備え、
分析カラムから溶出した成分に前記送液装置により送液された混合試薬を添加する位置から検出手段までの間に、前記溶出した成分と前記混合試薬とを反応させる反応手段をさらに備えた、第四の発明に記載の液体クロマトグラフィである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の送液装置は、
２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプと、
前記ポンプにより送液された試薬を混合し貯留する混合容器と、
前記混合容器に貯留した混合試薬を吸引し吐出する混合試薬送液ポンプと、
を備えていることを特徴としており、前記送液装置は試料を分析カラムに導入する前に試料成分を誘導体化し分析を行なうプレカラム反応液体クロマトグラフィ、または分析カラムから溶出した試料成分を誘導体化し分析を行なうポストカラム反応液体クロマトグラフィにおける試料成分を誘導体化するための試薬を添加する装置として用いることができる。

本発明の送液装置に備える、２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプや混合試薬送液ポンプは、液体クロマトグラフィで通常用いられるポンプであればよく、プランジャポンプや電磁式ダイヤフラムポンプが例示できるが、試薬の送液量が少ない場合は、低流速領域において安定した送液が可能な電磁式ダイヤフラムポンプを、２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプおよび／または混合試薬送液ポンプとして用いると好ましい。なお、前記電磁式ダイアフラムポンプは、電磁コイル（ソレノイドともいう）に駆動制御されたピストンの往復動を、逆止弁を介して流路中に設けたダイアフラム室に伝達することにより送液力を得る動作原理を有した送液ポンプであればよい。電磁式ダイアフラムポンプにおいて、吸引時間と吐出時間すなわち送液周期は制御用パルス信号により仕様の範囲内で自由に設定することができ、流量はピストンのストロークを調節することで設定することができる。

本発明の送液装置に備える混合容器の一態様としては、
それぞれのポンプで送液された２種類以上の試薬を受け入れるためのポートと、
混合された前記２種類以上の試薬を混合試薬送液ポンプで吸引し送液するためのポートと、
混合された前記２種類以上の試薬の容量を一定に保つための試薬排出ポート（オーバーフローポート）と、
を備えた混合容器をあげることができる。なお、本発明の送液装置をプレカラム反応液体クロマトグラフィにおける試料成分を誘導体化するための試薬を添加する装置として使用する場合は、前記混合容器に、図２５に示すような、試料導入手段により導入された試料を受け入れるためのポートをさらに備えてもよい。

以下、図面を用いて本発明を詳細に説明する。

本発明の送液装置の一態様を図１４に示す。図１４ａおよび図１４ｂの送液装置はともに、ポストカラム反応液体クロマトグラフィにおける、分析カラムから溶出した成分を誘導体化させるための反応試薬を添加するための装置であって
反応試薬Ａ（１１ａ）送液用のポンプ（１０ａ）と、
反応試薬Ｂ（１１ｂ）送液用のポンプ（１０ｂ）と、
混合容器（２０）と、
混合反応試薬送液用ポンプ（１９）とを備えている。図１４ａはポンプ（１０ａ）で送液された反応試薬Ａ（１１ａ）とポンプ（１０ｂ）で送液された反応試薬Ｂ（１１ｂ）とが個別に混合容器（２０）に導入される態様を、図１４ｂはポンプ（１０ａ）で送液された反応試薬Ａ（１１ａ）とポンプ（１０ｂ）で送液された反応試薬Ｂ（１１ｂ）とが事前に合流し混合した状態で混合容器（２０）に供給される態様を、それぞれ示している。図１４の送液装置では、反応試薬Ａ（１０ａ）と反応試薬Ｂ（１０ｂ）との混合比率を安定させるため、ほぼ大気圧下の状態（すなわち、ほぼ負荷がない状態）に設けた混合容器（２０）に反応試薬Ａ（１１ａ）と反応試薬Ｂ（１１ｂ）をそれぞれ別のポンプ（１０ａ、１０ｂ）を用いて供給し混合後、混合した反応試薬をポンプ（１９）を用いて一定の周期で送液する。送液された混合反応試薬は分析カラムから溶出した試料成分と混合し、反応コイル（８）といった反応手段において前記成分を誘導体化させる。混合容器（２０）は、
反応試薬Ａ（１１ａ）および反応試薬Ｂ（１１ｂ）を受け入れるための１つ以上のポート（好ましくは図１４ａに示すような２つのポート）と、
貯留した混合反応試薬をポンプ（１９）で送液するためのポートと、
混合反応試薬の貯留容量を一定に保つための混合反応試薬排出ポート（オーバーフローポート、２３）と、
を備えている。なお、反応試薬の送液量が少ない場合は、ポンプ（１０ａ）、ポンプ（１０ｂ）、ポンプ（１９）がいずれも電磁式ダイヤフラムポンプであると好ましい。

反応試薬Ａ送液用ポンプ（１０ａ）および反応試薬Ｂ送液用ポンプ（１０ｂ）が電磁式ダイヤフラムポンプである場合、ポンプ（１０ａ）およびポンプ（１０ｂ）はそれぞれ吸引／吐出を数秒周期で繰り返して混合容器（２０）へ送液するのが好ましい。混合した反応試薬は混合容器（２０）内で均一化され、混合反応試薬の一部は混合反応試薬送液ポンプ（１９）により送液され、分析カラムから溶出した試料中の成分に添加される。なお、混合容器（２０）の容量を超えた混合反応試薬は排出ポート（オーバーフローポート、２３）から容器外に排出される。図１４の送液装置のうち混合容器（２０）付近を拡大した図を図１５に示す。混合反応試薬の送液量（流速）Ｆｍは反応試薬Ａの流速Ｆａと反応試薬Ｂの流速Ｆｂの合計より若干少なく設定する。これにより、混合容器内の混合反応試薬の量は容器容量まで徐々に増加し、最終的には容器容量と同じ容量まで達する。以降、増加分は混合反応試薬排出ポート（オーバーフローポート）より系外に廃棄される（流速：Ｆｗ）。図１５ａは図１４ａの混合容器（２０）付近を、図１５ｂは図１４ｂの混合容器（２０）付近を、それぞれ拡大した図である。なお、混合容器（２０）に供給される反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂの混合効率を向上させることを目的に、混合容器（２０）内に攪拌子（２１）を入れ、外部に設置された駆動ユニット（２２）により攪拌子（２１）を回転させることで反応試薬を攪拌させてもよい。また、反応試薬Ａの流速Ｆａと反応試薬Ｂの流速Ｆｂとの合計（すなわちＦａ＋Ｆｂ）と、混合反応試薬の流速Ｆｍとの差（すなわちＦａ＋Ｆｂ−Ｆｍ）は、出来るだけ小さい方が望ましい。その差分はオーバーフローＦｗとなり廃棄されるためである。

Ｆａ＋Ｆｂ＞Ｆｍ
Ｆｗ＝Ｆａ＋Ｆｂ−Ｆｍ
反応試薬Ａの流速：Ｆａ、反応試薬Ｂの流速：Ｆｂ
混合反応試薬の流速：Ｆｍ、オーバーフローの流速：Ｆｗ
本発明の送液装置は、混合反応試薬の組成を決定する反応試薬Ａ送液ポンプおよび反応試薬Ｂ送液ポンプには負荷が全く掛からない。そのため、反応試薬の送液量を常に一定の値に保つことができ、混合比率を一定に保つことができる。また混合試薬送液ポンプは下流に存在する反応コイルといった反応手段や検出手段により若干の負荷を受けるが、負荷の変動は少なく、送液量も安定している（図１６参照）。

反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂが混合容器に供給されるときの流速と、混合容器の容量とを仮定したときの混合容器内の各反応試薬の組成変化を数値計算した。図１７は、反応試薬Ａの流速Ｆａを毎分１０μＬ、反応試薬Ｂの流速Ｆｂを毎分１０μＬとして仮定し、混合容器の容量を変化させたときの容器内の各反応試薬の組成を示したものであり（初期状態として混合容器内には反応液Ａが１００％満たされている）、図１７ａは容器容量を５００μＬ、図１７ｂは容器容量を２００μＬ、図１７ｃは容器容量を１００μＬ、図１７ｄは容器容量を５０μＬ、図１７ｅは容器容量を２０μＬとそれぞれ仮定した場合の組成変化を示している。時間の経過とともに混合容器内の混合反応試薬に占める反応試薬Ｂの割合が増加していき、最終的に反応試薬Ａと反応試薬Ｂの割合がそれぞれ５０％の状態で一定となる。たとえば混合容器の容量が５０μＬの場合は約１０分で安定化し、混合容器の容量が大きいほど５０％に到達する時間が長くなる。混合容器の容量は大きいほど反応試薬の混合は良好になるが、反応試薬Ａおよび／または反応試薬Ｂの送液量を意図的に変化させた場合、実際には各反応試薬の組成が変化するのに時間を要してしまう。また、混合試薬の劣化などにより測定結果が変動する可能性を考慮すると、可能な限り混合容器の容量は小さい方が好ましい。

本発明の液体クロマトグラフィ用送液装置は、
２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプと、
前記ポンプにより送液された試薬を混合し貯留する混合容器と、
前記混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプと、
を備えていることを特徴としており、過大な背圧がかからない混合容器を備えることで、２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプおよび混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプには負荷がほとんど掛からない。このため、これまで耐圧性の低さから適用が困難であった電磁式ダイアフラムポンプを、２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプおよび／または混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプとして適用することが可能となる。電磁式ダイアフラムポンプは液体の吸引／吐出周期が制御しやすく、各試薬の送液量が同じ場合であっても異なる場合であっても、ピストンの戻り位置を調整することで送液量の変更が可能であり、送液周期が同期するように調整することも可能なため、反応試薬の混合を確実に行なうことができる。したがって、本発明の送液装置に備える、２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプおよび／または混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプを電磁式ダイアフラムポンプにすることにより、特に低流量領域における送液安定性を正確に制御することができる。なお、本発明の送液装置に備えた混合容器に、混合試薬の容量を一定に保つための試薬排出ポート（オーバーフローポート）を設けると、混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプの吸引配管にエアが混入することを防止できるため、各試薬の流速を変化させたときに得られる混合比率を予測可能なものとすることができる。

本発明の送液装置は、試料を分析カラムに導入する前に試料成分を誘導体化し分析を行なうプレカラム反応液体クロマトグラフィにおける試料成分を誘導体化するための試薬を添加する装置として、または分析カラムから溶出した試料成分を誘導体化し分析を行なうポストカラム反応液体クロマトグラフィにおける試料成分を誘導体化するための試薬を添加する装置として、液体クロマトグラフィに備えることができる。

ポストカラム反応液体クロマトグラフィの流路構成の一態様（複数の反応試薬を直接反応系へ導入する場合）を示した図である。ポストカラム反応液体クロマトグラフィの流路構成の別の態様（複数の反応試薬を事前に混合後、反応系へ導入する場合）を示した図である。一般的なプランジャポンプの構造を示した図である。ａは液体を吸引する工程を、ｂは液体を吐出する工程を、それぞれ示している。２種類の反応試薬をそれぞれのプランジャポンプを用いて送液したときの送液パターンの一例（反応試薬Ａと反応試薬Ｂとの流速が完全に一致する場合）を示した図である。ａは反応試薬Ａの流速パターンを、ｂは反応試薬Ｂの流速パターンを、ｃは反応試薬Ａと反応試薬Ｂの合計流速パターンを、それぞれ示している。２種類の反応試薬をそれぞれのプランジャポンプを用いて送液したときの送液パターンの別の例（反応試薬Ａと反応試薬Ｂとの流速が僅かに異なる場合）を示した図である。ａは反応試薬Ａの流速パターンを、ｂは反応試薬Ｂの流速パターンを、ｃは反応試薬Ａと反応試薬Ｂの合計流速パターンを、それぞれ示している。一般的な電磁式ダイアフラムポンプの構造を示した図である。ａは液体を吸引する工程を、ｂは液体を吐出する工程を、それぞれ示している。２種類の反応試薬を送液するポンプとして電磁式ダイアフラムポンプを用いたときの流路構成の一態様を示した図である。２種類の反応試薬をそれぞれの電磁式ダイアフラムポンプを用いて送液したときの吐出パターンの一例（反応試薬Ａと反応試薬Ｂの流速が完全に一致する場合）を示した図である。ａは反応試薬Ａを送液するポンプＡの吐出パターンを、ｂは反応試薬Ｂを送液するポンプＢの吐出パターンを、ｃはポンプＡとポンプＢの合計吐出パターンを、それぞれ示している。２種類の反応試薬をそれぞれの電磁式ダイアフラムポンプを用いて送液したときの吐出パターンの別の例（反応試薬Ａと反応試薬Ｂの流速が異なる場合）を示した図である。図ａは反応試薬Ａを送液するポンプＡの吐出パターン、図ｂは反応試薬Ｂを送液するポンプＢの吐出パターン、図ｃはポンプＡとポンプＢの合計吐出パターンを、それぞれ示している。一般的な電磁式ダイアフラムポンプを用いて送液したときの負荷に対する流量特性の一例を示した図である。ポンプの下流側に負荷がない流路構成において、２種類の反応試薬をそれぞれの電磁式ダイアフラムポンプを用いて送液したときの、各試薬の流れを示した図である。ａはポンプＡにより反応試薬Ａを吐出する工程を、ｂはポンプＢにより反応試薬Ｂを吐出する工程を、それぞれ示している。ポンプの下流側に負荷がある流路構成において、２種類の反応試薬をそれぞれの電磁式ダイアフラムポンプを用いて送液したときの、各試薬の流れを示した図である。ａはポンプＡにより反応試薬Ａを吐出する工程を、ｂはポンプＢにより反応試薬Ｂを吐出する工程を、それぞれ示している。図１１および図１２に示す流路構成において、２種類の反応試薬をそれぞれの電磁式ダイアフラムポンプを用いて送液したときの、各試薬の流れの模式図である。ａは図１１に示す流路構成における流れを、ｂは図１２に示す流路構成における流れを、それぞれ示している。本発明の送液装置の一態様を示した図である。ａはそれぞれのポンプにより送液された２種類の反応試薬を混合容器へ直接導入した態様を、ｂはそれぞれのポンプにより送液された２種類の反応試薬を事前に混合後混合容器へ導入した態様を、それぞれ示している。図１４の送液装置のうち混合容器付近を拡大した図である。ａは図１４ａの送液装置の混合容器付近を、ｂは図１４ｂの送液装置の混合容器付近を、それぞれ拡大した図である。本発明の送液装置を用いたときの、反応試薬Ａ送液ポンプ（ポンプＡ）、反応試薬Ｂ送液ポンプ（ポンプＢ）および混合反応試薬送液ポンプの動作を示した図である。本発明の送液装置を用いたときの、混合容器内の組成変化を示した図である。なお、反応試薬Ａ（Ｆａ）および反応試薬Ｂ（Ｆｂ）の流速は毎分１０μＬであり、ａは混合容器容量が５００μＬ、ｂは混合容器容量が２００μＬ、ｃは混合容器容量が１００μＬ、ｄは混合容器容量が５０μＬ、ｅは混合容器容量が２０μＬの場合を、それぞれ示している。実施例１で使用した本発明の送液装置を備えた液体クロマトグラフィの流路構成を示した図である。実施例１で使用したグルコースの誘導体化反応を示した図である。実施例１で使用した液体クロマトグラフィでグルコースを測定したときのクロマトグラムである。実施例１の測定における反応試薬Ａ送液ポンプ（ポンプＡ）、反応試薬Ｂ送液ポンプ（ポンプＢ）および混合反応試薬送液ポンプの動作を示した図である。実施例２で使用した本発明の送液装置を備えた装置の流路構成を示した図である。実施例２の測定における反応試薬Ａ送液用ポンプ、反応試薬Ｂ送液用ポンプおよび混合反応試薬送液用ポンプの動作を示した図である。ａは反応試薬Ａ送液用ポンプの動作、ｂは反応試薬Ｂ送液用ポンプの動作、ｃは混合反応試薬送液用ポンプの動作を、それぞれ示している。実施例２で得られた結果を示した図である。ａは紫外検出器の出力変化、ｂは混合反応試薬の実際の流量変化を示している。本発明の送液装置をプレカラム反応液体クロマトグラフィに適用したときの流路構成の一態様を示した図である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
本発明の送液装置の効果を実証するため、本発明の送液装置を備えたポストカラム反応液体クロマトグラフィを用いて糖分析を行なった。

アルドール類の糖は強アルカリ存在下で、２−シアノアセトアミド（２−ｃｙａｎｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）と加熱することで２８０ｎｍから３００ｎｍに紫外吸収を有する物質（誘導体）に変換される（図１９参照）。ここで変換された誘導体を検出器で検出することで糖分析を行なう。

本実施例で使用したポストカラム反応液体クロマトグラフィの流路構成を図１８に示す。試料注入バルブ（３）から注入された試料（５）は、溶離液送液ポンプ（１）で送液された溶離液（２）により分析カラム（７）に移送され、順相クロマトグラフィにより各成分に分離される。分離した各成分に対し、２．５％２−シアノアセトアミド溶液（反応試薬Ａ（１１ａ））および０．１ＭＮａＯＨ溶液（反応試薬Ｂ（１１ｂ））を本発明の送液装置を用いて混合／送液し、予熱コイル（３２）で８７℃に加熱した状態で連続的に添加後、４５℃で保たれた反応オーブン（９）中で誘導体を生成させ、その生成物を紫外検出器（１２）で検出した。なお、溶離液送液ポンプ（１）として東ソー製ＣＣＰＭＩＩを、検出器（１２）として東ソー製ＵＶ−８０２０（マイクロセル、波長３００ｎｍ）を、カラムオーブン（９）として東ソー製ＣＯ−８０２０を、反応試薬および混合反応試薬送液ポンプ（１０ａ、１０ｂ、１９）としてＫＮＦ社製ソレノイド駆動ダイアフラム式送液ポンプＦＭＭ２０を、それぞれ使用した。前記検出器の下流には加熱による気泡の発生を防ぐ目的で抵抗管（３１ａ）を配し、若干検出器に圧力が掛かるようにした。電磁式ダイアフラムポンプの下流（吐出部側）には、実送液量を抑える目的と脈流を緩和する目的で抵抗管（３１ｂ、３１ｃ）を配した。混合容器（２０）としては約３００μＬ容量のガラス製容器を使用した。溶離液（２）としては２０ｍＭのトリエチルアミンを含むアセトニトリル／水（７５／２５）、分析カラム（７）としては順相クロマトグラフィーカラム（東ソー製、ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ−８０、粒径：５μｍ、内径：１ｍｍ、長さ：２００ｍｍ）を使用し、溶離液送液ポンプ（１）を用いて毎分２７μＬで溶離液の送液を行なった。反応コイル（８）は内径０．２ｍｍ、長さ２ｍのＰＴＦＥチューブを使用した。試料（５）は、グルコース（濃度２５μｇ／ｍＬ）を用い、試料注入バルブ（３）を用いて０．５μＬを分析カラム（７）に導入した。

反応試薬Ａ（２−シアノアセトアミド溶液、１１ａ）、反応試薬Ｂ（０．１ＭＮａＯＨ溶液、１１ｂ）および反応試薬Ａと反応試薬Ｂとが混合した試薬を送液するための電磁式ダイアフラムポンプ（１０ａ、１０ｂ、１９）の吸引／吐出周期（設定値）および実際の流速（実測）は表１の通りである。また、本実施例における送液パターン（制御値）を図２１に示す。

前記条件で得られたクロマトグラムを図２０に、グルコースの溶出時間と面積、高さの再現性（ｎ＝１０）をまとめた表を表２にそれぞれ示す。溶出時間のＣＶが０．２６％、面積のＣＶが４．５％と良好な値を示しており、２つの反応試薬が安定的に送液されていることを示唆している。

実施例２
本発明の送液装置の効果を実証するため、紫外吸収を有する液体と紫外吸収を有しない液体（純水）を送液し、送液安定性、混合効率の検証を実施した。

本実施例で使用した装置の流路構成を図２２に示す。反応試薬Ａ（１１ａ）として純水、反応試薬Ｂ（１１ｂ）として１％アセトン水溶液を使用し、それぞれ電磁式ダイアフラムポンプ（１０ａ、１０ｂ）を用い、４秒周期で混合容器（２０）へ送液した。さらに、前記混合容器（２０）内の混合溶液を、別の電磁式ダイアフラムポンプ（１９）で１０秒周期で送液し、その組成変化を紫外検出器（１２）（検出波長：２５４ｎｍ）でモニタした。電磁式ダイアフラムポンプ（１０ａ、１０ｂ）の脈動を抑える目的で下流に抵抗管（３１ｂ、３１ｃ）を設けている。紫外検出器（１２）としてＫ−Ｍａｃ製ＵＶ−ＶｉｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ（ＳｐｅｃｔｒａＡｃａｄｅｍｙ）を、電磁式ダイアフラムポンプ（１０ａ、１０ｂ、１９）としてＫＮＦ社製ソレノイド駆動ダイアフラム式送液ポンプＦＭＭ２０を、それぞれ使用した。紫外検出器（１２）の下流には、実際の流量をリアルタイムで計測する目的で、電子天秤（３４）および時間と重量増加から流量を積算する流量計算機（３５）を設けている。なお、混合容器（２０）は約３００μＬ容量のガラス製容器を使用した。

本実施例における送液パターン（制御値）を図２３に示す。図２４は０分から１２０分までは反応試薬Ｂのみを送液、１２０分から２７０分までは反応試薬Ａのみを送液、２７０分から３５０分までは反応試薬Ａおよび反応試薬Ｂの送液を行なった場合の、実際に測定された流速および紫外吸収の変化を示したものである。図２３ｃと図２４ｂとの比較からもわかるように、電磁式ダイアフラムポンプによる吸引／吐出動作は間欠的に行なうものの、実際の流量はほぼ一定で連続的な値を示していることがわかる。これは、電磁式ダイアフラムポンプ（１０ａ、１０ｂ、１９）の吸引／吐出の周期が早く、下流に設置した抵抗管（３１ａ）が脈流を緩和させているためである。また、図２４ａと図２４ｂとの比較からわかるように、最終的に送液される溶液の組成が変化しても、実際の流量はほとんど変化せず、一定であることが分かる。

実施例３
本発明の送液装置を備えたプレカラム反応液体クロマトグラフィの一態様を図２５に示す。図２５に示す液体クロマトグラフィにおいて、本発明の送液装置に備える混合容器（２０）には、
試料導入手段（３６）により導入された試料（５）を受け入れるためのポートと、
反応試薬Ａ送液ポンプ（１０ａ）により送液された反応試薬Ａ（１１ａ）を受け入れるためのポートと、
反応試薬Ｂ送液ポンプ（１０ｂ）により送液された反応試薬Ｂ（１１ｂ）を受け入れるためのポートと、
反応試薬Ａ、反応試薬Ｂおよび試料が混合した溶液を送液ポンプ（１９）で送液するためのポートと、
反応試薬Ａ、反応試薬Ｂおよび試料の混合溶液の容量を一定に保つための試薬排出ポート（２３）と、
を設けている。

試料導入手段（３６）により導入された試料（５）は混合容器（２０）へ導入され、混合容器（２０）内で反応試薬Ａ（１１ａ）および反応試薬Ｂ（１１ｂ）と混合する。前記混合した溶液は、送液ポンプ（１９）により反応オーブン（９）内に設けた反応コイル（８）内を通過することで前記試料成分の誘導体化反応を行なう。前記誘導体化された試料成分は液体クロマトグラフィ試料注入バルブ（３）へ導入され、前記注入バルブ（３）の切り替えにより分析カラム（７）へ導入することにより特異的検出を行なう。

１：溶離液送液ポンプ
２：溶離液
３：試料注入バルブ
４：試料ループ
５：試料
６：カラムオーブン
７：分析カラム
８：反応コイル
９：反応オーブン
１０：反応試薬送液ポンプ
１１：反応試薬
１２：検出器
１３：廃液
１４：カム
１５：カム回転中心
１６：プランジャ
１７：チャンバ
１８：逆止弁
１９：混合反応試薬送液ポンプ
２０：混合容器
２１：攪拌子
２２：ミキサ（駆動ユニット）
２３：試薬排出ポート
２４：ポンプヘッド
２５：ミキシングコイル
２６：ダイアフラム
２７：ピストン
２８：電磁コイル
２９：電磁式ポンプの逆止弁
３０：ストローク調整止具
３１：抵抗管
３２：予熱コイル
３３：キャップ
３４：電子天秤
３５：流量計算器
３６：試料導入手段

Claims

２種類以上の試薬を混合し、前記混合した試薬を送液する、液体クロマトグラフィ用送液装置であって、
前記２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプと、前記ポンプにより送液された試薬を混合し貯留する混合容器と、前記混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプと、を備え、かつ前記混合容器が、
２種類以上の試薬を受け入れるポートと、貯留した混合試薬を送液するためのポートと、混合試薬の貯留容量を一定に保つための試薬排出ポートと、を備えた混合容器である、液体クロマトグラフィ用送液装置。
２種類以上の試薬をそれぞれ送液するポンプおよび／または混合容器に貯留した混合試薬を送液するポンプが電磁式ダイアフラムポンプである、請求項１に記載の送液装置。
試料を導入する導入手段と、
導入手段から導入した試料を分離する分析カラムと、
分析カラムから溶出した成分を検出または定量する検出手段と、
を備えた液体クロマトグラフィであって、
分析カラムの上流側、または分析カラムの下流側から検出手段までの間に、請求項１または２に記載の送液装置を備えた、液体クロマトグラフィ。
送液装置を分析カラムの下流側から検出手段までの間に備え、
分析カラムから溶出した成分に前記送液装置により送液された混合試薬を添加する位置から検出手段までの間に、前記溶出した成分と前記混合試薬とを反応させる反応手段をさらに備えた、請求項３に記載の液体クロマトグラフィ。