JP5526324B2 - 薬物が結合可能な光応答性薬物輸送体 - Google Patents
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低分子化合物、ペプチド、核酸又はタンパク質に直接光分解性保護基を結合させることによって一時的にその活性を抑え、光照射により保護基を除去することによって、活性を回復させることが可能な分子(広義な意味でのケージド化合物)である。また、最近では、光応答性官能基を有する非天然アミノ酸を含むタンパク質を人工的に合成し、その活性を光制御する方法も開発されている。
紫外光・可視光照射によってシス・トランス異性化するアゾベンゼンをグラフトしたアクリル酸とジメチルアクリルアミドとを共重合させて得た高分子を、タンパク質に結合させ、紫外・可視光照射に応じてエンドヌクレアーゼ12Aの活性をOFF/ONする方法である。
Jiangらは、ピレンメタノールをグラフトしたアクリル酸とポリエチレングリコールのブロック共重合体から形成した高分子ミセルにおいて、UV光照射によりピレンメタノールエステルが加水分解を受けてミセルが崩壊することに基づき、蛍光色素Nile Redを例に疎水性物質の光放出を実現している。また、山口らは、アルキル鎖の末端に光分解性の2−ニトロベンジル基を有するリン脂質を合成し、同分子が形成するリポソームがUV光照射により崩壊することを利用して、内水相に封入した水溶性物質(例として蛍光色素カルセイン)の光放出を実現している。
Rotelloらは、表面に、光分解性フェナシル基を介してアミンを有する化合物を結合させた金ナノ粒子、あるいは光分解性2−ニトロベンジル基を介してアミンを結合させた金ナノ粒子を開発し、その表面電荷が光応答的に正電荷から負電荷になることを利用して、キモトリプシンやDNAとの相互作用を光制御する方法を開発した(非特許文献1)。また、プラスミドDNAへ適用することで、細胞へのトランスフェクションの光制御も実現されている。
Nagasakiらは、末端にリジン残基を導入したポリアゾベンゼンデンドリマーを開発し、同分子がUV光及び可視光照射に応じてプラスミドDNAとの相互作用が変化することを利用して、細胞へのプラスミドDNAのトランスフェクションを光制御する。
本発明では、薬物の固定化が簡便であり、担体への薬物の精密な固定化方法を必要とせず、光照射に対して即応的な薬物放出及び活性化を実現でき、また、広範な薬物に適用可能な、新規な光応答性薬物輸送体を開発することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明者らは、微粒子(担体)の表面に担体結合基を介して、光分解性基及び薬物結合基を共有結合で結合することに着目し、種々検討して、本発明を完成することができた。
すなわち、本発明は、次の一般式
本発明の薬物付き光応答性薬物輸送体は、嵩高い微粒子の立体障害によって薬物活性を一時的に抑制し、光照射によって薬物を微粒子から切り離して、その活性を発揮させるのを原理とするため、微粒子に固定する薬剤の配向は大まかに設計するだけでよく、分子設計が容易である。また、薬物の活性発揮は光照射による微粒子からの薬物の切離しに基づくので、即応的な薬物放出及び活性発揮を実現できる。また、薬物としては広範なものを使用でき、医療分野における薬物輸送システム(DDS)、例えば、腫瘍部位のみへの至適量の薬剤投与も可能となり、薬剤の副作用軽減にも寄与できる。
はじめに、本発明の光応答性薬物輸送体又は薬物付き光応答性薬物輸送体における、光照射依存的な薬物放出と活性制御とを、図1の概念図を用いて説明する。
嵩高い微粒子担体(A)の表面に固定化された薬物(D)は、微粒子担体の立体障害効果によって薬物とその標的物質(B)との相互作用が妨げられ、結果的にその薬物の活性が抑制(阻害)されている。これに光照射すると、光分解性基(X)が分解し、薬物が微粒子担体表面から解離して、薬物と標的物質との相互作用が可能となり、薬物の活性が発揮される。
〔但し、式中のAは微粒子(担体)、
Xは担体結合基、
Yは光分解性基、
Lは薬物結合性官能基を意味する〕で表されるところの、
微粒子表面に、担体結合基、光分解性基及び薬物結合性官能基がこの順に共有結合で結合されている光応答性薬物輸送体、である。
微粒子の素材は、薬物の固定化に適するものであれば特に限定しない。金(Au)、ガラス、シリコン、炭素(C60、ダイアモンド)、金属酸化物、半導体、プラスチック(スチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、PET等)等がある。
なお、上記構造式における担体−担体結合基間の結合は、本願明細書では「共有結合」とみなしている。
〔但し、式中Aは微粒子(担体)、
Xは担体結合基、
Yは光分解性基、
Lは薬物結合性官能基、
D:薬物で、Rは前記薬物結合性官能基との反応に与る薬物中の官能基、
点線(…で表わす)は水素結合、配位結合、ファンデルワールス結合、静電的相互作用等の結合様式を意味し、薬物結合性官能基(L)が活性エステル基である場合には、薬物中の官能基(D)とカップリング反応した後は共有結合を示す。〕で表されるところの、
微粒子表面に、担体結合基、光分解性基及び薬物結合性官能基がこの順に共有結合で結合され、更にこれに薬物(ドラッグ)が結合されている薬物付き薬物輸送体である。
「薬物」(R−D)としては、生体に種々の生理活性を示す生理活性物質があり、更に具体的には、生理活性を示す種々の低分子化合物や、DNA・RNA等の核酸、あるいは糖、脂質、ペプチド、タンパク質等である。
なお、本発明で用いた下記構造式(I)のBis(12−(4−succinimidyloxycarbonyloxyethyl−2−methoxy−5−nitrophenyl)oxydodecyl) disulfideは、特開2007−291005に記載の方法によって合成した。
下記(a)の式(II)の構造で示されるDithiobis(succinimidylundecanoate)(同仁化学社製)、トリエチルアミン(和光社製)及びメトキシ化ポリエチレングリコールモノアミン(分子量5,000、日油社製)を、それぞれの最終濃度が1.4mM、2.4mM及び2.4mMとなるようにDMSO中で混合し、室温で1時間振とうして、式(III)のジスルフィド化合物を得た。
反応式は以下の(a)に示す。
式(I)のジスルフィド化合物、トリエチルアミン、およびBiotin PEO3−LC−amine(Pierce社製)を、それぞれの最終濃度が1.9mM、4.1mM、4.1mMになるようDMSO中で混合し、終夜振とうすることで、以下の反応式に示す式(IV)の化合物を得た。 反応式を式(b)に示す。
また、図中の点線で囲んだ部分がビオチン基である。
式(II)の構造式で示されるDithiobis(succinimidylundecanoate)(同仁化学社製)、トリエチルアミン及びトリエチレングリコールモノアミンを、それぞれの最終濃度が1.2mM、2.6mM及び2.6mMとなるようにDMSO中で混合し、室温で1時間振とうし、以下の反応式(C)に示す(V)のジスルフィドを得た。なお、トリエチレングリコールモノアミンは、文献(Bioconjugate Chemistry,12:701−710,(2001))にしたがって合成した。
反応式は以下の(c)に示す。
スクシンイミジルエステルを提示する金ナノ粒子と、分子内に1級アミンを有する薬剤とは、両者を混合するだけで、その薬剤を固定化した金ナノ粒子を容易に得ることができる。ここでは、固定する薬剤の例として、以下の式(VII)の11−アジド−3,6,9−トリオキサウンデカン−1−アミン(Fluka社製)を用いた。
光分解性基を介してニトリロ三酢酸(NTA)を提示する金ナノ粒子と、分子内にヒスチジンタグを有するタンパク質・ペプチド系薬剤とは、混合するだけで、その薬剤を固定した金ナノ粒子を容易に得ることができる。ここでは、固定する薬剤の例としてヒスチジンタグを有するグルタチオンSトランスフェラーゼ(His−GST)を用いた。
プラスミドDNApET41a(Novagen)で形質転換した大腸菌BL21を、37℃で終夜増殖後、対数増殖期に1mMのIPTGによってタンパク質発現を誘導し、その5時間後に集菌し、BugBuster(Novagen)で大腸菌を破砕し、遠心分離(12,000×15分)により細胞残屑を除去した。得られた可溶性画分をグルタチオンセファロースカラム(GEヘルスケア)に負荷し、グルタチオンによる溶出、限外濾過濃縮を経て、His−GSTを得た。
実施例3で得られた金ナノ粒子に対して、最終濃度7.5mMとなるようにNiCl2を加え、6時間〜終夜撹拌することによって、NTAをNi2+錯体に置き換えた。この金ナノ粒子を遠心洗浄(18,100rpm×30分、4回)した後、0.02%Tween20を含むリン酸バッファー(PBS)中で、His−GST25μgを添加し、室温で2時間反応させた。遠心分離(18,100rpm×30分、4回)により、未反応のHis−GSTを除去し、His−GSTを固定した金ナノ粒子(目的物)を得た。
薬物付き薬物輸送体として、実施例4で得られたもの(すなわち、光分解性基を介してスクシンイミジルエステルを提示する金ナノ粒子に式(VII)の化合物を固定したもの)を用いた。この薬物付き薬物輸送体を、石英セル中で、紫外透過・可視吸収フィルターU360(HOYA社製)を装着した250W超高圧水銀光源(SX−UI 251HQ、ウシオ社製)により、9.1mW/cm2の光量で30分光照射し、アミコン30,000を用いた遠心分離(7,000rpm×30分、4回)により脱塩した。脱塩後の濃縮物を凍結乾燥し、その粉末を用いてKBrによるタブレットを作製し、赤外線吸収スペクトルを測定した(図2の(3))。
同様にして、実施例1で得られた「光分解性基を介してスクシンイミジルエステルを提示する金ナノ粒子」、及び実施例4で得られた「11−アジド−3,6,9−トリオキサウンデカン−1−アミン(式(VII))を固定化した金ナノ粒子」を各々凍結乾燥し、その粉末を用いてKBrによるタブレットを作製し、赤外線吸収スペクトルを測定した(図2の(1)、(2))。
薬物付き薬物輸送体として、実施例5で得られたもの(光分解性基を介してNTAを担持する金ナノ粒子へHis−GSTが固定されたもの)を用いた。石英セル中で、ウシオの250W超高圧水銀光源により、6.3mW/cm2の光量(波長365nm)で適当時間光照射を行い、同溶液の遠心上清中(18,100rpm×30分)のタンパク定量を行うことで、溶液中に放出されたタンパク質を経時的に定量したところ、光照射時間に依存するタンパク質の放出が観察された(図3)。なお、横軸は光照射時間、縦軸は溶液中に放出されたHis−GST濃度(Bradford法で求めたもの)を意味する。また、このタンパク質の分子量をSDSポリアクリルアミド電気泳動により解析したところ、光照射時のみ溶液中に使用したHis−GSTと同じ分子量のタンパク質が放出されていることを確認できた(図4)。なお、図中の(i)はマーカー、(iiは)使用したHis−GST、(iii)は光照射粒子の遠心上清、(iv)は光非照射粒子の遠心上清である。
Claims (1)
- 下記式(19)、(21)又は(23)で表わされる、薬物が結合可能な光応答性薬物輸送体。
〔但し、式中のAは金ナノ粒子である〕
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