JP5513844B2 - タンパク質の翻訳後修飾の検出・定量用プローブ - Google Patents
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Description
(I)タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するためのプローブ
(I-1)N末端側から順に下記(1)〜(5)に示すアミノ酸配列を有するプローブ:
(1)キャップタンパク質のアミノ酸配列
(2)N端側にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列、
(3)ユビキチン化されうるリンカー配列
(4)修飾認識配列、および
(5)発色性タンパク質のアミノ酸配列。
(I-1)または(I-2)に記載するプローブをコードするポリヌクレオチド。
(I-1)または(I-2)に記載するプローブまたは(II)に記載するポリヌクレオチドを含む、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するための試薬または試薬キット。
(II)に記載するポリヌクレオチドを導入して調製される、(I-1)または(I-2)に記載するプローブを発現する非ヒト動物またはその子孫。
(V-1)(I-1)または(I-2)に記載するプローブを発現する細胞を用いて、当該プローブに起因する発色を測定することを特徴とする、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法。
(V-2)上記プローブを発現する細胞が、(II)に記載するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって調製されるものである、(V-1)に記載する方法。
(VI-1)被験物質の存在下で、(I-1)または(I-2)に記載するプローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
(VI-2)被験物質を、(I-1)または(I-2)に記載するプローブを発現しえる細胞、または(IV)記載の非ヒト動物またはその子孫に導入し、当該プローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
本発明のタンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するためのプローブ(本明細書では、単に「プローブ」または「翻訳後修飾検出・定量用プローブ」ともいう)は、少なくとも「(1)キャップタンパク質のアミノ酸配列」(以下、単に「(1)キャップ配列」ともいう)、「(2)N端側にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」(以下、単に「(2)配列」ともいう。またこの配列のうち、「ユビキチンリガーゼ認識配列」を「UbL認識配列」と、また「修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」を「基質配列」ともいう)、「(3)ユビキチン化されうるリンカー配列」(以下、単に「(3)リンカー配列」ともいう)、「(4)修飾認識配列」、および「(5)発色性タンパク質のアミノ酸配列」(以下、単に「(5)発色配列」ともいう)の5つのドメインを有するものである。
(b)リン酸化されたスレオニンを含むアミノ酸配列:forkhead-associated 2 domain(配列番号2:103〜288)
斯くして本発明の「プローブ」は、かかる「発色性タンパク質」の発色特性に基づいて、吸光分光法、発光分光法、または蛍光分光法などで検出することができ、その結果、マーカーもしくはインジケーターとして機能する。
本発明は、また、前述する翻訳後修飾検出・定量用プローブをコードするポリヌクレオチドを提供する。当該ポリヌクレオチドは、前述する本発明のプローブのアミノ酸配列から定法に従って帰納的に求めることができる。このため、本発明のポリヌクレオチドはその全配列を化学合成により構築してもよいし、またポリメラーゼ連鎖反応(PCR)等の一般的な遺伝子工学的手法により各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを調製し、それぞれを連結して作成することもできる。
また、ここで「作動可能に結合する」とは、プローブをコードするポリヌクレオチドが、上記各種の機能性DNA配列との結合位置及び方向に係わらず、細胞内で発現し得る状態で存在することを意味する。
本発明は、また、前述する翻訳後修飾検出・定量用プローブを発現するように構築された非ヒト動物またはその子孫動物(トランスジェニック非ヒト動物)を提供する。
前述する本発明のプローブまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化の組織学的研究やそのメカニズムを解明するための試薬として有効に使用することができる。特に本発明のプローブは、生きた細胞内や体内におけるタンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化を、目で視覚的に見えるように設計されていることから、マーカー試薬または分子イメージング試薬として有効に使用することができる。なお、ここでいう本発明のプローブをコードするポリヌクレオチドは、前述するように、当該ポリヌクレオチドが細胞内で発現するのに必要な機能性DNA配列に、作動可能に結合された状態のものであってもよい。
本発明は、前述する本発明のプローブまたはそれをコードするオリゴヌクレオチド(前述する試薬)を用いて、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法を提供する。
本発明は、また、前述する本発明のプローブまたはそれをコードするオリゴヌクレオチド(前述する試薬)を用いて、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法を提供する。ここで対象とする翻訳後修飾への「影響」には、タンパク質の翻訳後修飾に正の影響(修飾誘導、修飾促進)を与える場合と、負の影響(修飾抑制、脱修飾)を与える場合の両方が含まれる。
(1)インスリン受容体によるリン酸化検出・定量用プローブ(IR-Lucus)の設計と作成(図2)
受容体型チロシンキナーゼであるインスリン受容体(IR)による翻訳後修飾(リン酸化)を可視化するためのプローブ(以下、これを「IR-Lucus」ともいう)を作成した。
上記プローブ(IR-Lucus)のNegative Controlとして、2種類のプローブ(UbG76VIR-Lucus、IR-Lucus-Ala)を作成した。
(1)IR導入細胞(CHO-IR細胞)の調製
(1-1)IR発現ベクターの構築
インスリン受容体(IR)のcDNAを、膵臓由来のcDNAライブラリーから定法のPCRに従って増幅しクローニングした。クローニングして得られたcDNAをpBLuescript SK(+)(宝酒造社製)にサブクローニングし、得られたPCRフラグメントの塩基配列を、ABI310ジェネティック・アナライザーにより確認した。斯くして、インスリン受容体(IR)をコードするcDNAを、哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.1/V5-HisA(Invitrogen Co.)のHind IIIおよびEcoR I部位にサブクローニングし、これをIR発現ベクターとした。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、10 %ウシ胎児血清(FCS)(ライフ・テクノロジー社製)を補充したHamのF-12培養液(CHO用培養液)中で、37℃、5 %CO2 下で培養した。得られたCHO細胞を付着細胞用表面処理済み培養皿に播種し、LipofectAMINE2000試薬(ライフ・テクノロジー社製) を用いて、37℃、5 %CO2の条件で、(1-1)で調製したIR発現ベクターを導入し、IR導入細胞(CHO-IR細胞)を調製した。
(2-1)プローブ発現ベクターの構築
実施例1で作成した各プローブ(IR-Lucus、UbG76VIR-Lucus、IR-Lucus-Ala)をコードするcDNAを、それぞれ哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.1/V5-HisA(Invitrogen Co.)のHind IIIおよびEcoR I部位にサブクローニングし、それぞれIR-Lucus発現ベクター、UbG76VIR-Lucus発現ベクター、およびIR-Lucus-Ala発現ベクターとした。
上記(1)で調製したIR導入細胞(CHO-IR細胞)を、付着細胞用表面処理済み培養皿に播種した。次いでLipofectAMINE2000試薬(ライフ・テクノロジー社製)を用いて、37℃、5%CO2の条件で、当該IR導入細胞(CHO-IR細胞)に、上記(2-1)で調製した各プローブ発現ベクター(IR-Lucus発現ベクター、UbG76VIR-Lucus発現ベクター、およびIR-Lucus-Ala発現ベクター)をそれぞれ導入し、プローブ導入細胞(IR-Lucus導入細胞、UbG76VIR-Lucus導入細胞、およびIR-Lucus-Ala導入細胞)を調製した。当該プローブ導入細胞は、インスリン受容体(IR)(キナーゼ)とプローブ(IR-Lucus、UbG76VIR-Lucus、またはIR-Lucus-Ala)が共発現するCHO細胞(IR-プローブ発現細胞)である。以下、IRとプローブ(IR-Lucus)が共発現するCHO細胞を「IR-プローブ(IR-Lucus)発現細胞」と、IRとプローブ(UbG76VIR-Lucus )が共発現するCHO細胞を「IR-プローブ(UbG76VIR-Lucus )発現細胞」と、またIRとプローブ(IR-Lucus-Ala)が共発現するCHO細胞を、「IR-プローブ(IR-Lucus-Ala)発現細胞」という。
(1)実施例2(2)(2-2)で調製した「IR-プローブ(IR-Lucus)発現細胞」を、プロテアソーム阻害剤(MG-132)で処理した後、この細胞を可溶化し、V5エピトープに対する抗V5抗体(クロンテック社製)とHRP標識二次抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。また比較のため、プロテアソーム阻害剤(MG-132)で処理しない「IR-プローブ(IR-Lucus)発現細胞」についても可溶化して同様に、抗V5抗体を用いてウェスタンブロッティングに供した。
これは、プローブ(IR-Lucus-Ala)の基質配列はインスリン刺激してもリン酸化されず、ポリユビキチン化が生じているのに対して、プローブ(IR-Lucus)の基質配列は、インスリン刺激によってリン酸化し、その結果、ポリユビキチン化が抑制されていることを意味する(図3e参照)。
CHO-IR細胞に、プローブ(IR-Lucus)またはプローブ(IR-Lucus-Ala)を導入して調製した「IR-プローブ(IR-Lucus)発現細胞」(5×106個)または「IR-プローブ(IR-Lucus-Ala)発現細胞」(5×106 個)を、マウス右背面皮下にそれぞれ移植して一晩放置した後、1.0IU/kgの容量でインスリンを当該マウスの腹腔内に注射した。
マウスin vivoイメージングの直前に、ルシフェリン(150mg/kg)を当該マウスの腹腔内に注射して、超高感度カメラを設置した暗箱でプローブからのルシフェラーゼの生物発光を1分間可視化計測した。
(1)セリン・スレオニンキナーゼによるリン酸化検出・定量用プローブ(Akt-Lucus)の設計と作成(図5a)
細胞死や糖代謝を制御するセリン・スレオニンキナーゼであるAkt による翻訳後修飾(リン酸化)を可視化するためのプローブ(以下、これを「Akt-Lucus」ともいう)を作成した。
(1)プローブ導入細胞の調製
(1-1)プローブ発現ベクターの構築
実施例6で作成したプローブ(Akt-Lucus)をコードするcDNAを、哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.1/V5-HisA(Invitrogen Co.)のHind IIIおよびEcoR I部位にサブクローニングし、Akt-Lucus発現ベクターとした。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、10 %ウシ胎児血清(FCS)を補充したHamのF-12培養液(CHO用培養液)中で、37℃、5 %CO2 下で培養した。得られたCHO細胞を付着細胞用表面処理済み培養皿に播種し、LipofectAMINE2000試薬(ライフ・テクノロジー社製) を用いて、37℃、5 %CO2の条件で、(1-1)で調製したAkt-Lucus発現ベクターを導入し、プローブ(Akt-Lucus)導入細胞(「プローブ(Akt-Lucus)発現細胞」)を調製した。
実施例6で調製したプローブ(Akt-Lucus)を用いて、Akt によるタンパク質リン酸化が細胞内のどこで、どの程度起こっているのかを検討した。
IR導入細胞を、10 %ウシ胎児血清(FCS)(HyClone)を補充したHamのF-12培養液(GIBCO)中(CHO用培養液)、37℃ 、5 % CO2 下で培養した。得られたCHO細胞を付着細胞用表面処理済み培養皿に播種し、LipofectAMINE2000試薬(ライフテクノロジー社製) により37℃、5 %CO2 下でIR-Lucus発現ベクターを遺伝子導入した。その後、遺伝子導入した細胞を0.2mg/ml G418および0.2mg/ml Hygromycin B(Invitrogen)で処置し、G418(ナカライテスク)およびHygromycin Bへの耐性に対してIR-Lucusを安定的に発現する細胞を選択するために培養を続け、安定発現細胞株(IR-IRLucus安定発現細胞株)を選択した。
本プローブが、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質を探索するハイスループットスクリーニングにおいて、有効に利用できることが実証するために、384 well Cell-Culture Microplate(コーニング社)および1,536 well Cell-Culture Microplate(greiner bio-one社)による検討を行った。
配列表フリーテキスト
配列番号1は、タンパク質の翻訳後修飾(リン酸化)を検出または定量するためのプローブ(IR-Lucus)のアミノ酸配列;配列番号2は、タンパク質の翻訳後修飾(リン酸化)を検出または定量するためのプローブ(Akt-Lucus)のアミノ酸配列;配列番号3は細胞内膜(小胞体膜・ゴルジ体膜)の局在化配列のアミノ酸配列;配列番号4はミトコンドリア外膜の局在化配列のアミノ酸配列;配列番号5は核の局在化配列のアミノ酸配列;配列番号6は細胞質の局在化配列のアミノ酸配列を、それぞれ示す。
Claims (9)
- N末端側から順に下記(1)〜(5)に示すアミノ酸配列を有するプローブ:
(1)キャップタンパク質のアミノ酸配列
(2)N端側にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列、
(3)ユビキチン化されうるリンカー配列
(4)修飾認識配列、および
(5)発色性タンパク質のアミノ酸配列。 - C末端側に、さらに(6)局在性配列を有することを特徴とする、請求項1に記載するプローブ。
- 請求項1または2に記載するプローブをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1または2に記載するプローブまたは請求項3に記載するポリヌクレオチドを含む、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するための試薬または試薬キット。
- 請求項3に記載するポリヌクレオチドを導入して調製される、請求項1または2記載のプローブを発現してなる非ヒト動物またはその子孫。
- 請求項1または2に記載するプローブを発現する細胞を用いて、当該プローブに起因する発色を測定することを特徴とする、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法。
- 上記プローブを発現する細胞が、請求項3に記載するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって調製されるものである、請求項6に記載する方法。
- 被験物質の存在下で、請求項1または2に記載するプローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
- 被験物質を、請求項1若しくは2に記載するプローブを発現しえる細胞または請求項5記載の非ヒト動物またはその子孫に導入し、当該プローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
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