JP5513745B2 - 生物学的分子および担体ポリマーを含む粒子の調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、超臨界流体法を用いる生体分子および生物学的に活性な物質のデリバリーのための粒子担体の製造方法、該方法を用いて作製できる生産物、および該方法を実施するための装置に関する。

注射（ＩＭ／ＩＶ）後の細胞取込のための生物学的活性物質のデリバリーの成功は、しばしば、標的に届く前に体が該活性物質を分解する能力、および標的の該活性物質を取り込む能力によって制限される。例えば、ＤＮＡ療法のデリバリーの間、プラスミドは、系に存在する化学物質によって破壊される場合があり、ＤＮＡが可溶化されているか、または溶液中にある場合、樹状細胞などの標的細胞は、溶性物質の取り込みを好まないことがある。ウイルス性ベクター、粒子担体およびアジュバントの使用を包含する該ハードルを克服するためのいくつかの戦略が採用されている。なかでも、本発明に関わる特定のものは、粒子担体アプローチであり、該アプローチによって活性物質が粒子形態中に包まれて、化学物質の攻撃から活性物質を保護し、粒子療法が食作用などの自然過程によって細胞に侵入することを可能とする。細胞中への侵入およびその後の粒子担体の破壊後、治療物質は制御された方法で放出され、治療応答をもたらしうる。

今日までに、所望の物理的、化学的および生物学的特性を有するかかる粒子担体を製造する手段として、種々の処理方法が利用されてきた。１の既知の処理方法は、超臨界流体または臨界点近傍流体の使用を含む。本明細書中で使用される場合、「超臨界流体」なる語は、実質的に、同時にその臨界圧（Ｐｃ）および臨界温度（Ｔｃ）であるか、または同時にその臨界圧（Ｐｃ）および臨界温度（Ｔｃ）を越えている流体をいう。本明細書中で使用される場合、「臨界点近傍流体」なる語は、溶液（または溶媒）の換算温度（Ｋｅｌｖｉｎで測定された実際の温度をＫｅｌｖｉｎで測定された溶液（または溶媒）の臨界温度で割った値）および換算圧力（実際の圧力を溶液（または溶媒）の臨界圧力で割った値）がどちらも０．８よりも大きいが、超臨界流体ではない流体をいう。したがって、特定の流体の臨界点近傍条件は、換算温度および換算圧力がどちらも各々、０．８より大きい条件であるが、超臨界ではない条件をいう。本明細書中で使用される場合、「流体」なる語は、溶媒および溶媒中の溶液のどちらも示す。周囲条件下で、溶媒は、気体または液体であることができる。「溶媒」なる語は、また、２以上の異なる個別の溶媒の混合物を包含することを意味する。

臨界点近傍および超臨界流体（ＳＣＦ’ｓ）の使用およびその特性は、広範囲に文書化されている（例えば、ＭｃＨｕｇｈ Ｍ．Ａ．およびＫｒｕｋｏｎｉｓ Ｖ．Ｊ．，Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，第２版，１９９４、Ｋｉｎｇ Ｍ．Ｂ．およびＢｏｔｔ Ｔ．Ｒ．，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｅａｒ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｓｏｌｖｅｎｔｓ，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｇｌａｓｇｏｗ，１９９３、およびＫｒｕｋｏｎｉｓ Ｖ．Ｊ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｇ．およびＰｅｒｒｕｔ Ｍ．，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ，Ｔｏｍｅ １，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３ｒｄ Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．ｏｎ Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ，１９９４参照）。超臨界流体は、それらの独特の特性のために、いくつかの活動分野においてかなりの関心がもたれている。これらの特性は、自己拡散および気体に近い粘度、液体に近い密度、および表面張力ゼロを包含する。さらに、超臨界流体の高い圧縮性は、圧力の小さな変化に対する流体密度の大きな変化を意味し、次いで、それは、高度に調節可能な溶媒化力をもたらし、かくして、単一の超臨界流体を用いて選択的抽出が可能である。さらに、多くの超臨界流体は周囲の温度および圧力条件で気体であり、それは、従来の液体抽出において必要とされた蒸発または濃縮工程を不要にする。超臨界流体の密度は、典型的に、通常の作業条件下で０．１〜１．４ｇｍｌ−１である。一般に使用される超臨界流体の多くは、その不活性およびルーチンな作業条件において使用される穏やかな温度のために、低安定性の化合物を用いる作業に有益な環境を提供する。二酸化炭素は、安価で、容易に入手可能であり、不活性で、非毒性で、非可燃性であり、かつ、周囲温度に近い臨界温度を有するので、最も幅広く使用されるＳＣＦである。

ＳＣＦを使用できる多くの方法がある。１のかかるクラスの方法において、超臨界流体は、反溶媒（anti-solvent）または非溶媒として使用される。ガス反溶媒（Gas-Anti Solvent）（ＧＡＳ）、超臨界反溶媒（Supercritical Anti-Solvent）（ＳＡＳ）、圧縮流体反溶媒での沈澱（Precipitation with a Compressed fluid Anti-solvent）（ＰＣＡ）、エーロゾル化超臨界抽出システム（Aerosolised Supercritical Extraction System）（ＡＳＥＳ）、および固体の溶液強化分散（Solution Enhanced Dispersion of Solids）（ＳＥＤＳ）などの技術は、該クラスの例である。

しかしながら、ＤＮＡプラスミドなどの生物学的分子の再形成のための反溶媒としての超臨界流体の利用において、ＤＮＡの活性または所望の構造の保存において問題が引き起こされる場合がある。これは、Ｏｋａｍｏｔｏらによる文献、Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ９２，Ｎｏ２，２００３ ｐｐ３７１−３８０、Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｉｎｔ Ｊ．Ｐｈａｒｍ，２９０，（２００５） ｐｐ７３−８１、Ｔｓｅｒｖｉｓｔａｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏ．Ｅｎｇ，Ｖｏｌ７２，Ｎｏ１，２００１において報告されている。これらの問題は、主として、例えばＤＮＡなどの分子の溶解のための水性媒体の使用、次いで、水の存在下で酸形成物質である二酸化炭素などの超臨界反溶媒との混合の結果としての、ｐＨ効果およびプロトン攻撃の結果として引き起こされる。かかる場合、バッファーを用いてｐＨを安定化して、生物学的分子の分解を最小限にする。

ＵＳ−Ａ−５，０４３，２８０は、ポリラクチドなどの担体ポリマー中に埋め込まれた医薬物質を有する生成物の製造方法であって、該物質および該担体を含有する液体媒体を超臨界ガス中に送り、かくして形成された粒子を媒体とガスとの混合物から分離することを特徴とする方法を開示する。

ＵＳ−Ａ−６，１８３，７８３は、ポリマーフィルムの被包層で被覆された活性物質を含むマイクロカプセルの製造方法であって、活性物質をポリマー溶液中に懸濁し、次いで、超臨界流体を用いて溶媒を抽出してマイクロカプセルを形成させる方法を開示する。
ＵＳ−Ａ−５，８３３，８９１は、生物学的分子をポリマー粒子中に埋め込むことのできる方法であって、生物学的分子およびポリマーの混合した溶液または懸濁液を超臨界流体中にスプレーすることによる方法を開示する。

ＷＯ−Ａ−２００４／００４８６２は、溶媒中における物質の溶液の小滴を非混和液中に懸濁し、次いで、超臨界流体を用いて溶媒を抽出することによる、物質の粒子を作成する方法を開示する。
ＷＯ−Ａ−２００４／００６８９３は、炭水化物ポリマーおよび生物ポリマーを含む粒子の作成方法であって、これら２つを含む溶液と超臨界流体とを混合することによる方法を開示する。

本発明の目的は、生物学的分子を含む粒子の形成のための超臨界流体を用いる新規な方法を提供することにあり、既知の方法のこれらの問題に向けられている。本明細書中で使用される場合、「生物学的分子」なる語は、特に、核酸分子（該用語はＤＮＡおよびＲＮＡ分子を包含する）またはタンパク質分子を包含する。

本発明によると、生物学的分子および担体ポリマーを含む粒子の調製方法が提供され、該方法は、生物学的分子の濃度が、溶剤中における該生物学的分子の飽和濃度の５０％以上である生物学的分子および担体ポリマーの有機溶剤中溶液を提供し、
次いで、該溶液媒体を反溶媒物質と接触させて、それにより、生物学的分子および担体ポリマーを、生物学的分子および担体ポリマーの両方を含む粒子として溶剤から分離させる工程を含む。

その後、本発明の方法において、形成された流体を使用するために、単離および収集してもよい。

本発明の方法は、一般的に既知の方法に類似の方法で、生物学的分子を粒子中に被包して、生物学的分子を化学的攻撃から保護することができ、かつ、該粒子治療剤を食作用などの自然過程によって細胞中へ侵入させることができる。驚くべきことに、本発明の方法を用いると、二酸化炭素などの酸性ベースの物質を用いて、定量可能な分解を伴うことなくＤＮＡプラスミドなどの感受性生物学的分子のための特定の担体を製造するために、超臨界流体に基づく方法を用いることが可能であり、粒子中のプラスミドなどの生物学的分子の負荷量が別法によって達成されるよりも高く、有益な治療特性があることが見出された。

本発明の方法は、好ましくは、次いで、形成された粒子を単離および収集するさらなる工程を有する。後者の工程は、好ましくは、次いで、形成された粒子を治療に使用される医薬処方中に処方するさらなる工程を有する。

「生物学的分子」なる語は、本明細書において、ペプチドおよびペプチド誘導体、例えば、ポリペプチドおよびタンパク質、および核酸誘導体、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。本発明の方法は、特に、ＤＮＡプラスミドである生物学的分子と一緒に使用するのに適する。かかる物質をカプセルで被包することが当該分野で知られている。本発明の方法は、特に、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミドである生物学的分子と一緒に使用するのに適する。ＤＮＡプラスミドは、典型的には、１〜４００＋キロ塩基対（ｋｂｐ）の大きさの範囲である。本発明を用いてカプセル被包できるプラスミドの大きさには制限がないようであり、本明細書中に報告される実験的例は、２〜１０ｋｂｐのプラスミドのカプセル被包を示すが、これは非限定的かつ典型例であると考えられるべきである。

「担体ポリマー」なる語は、当該分野の用語である。担体ポリマーは、生物学的分子のカプセル被包の分野で知られており、適当なポリマーは、包まれる生物学的分子に関する既知の特徴に基づいて選択されうる。１つの担体ポリマーまたは複数の担体ポリマーを用いてもよい。適当な担体ポリマーは、患者に投与した後に、その中身の生物学的分子の放出を容易にするように、水溶性のポリマー、または水と接触すると崩壊するポリマー、例えば、生物分解性ポリマーを包含する。適当なポリマーは、特に、臨界点近傍または超臨界流体二酸化炭素を反溶媒物質として使用する場合、ポリヒドロキシ酸およびポリヒドロキシ酸を基礎とするポリマー、特に、ポリ−（Ｌ−ラクチド）を包含する。ＰＬＡは、生物学的適合性で生物分解性物質であり、最も一般的には、下記に示すように、開環重合によって乳酸の環状ジエステルから調製される。

乳酸のキラル性質のために、ＰＬＡのいくつかの別個の形態が存在する。Ｌ型であるポリ−（Ｌ−ラクチド）は、典型的に、約３７％の結晶性、約５０−８０℃のガラス転移温度および１７３−１７８℃の融点を有する。

かかるポリヒドロキシ酸、特にＰＬＡの適当な分子量は、約５０００〜１５０，０００、好ましくは約５，０００〜７５，０００である。分子量が高ければ、生じる分離した粒子が少数になり、かつ、放出速度が遅くなる。例えば、担体ポリマーは、ポリヒドロキシ酸から選択される２以上のポリマーの混合物、例えば、２以上のポリ乳酸の混合物を含みうる。

担体ポリマーは、例えば、その性質を修飾するために、他の物質を含んでいてもよい。例えば、担体ポリマーは、ポリマーの湿潤を増加するために１以上の界面活性剤を含んでいてもよい。例えば、粒子は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含んでいてもよく、ＰＶＰは、粒子中、ＰＬＡと一緒になって、典型的には粒子の湿潤を促進することによって、粒子の分解速度を修飾することができる。典型的には、担体ポリマーは、０．１〜１．０ｗｔ％のＰＶＰを含有しうるが、ＰＶＰ量の増加は、分離した粒子の形成よりもむしろ凝集の傾向をもたらすことができるので、実際的な上限値が見出されうる。

溶剤中における生物学的分子：担体ポリマーの重量比は、例えば、１：１０００〜１：１、好ましくは、１：２０〜１：１であってもよい。粒子の所望の特性を達成するための適当な比は、実験的に決定すればよい。これらの比は、本発明のさらなる利点を示し、ここに、先行技術よりも、ＤＮＡなどの生物学的分子の負荷量が有意に高い粒子を作成しうる。

生物学的分子の濃度が溶剤中の生物学的分子の飽和濃度の５０％以上である有機溶剤は、単一有機溶媒物質または複数の溶媒物質の混合物を含んでいてもよい。好ましくは、有機溶剤は、生物学的分子が比較的よく溶ける第１の有機溶媒、および生物学的分子が比較的溶け難い第２の有機溶媒の混合物であって、担体ポリマーが第１および第２の溶媒のいずれかまたは両方に対して溶解性である混合物を含む。好ましくは、有機溶剤は、実質的に、無水であり、例えば、１％ｖ：ｖ未満、好ましくは０．５％ｖ：ｖ未満、より好ましくは０．１％ｖ：ｖ未満の水しか含有していない。

好ましくは、本発明の方法は、
第１有機溶媒中における生物学的分子の第１溶液を提供し、
第２有機溶媒中における担体ポリマーの第２溶液を提供し、
第１および第２溶液を混合して、
それにより、生物学的分子の濃度が形成された第１および第２溶媒の混合物中における生物学的分子の飽和濃度の５０％以上である第１および第２溶媒の混合物を形成し、
次いで、形成された混合物を反溶媒物質と接触させて、それにより、生物学的分子および担体ポリマーを、生物学的分子および担体ポリマーの両方を含む粒子として、第１および第２溶媒の混合物から分離する
工程によって実施する。

該本発明の方法を実施する好ましい方法において、第１および第２溶媒に同じ溶媒物質を用いてもよい。例えば、生物学的分子の第１溶液は、溶媒中において、該溶媒中における生物学的分子の飽和濃度の５０％以上の生物学的分子濃度で調製してもよく、担体ポリマーの第２溶液は、同じ溶媒中で調製してもよい。第２溶液の体積は、第１溶液の体積と比べて非常に小さくてもよく、第１および第２溶液を混合した場合、生物学的分子の濃度は、依然として、第１および第２溶液を混合することによって形成される溶剤中における生物学的分子の飽和濃度の５０％以上である。

好ましくは、該本発明の方法を実施する好ましい方法において、第１有機溶媒は、生物学的分子が比較的溶けやすい溶媒であり、第２有機溶媒は、生物学的分子が比較的溶け難い溶媒である。
生物学的分子が溶性である適当な第１有機溶媒は、既知である。プラスミドなどのＤＮＡ分子に好ましい溶媒は、極性溶媒、特に、ＤＮＡと配位結合できるもの、例えば、当該分野で「配位性溶媒」と呼ばれているものである。ＤＮＡ分子に適当な第１有機溶媒物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびホルムアミドを包含する。第１溶媒は、単一の第１溶媒物質または複数の溶媒物質の混合物を含んでいてもよい。

第１有機溶媒中におけるＤＮＡ分子の第１溶液は、いずれかの適当な方法によって調製されうる。適当な方法は、ＤＮＡ分子の水性溶液（かかる分子は、通常、水性溶液として保存される）からＤＮＡ分子を、例えば、ＤＮＡ分子が典型的にはゲルとして析出するｐＨにｐＨを調製することによって、例えば、該水性溶液を酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）などの適当なバッファーと混合することによって、および／または該水性溶液を水混和性有機溶媒、例えば、エタノールなどのＣ_１−５アルコールと混合することによって、沈澱させることを特徴とする。次いで、沈澱したＤＮＡ分子を洗浄して、例えばエタノールなどのＣ_１−５アルコールなどの有機溶媒中、残留塩、例えば、酢酸ナトリウムなどの混入物質を除去してもよい。次いで、沈澱したＤＮＡ分子を水抽出性媒体、例えば、エタノールなどのＣ_１−５アルコールと接触させたまま維持して、沈澱ＤＮＡから水を除去してもよい。ＤＮＡは、本発明の方法で使用する前、かかる媒体中で保存してもよい。次いで、例えば、デカント、次いで蒸発によって、ＤＮＡを水抽出性媒体から分離してもよい。次いで、ＤＮＡを第１溶媒、例えば、ＤＭＳＯ中に溶解してもよい。

既知の種類の担体ポリマーが溶性である適当な第２有機溶媒は既知であり、適当な第２溶媒は、担体ポリマーに基づいて選択されうる。第２溶媒は、単一溶媒物質または複数の溶媒物質の混合物を含んでいてもよい。適当な第２有機溶媒物質は、第１溶媒よりも極性の低い溶媒、例えば、実質的に非極性溶媒を包含する。適当な第２溶媒は、ハロゲン化炭化水素、例えば、Ｃ_１−５ハロゲン化炭化水素溶媒、例えば、ジクロロメタン、クロロホルムおよびヘキサフルオロイソプロパノールを包含する。例えば、かかる溶媒中、ポリ乳酸は非常によく溶けるが、ＤＮＡは事実上、不溶性である。

「事実上、不溶性」なる語は、例えば薬局方に定義されるような、医薬分野において許容される意味を有する。典型的には、「事実上、不溶性」なる語は、１，０００部以上の第２溶媒中において１部の生物学的分子の溶解度、好ましくは、５，０００部以上の第２溶媒中において１部の生物学的分子の溶解度、より好ましくは、１０，０００部以上の第２溶媒中における１部の生物学的分子の溶解度をいう。

生物学的分子の濃度は、溶剤、例えば、第１および第２有機溶媒の混合物中における生物学的分子の飽和濃度の５０％以上である。好ましくは、該濃度は、７５％以上、好ましくは、９０％以上である。最も好ましくは、溶剤は、生物学的分子で飽和または過飽和されており、すなわち、溶液濃度は飽和濃度の１００％以上である。この高い濃度は、担体ポリマーによって被包されるようにするために、生物学的分子を担体ポリマーよりも前に溶液から析出させるためである。かかる混合物中における生物学的分子の飽和濃度は、実験的に決定すればよい。

溶剤が第１および第２溶媒の混合物を含む場合、上記の生物学的分子濃度は、好都合には、第１および第２溶媒、および混合物中におけるそれらの相対比率の選択によって達成されうる。例えば、これは、生物学的分子が不溶性または事実上不溶性である第２溶媒の選択によって達成されうる。かかる第２溶媒を生物学的分子が溶性である第１溶媒と混合することによって、生物学的分子の飽和濃度が第１溶媒中よりも低い第１および第２溶媒の混合物が調製されうる。かかる第２溶媒を、第１溶媒中における生物学的分子の溶液と混合することによって、該混合物中における飽和濃度に相対的な生物学的分子の濃度を増加することができる。飽和濃度の５０％以上である第１および第２溶媒の混合物中における生物学的分子の濃度は、該混合物を反溶媒物質と接触させた場合に、生物学的分子の沈澱を促進する。

かかる第１および第２溶媒の混合物中における第１および第２溶媒の適当な比率は、実験的に決定すればよい。例えば、上記ＤＭＳＯまたはホルムアミドなどのより極性の高い第１溶媒、および上記ハロゲン化溶媒などのより極性の低い第２溶媒の場合、適当な第１：第２溶媒体積比は、２：１〜１：１０、典型的には２：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：３＋／−１０％でありうる。

第２有機溶媒中における担体ポリマーの第２溶液を提供し、次いで、これを第１溶液と混合することによる好ましい方法で溶剤が成し遂げられる場合、第２溶液中における担体ポリマー溶液の濃度は、例えば、０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍｌでありうる。

第１および第２溶液は、種々の方法で混合してもよい。１の適当な方法において、第２溶媒中における担体ポリマーの第２溶液を、第１溶媒中における生物学的分子の第１溶液に加えてもよい。例えば、第２溶液を第１溶液に滴下してもよく、次いで、該混合物をよく混合する。しかしながら、別法では、第１溶液を第２溶液に加えてもよい。

しかしながら、次いで、提供される溶剤を反溶媒物質と接触させて、それにより、生物学的分子および担体ポリマーを、生物学的分子および担体ポリマーの両方を含む粒子として媒体から分離する。好ましい反溶媒物質は、超臨界流体または臨界点近傍流体または液化ガスである。好ましくは、該流体の圧力は、０．８〜７．０Ｐｃであり、温度は、０．８〜４．０Ｔｃである。便宜上、および生物学的分子または担体ポリマーの分解傾向を回避するために、これらの圧力および温度範囲の下限が好ましい。適当には、本発明の方法のために、好ましくは２５℃〜４５℃および圧力８０〜３００バール、典型的には８０〜２００バールにおける超臨界状態または臨界点近傍状態において、二酸化炭素を反溶媒物質として用いてもよい。好ましい反溶媒物質は、超臨界流体二酸化炭素である。二酸化炭素は、３１℃の臨界温度および７４バールの臨界圧を有する。生物学的分子ＤＮＡに好ましい処理条件は、３０〜４０℃であり、これを超えると、ＤＮＡの分解が起こる可能性がある。１００〜２００バールの圧力が適当なようであり、この範囲を超えると、粒径にほとんど影響がないようである。結果として、一般に、所望の粒径を達成するために適当な条件は、３５＋／−５℃および圧力１００＋／−２０バールでありうる。

反溶媒に使用してもよい他の適当な物質は、超臨界および臨界点近傍亜酸化窒素、一酸化炭素、エチレン、クロロトリフルオロメタン、エタン、Ｃ_１−Ｃ_５ヒドロフルオロカーボンまたはその誘導体、例えば、トリフルオロメタン、テトラフルオロエタンおよびクロロフルオロカーボンを包含する。

溶剤、例えば、第１および第２溶液の混合物は、反溶媒物質、例えば、超臨界流体と種々の方法で接触させてもよい。例えば、混合処理は、ガス−反溶媒（ＧＡＳ）、超臨界反溶媒（ＳＡＳ）、圧縮流体反溶媒での沈澱（ＰＣＡ）、エーロゾル化超臨界抽出システム（ＡＳＥＳ）、または固体の溶液強化分散（ＳＥＤＳ）処理であってもよい。

１の方法において、超臨界条件または臨界点近傍条件下、超臨界流体または臨界点近傍流体を圧力容器中に入れ、溶剤を圧力下、圧力容器中に導入ことによって、溶剤を超臨界流体または臨界点近傍流体、例えば、超臨界または臨界点近傍二酸化炭素と接触させる。適当には、かかる圧力容器は、超臨界条件を維持するための適当な圧力が容器内で維持される一方で、超臨界流体の物質が出口を介して出ていくことができ、減圧後、例えば、出口を介して溶剤を、例えば蒸気状態で、運搬することができるような、その出口に背圧制御を有するフロー容器であってもよい。

かかる条件下、粒子の沈澱は、典型的に、反溶媒が超臨界状態であるような条件下、圧力容器内で起こり、粒子を該圧力容器から収集してもよい。適当には、粒子の収集は、超臨界流体反溶媒物質、例えば、二酸化炭素がガスに変換するように圧力容器を減圧することによって、達成されうる。適当には、該減圧工程の前に、フロー容器中に超臨界流体を流して、残留する第１および第２溶媒を形成された粒子から一掃する段階があってもよい。

別の方法において、溶剤および超臨界流体は、各導管に沿って、混合された溶液および超臨界流体が合流して互いに接触する領域に送られうる。この最後に記載した本発明の方法を実施する方法を実施するための適当な装置は、その２つの肢の各々に沿って第１および第２溶液および超臨界流体を送ることができ、その結果、それらが管の接合点で合流し、第３の肢に沿って流れ、第３の肢を介して出ていくことができる「Ｔ」または「Ｙ」配置の管を含む。例えば、溶剤および超臨界流体は、各共軸導管に沿って、混合された溶液および超臨界流体が合流して互いに接触する領域に送られうる。典型的には、かかる配置において、反溶媒、例えば、超臨界流体は、２つのかかる共軸導管の外側に沿って送られ、溶剤は内側に沿って送られうる。

本発明の方法によって形成された粒子は、有利には、少なくとも部分的に、好ましくは全体的に、担体ポリマーによって被包された生物学的分子の形態にある。上記のように、本発明のさらなる利点は、先行技術の方法よりも、ＤＮＡなどの生物学的分子の負荷量粥有意に高い粒子が作成されうることである。典型的な先行技術の方法は、粒子中において約１重量％の生物学的分子、例えば、ＤＮＡを成し遂げる。

したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって提供されうる、生物学的分子および担体ポリマーを含む粒子であって、該生物学的分子が粒子の５重量％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２５％以上、または５０％以上を構成する粒子を提供する。粒子の９９％以上までが生物学的分子であってもよい。これらの粒子中、生物学的分子は、５０％以上が担体ポリマーに包まれた状態であってもよく、好ましくは９０％以上が包まれている。被包されていない生物学的分子は、典型的には、粒子の外表面にあるか、または粒子と結合していない。ＰＬＡを担体ポリマーとして有する粒子は、典型的には、１００ｎｍ〜２μｍの最大寸法を有する。

かかる粒子において、典型的な担体ポリマーは、上記のとおりであり、例えば、本発明の方法に関して上記したように、ポリヒドロキシ酸およびポリヒドロキシ酸を基礎とするポリマーである。
上記のように、かかる粒子中の担体ポリマーは、他の物質、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を上記のレベルで含んでいてもよい。

かかる粒子は、生物学的分子および担体ポリマーを含む先行技術の粒子と同じ方法で生物学的分子に基づく療法に用いてもよいが、本発明の粒子、例えば、本発明の方法の生産物において達成された生物学的分子のより高い負荷量は、それらが投与された患者に応答増加を導くことができる。「療法」なる語およびその派生語は、本明細書において、予防的および治癒的治療の両方を包含する。

本発明のさらなる態様において、例えば、注射（ＩＭ／ＩＶ）後の細胞取り込みのために、患者への投与形態で提供される本発明の粒子を含む治療的処方が提供される。かかる処方は、適当なビヒクルと共に、例えば、水性ビヒクルと共に、注射に適当な形態に作製されたかかる粒子を含んでいてもよい。
さらなる態様において、治療の必要なヒトまたは動物の治療方法であって、かかる患者にかかる医薬処方を投与する工程を含む方法が提供される。

本発明は、今回、ほんの一例として、下記の図面を参照して記載される。
図１は、本発明の方法を実施するために使用されるような装置の単純化されたフローダイアグラムである。
図２および図３は、本発明の方法を用いて調製されるような本発明の粒子のマイクロ写真である。
図４は、本発明の粒子からのＤＮＡの放出を示すゲル電気泳動跡である。
図５は、本発明の粒子からのＤＮＡの放出を示す別のゲル電気泳動跡である。
図６は、本発明の粒子からの長時間のＤＮＡの放出を示す。
図７は、粒子のサイズ分布を示す。
図８は、イン・ビボ実験の結果を示す。

図１に関し、本発明の方法を実施するための適当な装置は、工程温度および圧力に抵抗することができる温度調節された粒子収集容器１を含む。溶液リザーバー２が提供され、そこから、ポンプ４の手段によって、生物学的分子および担体ポリマーの混合溶液が管３を介して圧力容器１に送られることができる。圧縮ガス状二酸化炭素の供給源５、例えば、通常のシリンダーは、そこから二酸化炭素がポンプ７の手段によって、管６を介して容器１へ送られうる。圧力容器１中に送られる二酸化炭素の温度を調節するために、熱交換器８が提供され、二酸化炭素の流れの圧力もまた、熱交換器８の下流で二酸化炭素が超臨界状態になるように調節される。リザーバー２由来の混合溶液および超臨界二酸化炭素は、共軸ノズル９を介して容器１中に送られ、該溶液は内側の導管１０に沿って流れ、超臨界二酸化炭素は外側の導管１１に沿って流れる。容器１内には、容器１内で形成される粒子１３を捕獲するために、フィルターカップ１２が提供される。二酸化炭素および過剰の溶媒は、容器１から排出管１４を介して出ていくことができ、排出管１４には、容器１中の二酸化炭素が超臨界または臨界点近傍状態になるように容器１内の圧力を維持するために、背圧調節器１５が提供される。調節器１５の下流で、二酸化炭素および溶媒の混合物は、リサイクルまたは廃棄のために適当な収集容器（示されない）に送られうる。該装置には、当該分野で理解されるような適当なセンサーおよび制御装置が提供される。

実施例１
ＨＢＶ−Ｓ ＤＮＡプラスミドを負荷したポリ（Ｌ−ラクチド）粒子の形成
１．ＤＮＡ溶液の調製
ＤＮＡプラスミドは、外部から供給された。使用した３つのプラスミドは、ｐＧＡＧ（４．９ｋｂｐ，ＨＩＶウイルスのＧＡＧ抗原をコードする）：ｐＲＮＧ（６．５７ｋｂｐ，ＨＩＶウイルスのＲＴ、ＮｅｆおよびＧＡＧ抗原をコードする）、およびＨＢＶ−ＳＡｇ（４．９ｋｂｐ，Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）をコードする）であった。これらは、典型的かつ代表的なＤＮＡプラスミドであると考えられる。

典型的な例において、低温で保存されたＰＢＳ中におけるＨＢＶ−Ｓプラスミドの１ｍｇ／ｍｌ溶液５ｍｌを室温になるまで放置した。該溶液に、０．２５ｍｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および１０ｍｌの無水エタノールを加えた。該溶液を低温で静置して、ＨＢＶ−Ｓプラスミドを沈澱させた。該溶液を３５００ｒｐｍで３０分間遠心分離してプラスミドを濃縮した。次いで、該プラスミドを無水エタノール中で３回洗浄して、いずれの残留塩も除去した後、必要時まで、エタノールを基礎とする媒体下、低温で保存した。

該エタノールを捨て、大量の残留エタノールを蒸発させるために、ペレットを室温で放置した。Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって供給された分析等級ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍｌを加えた。次いで、該溶液を混合し、ＨＢＶ−Ｓプラスミドが全て溶液中に入るまで遠心分離した。使用されたＤＭＳＯの典型的な水分含量は、ＤＮＡを溶解する前、０．０１３８％であった。

研究は、ＤＮＡプラスミドが有機溶媒ＤＭＳＯおよびホルムアミド中に溶解された後、そのスーパーコイル構造を保持するかどうかを確認するために行われた。これは、ＤＮＡプラスミドを用いるいくつかの小規模沈澱実験を実施することによって行われた。ＢＰＤによって供給されたＤＮＡプラスミド１００μｇを１ｍｌのＤＭＳＯまたはホルムアミド中に溶解し、ＤＮＡ溶液を密閉ガラスピペット中に入れた。次いで、浸漬管を用いて溶液中に二酸化炭素をバブリングすることによって有機溶媒を除去し、各溶媒で３回の沈澱を行った。沈澱したＤＮＡの状態をゲル電気泳動によって決定した。この結果は、二酸化炭素を用いて溶媒を除去することにより、ＤＮＡがこれらの溶媒から沈澱することができることを示し、また、試料のほとんどにおいて、沈澱後にＤＮＡのスーパーコイル構造の少なくともいくらかが保持されたことを示した。しかしながら、これらの溶媒と接触する長い処理時間は、ＤＮＡのスーパーコイル構造を分解する傾向にあることが分かった。

２．ポリマー溶液の調製
Ｆｌｕｋａによって供給された約０．５ｄｌ／ｇの固有粘度（製造者の明細）および約６７，４００の分子量（製造者の明細）を有するポリ（ｌ−ラクチド）「ＰＬＡ」５０ｍｇを正確に計量した。１０ｍｌの分析等級ジクロロメタン（ＤＣＭ）を加え、該溶液を１０分間超音波処理して、完全にＰＬＡを溶解させた。

３．ＤＮＡおよびポリマー溶液の混合
次いで、ＰＬＡ／ＤＣＭ溶液をＤＮＡ／ＤＭＳＯ溶液に滴下し、得られた溶液を混合した。

４．ＤＮＡおよびポリマー溶液と超臨界流体の接触
次いで、ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液を、Ｊａｓｃｏ ＰＵ−９８０ポンプを用いて、流速１ｍｌ／分で、１／１６’’ステンレススチール管から内径１２７μｍの１０ｃｍ長ノズルを通って、粒子収集容器１中に送り込んだ。ＢＯＣによって供給された二酸化炭素を圧力１００バールまで、３ｋｇ／時間の速度でポンプで汲み上げ、熱交換器に通して二酸化炭素を３５℃に加熱し、混合ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液と同じ時に粒子収集容器中に送り込み、ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液と接触させた。溶液の混合物が超臨界二酸化炭素と接触する時、ＤＮＡおよびＰＬＡの微小粉末としての沈澱が開始する。

ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液および二酸化炭素の粒子収集容器中への流れは、ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液が全てポンプで汲み上げられるまで、２０分間続けられた。次いで、１：１ ＤＣＭ：ＤＭＳＯ溶液の混合物を１ｍｌ／分で５分間ポンプで汲み上げて、ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液の管を洗浄し、それにより、ＤＮＡ／ＰＬＡ溶液の全てが確実に沈澱するようにした。

次いで、溶液ポンプを止め、一方、超臨界二酸化炭素の流れを３０分間持続させた。次いで、二酸化炭素ポンプを止め、系を減圧した。いったん系を完全に減圧したら、試料を回収した。

下記の表は、上記の実施例１の手法にしたがう１４回の実験において使用された条件範囲を例示するものである。

図２および３は、粒子のマイクロ写真を示す。付随するスケールは、粒子の大きさを示す。形成された粒子の試料はある程度堅く結合した直径約１０ミクロンまでの凝集物を含有したが、個々の粒子は、直径２００ｎｍ〜３ミクロンの大きさで形成された。図１において、粒子は、９５ｗｔ．％の分子量６７，０００のＰＬＡおよび５ｗｔ．％のＤＮＡプラスミドを含む。図２において、粒子は、８９ｗｔ．％の分子量６７，０００のＰＬＡの混合物、１０ｗｔ％のＤＮＡプラスミドおよび１ｗｔ％のポリビニルピロリドンを含む。

分子量約６７，０００のＰＬＡを用いると、直径２ミクロン未満の分離した個々の粒子が形成され、いずれの凝集物も容易に分散することが分かった。分子量約１０２，０００のＰＬＡを用いると、生成物は、直径２ミクロン未満の分離した個々の粒子を含む白色粉末であったが、２００ミクロンまでの堅く結合された大きな凝集物も存在した。分子量約１５２，０００および２５９，０００のＰＬＡを用いると、生成物は、大きな白色ふわふわしたボールであり、個々の粒子は観察されなかった。

分子量約５，０００のＰＬＡを用いると、分離した個々の球形粒子が形成されたが、分子量６７，０００のＰＬＡを用いて製造された粒子よりも大きく、５０ミクロンまでのいくつかの凝集物が存在した。ＳＥＭは、これらの粒子がわずかに有孔性であることを示し、これにより、該低分子量ＰＬＡが超臨界二酸化炭素中にわずかしか溶けないことを示唆した。

処理条件の適当な選択により、注射に適当な粒径を達成することができる。

図７は、０．５バール真空圧にてＳｙｍｐａｔｅｃ上で測定した分子量６７，０００のＰＬＡを用いる上記の方法を用いて形成される粒子のサイズ分布のグラフを示す。

５．ＰＶＰとの共同処方
実験は、担体ポリマー中へのＰＶＰの共同処方の影響を決定するために行われた。ＰＶＰ共同処方は、上記の実験において使用された分子量約６７，０００のＰＬＡを用いて調製された。顕微鏡検査は、ＰＶＰ量の増加に伴って、凝集物の形成が数およびサイズにおいて増加したことを示した。１ｗｔ％以下のＰＶＰを含有する試料は、所望の粒子特性を保持した。

形成した粒子の湿潤性を評価するために、種々の割合でＰＶＰを含有する１５ｍｇの各粒子試料を１０ｍｌの水中に置き、３０分間振盪する外観検査を行った。結果を下記にまとめる。

これらの外観観察は、高いＰＶＰ負荷がＰＬＡの湿潤性を改善したことを示す。動的光散乱分析を最低量のＰＶＰを含有する試料で行った。該試料は、１０ｍｇを量り、これを３ｍｌの水に添加することによって調製された。次いで、該試料を１０分間プローブ超音波処理に付した。試料の各々のカウント率を分析し、カウント率が高ければ高いほど、懸濁中の粒子が多かった。結果は、ＰＶＰの量と、懸濁中に含まれる粒子の数との間に相関があることを示した。
０．１ｗｔ％ ＰＶＰ カウント率＝６００ｋｃｓ^−１
０．５ｗｔ％ ＰＶＰ カウント率＝８００ｋｃｓ^−１
１ｗｔ％ ＰＶＰ カウント率＝１４００ｋｃｓ^−１

６．粒子中におけるＤＮＡの被包の証拠
図４は、生成粒子のゲル電気泳動分析を示す。
図４に示されるレーンは、
レーン１：１Ｋｂ＋マーカー
レーン２：１μｌクロロホルム／ＴＥ抽出物
レーン３：２μｌクロロホルム／ＴＥ抽出物
レーン４：５μｌクロロホルム／ＴＥ抽出物
レーン５：１μｇＥｔＯＨを用いた沈澱
レーン６：ＥｔＯＨを用いた沈澱、ＴＥ洗浄
レーン７：ＤＣＭ／ＴＥを用いて抽出し、ＥｔＯＨを用いて沈澱したＤＮＡ １μｇ
レーン８：濾過およびＥｔＯＨ沈澱由来のＤＮＡ １μｇ
レーン９：１００ｎｇ投入ＤＮＡ
レーン１０：５００ｎｇ投入ＤＮＡ
レーン１１：１μｇ投入ＤＮＡ
レーン１２：１Ｋｂ＋マーカー

レーン１および１２は、サイズマーカーである。レーン２〜４は、１０ｗｔ％ＤＮＡ試料（６７ｋ ＰＬＡ）を示し、ここに、クロロホルムを用いてポリマーを溶解し、次いでＴＥバッファーを加えてＤＮＡを抽出した。これらのレーンは、試料中にＤＮＡが存在することを示す。レーン５、７、８、９、１０および１１は、本明細書中で標準として用いられている同じプラスミドＤＮＡの種々のレベルである。

レーン６は、同じ試料をＴＥバッファー中で洗浄して、いずれかのゆるく結合した、または結合していないＤＮＡを除去した場合を示す。かくして、バンドが見られないことは、ＤＮＡが被包されていることを示す。
ゲル電気泳動は、また、ＤＮＡがそのスーパーコイル構造の大部分を保持したことを示した。

７．被包効力
１、５、１０、２５および５０ｗｔ％のＤＮＡ負荷量を有する粒子（残りは担体ポリマーである）を、分子量約６７，０００のＰＬＡを用いて上記のように調製した。５、１０および２５ｗｔ％のＤＮＡ負荷量を有する粒子（残りは担体ポリマーである）を、分子量約５，０００のＰＬＡを用いて上記のように調製した。被包効力は下記のとおりであった。

８．ＤＮＡの構造に対する超臨界二酸化炭素の影響
超臨界二酸化炭素がＤＮＡのスーパーコイル構造を崩壊するか否かを決定するために、上記の処理を純粋なＤＮＡプラスミドで、すなわち、担体ポリマーを用いないで行った。この目的のために、５ｍｇのＤＮＡプラスミドのペレットを５ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解し、該溶液を上記の処理に付した。該実験の収率は９２％であり、ゲル電気泳動研究は、ＤＮＡがそのスーパーコイル構造の大部分を保持したことを示した。

９．粒子からの無傷ＤＮＡの持続放出の証拠
図５は、ゲル電気泳動分析を示し、無傷ＤＮＡが粒子担体から長時間放出されていることを示す。該放出は、ゲル電気泳動によって測定され、５ｋおよび６７ｋの両方について１０ｗｔ％負荷試料であるＰＬＡの１０ｍｇ／ｍｌ懸濁液５０μｌを各時点で用いた。粒子を５０μｌ ＴＥバッファー中室温でインキュベートした後、各試料２μｌを０．８％アガロースゲル上に付し、遺伝子量でＤＮＡ定量を行った。注意：該ゲル画像上では認識できないが、６７ｋ粒子からの放出が見られた。しかしながら、放出レベルは非常に低く、遺伝子量の検出下限を越えている。重要な点は、ＤＮＡが無傷状態で長時間放出していることである。

長時間の粒子担体からのＤＮＡの持続的放出のさらなる証拠は、ＵＶ分光学によって測定された。図４のゲルから得られた例示的放出プロフィールは、図６に示され、ＤＮＡプラスミドが長時間にわたって、注射後の担体から放出されることができることを明らかにする。ＰＬＡ−ＤＮＡ、ＰＬＡ−ＰＬＡ−ＤＮＡおよびＰＬＡ−ＰＶＰ−ＤＮＡを修飾することによって、放出のタイムスケールおよび性質を調節する組成物を有利に調節することができることが分かった。

１０．イン・ビボ研究
イン・ビボ研究は、上記の超臨界流体処理によって製造された粒子がイン・ビボ応答を生じることができるかを評価するために、マウスで行った。上記のようにして形成された粒子を含む２つの処方をＧｅｎｅ Ｇｕｎ（ＢＰＤｓ’Ｇｏｌｄ Ｓｔｄ’）および裸のＤＮＡプラスミドと共に試験した。
イン・ビボ作業のためにしたがったプロトコールは、標準的なものであり、承認された手順にしたがった。
図８は、２８日後の応答を示す。デリバリーされた全ＤＮＡは、各ケースで同じではなかった。Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ＝１μｇ、ＳＣＦ＝１０μｇおよび「裸の」ＤＮＡ＝１００μｇ。正の結果が得られた。結果は、本発明の方法を用いて製造された粒子がイン・ビボで応答を誘起することを示し、「裸の」ＤＮＡよりも少なくとも１０倍良好な応答が得られた。

図１は、本発明の方法を実施するために使用されるような装置の単純化されたフローダイアグラムである。 図２は、本発明の方法を用いて調製されるような本発明の粒子のマイクロ写真である。 図３は、本発明の方法を用いて調製されるような本発明の粒子のマイクロ写真である。 図４は、本発明の粒子からのＤＮＡの放出を示すゲル電気泳動跡である。 図５は、本発明の粒子からのＤＮＡの放出を示す別のゲル電気泳動跡である。 図６は、本発明の粒子からの長時間のＤＮＡの放出を示す。 図７は、粒子のサイズ分布を示す。 図８は、イン・ビボ実験の結果を示す。

Claims (23)

1. 核酸誘導体、ＤＮＡまたはＲＮＡである生物学的分子、および担体ポリマーを含む粒子の調製方法であって、
   生物学的分子と配位結合できる極性溶媒である第１の有機溶媒と、Ｃ_１−５ハロゲン化炭化水素溶媒である第２の有機溶媒との混合物である有機溶剤中における、前記生物学的分子および担体ポリマーの溶液を提供し、ここで、担体ポリマーは第１および第２の溶媒のいずれか又は両方に対して溶解性であり、前記有機溶剤は１％ｖ：ｖ未満の水を含有し、そして、生物学的分子の濃度は生物学的分子の前記有機溶剤中における飽和濃度の５０％以上であり、
   次いで、該溶液を、超臨界流体である反溶媒物質と接触させて、それにより、生物学的分子および担体ポリマーを、生物学的分子および担体ポリマーの両方を含む粒子として前記有機溶剤から分離させる工程を含む、方法。
2. 次いで、形成された粒子を単離および収集するさらなる工程によって特徴付けられる請求項１記載の方法。
3. 生物学的分子がＤＮＡプラスミドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 担体ポリマーがポリヒドロキシ酸またはポリヒドロキシ酸を基礎とするポリマーを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 担体ポリマーがポリ−（Ｌ−ラクチド）を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
6. ポリ−（Ｌ−ラクチド）が約５０００〜１５０，０００の分子量を有することを特徴とする請求項５記載の方法。
7. ポリ−（Ｌ−ラクチド）の分子量が約５，０００〜７５，０００であることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 担体ポリマーが１以上の界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 担体ポリマーがポリビニルピロリドンを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 担体ポリマーが０．１〜１．０ｗｔ％のポリビニルピロリドンを含有することを特徴とする請求項９記載の方法。
11. 前記有機溶剤中における生物学的分子：担体ポリマーの重量比が１：２０〜１：１の範囲であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
12. 第１の有機溶媒中における生物学的分子の第１溶液を提供し、
    第２の有機溶媒中における担体ポリマーの第２溶液を提供し、
    第１および第２溶液を混合して混合溶液を形成し、それにより、第１および第２溶媒の混合物である有機溶剤を形成し、ここに、生物学的分子の濃度は、形成された第１および第２溶媒の混合物である有機溶剤中における生物学的分子の飽和濃度の５０％以上であり、
    次いで、該形成された混合溶液と反溶媒物質とを接触させて、それにより、生物学的分子および担体ポリマーを、生物学的分子および担体ポリマーの両方を含む粒子として、第１および第２溶媒の混合物である有機溶剤から分離する
    工程によって特徴付けられる請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 第１の有機溶媒がジメチルスルホキシドまたはホルムアミドであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
14. 第２の有機溶媒がジクロロメタン、クロロホルムおよびヘキサフルオロイソプロパノールから選択される請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
15. 生物学的分子の濃度が、前記有機溶剤中における生物学的分子の飽和濃度の９０％以上であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
16. 前記有機溶剤が生物学的分子で飽和されているか、または過飽和されていることを特徴とする請求項１５記載の方法。
17. 第１：第２溶媒体積比における第１溶媒および第２溶媒が２：１〜１：１０である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. 第２の有機溶媒中における担体ポリマーの第２溶液を提供し、該溶液を第１溶液と混合することを特徴とし、ここに、第２溶液中における担体ポリマー溶液の濃度が０．１〜２００ｍｇ／ｍｌである請求項１２〜１７のいずれか１項記載の方法。
19. 反溶媒物質が２５℃〜４５℃および圧力８０〜３００バールの二酸化炭素であることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法、
20. 前記有機溶剤および前記超臨界流体を、混合された溶液および超臨界流体が合流して互いに接触する領域に、各々の導管に沿って送ることを特徴とする請求項１９記載の方法。
21. 次いで、形成された粒子を治療に用いられる医薬処方に製造するさらなる工程を含む、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
22. 請求項１〜２１のいずれかに記載の方法で調製される、生物学的分子および担体ポリマーを含む粒子であって、前記生物学的分子が前記粒子の５重量％以上を構成する、前記粒子。
23. 請求項２２に記載の粒子を含む、医薬組成物。

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