JP5496898B2 - タンパク質リフォールディングのための方法および剤 - Google Patents
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Description
バイオテクノロジーにおける1つの重要なプロセスは、組換タンパク質の発現である。分子生物学において達成された発達に起因して、タンパク質を、そのコード配列から始めてクローニングすること、および組換のやり方で、それを宿主生物中で産生することが可能である。バクテリアにおける組換タンパク質の高収率産生により、組換タンパク質はしばしば、生物学的に不活性な凝集体または封入体の形態で沈殿する。これらの封入体中に含まれるタンパク質は、続いて、in vitroリフォールディングにより、生物学的に活性な形態に変換されなければならない。
WO03/051908には、特別なイオン性液体、すなわち置換イミダゾリウム塩のリフォールディング剤としての使用が開示されている。
それゆえ、新規な、高度に有効なタンパク質リフォールディング添加物についてのはっきりとしたニーズが存在した。
特定の電子密度分布を有するイオン性液体が、タンパク質リフォールディングおよび安定化剤に特に有効であることが見出された。前記イオン性液体は、空間的に互いに異なる少なくとも1つの電子供与体領域および少なくとも1つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含む必要がある。
[HetN]+−ED A
または
[HetNED]+ B
ここで、HetNは、少なくとも1つの窒素原子を環系の一部とする芳香族性、一部芳香族性または非芳香族性のヘテロシクリル環系である、
の1種であるカチオンを有する。典型的には、HetNは5または6員環構造である。
構造Bによれば、EDはヘテロシクリル環系の一部であり、これはEDが環構造に直接組込まれた電子供与基であることを意味する。
−H、−CN、−OR’、−NR’2、−P(O)R’2、−P(O)(OR’)2、−P(O)(NR’2)2、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−NO2、1〜20のC原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、2〜20のC原子および1または2以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、2〜20のC原子および1または2以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、1〜6のC原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、3〜7のC原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−C1〜C6アルキルもしくはアリールC1〜C6アルキルを表し、
ここで、1または2以上の置換基R1’〜R4’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Fおよび/または−Cl、または−OH、−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−C(O)X、−SO2OH、−SO2X、または−NO2によって置換されていてもよいが、R1’およびR4’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基R1’からR4’の1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO2−、−SO2O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N+R’2−、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO2NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’2)NR’−、−PR’2=N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、R’=H、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたC1〜C6アルキル、C3〜C7シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびX=ハロゲンであり、
好ましい態様において、本発明のイオン性液体のカチオンは、1つだけの電子供与体領域を有する。
置換基R’は、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。
好ましい態様において、1分子当たり置換基R1’からR4’のうちの1つ、ただし1つのみが、−CN、−OR’、−NR’2、−P(O)R’2、−P(O)(OR’)2、−P(O)(NR’2)2、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’2、−SO2NR’2または−NO2である。
そして、他のR2’は、互いに独立して、−H、メチル、エチル、イソプロピル、n-プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルである。最も好ましくは−Hである。
そして、R1’は、メチル、エチル、(イソ−)プロピル、n−プロピルまたはn−ブチルの群から選択される。
別の好ましい態様において、イオン性液体のアニオンは、Cl−、Br−、I−またはBF4 −である。
a)タンパク質を、尿素や塩酸グアニジニウムなどの変性剤またはカオトロピック剤で封入体から可溶化すること(これは、組換タンパク質が、変性(完全にアンフォールド)され、可溶化(凝集体が溶解)することを意味する)、
b)ステップa)で可溶化されたタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも1つの電子供与体領域および少なくとも1つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも1種含む液体媒体と接触させることによってリフォールディングすること、
により、タンパク質を封入体から抽出する方法にも向けられる。
好ましい態様において、剤は付加的に1種または2種以上の以下の物質を含む:
−トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン、還元型グルタチオン、1,4−ジチオスレイトール、または2−メルカプトエタノールなどの、還元剤、
−酸化型および還元型グルタチオンの混合物あるいはシステインおよびシスチンの混合物などの、酸化還元系、
−尿素、グアニジニウム、L−アルギニン、アルキルウレア、カルボン酸アミド、アルキル化アミン、トリスバッファ、ポリエチレングリコール、デタージェント、糖、および/または両性イオン分子などの、リフォールディングを推進することが知られている他の物質
BCAはビシンコニン酸を意味する
bis−TRISは2,2−ビス(ヒドロキシメチル)−2−2’−2’’−ニトリロトリエタノールを意味する
BMEは2−メルカプトエタノールを意味する
bmimClは1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドを意味する
Brij−35はC12E23ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテルを意味する
CHESは2−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸を意味する
DTEはエリスロ−1,4−ジメルカプト−2,3−ブタンジオールを意味する
DTTは1,4−ジチオスレイトールを意味する
EDTAはエチレンジアミンテトラ酢酸を意味する
EKはウシエンテロキナーゼの触媒性サブユニットを意味する
emimClは1−エチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドを意味する
Hepesは4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸を意味する
λPPaseはλタンパク質ホスファターゼを意味する
Mesは2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸を意味する
MMP12はヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ12からの触媒性サブユニットを意味する
Mopsは3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸を意味する
TCEPはトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンを意味する
THPはトリス(ヒドロキシプロピル)ホスフィンを意味する
Trisはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンを意味する
trx−GFPは細菌性チオレドキシンタンパク質および緑色蛍光タンパク質からなる融合タンパク質を意味する
イオン性液体または液体塩は、有機カチオンおよび無機または(それ程多くないが)有機アニオンからなるイオン種である。これらは中性分子を含まない。これは本発明にしたがって使用されるイオン性液体が、室温で液体であり、あるいは室温で液体でない場合、少なくとも処理条件下で、液体型で存在する、および/または液体媒体に可溶であるべきであることを意味する。例えば、N−エチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウムは室温で固体であるが、4〜37℃の室温で生物学的に関連のあるバッファ(pH5.0〜9.0)に高度に可溶(>2.0M)である。
例えば、1,4−メチルピペラジンは2価の1,1,4,4−テトラメチルピペラジニウムカチオンに変換することができるが、好ましい態様においては、本発明のイオン性液体は、1つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンのみを含有する。
電子供与体領域を有するカチオンの例は、N−アルキルジメチルアミノピリジニウムおよびN,N−ジアルキルモルホリニウムである。
本発明によれば、熱安定性の増大は、それぞれ、生物学的活性または正しいタンパク質フォールディングが、室温よりはるかに高温であり得る温度においてさえ長期間に渡って維持されることを意味する。
封入体は、多くの確立された手法のいずれかを用いて、宿主細胞から単離されてよい。
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、Xa因子、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよびキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンまたはレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテイナーゼ;
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、キモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンIII;
ウィルスタンパク質、例えば、ウィルスエンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、ウィルスプロテアーゼ、ポリメラーゼおよび/またはT抗原;
ホスファターゼ;
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび/またはセリンキナーゼ;
成長因子、例えば上皮成長因子(EGF)、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子(FGF)、インスリン様成長因子IおよびII(IGF IおよびII)、インターロイキン−2(IL−2)、神経成長因子(NGF)、形質転換成長因子ベータ(TGF−ベータ)および/または血小板成長因子(PDGF)、
ならびにこれらのタンパク質から誘導されるタンパク質および断片である。
ウシエンテロキナーゼ(エンテロキナーゼについてEK)。プロテインデータバンク(PDB)同定番号1EKB。
マトリクスメタロプロテアーゼ12(MMP12)。PDB同定番号2OXU。
チオレドキシンおよび緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質(trx−GFP)。TrxのPDB同定番号2TRX。GFPのPDB同定番号1B9C。
ラムダプロテインホスファターゼ(λPPase)。PDB同定番号1G5B。
ヒトライノウィルスプロテアーゼ3C(HRV 3C)。PDB同定番号1CQQ。
のリフォールディングに好適である。
高温においては凝集反応が増大するため、リフォールディングは好ましくは0〜37℃、好ましくは5〜20℃の低温で行われる。
典型的には、リフォールディング効率のパラメータとして、プロセスの過程に渡ってまたはその後に、タンパク質の生物学的活性および凝集動態を計測することができる。
さらなる詳述をすることなく、上記記載を用いて、当業者は本発明を最大限活用できると信じられる。したがって、好ましい特定の態様および例は、単に描写的であり、本開示の残りの部分に多少なりとも限定するものでは全くないと解されるべきである。
以下の例は、本発明の実際の適用を表したものである。
例1
封入体として発現したタンパク質の変性(または可溶化)および還元
封入体の形態のタンパク質を、50mMのTRIS、pH8.0、7.0Mのグアニジン塩酸塩、0.2MのNaCl、2.0mMのEDTA、および10mMのTCEP溶液中の封入体を室温下で約2時間攪拌することで変性、可溶化および還元する。サンプルを25,000×g、4℃で15分遠心し、その後0.45μmフィルターに通して、あらゆる不溶性物質を除去する。タンパク質サンプルの濃度を、ビシンコニン酸(BCA)法(例えば、Smith, P.K., et al., (1985). Anal. Biochem. 150, 76-85あるいはEMD Chemicalsの商品番号71285またはThermoFisherの商品番号23225参照)を用いて決定した。
N−エチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムブロマイド、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドまたは1−エチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドを用いたマトリクスメタロプロテイナーゼ12のリフォールディング
50mMのTRIS、pH8.0、7.0Mのグアニジン塩酸塩、0.2MのNaCl、2.0mMのEDTAおよび10mMのTCEP中に存在する、マトリクスメタロプロテイナーゼ12(MMP12)のリフォールディングを、1:50の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は100μg/mLである。リフォールディングバッファは、0.5Mのイオン性液体N−エチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムブロマイド、1−ブチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドまたは1−エチル−3−メチルイミダゾリウムクロライドを含む、50mMのbis−TRIS、pH6.5、である。リフォールディングサンプルを、300RPMで振とうしながら22±2℃で20〜24時間インキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、50mMのTRIS、pH7.5、0.15MのNaCl、2.0mMのCaCl2、1.0μMのZnCl2および0.03%(v/v)のBrij−35に対して、1:40000またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、10±2℃で20〜24時間透析する。リフォールディングは、MMP12特異的な酵素活性アッセイを用いて計測する。MMP12酵素活性の計測に用いられる基質は、Invitrogen社から入手可能な、BODIPY−FL−標識DQエラスチン抱合体(カタログ番号E12056)である。
4−(3−ヒドロキシプロピル)−4−メチルモルホリニウムクロライドを用いたチオレドキシン−緑色蛍光タンパク質融合体のリフォールディングおよびリフォールディング剤L−アルギニン、NaClおよび非デタージェントスルホベタイン256との比較
50mMのTRIS、pH8.0、7.0Mのグアニジン塩酸塩、0.2MのNaCl、2.0mMのEDTAおよび10mMのTCEP中に存在する、チオレドキシン−緑色蛍光タンパク質融合体(trx−GFP)のリフォールディングを、1:50の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は100μg/mLである。リフォールディングバッファは、50mMのTAPS、pH8.5、7.6mMの還元型グルタチオン、2.4mMの酸化型グルタチオンおよび0.5Mのイオン性液体4−(3−ヒドロキシプロピル)−4−メチルモルホリニウムクロライドまたは3種のコントロールリフォールディング添加物:0.5MのL−アルギニン、0.25MのNaCl、もしくは1.0Mの非デタージェントスルホベタイン、のうちの1種である。リフォールディングサンプルを、300RPMで振とうしながら22±2℃で20〜24時間インキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、50mMのTRIS、pH8.0に対して、1:40000またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、10±2℃で20〜24時間透析する。trx−GFP融合タンパク質のリフォールディングの程度は、388nmの励起波長および504nmの発光波長を用いて、リフォールドされたサンプルの相対蛍光強度を計測することによって判断する。
N−エチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムブロマイドを用いたウシエンテロキナーゼのリフォールディングおよびリフォールディング剤L−アルギニン、NaClおよび非デタージェントスルホベタイン256との比較
50mMのTRIS、pH8.0、7.0Mのグアニジン塩酸塩、0.2MのNaCl、2.0mMのEDTAおよび10mMのTCEP中に存在する、ウシエンテロキナーゼ(EK)のリフォールディングを、1:50の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は100μg/mLである。リフォールディングバッファは、1.0Mのイオン性液体N−エチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムブロマイドまたは3種のコントロールリフォールディング添加物:0.5MのL−アルギニン、0.25MのNaCl、もしくは1.0Mの非デタージェントスルホベタイン、のうちの1種を含む、50mMのHEPES、pH7.5である。リフォールディングサンプルを、300RPMで振とうしながら22±2℃で20〜24時間インキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、20mMのTRIS、pH7.5、150mMのNaClおよび2.0mMのCaCl2に対して、1:40000またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、10±2℃で20〜24時間透析する。リフォールディングは、EK特異的な酵素活性アッセイを用いて計測する。酵素活性の計測に用いられる基質は、Sigma Aldrich社から入手可能な、蛍光標識されたペプチド基質(Gly−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys−β−ナフチルアミド、カタログ番号G5261)である。
N−メチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムヨーダイドを用いたラムダプロテインホスファターゼのリフォールディング
50mMのTRIS、pH8.0、7.0Mのグアニジン塩酸塩、0.2MのNaCl、2.0mMのEDTAおよび10mMのTCEP中に存在する、ラムダプロテインホスファターゼ(λPPase)のリフォールディングを、1:50の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は200μg/mLである。リフォールディングバッファは、7.6mMの還元型グルタチオン、2.4mMの酸化型グルタチオンおよび様々な濃度のイオン性液体N−メチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムヨーダイドを含む、50mMのHEPES、pH7.5、である。リフォールディングプロセスは、22±2℃で20〜24時間、300RPMで振とうしながら行う。リフォールディング後、サンプルを、5.0mMのDTT、2mMのMgCl2、0.1mMのEDTA、0.1%(w/v)のBSAおよび0.01%(v/v)のBrij−35を含む、50mMのTRIS、pH7.5中に1:50で希釈する。リフォールディングは、λPPase特異的な酵素活性アッセイを用いて計測する。酵素活性の計測に用いられる基質は、Sigma Aldrich社から入手可能な、4−ニトロフェニルホスフェート(カタログ番号N22002)である。
イオン性液体N−メチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムクロライドによる、上昇した温度でのウシヘモグロビンの安定化
天然のウシヘモグロビン(Sigma/Aldrichカタログ番号H2625)を0.1Mのリン酸ナトリウム、pH7.4、0.4MのNaCl、に最終濃度10.0mg/mLで溶解する。このヘモグロビン溶液のアリコートを、1.5MのN−メチル−4−(N,N−ジメチルアミノ)ピリジニウムクロライド、100%グリセロール、蒸留および脱イオン化したH2O、または1.5MのNaClで2倍に希釈し、以下の4種の試験溶液を作成する。
(2)0.2MのNaCl、5.0mg/mLのヘモグロビン、および50%(v/v)グリセロールを含有する、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.4(■);
(3)0.2MのNaClおよび5.0mg/mLのヘモグロビンを含有する、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.4(●、コントロール);
(4)0.95MのNaClおよび5.0mg/mLのヘモグロビンを含有する、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.4(▼;ベースバッファから0.2MのNaClおよび試験として0.75MのNaCl)
4−(3−ヒドロキシエチル)−4−メチルモルホリニウムヨーダイドを用いた一本鎖抗体チオレドキシン融合タンパク質のリフォールディングおよびリフォールディング剤非デタージェントスルホベタイン256、トレハロースおよびポリエチレングリコール3350との比較
50mMのTRIS、pH8.0、7.0Mのグアニジン塩酸塩、0.2MのNaCl、2.0mMのEDTAおよび10mMのTCEP中に存在する一本鎖抗体チオレドキシン融合タンパク質(scFv−trx)のリフォールディングを、タンパク質をリフォールディングバッファに、4−(3−ヒドロキシエチル)−4−メチルホルホリニウムヨーダイドを含有するリフォールディングバッファについて1:50の比率で(200μg/mLの最終タンパク質濃度)、または非デタージェントスルホベタイン256、トレハロースもしくはポリエチレングリコール3350を含有するリフォールディングバッファについて1:100の比率で(100μg/mLの最終タンパク質濃度)、速やかに希釈することにより行う。
Claims (6)
- 空間的に互いに異なる少なくとも1つの電子供与体領域および少なくとも1つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体の、タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および/または凝集の低減のための使用であって、該イオン性液体が、以下の一般構造AまたはB
[HetN] + −ED A
または
[HetNED] + B
ここで、HetNは、少なくとも1つの窒素原子を環系の一部とする芳香族性、一部芳香族性または非芳香族性のヘテロシクリル環系であり、EDは、電子供与体である、
の1つを含むカチオンを有し、ここで、該カチオンが、
−H、−CN、−OR’、−NR’2、−P(O)R’2、−P(O)(OR’)2、−P(O)(NR’2)2、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−NO2、1〜20のC原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、2〜20のC原子および1または2以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、2〜20のC原子および1または2以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、1〜6のC原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、3〜7のC原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−C1〜C6アルキルもしくはアリール−C1〜C6アルキルを表し、
ここで、置換基R1’、R2’、R3’および/またはR4’が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、1または2以上の置換基R1’〜R4’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Fおよび/または−Cl、または−OH、−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−C(O)X、−SO2OH、−SO2X、または−NO2によって置換されていてもよいが、R1’およびR4’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基R1’〜R4’の1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO2−、−SO2O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N+R’2−、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO2NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’2)NR’−、−PR’2=N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、R’=H、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたC1〜C6アルキル、C3〜C7シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびX=ハロゲンであり、
ただし、ピリジニウムカチオンは、−CN、−OR’、−NR’2、−P(O)R’2、−P(O)(OR’)2、−P(O)(NR’2)2、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’、−SO2NR’2または−NO2である置換基R1’〜R4’を1分子当たり少なくとも1つ、および/または−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−C(O)X、−SO2OH、−SO2X、または−NO2で置換されているかあるいは1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO2−、−SO2O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N+R’2−、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO2NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’2)NR’−、−PR’2=N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられている置換基R1’〜R4’を1分子当たり少なくとも1つ有している、
の群から選択されることを特徴とする、前記使用。 - カチオンが、
N−メチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウム、
N−エチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウム、
N−ブチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウム、
4−(シアノメチル)−4−メチルモルホリニウム、
4−(3−ヒドロキシエチル)−4−メチルモルホリニウム、
1−ブチル−3−メチルイミダゾリウム、
1−エチル−3−メチルイミダゾリウムまたは
4−(3−ヒドロキシプロピル)−4−メチルモルホリニウム
であることを特徴とする、請求項1に記載の使用。 - カチオンが、
N−メチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウム、
N−エチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウムまたは
N−ブチル−4−(N’,N’−ジメチルアミノ)−ピリジニウムであることを特徴とする、請求項1に記載の使用。 - イオン性液体のアニオンが、Cl−、Br−、I−またはBF4 −であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および/または凝集の低減方法であって、
ここで、処理するタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも1つの電子供与体領域および少なくとも1つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも1種含む液体媒体と接触させ、
ここで、該カチオンが、
−H、−CN、−OR’、−NR’2、−P(O)R’2、−P(O)(OR’)2、−P(O)(NR’2)2、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−NO2、1〜20のC原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、2〜20のC原子および1または2以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、2〜20のC原子および1または2以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、1〜6のC原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、3〜7のC原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−C1〜C6アルキルもしくはアリール−C1〜C6アルキルを表し、
ここで、置換基R1’、R2’、R3’および/またはR4’が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、1または2以上の置換基R1’〜R4’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Fおよび/または−Cl、または−OH、−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−C(O)X、−SO2OH、−SO2X、または−NO2によって置換されていてもよいが、R1’およびR4’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基R1’〜R4’の1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO2−、−SO2O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N+R’2−、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO2NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’2)NR’−、−PR’2=N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、R’=H、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたC1〜C6アルキル、C3〜C7シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびX=ハロゲンであり、
ただし、ピリジニウムカチオンは、−CN、−OR’、−NR’2、−P(O)R’2、−P(O)(OR’)2、−P(O)(NR’2)2、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’、−SO2NR’2または−NO2である置換基R1’〜R4’を1分子当たり少なくとも1つ、および/または−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’2、−SO2NR’2、−C(O)X、−SO2OH、−SO2X、または−NO2で置換されているかあるいは1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO2−、−SO2O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N+R’2−、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO2NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’2)NR’−、−PR’2=N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられている置換基R1’〜R4’を1分子当たり少なくとも1つ有している、
の群から選択されることを特徴とする、前記方法。 - a)タンパク質を、変性剤またはカオトロピック剤で封入体から可溶化すること、
b)ステップa)で可溶化したタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも1つの電子供与体領域および少なくとも1つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも1種含む液体媒体と接触させることによってリフォールディングすること、
ここで、該カチオンが、
−H、−CN、−OR’、−NR’ 2 、−P(O)R’ 2 、−P(O)(OR’) 2 、−P(O)(NR’ 2 ) 2 、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’ 2 、−SO 2 NR’ 2 、−NO 2 、1〜20のC原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、2〜20のC原子および1または2以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、2〜20のC原子および1または2以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、1〜6のC原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、3〜7のC原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−C 1 〜C 6 アルキルもしくはアリール−C 1 〜C 6 アルキルを表し、
ここで、置換基R 1’ 、R 2’ 、R 3’ および/またはR 4’ が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、1または2以上の置換基R 1’ 〜R 4’ が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Fおよび/または−Cl、または−OH、−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’ 2 、−SO 2 NR’ 2 、−C(O)X、−SO 2 OH、−SO 2 X、または−NO 2 によって置換されていてもよいが、R 1’ およびR 4’ が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基R 1’ 〜R 4’ の1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO 2 −、−SO 2 O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N + R’ 2 −、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO 2 NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’ 2 )NR’−、−PR’ 2 =N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、R’=H、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたC 1 〜C 6 アルキル、C 3 〜C 7 シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびX=ハロゲンであり、
ただし、ピリジニウムカチオンは、−CN、−OR’、−NR’ 2 、−P(O)R’ 2 、−P(O)(OR’) 2 、−P(O)(NR’ 2 ) 2 、−C(O)R’、−C(O)OR’、−C(O)NR’、−SO 2 NR’ 2 または−NO 2 である置換基R 1’ 〜R 4’ を1分子当たり少なくとも1つ、および/または−OR’、−CN、−C(O)OH、−C(O)NR’ 2 、−SO 2 NR’ 2 、−C(O)X、−SO 2 OH、−SO 2 X、または−NO 2 で置換されているかあるいは1または2の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−O−、−S−、−S(O)−、−SO 2 −、−SO 2 O−、−C(O)−、−C(O)O−、−N + R’ 2 −、−P(O)R’O−、−C(O)NR’−、−SO 2 NR’−、−OP(O)R’O−、−P(O)(NR’ 2 )NR’−、−PR’ 2 =N−および−P(O)R’−から選択される原子および/または原子群と置き換えられている置換基R 1’ 〜R 4’ を1分子当たり少なくとも1つ有している、
の群から選択されることを特徴とする、
により、タンパク質を封入体から抽出する方法。
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