JP5493195B2 - 炭水化物およびトリプトファン含有ペプチドを含む組成物 - Google Patents
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Description
最近、トリプトファンが脳に吸収されると、人の行動、気分、脳機能、脳の発達という幾つかの面に、そうしたトリプトファンがもたらすと考えられる益について様々な報告がなされてきた。そのような報告の例には、国際公開第99/55174号パンフレット、国際公開第00/42868号パンフレット、国際公開第2005/023017号パンフレットがある。
したがって、脳での吸収を良好にすることができる形でトリプトファンを提供する組成物であって、産業的に広く入手可能な源からのものであり、トリプトファン/LNAA比率が高く、アレルゲン性が低い、さらに脳機能、機敏さ、睡眠、気分、集中力、認知、および関連分野の1つまたはそれ以上にとって有益でありうる(例えば、人間(例えば、子供など)用の)配合物に使用することができる、組成物が必要とされた。
緩慢に摂取されるグルコース(SAG)について: これは、小腸で完全に消化されると思われるが、例えば、グルコースまたはスクロースよりゆっくりした速度で消化され、結果として低い血糖値になり、それが長い間保たれるような炭水化物を指す。一方、急速に摂取されるグルコース(RAG)は、急速に加水分解され、結果として高い血糖濃度になり、その濃度は比較的短時間しか維持されないような炭水化物である。
使用したポリエチレン管(50mL)は、Falcon(Oxford,United Kingdom)のものであった。ガラス球(直径1.5cm)は、Magnet Wholesale(Halesworth,United Kingdom)のものであった。振盪水槽は、Grant Instruments LtdモデルSS−40−2(Cambridge,United Kingdom)であった。その槽に、50mL管を厳密に水平に保持するためのクリップを取り付け、管が完全に水中に浸り、それぞれの管の長軸が移動方向になるようにした。HPLCシステムは、Dionex(UK)Ltd(Camberley,United Kingdom)のものであった。そのシステムについては、以下に詳しく説明する。試薬は、特に記載のない限り、Sigma(Poole,United Kingdom)またはMerck(Poole,United Kingdom)からのものであった。
食物の試料(0.6g未満の炭水化物を含む)を秤量してミリグラムに四捨五入し、それを50mLのポリプロピレン遠心分離管に入れた。内標準溶液(アラビノース40g/Lを5mL)および10mLの新たに調製したペプシン−ガーゴム溶液(0.05mol HCI/L中にペプシン5g/Lおよびガーゴム5g/Lを含む)を加えた。管にふたを取り付けて、内容物を渦混合し、37℃の水槽に30分間入れて、ペプシンによるタンパク質の加水分解が起こるようにした。5ミリリットルの0.5mol酢酸ナトリウム/L(平衡化して37℃になっているもの)をそれぞれの管に入れてpH5.2の緩衝液を作った。5個のガラス玉を加え、管にふたを取り付けてから静かに振って、内容物を分散させた。その後、37℃の水槽に入れて数分間平衡化した。振盪水槽中で、ガラス玉は、主な温置の間に試料の物理的構造を機械的に破壊する働きをする。ガーゴムは粘度を画一化し、試料を懸濁状態に保ち、その沈殿およびガラス玉による過剰な破壊を防ぐ。
2種類の糖の標準液を検量線の作成用に用いた。標準液1は保存糖混合液1mLであり、標準液2は保存糖混合液10mLであり、それぞれを水で20mLにし、その中に内標準溶液5mLを加えてよく混ぜた。その後、この混合液0.2mLを取り出し、無水エタノール4mLを含む管に加えた。
RAG=G20
SAG=G120−G20
[材料]
「Protex 6L」という商品名のサブチリシンは、Genencor(Leiden,The Netherlands)から、ペプシンはSigmaから、またトリプシン/キモトリプシンの混合物(Porcine PEM)はNovozymes(Bagsvaerd,Denmark)から入手した。リゾチームは、Delvozyme L(乾燥物質22%)としてDSM Food Specialities(Delft,The Netherlands)から入手した。
使用したリゾチーム調製物の純度は、SDS−PAGEで検査した。SDS−PAGEおよび染色に用いた材料はすべてInvitrogen(Carlsbad,CA,US)から購入した。試料は、製造業者の取扱説明書に従ってSDS緩衝液を用いて調製し、製造業者の取扱説明書に従ってMES−SDS緩衝系を用いて12%ビス−トリスゲルで分離した。染色は、Simply Blue Safe Stain(Collodial Coomassie G250)を用いて行った。加水分解の前には、リゾチームは、およそ14kDaの分子量の単一バンドとしてゲル上に現れた。
P4000ポンプ(Thermo Electron,(Breda,the Netherlands))に連結されたイオン・トラップ質量分析計(Thermo Electron,(Breda,the Netherlands))を用いたHPLCを使用して、本発明による方法で製造された、タンパク質の酵素加水分解物中にトリプトファン含有ペプチド(主にジペプチドおよびトリペプチド)があるかどうかを判定した。Inertsil 3 ODS 3、3μm、150*2.1mmのカラム(Varian Belgium,(Belgium))を用い、それと共に溶離用の0.1%ギ酸/ミリQ水(Millipore,(Bedford,MA,USA);溶液A)および0.1%ギ酸/アセトニトリル(溶液B)の勾配を付けて、生じたペプチドを分離した。勾配は100%の溶液A(ここで、10分間維持)から始め、25分間で直線的に20%Bまで増大させ、すぐに開始条件まで進み、安定化させるためにそこで15分間維持した。使用した注入量は50マイクロリットルであり、流量は200マイクロリットル/分であり、カラム温度は55℃に維持した。注入試料のタンパク質濃度はおよそ50マイクログラム/ミリリットルであった。注目しているペプチドの同定は、保持時間、プロトン化された分子に基づいて、また注目しているペプチド専用のMS/MS(約30%の最適衝突エネルギーを使用)を用いて行う。特定のトリプトファン含有ペプチドの定量は、外標準法を用いて実施する。
テトラペプチドVVPP(M=410.2)を使用して、MS法における最適感度およびMS/MS法における最適断片化の調節を行い、5μg/mlの持続注入を行った。その結果として、MS法におけるプロトン化分子およびMS/MS法における約30%の最適衝突エネルギーが得られ、Bイオン系列およびYイオン系列が生成された。
LC/MS/MSに先だって、タンパク質の酵素加水分解物を、周囲温度および13000rpmで10分間遠心分離し、上澄み液を、ミリポア水濾過装置に通した脱イオン水(ミリQ水)で1:100に希釈した。
種々のプロトン性混合物(protolytic mixtures)と一緒に温置している間に得られる加水分解度(DH)を、迅速OPA試験で観測した(Nielsen,P.M.;Petersen,D.;Dambmann,C.Improved method for determining food protein degree of hydrolysis.Journal of Food Science 2001,66,642−646)。
合計ケルダール態窒素をフローインジェクション分析で測定した。TKN Method Cassette 5000−040、SOFIAソフトウェア付きPentium 4のコンピュータおよびTecator 5027オートサンプラーを装備したTecator FIASTAR 5000フローインジェクションシステムを用いて、タンパク質を含んだ溶液から放出されるアンモニアの量を590nmで量った。この方法の動的範囲(0.5〜20mg N/l)に対応する量の試料を、95〜97%硫酸およびKjeltabと一緒に消化管に入れ、200℃で30分間、その後に360℃で90分間の消化プログラムを実施した。FIASTAR 5000システムに注入した後、窒素ピークを測定する。それに基づいて測定タンパク質の量を推測することができる。
高圧ポンプ、10〜100マイクロリットルの試料を注入できる注入装置および214nmでカラムの流れを監視できる紫外吸光検出器を備えた自動HPLCシステムによって、プロテアーゼで処理したタンパク質試料のペプチドのサイズ分布の分析を実施した。
[実施例1]
Protexによるリゾチームの加水分解および生成ペプチドの同定。
10%(w/w)の純粋リゾチームを含む溶液をNaOHでpH8.2に調節し、52℃まで加熱した。存在するタンパク質1g当たり25マイクロリットルのProtexを加えて、加水分解を開始させた。連続攪拌しながらpHを8.2に維持した状態で、加水分解を5.5時間続けて、目に見える沈殿物のないほとんど透明の溶液を得た。Protex活性を不活性化させる加熱ステップの後、試料をDH分析用に取り分けた。溶液のDHは、ほぼ30%であることが分かった。熱処理した溶液を10kDaフィルターで限外濾過して完全に透明な液体を得た。この透明な液体を、LC/MS分析用、存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布を求めるため、ならびにイオン交換クロマトグラフィー用に使用した。存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布がどんなものかを知るために、その透明液体に対して材料および方法の項目に記載した分子サイズ分析を実施した。得られた結果は、芳香族の側鎖を有するアミノ酸(すなわちトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン)を含んだほとんどすべてのペプチドは、分子量が500kDa未満であることをはっきり示した。こうしたアミノ酸の分子量が大きいことを考慮すると、こうした小さいペプチドのほとんどがトリペプチドかまたはジペプチドであることを暗示している。
[加水分解物のトリプトファン含有量の増大]
リゾチームは、驚くほど多量のアルギニンおよびリジンの塩基性残基を含んでいる。さらに、リゾチーム分子は、かなりの数のグルタミン酸およびアスパラギン酸の酸性残基を含んでいる。高いトリプトファン/LNAA比率を特徴とする加水分解物を得るための革新的かつすっきりした精製経路を考案するのにこのデータを使用した。しかし、この精製経路の必須要件は、アルギニンまたはリジン残基あるいはグルタミン酸またはアスパラギン酸残基のどちらかを含んでいるペプチドに、非常にわずかなトリプトファン残基しか現れないことである。実施例1に示すように、ここで用いる特定の加水分解経路では、アルギニン残基を含んでいるトリプトファン含有ペプチドはほんのわずかしか生成せず、リジン残基、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を含んでいるペプチドは生成しない。
[大規模なリゾチーム加水分解]
いっそう大規模なリゾチーム加水分解手順では、幾らかの小さな変更を加えて、特に実施例1で記載した手順に従った。7.3%(w/w)の純粋リゾチームを含む溶液を、65℃まで加熱し、その後、NaOHを用いてpHをpH8.2に調節した。乾燥物質1g当たり25マイクロリットルのProtex 6Lを加えて加水分解を開始させた。連続攪拌し、pHを8.2に維持し、温度を53℃に保った状態で、加水分解を2時間にわたって続けた。その後、pH値を9.0まで増大させ、温置をさらに3.5時間続行して、いくらか沈殿した溶液を得た。その後、溶液のpHを4.5まで下げ、溶液を4℃未満まで冷却した。完全に透明な生成物を得るために、液体をZ 2000フィルター(Pall)で濾過し、その後、過剰の水および塩をナノ濾過で除去した。次いで得られた濃縮物に120℃で7秒間UHT処理を施し、蒸発させ、最後に噴霧乾燥させて、乾燥状態のリゾチーム加水分解物を得た。こうして得られた生成物はトリプトファン/LNAAのモル比が約0.19であった。
トリプトファンを有するペプチドを含んでいるペプチド組成物を、実施例3に示されているようにして調製した。得られた生成物は、ペプチドのレベルが約83%、ペプチド結合トリプトファン含有量が約5.5%、TRP/LNAA比率が約0.19である水性液体であった。前記生成物は、外観が淡黄色の粉末であり、水中に1%溶かすと、pHが約4.3の溶液となった。
− 水中に全成分を含んだプレミックスを調製する、
− そうしたものを10分間攪拌し、望まれる場合には、攪拌の終わり頃にpHを調節し、
− 任意選択により、高圧ホモジナイザーで均質化する。
Claims (11)
- 少なくとも2種類の異なる水溶性トリプトファン含有ペプチドを含む配合物であって、前記配合物のトリプトファン/LNAA比率が少なくとも0.15であり、前記配合物が、急速に摂取されるグルコース(RAG)組成物および緩慢に摂取されるグルコース(SAG)組成物をさらに含み、前記RAG組成物および前記SAG組成物が、1:0.5から1:4の間の乾燥重量比(RAG組成物:SAG組成物)で前記配合物中に存在し、
前記トリプトファン含有ペプチドが、リゾチームを加水分解することによって得られ、
前記緩慢に摂取されるグルコース(SAG)組成物が、1000から45000ダルトンの間の数平均分子量を有するプルラン、イソマルツロース、トレハロース、および/またはそれらの混合物のうちの1種または複数種を含み、
前記急速に摂取されるグルコース(RAG)組成物が、グルコース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、デンプン加水分解物、デキストロース、および/またはそれらの混合物のうちの1種または複数種を含む、少なくとも2種類の異なる水溶性トリプトファン含有ペプチドを含む配合物。 - 前記トリプトファン含有ペプチド:RAG組成物の重量比が、1:2から1:20の間である、請求項1に記載の配合物。
- ペプチドAWまたはGNWを含む、請求項1に記載の配合物。
- AW:GNWのモル比が、1:2から10:1の間である、請求項3に記載の配合物。
- ジペプチドまたはトリペプチドから選択される少なくとも2種類の異なるペプチドを含む配合物であって、ジペプチドまたはトリペプチドから選択される2種類のペプチドが、ジペプチドおよびトリペプチドの総量の少なくとも5mol%の量だけそれぞれ存在し、全トリプトファンの30mol%より多くがペプチド結合トリプトファンとして存在し、40mol%より多くの前記ペプチド結合トリプトファンがジペプチドまたはトリペプチドの形で存在し、前記配合物は、トリプトファン/LNAA比率が0.15より大きく、前記配合物は急速に摂取されるグルコース(RAG)組成物および緩慢に摂取されるグルコース(SAG)組成物をさらに含み、前記RAG組成物および前記SAG組成物が、1:0.5から1:4の間の乾燥重量比(RAG組成物:SAG組成物)で前記配合物中に存在し、
前記ペプチド結合トリプトファンが、リゾチームを加水分解することによって得られ、
前記緩慢に摂取されるグルコース(SAG)組成物が、1000から45000ダルトンの間の数平均分子量を有するプルラン、イソマルツロース、トレハロース、および/またはそれらの混合物のうちの1種または複数種を含み、
前記急速に摂取されるグルコース(RAG)組成物が、グルコース、スクロース、マルトデキストリン、デンプン、デンプン加水分解物、デキストロース、および/またはそれらの混合物のうちの1種または複数種を含む、ジペプチドまたはトリペプチドから選択される少なくとも2種類の異なるペプチドを含む配合物。 - 前記ペプチド結合トリプトファン:RAG組成物の重量比が、1:2から1:20の間である、請求項5に記載の配合物。
- 容易に摂取され、かつ急速に摂取されるグルコースと緩慢に摂取されるグルコースを合わせた総量が、容易に摂取される全配合物の5〜20(重量)%である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の配合物。
- 摂取の容易な製品であり、かつ、乾燥重量で0.5〜5%の前記トリプトファン含有ペプチドを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の配合物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の前記配合物を含む、食物、ペットフード、餌、飲料、健康補助食品または栄養補助組成物。
- 手軽に飲める液体の形の請求項9に記載の食物、ペットフード、餌、飲料、健康補助食品または栄養補助組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の配合物を1〜20重量%含む、請求項9または10に記載の食物、ペットフード、餌、飲料、健康補助食品または栄養補助組成物。
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