JP5486926B2

JP5486926B2 - 単離されたスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス

Info

Publication number: JP5486926B2
Application number: JP2009536312A
Authority: JP
Inventors: タング，イー−ウエイ; ストラツトン，チヤールズ・ダブリユ; ハン，チエン
Original assignee: バンダービルト・ユニバーシテイ; キアゲン・サイエンシズ・エル・エル・シー
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2007-11-09
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2027-11-09
Also published as: US8445661B2; EP2089541B1; US20100240093A1; CN101627130B; JP2010508848A; US20130210021A1; EP2089541A2; EP2089541A4; WO2008143641A2; WO2008143641A3; CN101627130A

Description

本発明は単離細菌、特にスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の単離された細菌に関する。

ブドウ球菌種は一般に血液培養から単離され、多くの種は重要な病原体として知られている。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、特にメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）は世界中の病院で血液培養から単離されている強毒性病原体である（Ｄｅｒｅｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４０：５６２−７３．８）。スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）及び他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）は皮膚常在細菌叢の代表的メンバーであり、血液培養中に高頻度で存在する汚染物質とみなされている。しかし、ＣｏＮＳに起因する感染症の発生率は世界中で増加しているため、迅速な臨床介入のために潜在的に病原性のスタフィロコッカス種と許容可能な皮膚汚染物質と適時に同定及び区別することが益々重要になっている。

重要な病原性ＣｏＮＳブドウ球菌種の１つはスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）である（Ｆｒｅｎｅｙ，Ｊ．ら（１９８８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３８：１６８−１７２）。この微生物による感染の臨床徴候としては、膿瘍、髄膜炎、脳室腹腔シャント感染、脊椎椎間板炎、人工器官連結部感染、カテーテル関連菌血症及び心内膜炎が挙げられる（Ｃａｓｔｒｏ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄＬ．Ｄｏｗｄｙ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８：６８１−２；Ｐａｒｅｊａ，Ｊ．ら（１９９８）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２８：６０３−４；Ｐａｔｅｌ，Ｒ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：４２６２−３）。スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス感染はより傾向がある。

Ｄｅｒｅｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４０：５６２−７３．８Ｆｒｅｎｅｙ，Ｊ．ら（１９８８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３８：１６８−１７２Ｃａｓｔｒｏ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄＬ．Ｄｏｗｄｙ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８：６８１−２Ｐａｒｅｊａ，Ｊ．ら（１９９８）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２８：６０３−４Ｐａｔｅｌ，Ｒ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：４２６２−３。

本願発明は、単離された生物学的に純粋なスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）の培養物を提供するものであり、当該培養物のサンプルはＡＴＣＣアクセション番号ＰＴＡ−７９６１として寄託されている。本発明は更に、配列番号１又は配列番号２の少なくとも約２００個の連続残基を含む単離ポリヌクレオチドを提供し、更に、配列番号１若しくは配列番号２の少なくとも約３００個の連続残基を含む単離ポリヌクレオチド又は配列番号１若しくは配列番号２の少なくとも約４００個の連続残基を含む単離ポリヌクレオチドを含むことができる。ある態様において、配列番号１の少なくとも約２００個の連続残基を含む単離ポリヌクレオチドはヌクレオチド位置６６０からヌクレオチド位置８５８までの残基を含むポリヌクレオチドを含むことができる。本発明の単離ポリヌクレオチドは更に、中ストリンジェント条件下で配列番号１又は配列番号２とハイブリド形成するポリヌクレオチドを含むことができる。

臨床検体から単離されたスタフィロコッカス・ルグドゥネンシスからスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）を識別する方法又は臨床単離株に由来する未知細菌株をスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスとして同定する方法も本発明により提供され、前記方法は配列番号１の少なくとも２００個の連続塩基対のヌクレオチド配列を未知細菌株のｔｕｆ遺伝子配列の対応領域のヌクレオチド配列と比較する段階を含み、未知細菌株が配列番号１の対応する少なくとも約２００塩基対に対して少なくとも約９７％の配列一致度、より好ましくは少なくとも約９９％の配列一致度を示す場合にスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスであると判断することができる。本発明の方法の１態様において、配列番号１の少なくとも約２００塩基対は配列番号１のヌクレオチド位置６６０〜８５８を含む連続配列に対応するヌクレオチド配列を含む。

類縁のスタフィロコッカス種及びコクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）種のこれまで発表されている遺伝子配列に対して相同性をもつプロトタイプ単離株Ｂ００６に由来する核酸配列の近接結合解析を示す系統樹である。系統解析は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子全長配列に基づいて実施した。ＡＢ００９９４１、ＡＦ３２２００２、ＣＰ００００２９、Ｄ８３３５８、Ｘ８７７５４及びＸ８７７５６は夫々スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、「スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ」（“Ｓ．ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒｉ”）、スタフィロコッカス・エピデルミジス、スタフィロコッカス・アウリクラリス（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ）、コクリア・バリウス（Ｋ．ｖａｒｉｕｓ）及びコクリア・ロセウス（Ｋ．ｒｏｓｅｕｓ）であった。目盛は系統間の相対距離を示す。類縁のスタフィロコッカス種及びエンテロッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種のこれまで発表されている遺伝子配列に対して相同性をもつプロトタイプ単離株Ｂ００６に由来する核酸配列の近接結合解析を示す系統樹である。系統解析はｔｕｆ遺伝子全長配列に基づいて実施した。ＡＪ９３８１８２、ＢＡ００００１７、ＢＡ００００１８、ＢＡ００００３３、ＢＸ５７１８５６、ＢＸ５７１８５７、ＣＰ００００４６、ＣＰ０００２５３及びＣＰ０００２５５はいずれもスタフィロコッカス・アウレウスである。ＡＥ０１５９２９、ＡＥ０１６８３０、ＡＰ００６７１６、ＡＰ００８９３４及びＣＰ００００２９は夫々スタフィロコッカス・エピデルミジス、エンテロッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Ｓ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィチィクス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）及びスタフィロコッカス・エピデルミジスであった。目盛は系統間の相対距離を示す。コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス単離株のゲノムＤＮＡのＸｂａＩ消化物のパルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）パターンの写真である。レーン１〜１３は夫々スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（ＡＴＣＣ７００３２８）、Ｂ００６、Ｂ２３０、Ｂ０６０、Ｂ３３３、Ｂ２７７、Ｂ２８７、Ｂ２９２、Ｂ３３４、Ｂ３５４、Ｂ７１５、Ｂ７３９及びＢ８３７である。Ｂ２３０（レーン３）とＢ３３３（レーン５）は同一患者から１６日間隔で回収した２個の単離株である。分子サイズはキロベースで表す。

詳細な説明
本発明者らはこれまで未知のスタフィロコッカス種を単離し、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシスと所定の特性が共通していることから、スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスと命名した。しかし、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシスと異なり、スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスは有意に低病原性又は一般に非病原性である。

スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス細菌はコアグラーゼ陰性グラム陽性ブドウ球菌である。これらの細菌は非溶血性であり、カタラーゼ陽性であり、アルギニンジヒドロラーゼ陰性であり、ノボビオシンよりもポリミキシンＢに対する耐性のほうが強い。また、ＯＤＣ反応性が陽性であるという点で「スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ」と一致せず、１６ｓｒＲＮＡとｔｕｆ遺伝子の両者でヌクレオチド配列が相違するという点でスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス及びコクリア・バリアンシ・ロセア（Ｋｏｃｕｒｉａｖａｒｉａｎｓｉｒｏｓｅａ）と一致しない。

バンダービルト大学病院で２００３年９月から２００５年１０月まで実施した試験期間中に、合計１６個のＰＹＲ／ＯＤＣ陽性ブドウ球菌単離株が血液培養から回収された。これらのうちの４個は更に表現型解析法によりスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス［単離株２個］、スタフィロコッカス・エピデルミジス［１個］、及びスタフィロコッカス・アウリクラリス［１個］として同定され、この試験から除外された。残りの１２個のブドウ球菌単離株は１１人の患者から回収され、そのうち２個の単離株は同一患者から１６日間隔で回収した。全１２個の単離株は血液寒天プレート上で溶血反応せずに白色コロニーに成長した。これらの単離株はクランピング因子陰性であった。顕微鏡解析の結果、クラスター状の直径１μＭのグラム陽性球菌であることが判明した。

これらの１２個の単離株の生化学的反応プロファイルを表１に示す。ＡＰＩＳＴＡＰＨ（ｖ４．０）同定システムによると、８個は当初同定できず、識別スコアが低く、４個は９５．５〜９９．６％の同定確率でコクリア・バリアンシ／ロセアとして同定された（表１）。全１２個の単離株はゲンタマイシン、ミノサイクリン、リファンピン及びバンコマイシンに対して感受性であり、試験した他の抗生物質に対する感受性は多様であった（表２）。

全１２個の単離株はヌクレオチド位置８〜５３９に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の同一の部分配列を保有していた。プロトタイプ株Ｂ００６の全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は１５５６ヌクレオチドを含み、仮に割り当てた「スタフィロコッカス・ペッテンコフェリ」（ＡＦ３２２００２，Ｔｒｕｌｚｓｃｈ，Ｋ．ら（２００２）ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４３：１７５−８２）と９９．９４％の類似度で近縁であった（図１）。Ｂ００６単離株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（ＡＢ００９９４１，９７．４５％）、スタフィロコッカス・アウリクラリス（Ｄ８３３５８，９７．６４％）、スタフィロコッカス・エピデルミジス（ＣＰ００００２９，９７．７５％）、コクリア・バリアンス（Ｋｏｃｕｒｉａｖａｒｉａｎｓ）（Ｘ８７７５４，７７．８６％）及びコクリア・ロセア（Ｋｏｃｕｒｉａｒｏｓｅａ）（Ｘ８７７５６，７８．４９％）を含む表現型が類縁の他の種とは別に＜９８％の類似度でクラスターを形成した。

全１２個の単離株は更にヌクレオチド位置６６０〜８５８に同一の部分ｔｕｆ遺伝子（２００塩基対）も保有しており、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（ＡＴＣＣ＃７００３２８）との差は８．６％であった。プロトタイプ株Ｂ００６の全長ｔｕｆ遺伝子は１，１８８ヌクレオチドを含み、ＲＰ６２ＡとＡＴＣＣ１２２２８の２個のスタフィロコッカス・エピデルミジス単離株に対して９３．０２％の類似度で最も近縁であった（図２）（Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｒ．ら（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：２４２６−３８；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｑ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１５７７−９３）。これらの単離株はスタフィロコッカス・ヘモリティクス（９１．５９％）、スタフィロコッカス・アウレウス（９１．０２〜９１．２２％）、スタフィロコッカス・サプロフィチィクス（９０．３５％）及びエンテロッカス・フェカリスを含む表現型が類縁の他の種とは別に８２．６７％の類似度でクラスターを形成した（Ｂａｂａ，Ｔ．ら（２００２）Ｌａｎｃｅｔ３５９：１８１９−２７；Ｄｉｅｐ，Ｂ．Ａ．ら（２００６）Ｌａｎｃｅｔ３６７：７３１−９；Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｒ．ら（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：２４２６−３８；１５，１８，１９，２４，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｑ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１５７７−９３）。

これらの１２個のＯＤＣ／ＰＹＲ陽性ＣｏＮＳの近縁度をパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により更に分析した。同一患者から１６日間隔で回収した２個の単離株（Ｂ２３０とＢ３３３）を除く全単離株は類縁性がなかった。これらの２個の単離株は６バンド差未満のＰＦＧＥパターンを示し、疫学的に類縁であることが分かった（図３）。ＰＦＧＥデータをまとめると、１２個の単離株はこの種の１１種類の異なる株に相当することが分かった。患者の医療記録によると、この２個の類縁単離株は静脈カテーテル関連感染の原因であるとみなされた（表３）。バンコマイシンを投与し、カテーテルを抜去した。患者は完全に回復した。

これらの単離株を回収した１１人の患者の医療記録を精査し、統計及び臨床情報を表３に示す。同一患者から１６日間隔で回収した２個の単離株（Ｂ２３０とＢ３３３）が静脈カテーテル関連感染の原因となった病原体であるとみなされた。残りの１０個の単離株は汚染物質であるとみなされた。２個の単離株が病原体とみなされた１症例と、単離株が汚染物質であるとみなされた１０症例のうちの５症例を含む６症例（５４．５％）にバンコマイシンを含む抗生物質を投与した（表３）。

これらの１２個の新規単離株はＯＤＣ反応が陽性であるという点でスタフィロコッカス・ペッテンコフェリ（Ｔｒｕｌｚｓｃｈ，Ｋ．Ｈ．ら．（２００２）Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４３：１７５−１８２）と一致せず、１６ＳｒＲＮＡとｔｕｆ遺伝子の両者でヌクレオチド配列が相違するという点でスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス及びコクリア・バリアンス／ロセアと一致しなかった。本発明者らはこれらの単離株が血液培養の皮膚汚染物質としての他のＣｏＮＳ種の大半に類似していると判断し、その生化学的反応に基づいてスタフィロコッカス・ルグドゥネンシスから区別しなかった。生化学的反応により裏付けられる特性、１６ＳｒＲＮＡ及びｔｕｆ遺伝子配列、並びに臨床徴候に基づき、本発明者らは新規ブドウ球菌種ととして「スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス」を提唱し、Ｂ００６株をそのプロトタイプとした。基準株Ｂ００６は特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づき、２００６年１１月３日付けでＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州、マナサス）に寄託し、アクセション番号ＡＴＣＣＰＴＡ−７９６１を交付された。

血液培養から回収した１２個のＰＹＲ／ＯＤＣ陽性ブドウ球菌単離株について、１６ＳｒＲＮＡとｔｕｆ遺伝子の配列を比較解析した処、これらの単離株はスタフィロコッカス属内の新規種に相当することが判明した。この新規分類はＰＹＲ／ＯＤＣ反応が陽性である点で黄色ブドウ球菌及び他の大半のＣｏＮＳ種と相違する。また、マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロース及びＮ−アセチルグルコサミンの酸性化が陰性又は低く、１６ＳｒＲＮＡ及びｔｕｆ遺伝子の配列の変動という点でスタフィロコッカス・ルグドゥネンシスと相違する。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列解析は本試験で同定されたスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス株を含む所定の新規ブドウ球菌株を種レベルで明確に識別するほど十分な識別能はなかった。延長因子Ｔｕをコードするｔｕｆ遺伝子はペプチド鎖形成に関与しており、リボソームの一部である。これらの遺伝子は細菌ゲノムの必須成分であり、診断目的の好ましいターゲットである。種分化には数種のＣｏＮＳ種間のｔｕｆ遺伝子の配列変動で十分である（Ｋｏｎｔｏｓ，Ｆ．ら（２００３）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５５：４６５−９．，２１）。他の研究者による従来の試験ではＣｏＮＳ種の同定法として３種類の遺伝子同定法を対比させ、１６ＳｒＲＮＡ、ｓｏｄＡ遺伝子及びｔｕｆ遺伝子配列を比較しており、その結果、ｔｕｆ遺伝子配列決定が３種類のうちで最も信頼性と再現性の高い方法であることが分かった（Ｈｅｉｋｅｎｓ，Ｅ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：２２８６−９０）。全長ｔｕｆ配列分析によると、種内の保存は極めて高い（例えば９個のスタフィロコッカス・アウレウス株間で９９．９８％、２個のスタフィロコッカス・エピデルミジス間で１００．０％）。他方、異なるスタフィロコッカス種のｔｕｆ遺伝子配列間の相同度又は一致度は有意に低下する。新規に回収されたＢ００６株の全長ｔｕｆ遺伝子配列は系統解析により最もよく一致するもの（スタフィロコッカス・エピデルミジス）に対して９３％の配列一致度を示した。ｔｕｆ遺伝子内の核酸配列変動はスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、並びに表現型が類縁の他のスタフィロコッカス種及びコクリア種を区別するための確実な手段となることが本発明者らにより明らかになった。

このスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスの分布と天然生息環境はまだ十分に分かっていない。ブドウ球菌は自然界に広く分布しているが、主に哺乳動物と鳥類の皮膚、皮膚腺及び粘膜に存在する。ブドウ球菌は一般にその宿主に対して良性又は共生関係であるが、皮膚バリアの外傷、注射針による接種、又は医療装置の直接移植により宿主組織に侵入すると、病原性になる場合がある。血液検体の採取に特別な注意を払わない場合には、皮膚常在細菌叢による血液汚染の危険が大きい。スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスは他のＣｏＮＳ種と同様に、ヒト皮膚表面の常在細菌叢の一部であると思われる。

本発明者らの研究において、１２個のスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス単離株のうちの１０個がその臨床的意義に基づいて皮膚汚染物質であるとみなされた。他方、５症例（５０．０％）は当初にスタフィロコッカス・ルグドゥネンシスと同定されたので、バンコマイシン及び他の広域スペクトル抗生物質を投与した。従って、バンコマイシン等の広域で潜在的に毒性の抗生物質の過剰使用を制限するためには、臨床環境におけるスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスの迅速な検出と識別が不可欠であると思われる。ＰＹＲとＯＤＣに対する二重陽性に基づく迅速同定による表現型解析法をマンノース発酵結果と組み合わせると、正確な同定が得られると思われる。しかし、マンノース発酵には一晩培養が必要である。ｔｕｆ遺伝子を標的とするヌクレオチドプローブ等の分子法を利用すると、適時の正確で迅速な同定を助長することができる。

本発明により提供されるスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスはスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス株Ｂ００６ｔｕｆ遺伝子（配列番号１）に対して少なくとも約９７％のｔｕｆ遺伝子配列一致度、より好ましくはＡＴＣＣＰＴＡ−７９６１として寄託されたＢ００６株に対して少なくとも約９７％のｔｕｆ遺伝子配列一致度をもつ細菌及びその子孫を含む。本発明はスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスの単離細菌株及び／又は生物学的に純粋な培養物を提供し、スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスはＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣＰＴＡ−７９６１として寄託された培養物に相当するピロリドニルアリールアミダーゼ／オルニチンデカルボキシラーゼ陽性、カタラーゼ陽性、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種である。単離細菌株とはその天然環境からある程度精製されたものである。細菌の少なくとも約２０％が１種類の細菌株に由来する場合に細菌の培養物は生物学的に純粋であるとみなされる。しかし、培養物は少なくとも３３％純粋であることが好ましく、培養物は少なくとも４５％純粋であることがより好ましく、培養物は少なくとも９０％純粋であることが最も好ましい。

本発明は更にスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスのｔｕｆ遺伝子の配列（配列番号１）の少なくとも約１００〜約１１８８塩基対及び／又は１６ｓｒＲＮＡの配列（配列番号２）の少なくとも約１００〜約１５５６塩基対を含む単離ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）配列を提供する。本発明のポリヌクレオチドはｔｕｆ又は１６ｓｒＲＮＡ遺伝子とこの遺伝子配列のＮ又はＣ末端に位置する他の任意アミノ酸をコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。当然のことながら、核酸配列は配列番号１又は配列番号２のポリヌクレオチドの５’又は３’側に付加的残基を含んでいてもよい。ほぼいずれの長さの核酸フラグメントも利用することができ、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコーディングセグメント等の他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。従って、全体は非常に多様となる。

本発明は更に臨床単離株に由来するスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスの同定方法も提供し、前記方法は未知細菌株のｔｕｆ遺伝子の全長又は少なくとも約２００塩基対を配列決定する段階とおよびこの配列を配列番号１の対応領域と比較し、未知株と参照株Ｂ００６の配列一致度百分率を決定する段階とを含み、配列番号１の対応領域に対して少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９９％の配列類似度又は配列一致度をもつものをスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス種と同定することができる。

あるいは、スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスの同定方法は、未知細菌単離株のｔｕｆ遺伝子の少なくとも約２００残基を含み、配列番号１を含むポリヌクレオチドと中ストリンジェント条件下でハイブリド形成するポリヌクレオチドを単離する段階を含み、中ストリンジェントハイブリド形成条件は分子生物学分野の当業者に公知である。例えば、中ストリンジェントハイブリド形成は２５ｍＭＫＰＯ_４（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、５０μｇ／ｍＬ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、及び１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０^７ｃｐｍ／μｇ）を含有するハイブリド形成溶液中で約４２℃にて実施することができ、洗浄は２×ＳＳＣと０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する洗浄溶液中で約５０℃にて実施する。ハイブリド形成はセンス又はアンチセンスのＤＮＡ、ＲＮＡを含むポリヌクレオチドで実施することができる。各種ハイブリド形成及び臨床単離株から微生物を同定するための他の試験法で使用する分子診断用プローブとして配列番号１の全部又は少なくとも約２００ｂｐの一部を使用することもでき、このような試験法は微生物同定分野の当業者に公知である。

各々ピロリドニルアリールアミダーゼ／オルニチンデカルボキシラーゼ陽性であるが、翻訳延長因子Ｔｕをコードするｔｕｆ遺伝子を標的とするスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス特異的プライマー／プローブセットにより認識されない１２個の血液培養由来ブドウ球菌単離株を特性決定した（Ｈｅｉｋｅｎｓ，Ｅ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：２２８６−９０；Ｋｏｎｔｏｓ，Ｆ．ら（２００３）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５５：４６５−９；Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｆ．ら（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：２５４１−７）。これらの単離株は、臨床的に出現する他の一般的なブドウ球菌から、ＡＰＩＳＴＡＰＨ同定システム（Ｂｒｕｎ，Ｙ．ら（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：５０３−８；５；Ｇｅｍｍｅｌｌ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄＪ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：８７４−７；Ｌａｙｅｒ，Ｆ．，Ｂ．ら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２８２４−３０）において使用されているものを含む生化学的反応に基づいて明確に区別することができない。臨床的に見ると、中心静脈カテーテル関連感染症の同一患者から１６日間隔で回収した２個の単離株を除き、これらの単離株は主に皮膚汚染物質として挙動した。１６ＳｒＲＮＡと延長因子Ｔｕ（ｔｕｆ）遺伝子の配列解析を含む逐次遺伝子解析によると、これらの単離株は新規ブドウ球菌種であり、本発明者らはスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓｓｐ．ｎｏｖ）なる呼称を提唱した。

細菌単離株と参照株
２００３年９月から２００５年１０月までバンダービルト大学病院でＢＡＣＴＥＣ（登録商標）９２４０血液培養システム（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＳｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，Ｍｄ．）により回収したＰＹＲとＯＤＣに二重陽性のスタフィロコッカス単離株を試験対象とした。ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）からスタフィロコッカス・アウレウス（ＡＴＣＣ＃３５５５６）及びスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（＃７００３２８）の２個の類縁参照株を入手した。臨床単離株とＡＴＣＣ株を採取し、その後の試験に備えて７．５％グリセロールを添加した脳心臓浸出液（ＢＨＩ）に−８０℃で保存した。

表現型同定
コロニーサイズと色素；嫌気性及び好気性増殖；クランピング因子、Ｓｔａｐｈａｕｒｅｘラテックス凝集（ＭｕｒｅｘＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、ヘモリシン、オキシダーゼ、ＯＤＣ，ウレアーゼ及びＰＹＲの有無に基づく慣用法により先ず臨床単離株と参照単離株の両者を同定した（ＤｅＰａｕｌｉｓ，Ａ．Ｎ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：１２１９−２４．，１６，２５，３３）。ＡＰＩＳＴＡＰＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘＶｉｔｅｋ，Ｉｎｃ．，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ＭＯ）を製造業者の指示に従って使用することにより種同定を更に確認した（Ｂｒｕｎ，Ｙ．ら（１９９０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：５０３−８；Ｃｈａｐｉｎ，Ｋ．，ａｎｄＭ．Ｍｕｓｇｎｕｇ（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４３２４−７；Ｇｅｍｍｅｌｌ，Ｃ．Ｇ．，ａｎｄＪ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ（１９８２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：８７４−７；Ｈｅｉｋｅｎｓ，Ｅ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：２２８６−９０；Ｌａｙｅｒ，Ｆ．，Ｂ．ら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２８２４−３０）。ＰＹＲとＯＤＣはスタフィロコッカス・アウレウス（ＡＴＣＣ＃２５９２３）とスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（ＡＴＣＣ＃７００３２８）を夫々陰性及び陽性対照として実施した。生化学的試験はＤ−グルコース、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラフィノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−メリビオース、キシリトール及びα−メチルグルコサミンからの酸生成；硝酸還元；並びにアルカリホスファターゼ、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ及びアセトイン生成について実施した。キット説明書に推奨されているように補助試験を実施した（Ｃｈａｐｉｎ，Ｋ．，ａｎｄＭ．Ｍｕｓｇｎｕｇ（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４３２４−７；Ｌａｙｅｒ，Ｆ．ら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：２８２４−３０）。ジョージア州、アトランタの米国疾病対策センター（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ：ＣＤＣ）により推奨されている表現型解析法を使用して、カタラーゼ、コアグラーゼ、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、スクロース、Ｄ−トレハロース、キシロース、硝酸還元、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、並びにノボビオシン及びポリミキシンＢ耐性を含む生化学反応をテネシー州、ナッシュビルのテネシー州衛生検査局（ＴｅｎｎｅｓｓｅｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｅｒｖｉｃｅｓ）で更に確認した（Ｋｌｏｏｓｅ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄＴ．Ｌ．Ｂａｎｎｅｒｍａｎ（１９９５）ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｎｄＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ，ｐ．２８２−２９８，ｉｎＰ．Ｒ．Ｍｕｒｒａｙら．（編）ＭａｎｕａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第６版，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｋｌｏｏｓｅ，Ｗ．Ｅ．ａｎｄＫ．Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ（１９７５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：８２−８８）。

抗菌薬感受性試験
臨床検査標準協議会（ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）ガイドライン（ＣＬＳＩＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｓｋｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓ；Ａｐｐｒｏｖｅｄｓｔａｎｄａｒｄ，第９版（２００６）ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）に従い、アモキシシリン・クラブラン酸、セファゾリン、クリンダマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、ミノサイクリン、ペニシリン、リファンピン、トリメトプリム・スルファメトキサゾール（ＳＸＴ）及びバンコマイシンに対するインビトロ抗菌薬感受性試験をディスク拡散法により実施した。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅及び配列決定
各精製細菌単離株１白金耳を蒸留水１ｍｌに加えた。懸濁液を渦巻撹拌し、７分間９５℃に加熱し、８，０００×ｇで１５秒間遠心し、上清１μｌをＰＣＲ増幅に使用した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド位置５〜１，５５３の高度に保存されたプライマーセット（５’−ＴＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’及び５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＲＣＣＧＣＡ−３’；Ｒ＝Ｇ又はＡ；夫々配列番号３及び４）を使用し、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した（Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２６：３８９−９２）。従来記載されているようにＡＢＩＰＲＩＳＭ３７３０ＤＮＡシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）でＰＣＲプライマー及び／又は数種類の追加の内部プライマーを使用して部分又は全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を双方向に決定した（Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：３６７４−９；Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：１６７６−８）。

ｔｕｆ遺伝子増幅及び配列決定
ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な１３種類のブドウ球菌種（スタフィロコッカス・アウレウス９種，スタフィロコッカス・エピデルミジス２種，スタフィロコッカス・ヘモリティクス１種及びスタフィロコッカス・サプロフィチィクス１種）の全長ｔｕｆ配列を取得し、整列させた（Ｂａｂａ，Ｔ．ら（２００２）Ｌａｎｃｅｔ３５９：１８１９−２７；Ｄｉｅｐ，Ｂ．Ａ．ら（２００６）Ｌａｎｃｅｔ３６７：７３１−９；Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｒ．ら（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：２４２６−３８：Ｈｏｌｄｅｎ，Ｍ．Ｔ．ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１：９７８６−９１：Ｋｕｒｏｄａ，Ｍ．ら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ３５７：１２２５−４０；Ｋｕｒｏｄａ，Ｍ．，Ａ．ら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１３２７２−７；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｆ．ら（２００５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：７２９２−３０８；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｑ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１５７７−９３）。初代／プロトタイプ単離株Ｂ００６の全長ｔｕｆ遺伝子をＰＣＲにより増幅するように縮重プライマーセット（５’−ＴＡＡＧＡＡＴＡＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＷＡＴＡＡＴＧ−３’及び５’−ＡＡＡＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧＡＴＴＷＣＷＧＴ−３’，Ｗ＝Ａ又はＴ；夫々配列番号５及び６）を設計した。ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７３０ＤＮＡシーケンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で４種類の内部プライマー（５’−ＡＧＡＡＴＡＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＷＡＴＡＡＴＧＧ−３’，５’−ＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＴ−３’，５’−ＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＡＣＣＡＣＧＴＴＣ−３’及び５’−ＴＴＣＡＧＴＷＡＣＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣ−３’；夫々配列番号７〜１０）を使用してＰＣＲ増幅産物を双方向に配列決定した。保存プライマーセット（ｔｕｆ−ｆ，５’−ＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣＴＡ−３’；ｔｕｆ−ｒ，５’−ＴＴＣＡＣＧＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡ−３’；夫々配列番号１１及び１２）を使用して全単離株のヌクレオチド位置６６６〜８５８の部分ｔｕｆ遺伝子（Ｍａｒｔｉｎｅａｕ，Ｆ．ら（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：２５４１−７）を増幅した。同一増幅用プライマーを使用して部分ｔｕｆ遺伝子配列を決定した。

系統解析
従来記載されているように、ＧｅｎＢａｎｋ、リボソームデータベースプロジェクトＩＩサイト（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｈｔｍｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）及びＭｉｃｒｏＳｅｑＤａｔａｂａｓｅＬｉｂｒａｒｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）のＢＬＡＳＴクエリにより配列相同性検索を実施した（Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：３６７４−９；Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：１６７６−８）。ＤＳＧｅｎｅソフトウェア（バージョン１．５，ＡｃｃｅｌｒｙｓＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用することにより近接結合解析を使用する系統解析を実施した。

ヌクレオチド配列アクセション番号及び菌株寄託
部分又は全長１６ＳｒＲＮＡ遺伝子及びｔｕｆ遺伝子配列は夫々ＡＹ５６０５１９、ＤＱ１１７５３１及びＤＱ１１７５３０としてＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託した。スタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスのプロトタイプ株（Ｂ００６）はテネシー州、ナッシュビルの４８歳男性の血液から単離した。同菌株はブダペスト条約に基づき、２００６年１１月３日付けでバージニア州、マナサスのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、アクセション番号ＡＴＣＣＰＴＡ−７９６１を交付された。

Claims

単離されたスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）の生物学的に純粋な培養物であって、前記培養物のサンプルはＡＴＣＣアクセション番号ＰＴＡ−７９６１として寄託されている、培養物。
配列番号１の少なくとも２００個の連続残基を含む、単離されたポリヌクレオチド。
配列番号１の少なくとも３００個の連続残基を含む、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
配列番号１の少なくとも４００個の連続残基を含む、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
配列番号１の少なくとも２００個の連続残基が残基６６０〜８５８を含む、請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドに相補的な単離されたポリヌクレオチド。
配列番号１の少なくとも２００個の連続塩基対のヌクレオチド配列を未知細菌株のｔｕｆ遺伝子配列の対応領域のヌクレオチド配列と比較する段階を含み、未知細菌株が配列番号１の対応する少なくとも２００塩基対に対して少なくとも９７％の配列一致度を示す場合にスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）であると判断することができる、臨床検体から単離されたスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）からスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスを識別する方法。
細菌株が配列番号１の対応する少なくとも２００塩基対に対して少なくとも９９％の配列一致度を示す場合にスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスであると判断することができる、請求項７に記載の方法。
配列番号１の少なくとも２００塩基対が配列番号１のヌクレオチド位置６６０〜８５８に対応する、請求項７に記載の方法。
配列番号１の少なくとも２００個の連続塩基対のヌクレオチド配列を未知細菌株のｔｕｆ遺伝子配列の対応領域のヌクレオチド配列と比較する段階を含み、未知細菌株が配列番号１の対応する少なくとも２００塩基対に対して少なくとも９７％の配列一致度を示す場合にスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｐｓｅｕｄｏｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）であると判断することができる、臨床単離株に由来する未知細菌株をスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスとして同定する方法。
未知細菌株が配列番号１の対応する少なくとも２００塩基対に対して少なくとも９９％の配列一致度を示す場合にスタフィロコッカス・シュードルグドゥネンシスであると判断することができる、請求項１０に記載の方法。
配列番号１の少なくとも２００塩基対が配列番号１のヌクレオチド位置６６０〜８５８に対応する請求項１０に記載の方法。