CN101627130A - 分离的假路邓葡萄球菌 - Google Patents

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Abstract

揭示了一种不曾为人所知的葡萄球菌的分离菌株，假路邓(pseudolugdunensis)葡萄球菌。也揭示了假路邓葡萄球菌的tuf基因和16sRNA的序列，和将假路邓葡萄球菌与其他葡萄球菌物种进行区别的方法。

Description

分离的假路邓葡萄球菌
相关申请的对照
这份申请相关于并且主张享有的优先权为美国临时专利申请号60/865,160，所述申请于2006年11月9日递交。
技术领域
本发明涉及分离的细菌，且特别涉及葡萄球菌属的分离的细菌。
背景技术
葡萄球菌的物种通常是分离于血液培养菌的，且很多物种被认为是重要的病原体。金黄色葡萄球菌，特别是抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)，是一种有毒的病原体，所述病原体分离于在全世界医院的血液培养菌。(Deresinski，S.(2005)Clin.Infect.Dis.40：562-73.8)。表皮葡萄球菌和其他凝固酵素-阴性(CoNS)通常是正常微生物区系的中的一种，且被认为是在血液培养菌中的时常发生的污染物。由CoNS引起的感染的发生率已经在全世界提升了，但是，使得它在迅速临床介入的及时行为中在潜在的病原的葡萄球菌物种和可能的皮肤污染物之间来识别和辨别渐渐地变得更重要了。
一种更重要的病原的CoNS葡萄球菌物种是路邓葡萄球菌(Freney，J.等人(1988)Int.J.Svst.Bacteriol.38：168-172)。由于这种有机体的感染的临床表现包括溃疡，髓膜炎，有关(或连接)脑室与腹膜的分流术感染，脊柱炎(spondylodiscitis)，人工关节感染，导尿管-相关的细菌，和心内膜炎(Castro，J.G.，和L.Dowdy(1999)Clin.Infect.Dis.28：681-2；Pareja，J.，等人(1998)Ann.Intern.Med.128：603-4；Patel，R.等人(2000)JL Clin.Microbiol.38：4262-3.)。伴有路邓葡萄球菌的感染倾向于具有一更加
作为美国标准生物品收藏中心(ATCC)入藏号PTA-7961。本发明也提供了一种分离的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少大约200个的邻近的残留物；也可以提供一分离的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少大约300个的邻近的残留物，或分离的多聚核苷酸其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少大约400个的邻近的残留物。在某些具体的实施例中，一分离的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1的至少大约200个的邻近的残留物，其可以包含一多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含来自于核苷酸位置660至核苷酸位置858的残余物。本发明中的分离的多聚核苷酸也可以包含那些在适当的严格的条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2杂交而产生的。
本发明也提供了一种将假路邓葡萄球菌(pseudolugdunensis)与取自于一临床样本的路邓葡萄球菌分离体进行区别的方法，或用来与一临床的作为假路邓葡萄球菌的分离菌中识别一未知的细菌菌株，所述方法包含将SEQ IDNO：1的至少200个邻近的碱基对的核苷酸序列与一未知细菌菌株的相应区域的tuf基因序列的核苷酸序列进行比较，如果证明至少大约97％的序列相同，且更佳的为至少大约99％序列相同，与其相应的SEQ ID NO：1至少有大约的200个碱基对一致，则在其中所述的未知的细菌菌株可以被确定为假路邓葡萄球菌。在一本发明的方法的具体实施例中，SEQ ID NO：1至少有大约的200个碱基对包含对应于邻近的序列的核苷酸序列，包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列位置为660-858。
作为美国标准生物品收藏中心(ATCC)入藏号PTA-7961。本发明也提供了一种分离的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少大约200个的邻近的残留物；也可以提供一分离的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少大约300个的邻近的残留物，或分离的多聚核苷酸其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少大约400个的邻近的残留物。在某些具体的实施例中，一分离的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1的至少大约200个的邻近的残留物，其可以包含一多聚核苷酸，所述多聚核苷酸包含来自于核苷酸位置660至核苷酸位置858的残余物。本发明中的分离的多聚核苷酸也可以包含那些在适当的严格的条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2杂交而产生的。
本发明也提供了一种将假路邓葡萄球菌(pseudolugdunensis)与取自于一临床样本的路邓葡萄球菌分离体进行区别的方法，或用来与一临床的作为假路邓葡萄球菌的分离菌中识别一未知的细菌菌株，所述方法包含将SEQ IDNO：1的至少200个邻近的碱基对的核苷酸序列与一未知细菌菌株的相应区域的tuf基因序列的核苷酸序列进行比较，如果证明至少大约97％的序列相同，且更佳的为至少大约99％序列相同，与其相应的SEQ ID NO：1至少有大约的200个碱基对一致，则在其中所述的未知的细菌菌株可以被确定为假路邓葡萄球菌。在一本发明的方法的具体实施例中，SEQ ID NO：1至少有大约的200个碱基对包含对应于邻近的序列的核苷酸序列，包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列位置为660-858。
附图说明
图1是一动植物种类史的树状图，说明了从原型分离物B006和同族体到以前公布的相关的葡萄球菌和考克氏菌属物种的基因序列的核酸序列的邻接分析。动植物种类史的分析是基于完整的16S rRNA基因序列。AB009941，AF322002，CP000029，D83358，X87754和X87756分别为路邓葡萄球菌，凝固酶素阴性葡萄球菌(S.pettenkoferi)，表皮葡萄球菌，耳葡萄球菌，变异库克菌和玫瑰色库克菌。这个范围表明了相互有关的动植物种类史的发生的间隔。
图2是一动植物种类史的树状图，说明了从原型分离物B006和同族体到以前公布的相关的葡萄球菌和肠球菌物种的基因序列的核酸序列的邻接分析。动植物种类史的是分析基于完整的tuf基因序列。AJ938182，BA000017，BA000018，BA000033，BX571856，BX571857，CP000046，CP000253和CP000255是全部金黄色葡萄球菌.AEO15929，AE016830，AP006716，AP008934，和CP000029分别为表皮葡萄球菌，粪肠球菌，溶血性链球菌，腐生葡萄球菌和表皮葡萄球菌。这个范围表明了相互有关的动植物种类史的发生的间隔。
图3是一凝固酵素-阴性分离物的Xbal-缩短基因组DNA的脉冲凝胶电泳(PFGE)图案的照片。泳道1至泳道13分别为路邓葡萄球菌(ATCC 700328)的分离物，B006，B230，B060，B333，B277，B287，B292，B334，B354，B715，B739和B837。B230(泳道3)和B333(泳道5)为两个分离体，其从一超过16天的间隔内重新获得自相同的患者。分子尺寸以千碱基来表示。
具体实施方式
发明人已经分离了出了一种葡萄球菌的以前未知物种，所述的以前未知的物种它们已经被指定为假路邓葡萄球菌，因为其与路邓葡萄球菌共同具有的某些性质，但是，与路邓葡萄球菌相比，值得注意的是假路邓葡萄球菌有较低的致病性或通常为不致病的。
假路邓葡萄球菌细菌是凝固酵素-阴性格兰氏-阳性葡萄球菌。它们是非溶血的，接触素酶-阳性，精氨酸双水解酶阴性，以及对于多粘菌素B比对于新生霉素来说有更大的抗性。就它们的阳性ODC反应性来说，它们与凝固酶素阴性葡萄球菌是不一致的，且就它们在16s rRNA和tuf基因两者中的核苷酸序列的差异来说，它们与假路邓葡萄球菌和变异库克菌/玫瑰色库克菌(Kocuria variansi rosea)是不一致的。
从2003年9月到2005年10月在范德堡大学医院的研究期间内，总共16个PYR/ODC-阳性葡萄球菌分离物重新获得自血液培养菌中。这些中的四个基于表型的方法进一步被识别为路邓葡萄球菌[2个分离物]，表皮葡萄球菌[1个分离物]，和耳葡萄球菌[1个分离物]和那些从这份研究中被排除的。剩余的12个葡萄球菌分离物是从11个患者中重新获得的，且有2个分离物重新获得自相同的患者在一个超过16天的差异间隔内。所有的12个分离物生长出白色菌落而没有在血琼指平板上溶血。它们是聚集因子-阴性的。显微镜分析显示在丛中直径为1μM的格兰氏-阳性球菌。
这12个分离物的生物化学反应的数据图表被列于表1。基于API葡萄球菌(v4.0)识别系统，8个本来不可识别的，具有低识别百分数；4个被识别为变异库克菌/玫瑰色库克菌，且具有识别几率范围自95.5％至99.6％(表1)。所有的12个分离物都易受庆大霉素，二甲胺四环素，甲哌力复霉素和万古霉素的感染，且对于其他抗生素测试具有变异的易受感染性(表2)。
所有的12个分离体都具有一相同的部分的16S rRNA基因序列，其跨度核苷酸位置8-539。原型菌株B006一完整的16S rRNA基因包含1556核苷酸并且与试验的指定″凝固酶阴性葡萄状球菌″(AF322002，Trulzsch，K.，等人(2002)Diagnostic Microbiol.Infect.Pis.43：175-82)在99.94％上密切相似(图1)。B006隔离种群的16S rRNA基因序列分别地聚集自具有的相似度＜98％的其他显型相关的物种，包括路邓葡萄球菌(AB009941，97.45％)，耳葡萄球菌(D83358，97.64％)，表皮葡萄球菌(CP000029，97.75％)，变异库克菌(X87754，77.86％)和玫瑰色库克菌(X87756，78.49％)。
所有的12个分离物也都具有一相同的部分的tuf基因(200个碱基对)，其跨度核苷酸位置660-858，与路邓葡萄球菌的(ATCC#700328)具有8.6％的不同。原型菌株B006的整个tuf基因包含1,188核苷酸并且与两个表皮葡萄球菌分离物，RP62A和ATCC 12228最密切相关，具有相似度为93.02％(图2)(Gill，S.R.，等人(2005)J.Bacteriol.187：2426-38；Zhang，Y.Q.，等人(2003)Mol.Microbiol.49：1577-93)。这些分离物分别地聚集自其它显型相关的物种，包括溶血葡萄球菌(91.59％)，金色葡萄球菌(91.02-91.22％)，腐生葡萄球菌(90.35％)，和粪肠球菌具有相似度为82.67％(Baba，T.，等人(2002)Lancet359：1819-27；Diep，B.A.，等人(2006)Lancet 367：731-9；Gill，S.R.，等人(2005)J.Bacteriol.187：2426-38；15，18，19，24，Zhang，Y.Q.，等人(2003)Mol.Microbiol.49：1577-93)。
这12个ODC/PYR-阳性CoNS的关联性被进一步通过脉冲凝胶电泳(PFGE)分析。除了两个在超过16天间隔内重新获得自相同的患者的分离物(B230和B333)之外，所有的分离物是无关联的。这些两个分离物呈现为PFGE图案，具有不到6-带的差异，表明它们是传染病学相关的(图3)。PFGE数据全部表明12个分离体表现出这种物种的11个不同菌株。患者的医疗记录表明出两个相关的分离物已经被认为是一静脉线-接合物感染的原因(表3)。给予万古霉素并移除线。患者完全康复了。
将从11位患者中重新获得的分离物的的医疗记录进行观察，并将按人口统计和临床信息列于表3。两个在超过16天的间隔内重新获得自相同的患者的分离物(B230和B333)被认为是导致一静脉线-接合物感染的病原体。剩余的10个分离体被认为是污染物。抗生素，包括万古霉素，在6个案例中被给予了(54.5％)，包括一个案例中，在其中两个分离物被认为是病原体并且在10个案例中的5个中，在其中分离物被认为是污染物(表3)。
就阳性ODC反应来说，这12个新的分离体与凝固酶阴性葡萄状球菌不一致(Trulzsch，K.H.等人.(2002)Diagn.Microbiol.Infect.Dis.43：175-182)，就在16S rRNA和tuf基因两者中的核苷酸序列的差异来说，是与路邓葡萄球菌和变异库克菌/玫瑰色库克菌不一致的。发明人确认了这些分离物是相似于大部分的其他CoNS物种作为血液培养菌的皮肤污染物，并且基于它们的生物化学反应与路邓葡萄球菌是没有区别的。基于由生物化学反应证实的性质，16S rRNA和tuf基因序列，以及临床表现，发明人提出了“假路邓葡萄球菌”作为一种新的葡萄球菌物种，用菌株B006作为它的原型。品种的菌株，B006，被存放于美国标准生物品收藏中心(马纳萨斯，佛吉尼亚)，在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约下，在2006年11月3日指定入藏号为ATCC PTA-7961。
12个PYR/ODC-阳性的葡萄球菌的分离体重新获得自血液培养菌，相对的16S rRNA和tuf基因序列分析显示分离物代表在葡萄球菌菌属中的一新的物种。新的分类群由于它们阳性PYR/ODC反应，不同于金色葡萄球菌和大多数其他CoNS物种。由于它的阴性的或低甘露糖，乳糖，乳糖，海藻糖和N-乙酰基-葡萄糖胺的酸性，并且在16S rRNA和tuf基因中多变的序列，它不同于路邓葡糖球菌。
对于确定的区别某些新的葡萄球菌菌株16S rRNA基因序列分析是没有充分辨别力的，在物种水平上，包含在本研究中的识别的假路邓葡萄球菌菌株。tuf基因，解码了延伸因子Tu，是涉及到肽链的形成并且是核糖体的部分。这些基因是细菌基因组必要的组分，并且较佳的用作诊断的目的目标物。在几个CoNS物种中的tuf基因中序列变更，对于物种形成是不充分的(Kontos，F.，等人(2003)J.Microbiol.Methods55：465-9.，21)。之前由其他人的研究已经对比了三种基因的识别方法，用来识别CoNS物种--16S rRNA，sodA基因和tuf基因序列的比较，并且结果表明：在这三者中tuf基因的序列是最可靠的和可重现的方法。(Heikens，E.，等人(2005)J.Clin.Microbiol.43：2286-90)。基于完整的tuf序列分析，保存在一物种的是相当高的(例如，在9个金色葡萄球菌菌株中99.98％和在2个表皮葡萄球菌菌株中100.0％)。与此相反，存在一显著的缺少同种或相同在不同葡萄球菌物种的tuf基因序列中。通过动植物种类史的分析，新的重新获得的B006菌株的完整的tuf基因序列表明，与最为接近的相配的(表皮葡萄球菌)比较，具有93％的序列相同体。发明人已经展示出核酸序列在tuf基因中的变换来提供了一可靠的方法来在假路邓葡萄球菌，路邓葡萄球菌，和其他显型相关葡萄球菌和考克氏菌属物种之间用来进行区别。
这种假路邓葡萄球菌的分布和自然产生的地方还没有被完全确定。葡萄球菌在自然界广泛分布，虽然它们主要被发现于存活于哺乳动物和禽类的皮肤，皮肤腺，和黏膜上。葡萄球菌通常与它们的宿主具有一良性的或共生关系，但是如果通过侵犯皮肤的障阻的外伤，用针的接种，或医疗装置的直接移植而获得进入了宿主组织可能是致病的。其中特别注意没有被放在获得的血液样本上，通过中性皮肤菌丛中获得的血液污染是很严重的。假路邓葡萄球菌，类似于其他CoNS物种，看来是人类皮肤表面正常菌丛的一部分。
在发明人的研究中，12个假路邓葡萄球菌分离物中，基于它们临床含义10个被认为是的皮肤污染物。但是，5个案例(50.0％)收到了万古霉素和其他宽范围的抗生素，因为它们原来是被识别为路邓葡萄球菌的。在临床设置中为了限制过度使用宽范围和有潜在毒性的抗生素诸如庆大霉素，假路邓葡萄球菌的迅速地探测和区分因此能成为关键。基于在PYR和ODC中的双阳性迅速识别-基础的表型技术，当与甘露糖发酵产物相结合，可以提供精确的识别。甘露糖发酵，但是，需要过夜的培养菌。分子方法，诸如一核苷酸探针，其目标物为tuf基因，在一个及时的方式中可以促进精准和迅速识别。
作为本发明提供的假路邓葡萄球菌包含一细菌和它的子代，其具有至少97％的tuf基因序列相同于假路邓葡萄球菌B006菌株tuf基因(SEQ.ID NO：1)，并且更佳的至少大约97％tuf基因序列相同于B006菌株，其被存放为ATCC PTA-7961。本发明提供一分离的细菌菌株和/或一假路邓葡萄球菌的生物学上纯的培养菌，假路邓葡萄球菌为一吡咯烷酮基芳基酰胺酶/鸟氨酸脱羧酶-阳性，触酶-阳性，凝固酵素-阴性葡萄球菌物种，其由美国标准生物品收藏中心作为ATCC PTA-7961存放的的培养菌来表示。一分离的细胞菌株为一经受来自于自然环境的某些程度的纯化。如果至少大约20％的细菌来自于一细菌菌株，细菌的培养菌可以被认为是生物学上纯化的。但是，较佳的是倘若培养菌为至少33％纯化的，更佳的是倘若培养菌为至少45％纯化，且最佳的是倘若培养菌为至少90％纯化的。
本发明也提供了一分离的多聚核苷酸(DNA和/或RNA)序列，其包含tuf基因的序列(SEQ ID NO：1)的范围从至少大约100到大约1188个碱基对，和/或的假路邓葡萄球菌的16s rRNA(SEQ ID NO：2)的序列范围为至少大约100到大约1556个碱基对。本发明的多聚核苷酸序列包括DNA和/或RNA序列，其编码tuf或16s rRNA基因和其他位于至基因序列的N-末端或C-末端的氨基酸。这被理解为核酸序列对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多聚核苷酸上在5′或3′中的一种中可以包含附加的残留物。几乎任何长度的一核酸片段都可以被采用，且可以与其他DNA序列结合，诸如激活子，聚腺苷酸化信号，附加的限制酶位置，多重克隆位置，其他编码段，等等。因此，总长度的变化可以甚大。
本发明也提供了一种用来从临床分离物中识别假路邓葡萄球菌的方法，所述方法包括将一种未知的细菌菌株的tuf基因的所有或至少大约200个碱基对进行排序，并将这种序列与SEQ ID NO：1的相应区域比较来确定在未知的和参照菌株B006之间序列相同的百分比，在其中假路邓葡萄球菌物种可以被识别为具有至少大约97％，且更佳的至少大约99％的，序列相似或序列相同于SEQ ID NO：1的一相应的区域。
或者，一种用来识别假路邓葡萄球菌的方法，其可以包含分离一多聚核苷酸，其包含一未知的细菌分离体的tuf基因的至少大约200个残余物，并在适当的严格的条件下使多聚干苷酸与包含有SEQ ID NO：1的多聚核苷酸杂交，适当的严格的杂化条件被认为是那些在分子生物学的现有技术。例如，适当的严格的杂化条件可以在大约42℃下在一含有25mM KPO4(pH 7.4)，5x SSC，5x Denhart′s溶液，50μg/mL改性的，声波降解的鲑鱼精细胞DNA，50％甲酰胺，10％硫酸葡聚糖，和1-15ng/mL探针(大约5×107cpm/μg)的杂化溶液中进行，而洗涤在大约50℃下与一含有2x SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行。杂交可能涉及一包含DNA，RNA，感应器，或反本性的多聚核苷酸。所有的或SEQ ID NO：1的至少大约200bp中的一部分可以也被用作一分子诊断探针，其用于各种杂交，和用来从其他临床分离物中来进行微生物识别其他测试方法，那些方法被认为是那些在微生物识别的现有技术。
实施例
将来自于血液培养菌的十二个葡萄球菌分离物进行表征，每个吡咯烷酮基芳基酰胺酶/鸟氨酸脱羧酶-阳性，但不被路邓葡萄球菌-物种引物(primer)/探针识别设置目标的tuf基因(其将编码了转化延伸因子Tu(Heikens，E.，等人(2005)J.Clin.Microbiol.43：2286-90；Kontos，F.，等人(2003)J.Microbiol.方法55：465-9；Martineau，F.，等人(2001)J.Clin.Microbiol.39：2541-7.)。这些分离体不能被确定性地与其它普通的临床上遇到的基于包含那些用在API葡萄球菌识别系统中的生物化学反应的葡萄球菌区别开来(Brun，Y.，等人(1990)J.Clin.Microbiol.8：503-8；5；Gemmell，C.G.，和J.E.Dawson(1982)J.Clin.Microbiol.16：874-7；Layer，F.，B.等人(2006)J.Clin.Microbiol.44：2824-30)。临床上的，那些主要作为皮肤污染物发生作用的分离体，除了两种分离体，其为从同一患者身上重新获得的，在超过16天的间隔内，有一中心线-接合物感染。一系列的基因分析包括16S rRNA和延伸因子Tu(tuf)基因序列分析，表明那些分离物是新的葡萄球菌物种，并且发明人提出了假路邓葡萄球菌sp.nov的命名。
细菌分离物和参照菌株
PYR和ODC双-阳性葡萄球菌分离物重新获得自一
Figure A20078004164000131
9240血液培养菌系统(贝克顿迪金森诊断仪器系统，斯帕克思，马里兰州)，从2003年9月到2005年10月在范德堡大学医院，被包括在研究中。两个相关的参照菌株获得自美国标准生物品收藏中心(ATCC，马纳萨斯，佛吉尼亚)，其包括金黄色葡萄球菌(ATCC#35556)，和路邓葡萄球菌(#700328)。临床的分离体和ATCC菌株被收藏和保存在-80℃下含有7.5％丙三醇的脑心浸液(BHI)中用来进一步研究。
表型的识别
临床分离物和参照的分离物两者都首先通过基于菌落尺寸和色素；厌氧的和有氧生长的；存在聚集因子，葡萄球菌属乳胶凝集(骨螺诊断学公司，Norcross，GA)，溶血素氧化酶，ODC，脲酶，和PYR(De Paulis，A.N.，等人(2003)J.Clin.Microbiol.41：1219-24.，16，25，33)的传统方法来识别。物种识别通过用一API葡萄球菌(bioMerieux Vitek，Inc.，Hazelwood，MO)，依照于生产商说明(Bran，Y.，等人(1990)J.Clin.Microbiol.8：503-8；Chapin，K.，和M.Musgnug(2003)J.Clin.Microbiol.41：4324-7；Gemmell，C.G.，和J.E.Dawson(1982)J.Clin.Microbiol.16：874-7；Heikens，E.，等人(2005)J.Clin.Microbiol.43：2286-90；Layer，F.，B.等人(2006)J.CHn.Microbiol.44：2824-30.)来进一步确认。PYR和ODC分别通过用金黄色葡萄球菌(ATCC#25923)与路邓葡萄球菌(ATCC#700328)(包含作为阴性和阳性的控制器)来进行。生物化学测试包括来自于D-葡萄糖，D-海藻糖，D-甘露醇，D-甘露糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，N-乙酰氨基葡萄糖，密三糖，D-果糖，D-密二糖，木糖醇，和α-甲基-葡萄糖胺的酸产物；硝酸还原物；和碱性磷酸(酯)酶，精氨酸二水解酶，脲酶，和乙酰甲基原醇的产物。由于工具补充说明的建议而进行补充的测试(Chapin，K.，和M.Musgnug(2003)J.Clin.Microbiol.41：4324-7；Layer，F.，等人(2006)J.Clin.Microbiol.44：2824-30.)。生物化学反应，包括触媒，凝固酶，D-葡萄糖，D-甘露醇，D-果糖，半乳糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，D-海藻糖，木糖，硝酸还原物，精氨酸二水解酶，脲酶，和新生霉素以及多粘菌素B抗体，在田纳西州的健康实验室服务部门，在纳什维尔，田纳西，通过用被美国疾病控制和防治中心(CDC)，亚特兰大，乔治亚州所推荐(Kloose，W.E.和T.L.Bannerman(1995)葡萄球菌和微球菌，p.282-298，in P.R.Murray等人.(eds.)临床微生物学手册，第六版，美国微生物出版界协会，华盛顿.；Kloose，W.E.和K.H.Schleifer(1975)J.Clin.Microbiol.1：82-88)的表型的方法被进一步确认。
抗微生物敏感性测试
对羟氨苄青霉素-克拉维酸，唑啉头孢菌素，氯林可霉素，红霉素，庆大霉素，左氧氟沙星，二甲胺四环素，青霉素，甲哌力复霉素，甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑(SXT)和万古霉素在体外的抗微生物敏感性的测试通过依据临床实验室标准化研究所指南(临床实验室标准化研究所抗微生物盘敏感性测试操作标准；经核准的标准，第九版(2006)临床实验室标准化研究所，韦恩，PA)的纸片扩散法来确定。
16S rRNA基因扩大和排序
将每个纯化的细菌的隔离物的菌环放入1ml的蒸馏水。将悬浮液涡旋，在95℃下加热7分钟，在8000×g下离心分离15秒，并将1μl的上层清液用来进行PCR放大。一高保藏引物组合(分别为5′-TGG AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3′和5′-AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA-3′；R＝G或A；SEQID NOS：3和4)跨度16S rRNA基因的核苷酸位置5-1-553被用来通过PCR放大DNA片段(Tang，Y.W.，等人(1998)Clin.Infect.Pis.26：389-92.)。先前所表述，部分或全部的rRNA基因序列通过在一ABI PRISM 3730DNA顺序分析仪上(应用生物系统，福斯特市，CA)用PCR引物和/或几个附加内部的引物被双向确定(Tang，Y.W.，等人(1998)J.CHn.Microbiol.36：3674-9；Tang，Y.W.，等人(2000)J.Clin.Microbiol.38：1676-8)。
tuf基因放大和排序
13个葡萄球菌物种(9个金黄色葡萄球菌，2个表皮葡萄球菌，1个溶血葡萄球菌，和1个腐生葡萄球菌)的全部tuf排序都是在基因银行可以获得的，将其取回并将其进行排列(Baba，T.，等人(2002)Lancet 359：1819-27；Diep，B.A.等人(2006)Lancet 367：731-9；Gill，S.R.，等人(2005)J.Bacteriol.187：2426-38：Holden，M.T.，等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：9786-91：Kuroda，M.，等人(2001)Lancet 357：1225-40；Kuroda，M.，A.等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：13272-7；Takeuchi，F.，等人(2005)J.Bacteriol.187：7292-308；Zhang，Y.Q.，等人(2003)MoI.Microbiol.49：1577-93.)。一退化的引物组合(分别为5′-TAA GAA TAG GAG AGA TTTWAT AAT G-3′和5′-AAA TTA TTC AAA GAT TWC WGT-3′，W＝A或T；SEQ ID NOS：5和6)被指定通过PCR来放大第一/原型分离物B006的整个tuf基因。PCR放大的产物被通过四个内部的引物(分别为5′-AGA ATA GGAGAG ATT TWA TAATGG-3′，5′-TCT GAC AAA CCA TTC ATG AT-3′，5′-CTT TGA TTT GAC CAC GTTC-3’和5′-TTC AGT WAC AAC GCC TGATC-3′；SEQ ID NOS：7-10)在ABI PRISM 3730 DNA顺序分析仪(应用生物系统，福斯特市，CA)来双向地排序。一部分tuf基因跨度为核苷酸位置666-858(Martineau，F.，等人(2001)J.Clin.Microbiol.39：2541-7)通过使用一高保藏引物组合(分别为tuf，5′-TGG TCG TGG TAC TGT TGC TA-3′；tuf-r，5′-TTC ACG TGC AAT ACC ACG TA-3′；SEQ ID NOS：11和12)被用来放大所有的分离物。相同的放大的引物被用来决定部分的tuf基因序列。
动植物种类史的分析
序列同源检索通过基因银行的未成熟细胞(BLAST)询问来进行，核糖体的数据库项目II站点(http://rdp.cme.msu.edu/html/index.html)和MicroSeq数据库图书馆(应用生物系统，福斯特市，CA)，如先前所描述的(Tang，Y.W.，等人(1998)J.Clin.Microbiol.36：3674-9；Tang，Y.W.，等人(2000)J.Clin.Microbiol.38：1676-8)。用相邻连接的动植物种类史的分析，是通过使用DS基因软件(版本1.5，Accelrys Inc.，San Diego，CA)来进行的。
核苷酸序列入藏号和菌种储存物
部分或全部的16S rRNA基因和tuf基因序列被分别作为AY560519，DQl 17531，和DQl 17530存放在基因银行数据库。假路邓葡萄球菌的品种菌株(B006)是分离自一在纳什维尔，田纳西州的48岁男性的血液中。根据布达佩斯条约，在2006年11月3日，将其存放在美国标准生物品收藏中心，马纳萨斯，佛吉尼亚的，入藏号为ATCC PTA-7961。
表1、12个非常规分离物和相关物种的生物化学特征和抗菌易感性数据图表
Figure A20078004164000171
Figure A20078004164000191
a使用的索引：“+”，阳性的；“-”阴性的；“v”可变的；ND，未做；“R”，有抗性的；“S”，易受影响的。数字为基于API葡萄球菌结果的一板的分离物的阳性百分比或在抗菌的易感性的数据图表中的抗性百分比。
b Trulzsch，K.H等(2002)，“凝固酶阴性葡萄状球菌(Staphylococcus pettenkoferi)”，一新的葡萄球菌种类，分离自临床样本。”Diagn Microbiol.Infect.Dis.43：175-82.
表2、12个非常规分离物和相关物种的抗菌易感性数据图表
  B006   B060   13292   B230   B333   B334   B354   8277   B837   8739   8287   13715
  阿莫西林克拉维酸 R S S S S R S S R R S R
  头孢唑啉 R S S S S R S S R R S R
  氯林可霉素 S S S S R R S S R R S S
  红霉素 R S S S R R S S R R S S
  庆大霉素 S S S S S S S S S S S S
  左旋氧氟沙星 S S S R S R S S S S R R
  甲氧西林 R S S S S R S S R R S R
  二甲胺四环素 S S S S S S S S S S S S
  青霉素 R R R R R R S S R R R R
  利福平 S S S S S S S S S S S S
  甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑 S R S R S R S S S S R R
  万古霉素 S S S S S S S S S S S S
R-抗性；S-易感性
表3、11个患者的人口统计学的和临床上的信息，从这11个患者中重新获得了12个非常规的分离物
病例/隔离种群 性别 年龄 临床陈述 执行成果 ID参考   隔离种群的治疗细节 临床意义
B006 男 48   大RMCA区域脑梗死 稳定 无 无 污染物
  B060   女   55   吸入性肺炎   康复   无   万古霉素   污染物
B230/B333a 男 67   静脉线-结合物感染 康复 无   万古霉素、拆线 病原体
B277 女 94   左下叶肺炎，UTI 稳定 无 无 污染物
B287 女 78   具有多边心理状态的UTI 康复 无 无 污染物
B292b 男 30   慢性骨髓白血病，-阵危象 稳定 无 万古霉素 污染物
B334 女 72   多重物质配药过多引起的呼吸衰竭 康复 有 无 污染物
B354 男 37   腰骶脊柱损伤 稳定 无 万古霉素 污染物
B715c 男 81   UTI老年痴呆症 康复 有 无 污染物
B739 男 37   右后大腿的脓性肾炎，股显示无生长的培养菌 稳定 无 万古霉素 污染物
B837 女 65   AMS肾功能障碍 稳定 无 万古霉素 污染物
a这两个分离物是重新获得自同一个患者经过一超过16天时间间隔后。
b稍后被确定为具有一肺部真菌感染。
c第二个CoNS(表皮葡萄球菌)是重新获得自相同的血液培养菌样本。
序列表
<110>基因耐克生物医学制品公司
     范德比尔特大学
     忆伟·唐
     坚·韩
     查尔斯W·斯特拉顿
     查尔斯W·斯特拉顿
<120>孤立的假路邓葡萄状球菌
<130>GBP001
<160>12
<170>专利译本3.4
<210>1
<211>1188
<212>DNA
<213>假路邓葡萄状球菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1188)
<400>1
atggctaaag aaaaattcga tcgctcaaaa gaacatgcca atatcggaac tatcggtcac     60
gttgaccatg gtaaaacaac tttaacagct gcaatcgcaa ctgtattagc aaaaaatggt    120
gatactgtag ctcaatctta cgacatgatt gacaacgctc cagaagaaaa agaacgtggt    180
atcacaatca acactgctca catcgagtac caaactgaca aacgtcacta cgctcacgtt    240
gactgcccag gacacgctga ctatgttaaa aacatgatca ctggtgcagc tcaaatggac    300
ggcggtatct tagttgtatc tgctgctgac ggtccaatgc cacaaactcg tgaacacatt    360
cttttatcac gtaacgttgg tgtaccagct cttgttgtat tcttaaacaa agttgaccaa    420
gtagacgacg aagaattatt agaattagtt gaaatggaag ttcgtgactt attaagcgaa    480
tacgacttcc ctggtgacga tgtaccagta atcgctggat ctgcattaaa agcattagaa    540
ggcgacgaag aacaagaaac caaaatctta gaattaatgc aagcagttga cgacttcatc    600
ccaactccag accgtgactc tgacaaacca ttcatgatgc cagttgagga cgtattctca    660
atcactggtc gtggtactgt tgctacaggc cgtgttgaac gtggtcaaat caaagttggt    720
gaagaagttg aaatcatcgg tatggctgat gaatcacaaa aaacaactgt tactggtgta    780
gaaatgttcc gtaagttatt agactacgct gaagctggtg acaacatcgg tgcgttatta    840
cgtggtattg cacgtgaaga cgttcaacgt ggtcaagtat tagctgctcc tggttcaatc    900
acaccacaca ctaaattcaa agctgaagtt tacgtattat ctaaagacga aggtggacgt    960
cacactccat tcttctctaa ctaccgtcca caattctatt tccgtactac tgacgtaact   1020
ggtgtagtta acttaccaga aggtacagaa atggttatgc ctggtgacaa cgttgaaatg   1080
gacgttgaat taatttcacc aatcgctatc gaagacggta ctcgtttctc tatccgtgaa   1140
ggtggacgta ctgtaggatc aggcgttgtt actgaaatct ttgaataa                1188
<210>2
<211>1556
<212>DNA
<213>假路邓萄萄球菌
<220>
<221>rRNA
<222>(1)..(1556)
<400>2
tttatggaga gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa     60
gtcgagcgaa cagacgggga gcttgctccc ccgacgttag cggcggacgg gtgagtaaca    120
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acatgttgga ccgcatggtc ctacagtgaa agacggtctt gctgtcactt atagatggac    240
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gggatcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt    840
tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta    900
cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt    960
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaaatctt gacatccttt gccccctcta   1020
gagatagagg tttccccttc gggggacaaa gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct    1080
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttaagc ttagttgcca    1140
tcattcagtt gggcactcta agttgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga    1200
cgtcaaatca tcatgcccct tatgatttgg gctacacacg tgctacaatg gacaatacaa    1260
agggcagcta aaccgcgagg tcaagcaaat cccataaagt tgttctcagt tcggattgta    1320
gtctgcaact cgactacatg aagctggaat cgctagtaat cgtagatcag catgctacgg    1380
tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc    1440
gaagccggtg gagcaaccac tttgtggagc tagccgtcga aggtgggaca aatgattggg    1500
gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct ggaccacctc ctttct        1556
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于16S rRNA基因的引物
<400>3
tggagagttt gatcctggct cag                                              23
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于16S rRNA基因的引物
<400>4
aaggaggtga tccarccgca         20
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物1
<400>5
taagaatagg agagatttwa taat    24
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物2
<400>6
aaattattca aagattwcwg t       21
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物3
<400>7
agaataggag agatttwata atgg    24
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物4
<400>8
tctgacaaac cattcatgat         20
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物5
<400>9
ctttgatttg accacgttc          19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物6
<400>10
ttcagtwaca acgcctgatc         20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物7
<400>11
tggtcgtggt actgttgcta    20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>对于tuf基因的引物8
<400>12
ttcacgtgca ataccacgta    20

Claims (16)

1、假路邓(pseudolugdunensis)葡萄球菌的一分离的生物学上的纯培养菌，其特征在于，所述培养菌的一样品以ATCC入藏号PTA-7961被存放。
2、一分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1的至少大约200个邻近(continguous)的残余物。
3、如权利要求2所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1的至少大约300个邻近的残余物。
4、如权利要求2所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸包含SEQ ID NO：1的至少大约400个相邻的残余物。
5、如权利要求2所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的SEQ IDNO：1的至少大约200个相邻残余物包含660-858残余物。
6、如权利要求2所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸在适度严格的条件下与SEQ ID NO：1杂交。
7、一分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸包含SEQ ID NO：2的至少大约200个相邻残余物。
8、如权利要求7所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸进一步包含SEQ ID NO：2的至少大约300个相邻残余物。
9、如权利要求7所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸进一步包含SEQ ID NO：2的至少大约400个相邻残余物。
10、如权利要求7所述的分离的多聚核苷酸，其特征在于，所述的分离的多聚核苷酸在适度严格的条件下与SEQ ID NO：2杂化。
11、一种用来从分离于一临床样本的路邓葡萄球菌中辨别假路邓葡萄球菌的方法，其特征在于，所述方法包含将SEQ ID NO：1的至少200个相邻的碱基对的核苷酸序列与一种未知的细菌菌株的tuf基因序列的一相应区域的核苷酸序列进行比较，倘若表明所述未知的细菌菌株的至少大约97％的序列与SEQ ID NO：1的相应的至少大约200个碱基对相同，就可以将所述未知细菌菌株确定为假路邓葡萄球菌。
12、如权利要求11所述的方法，其特征在于，倘若表明所述未知的细菌菌株的至少大约99％的序列与SEQ ID NO：1的相应的至少大约200个碱基对相同，就可以将所述细菌菌株确定为假路邓葡萄球菌。
13、如权利要求11所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO：1的至少大约200个碱基对相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置660-858。
14、一种用来识别一取自于一临床分离物的未知的细菌菌株为假路邓葡萄球菌的方法，其特征在于，所述方法包含将SEQ ID NO：1的至少200邻近的碱基对的核苷酸序列与未知细菌菌种的tuf基因序列的一相应区域的核苷酸序列相比较，在其中倘若表明所述的未知的细菌菌株的至少大约97％的序列与SEQ ID NO：1的相应的至少大约200个邻近的碱基对相同，就可以将所述未知的细菌菌株确定为假路邓葡萄球菌。
15、如权利要求14所述，其特征在于，倘若表明所述的未知的细菌菌株的至少大约99％的序列与SEQ ID NO：1的相应的至少大约200个邻近的碱基对相同，就可以将所述未知未知的细菌菌株确定为假路邓葡萄球菌。
16、如权利要求14所述，其特征在于，所述的SEQ ID NO：1的至少大约200个碱基对相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置660-858。
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