JP5458286B1 - 樹状細胞表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセル - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、市場ニーズに十分に応えることのできるワクチンを提供することである。樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体を有し、且つウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有するバイオナノカプセルを用いる事によって、このような課題を解決することができる。

Description

本発明は、樹状細胞表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセルに関するものである。

主にＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質又はその改変体を、酵母細胞等の真核生物において発現させることによって得られるウイルス様粒子が、特定の組織に薬剤、遺伝子等を送達するためのＤＤＳナノキャリアとして有用であることが既に報告されている。

この様なウイルス様粒子自体は、癌組織及び肝臓組織へのＤＤＳナノキャリアとして特に有用であるが、送達を所望する組織にて発現するタンパク質や糖鎖等といった生体分子へ特異的に結合する分子を担持するウイルス様粒子とすれば、薬剤、遺伝子等を、斯かる組織に特異的に送達するためのＤＤＳナノキャリアとしての効果を発揮することも知られている（特許文献１〜１３）。

有効なワクチンの開発は、感染症への対策において非常に有用である。また、ガンの治療においては、細胞性免疫を活性化させてガン細胞を攻撃するといった機序に基づいた新たな治療法も開発されている。この様な背景を基に、質の良いワクチンを得ることが、近年、益々求められている。

この様な市場ニーズに反応し、免疫システムにおいて重要な役割を担う抗原認識細胞、中でも樹状細胞へ抗原物質、核酸等を効率的に送達するＤＤＳ技術、樹状細胞が積極的に抗原物質を提示できる様な技術等が開発されている（非特許文献１及び２）。

特開２００１−３１６２９８号公報 特開２００３−２８６１８９号公報 特開２００３−２８６１９８号公報 特開２００３−２８６１９９号公報 特開２００４−００２３１３号公報 特開２００４−０８１２１０号公報 特開２００４−２７７３５５号公報 特開２００７−１０６７５２号公報 特開２００７−２０９３０７号公報 特開２００８−０２９２４９号公報 特開２００８−１６２９８１号公報 特開２００９−１２０５３２号公報 特開２００９−１２０５３３号公報 特願２０１１−１６２５９６号公報

Ｓ．Ｔａｆｕｋｕ，Ｔ．Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．Ｔａｄａｎｏ，Ｒ．Ｍｉｔｓｕｍａｔａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ．Ｈａｒａｋｕｎｉ，Ｔ．Ｓｅｗａｋｉ，Ｔ．Ａｒａｋａｗａ，Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．（２０１１）４−１１． Ｈ．Ｗｅｉ，Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｈｏｕ，Ｗ．Ｑｉａｎ，Ｂ．Ｌｉ，Ｈ．Ｇｕｏ，Ｇ．Ｋｏｕ，Ｊ．Ｈｅ，Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｙ． Ｇｕｏ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ＣＤ１１ｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５（２００９）４６１２−４６２１． Ｍａｔｓｕｏ Ｈ，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ Ｎ，Ｉｉｊｉｍａ Ｍ，Ｎｉｉｍｉ Ｔ，Ｊｕｎｇ Ｊ，Ｊｅｏｎｇ ＳＹ，Ｃｈｏｉ ＥＫ，Ｓｅｗａｋｉ Ｔ，Ａｒａｋａｗａ Ｔ，Ｋｕｒｏｄａ Ｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；７：３３４１−５０．

上述のように、抗原物質、核酸等を樹状細胞へある程度は効率的に送達するＤＤＳ技術、樹状細胞が積極的に抗原物質を提示できる様な技術等が、研究レベルでは開発されてはいるものの、質の良いワクチンとして使用できるレベルには到達しておらず、更なる改良が必要とされている。

例えば、上述の様な技術を基に作製されるワクチンは、多量の投与が必要であったり、生体に対して悪影響を及ぼしかねない様な免疫賦活化剤（いわゆる、アジュバンド）の同時投与が必要であったりする場合がある。この様なワクチンでは、市場のニーズには十分に応えられるものとは言えず、より質の良いワクチンの開発が求められている。本発明の課題は、上述の様な市場ニーズに十分に応えることのできるワクチンを提供することである。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体を有するバイオナノカプセル、又は必要に応じて更にリポソームを含むバイオナノカプセルを個体へ投与したところ、脾臓組織に存在する樹状細胞内に、当該バイオナノカプセルが取り込まれることを見出した。

また、抗原物質を含有する前記バイオナノカプセルを動物個体へ投与したところ、斯かる抗原物質に対する抗体が個体内で著量産生されることも見出した。

さらに、マウスを用いた動物実験において、前記バイオナノカプセルを投与したところ、任意の疾患に対して顕著に優れた予防効果を発揮することも見出した。

本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す態様の発明を広く包含するものである。

項１ 樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体及びウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有するバイオナノカプセル。

項２ ウイルス様粒子が、抗体結合ドメインを含む上記項１に記載のバイオナノカプセル。

項３ 抗体結合ドメインが、ウイルス表面抗原タンパク質に含まれる上記項２に記載のバイオナノカプセル。

項４ ウイルス表面抗原タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｌタンパク質である、上記項１〜３の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。

項５ 抗体が、ＣＤ１１ｃタンパク質又はそのオルソログを認識する抗体である上記項１〜４の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。

項６ 更にリポソームを含む上記項１〜５の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。

項７ リポソームがカチオン性である、上記項１〜６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。

項８ リポソームがアニオン性である、上記項１〜６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。

項９ 更に、抗原物質及び／又は核酸を含む上記項１〜８の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。

項１０ 上記項１〜８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルを含む、樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸導入剤。

項１１ 上記項１〜８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルと、抗原物質及び／又は核酸を含むワクチン。

項１２ 動物の樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸導入方法であって、上記項９に記載のバイオナノカプセルを動物に投与する工程を含む方法。

項１３ 投与が経静脈投与、経皮下投与、又は経筋肉投与である上記項１２に記載の方法。

本発明のバイオナノカプセルは、動物個体内へ投与することによって、樹状細胞に効率的に到達できるものである。さらに、本発明のバイオナノカプセルは、樹状細胞に到達した後に、樹状細胞内に侵入する作用も発揮する。樹状細胞とは生体における免疫システムにおいて、抗原を提示する細胞として非常に重要な役割を担う細胞であるために、本発明のバイオナノカプセルが抗原物質を含んでいる場合、樹状細胞が斯かる抗原物質を極めて効率的に提示することになり、抗原物質に対して細胞性免疫及び／又は液性免疫に関する免疫システムが惹起される。

また、樹状細胞等に特定の配列を有する核酸を送達すれば、哺乳動物における免疫システムが感作し易くなることが知られており、更に樹状細胞内に抗原物質となるペプチド等をコードする核酸を導入すれば、斯かる樹状細胞内で抗原物質となるペプチドが発現することによって、斯かる樹状細胞外に抗原物質としてのペプチドを提示しやすくなることになる。

以上のことから、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルを生体内に投与すれば、斯かる抗原物質に対する抗体を生体内にて著量産生させることができる。そして、この様な抗体の中には、上記抗原物質を中和する機能を持った抗体が含まれることは当然であるために、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは、ワクチンとして優れた機能を発揮する。

また、本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、樹状細胞に侵入した後、上述のような抗原物質に対する抗体を産生する液性免疫システムを惹起するのみならず、細胞性免疫システムも惹起する効果を発揮する。従って、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは優れたワクチンとしての機能を有する。

そして、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルを動物に投与することによって、任意の疾患に対する予防効果を発揮する。このことからも、抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは、優れたワクチンとしての機能を発揮する。

本発明のバイオナノカプセル（Ａ）及びリポソームが結合したバイオナノカプセルの一態様を説明する模式図。図中の（Ａ）及び（Ｂ）において、ａはバイオナノカプセル、ｂは脂質膜、ｃはウイルス表面抗原タンパク質、ｄは樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体、ｅはリポソームを示している。 本発明のバイオナノカプセルとマウスの脾臓から単離したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞との親和性を示す結果。なお、図中のＺＺ−ＢＮＣは、抗体が結合していない単なるＺＺ−ＢＮＣと、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞との親和性を示している。 本発明の実施例３に示す、バイオナノカプセルをマウス個体へ投与した後の、マウス個体における局在を示す図。図中のＢｒｉｇｈｔ Ｆｉｅｌｄは明視野像を示し、Ｈｔは心臓、Ｌｇは肺、Ｋｄは腎臓、Ｌｖは肝臓、そしてＳｐは脾臓を示す。ＩｎｔｅｎｓｉｔｙはＢＮＣを標識化する際に用いたＣＦ−７５０色素が発する７８０ｎｍの蛍光強度を示す。 本発明のバイオナノカプセルをマウス個体に投与した後に、感作された樹状細胞の頻度を示す図。 本発明のバイオナノカプセルをマウス個体に投与した後の、脾臓組織に存在するＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の蛍光顕微鏡写真像。図中のＤＩＣは微分干渉像を示し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光像を示す。ＸＺは及びＹＺは三次元再構成画像処理を行った後の像であり、０．２５μｍずつ１５つのスライス画像を再構成処理に供した。 バイオナノカプセルと共にＤ３抗原をマウス個体に投与した後のマウス個体中のＤ３抗原に対する抗体の力価を測定した結果を示す図。 実験例６に示す樹状細胞標的化ＢＮＣの投与経路検討実験における、バイオナノカプセル、ＢＮＣ投与１２時間後の樹状細胞標的化ＢＮＣの動態解析結果を示す図。 実験例６に示す樹状細胞標的化ＢＮＣの投与経路検討実験における、リンパ節内の樹状細胞への移行能を検討した実験結果を示す図。図中（Ａ）はリンパ節内の樹状細胞への各種ＢＮＣの移行を確認した結果であり、（Ｂ）は各種ＢＮＣのリンパ節内の樹状細への移行を継時的に解析した結果である。なお、図中のＤＣ−ＢＮＣとはαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）を示し、ＺＺ−ＢＮＣとはそれの抗ＣＤ１１ｃ抗体を有さないＢＮＣである。 本発明のＢＮＣのリンパ節の樹状細胞への取り込まれる様子を観察した顕微鏡像。図中のαーＤＣ−ＢＮＣはαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣを示す。 実験例７の樹状細胞標的化ＢＮＣのアジュバント効果の実験結果を示す図。図中のＤＣ標的化ＢＮＣは、αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣを示す。 実験例８の樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討１における、マウスへの投与実験結果を示す。図中のグラフにおいて、縦軸は生存率を示し、横軸は日数を示す。また、（Ｘ／Ｙ）なる表記に関し、Ｘが１６日目まで生存した個体数を示し、Ｙが各投与群の個体数を示す。 実験例１０の樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討２における、マウスへの投与実験結果を示す。図中のグラフにおいて、縦軸は抗ＪＥＶ ＩｇＧ抗体の力価（Ｌｏｇ_１０）を示す。また、ＡはＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３を経静脈投与（ＩＶ）したもの、ＢはαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３を経静脈投与したもの、ＣはαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３を皮下投与（ＳＣ）したもの、ＤはαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３を筋肉内投与（ＩＭ）したものを示す。 実験例１１の抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣを用いた感染防御実験結果を示す。図中のグラフにおいて、縦軸は生存率を示し、横軸は日数を示す。また、（Ｘ／Ｙ）なる表記に関し、Ｘが１６日目まで生存した個体数を示し、Ｙが各投与群の個体数を示す。 実験例１２の核酸を抗原として有する樹状細胞標的化ＢＮＣの製造を確認した実験結果を示す。図中のＩｇＧ−ｚｚＢＮＣはα−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣを示し、ＩｇＧ−ｚｚＢＮＣ−ＬＰＸはα−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣを示し−カチオン性リポソーム−ＤＮＡを示す。 実験例１２の核酸を抗原として有する有する樹状細胞標的化ＢＮＣにおける、インビボイメージング装置を用いた実験結果を示す。図中の（Ａ）は写真像を示し、（Ｂ）は、各臓器の蛍光強度をグラフ化したものである。また、図中のＤＣ標的化ＢＮＣ−ＬＰＸ及びαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰＸは、αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−ＤＮＡを示す。（Ｂ）のグラフの縦軸は、領域あたりの蛍光強度を示す。 実験例１２の核酸を抗原として有する樹状細胞標的化ＢＮＣにおける、脾臓の樹状細胞への送達実験の結果を示す。図中の（Ａ）はＦＡＣＳによる解析結果を示し、（Ｂ）はその結果を定量してグラフ化したものである。 実験例１２の核酸を抗原として有する樹状細胞標的化ＢＮＣ、をマウス個体に投与した後の、脾臓組織に存在するＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の蛍光顕微鏡写真像。図中のＤＩＣは微分干渉像を示し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅは蛍光像を示す。ＸＺは及びＹＺは三次元再構成画像処理を行った後の像であり、０．２５μｍずつ１５つのスライス画像を再構成処理に供したものである。

以下に本発明について説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術であれば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． 「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ等の文献を参照すればよい。

（本発明のバイオナノカプセル）
本発明のバイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有する。この様なタンパク質は、自己組織化能を有し、カプシド、エンベロープ等を構成する膜タンパク質である。

図１の（Ａ）の模式図にて示す、本発明に係るバイオナノカプセルの１つの態様を基に、これの構造について適宜説明する。但し、本発明のバイオナノカプセルは、当該図面のみから導き出せされるものに限定はされない。

本発明のバイオナノカプセルは、ウイルス様粒子（ａ）に樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体（ｄ）が担持されており、ウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）は、当該ウイルス様粒子を構成する脂質膜（ｂ）に突き刺さった状態にて存在している。

ウイルス様粒子は、球状、楕円球状、ラグビーボール状、略球状、フィラメント状等が挙げられる。また、これらの形状において、その内部は液体で満たされていてもよい。

上記ウイルス表面抗原タンパク質としては、Ｂ型肝炎ウイルス、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−１）ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ−２）ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−１：ＨＩＶ）、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、パピロマウイルス（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）等のウイルス表面抗原タンパク質が挙げられる。

中でも、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等の表面抗原タンパク質は、それ自身の細胞への侵入を担う膜透過ドメインを有しているので好ましい。

なお、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質としては、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質、Ｓタンパク質等が挙げられ、特に限定されるものではないが、Ｌタンパク質とすることが好ましい。

Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質としては、例えばＬタンパク質のＮ末端のＰｒｅＳ領域及びそれに続く７７アミノ酸残基程度が欠失し、且つＣ末端側の５０アミノ酸程度が欠失したものであってもよい（特許文献１４）。この様なＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質は、大腸菌を用いて簡便に製造できる点で好ましい。

さらに、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質としては、斯かるタンパク質を主成分とするウイルス様粒子とした際に、粒子表面に露出する２９２番目のグルタミン残基、及び３０８番目のグリシン残基が、アルギニンに置換された変異体としてもよい。この様なＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質は、生体に投与した場合に、それ自身が抗原として認識されにくいという効果を発揮する。

本発明のバイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質の割合は、バイオナノカプセル当たり、通常は７０重量％〜９５重量％程度である。好ましくは、８０重量％〜９０重量％程度である。従って、バイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原タンパク質を主成分として含むものである。バイオナノカプセルは、ウイルス表面抗原タンパク質の他に、脂質も含有する。その割合は、バイオナノカプセル当たり、通常は５重量％〜１０重量％程度である。その他に、バイオナノカプセルには、糖鎖等の成分が含まれる。

樹状細胞としては、特に限定はされないが、例えば脾臓組織に存在する樹状細胞に限定はされず、皮膚のランゲルハンス細胞であってもよい。具体的には、全身に分布する骨髄系樹状細胞、形質細胞様樹状細胞等；表皮に分布するランゲルハンス細胞；リンパ節、脾臓、胸腺等に分布する指状嵌入細胞；リンパ管内に分布するヴェール細胞；真皮に分布する真皮内樹状細胞；リンパ組織内のリンパ濾胞（胚中心）に分布する胚中心樹状細胞、濾胞樹状細胞等；リンパ管若しくはリンパ洞に分布する抗原担送細胞等が挙げられる。

樹状細胞の表面タンパク質としては、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＤ２０５、ＣＤ２０９等が挙げられ、樹状細胞の中でも、抗原提示能力に長けた樹状細胞の表面にて著量発現しているという観点から、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ、ＣＤ２０５等が挙げられる。また、本発明の表面タンパク質は、これらのオルソログであってもよい。

上記抗体の構造は、上述のような樹状細胞の表面タンパク質と結合する部位を含む可変領域さえ有していればよく、それぞれ２つずつの重鎖及び軽鎖からなる免疫グロブリンに限定されるものではない。具体的な抗体の構造としては、Ｆｃ領域を含まないＦ（ａｂ′）_２、イムノグロブリンをパパインで消化することによって得られるＣＨ１領域及びＣＬ領域と重鎖可変領域、並びに軽鎖可変領域からなるＦａｂ等；イムノグロブリンの定常領域を含まないＦｖ等；そしてＦｖの単鎖型の抗体であるｓｃＦｖ等の分子構造が挙げられる。

また、これらの分子構造を組み合わせた多価化構造であってもよい。例えば、Ｆｃ領域と上記のｓｃＦｖ構造の２つとを組み合わせたｓｃＦｖ−Ｆｃ構造や定常領域のＣＨ３ドメインと上記のｓｃＦｖ構造の２つとを組み合わせたｍｉｎｉｂｏｄｙと称される構造等のように、ｓｃＦｖ構造を積み重ねる手法を採用することによって多価化が達成される。多価化とは、樹状細胞の表面タンパク質との結合部位を複数配置することである。

上述の抗体には、アフィボディ（登録商標）も含まれる。アフィボディとはプロテインＡの特定のドメインを足場にして、３つのへリックスドメインが結束した構造を有するタンパク質分子であり、抗原に対して結合する機能を有する。すなわち、上記抗体がアフィボディであるときには、当該アフィボディが樹状細胞の表面タンパク質を認識する分子であることとなる。

例えば、上記抗体がイムノグロブリンである場合、サブタイプは特に限定されることは無く、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等のいずれのサブタイプであってもよい。また、サブクラスも特に限定はされない。

用語、「認識する」とは、樹状細胞の表面タンパク質と抗体が「結合している」ことを意味する。より好ましくは、特異的又は選択的な結合である。この様な「結合している」ことは、樹状細胞の表面タンパク質と抗体との親和性、若しくは表面タンパク質を発現している樹状細胞と抗体との親和性によって判断できる。

親和性を有していれば、「結合している」と判断でき、親和性がより優れていれば、特異的又は選択的に「結合している」と判断できる。具体的な判断方法は、特に限定されないが、結合定数の測定、フローサイトメトリー解析等の蛍光免疫染色法、ウエスタンブロッティング等といった公知の方法によって判断できる。判断基準は単に親和性の有無に止まっていてもよく、親和性を相対的に比較して判断してもよい。

上記抗体（ｄ）は、その抗原認識部位が、バイオナノカプセルの外側に露出さえしていればよい。具体的には、例えば、図１に示すように、バイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に担持されていてもよく、バイオナノカプセルに含まれる脂質膜（ｂ）に担持されていてもよい。

上記抗体（ｄ）がウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に担持されている場合は、共有結合等といった化学的な結合を介して担持されてもよく、抗体結合ドメインを介して結合することによって担持されていてもよい。これらの中でも、抗体結合ドメインに上記抗体が結合していることが好ましい。特に、本発明のバイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）が抗体結合ドメインを有しており、斯かるドメインを介して上記抗体（ｄ）が結合していることが好ましい。

また、ウイルス表面抗原タンパク質と上記抗体が担持された状態に対して、さらに架橋剤等を用いた架橋処理が施されていてもよい。具体的な架橋剤は、特に限定はされないが、例えば、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ^３）ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＰ）、スベリイミド酸ジメチル二塩酸塩（ＤＭＳ）スベリン酸ジサクシンイミジル（ＤＳＳ）等が挙げられる。

抗体結合ドメインとしては、特に限定はされないが、例えば黄色ブドウ球菌等由来のプロテインＡが有するＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣドメインを含むＺドメイン、連鎖球菌等由来のプロテインＧが有するＣ１、Ｄ１、Ｃ２、Ｄ２、及びＣ３ドメインを含む抗体結合ドメイン、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ等由来のプロテインＬが有するＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、及びＢ５ドメインを含む抗体結合ドメイン等が挙げられる。

なお、プロテインＧが有する抗体結合ドメインのうち、少なくともＣ２ドメインを含むドメインを上述の抗体結合ドメインとすることが好ましく、プロテインＬが有する抗体結合ドメインのうち、少なくともＢ１ドメインを含むドメインを上述の抗体結合ドメインとすることが好ましい。

これらの抗体結合ドメインのアミノ酸配列として、例えば、プロテインＡが有するＺドメインであれば配列番号１に示すアミノ酸配列が挙げられる。プロテインＧが有する抗体結合ドメインであれば配列番号２に示すアミノ酸配列が挙げられる。プロテインＬが有する抗体結合ドメインであれば配列番号３に示すアミノ酸配列が挙げられる。

これらのアミノ酸配列は、抗体結合能を減衰させない範囲に限って、変異導入されたアミノ酸配列であってもよい。具体的な変異導入数は、共に特に限定はされないが、通常は変異前のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する変異体となるような変異導入数とすればよい。

なお、ここでいう変異導入とは、置換、欠失、挿入等である。具体的な変異導入については、公知の方法を採用することができ、特に限定はされないが、例えば置換であれば保存的な置換技術を採用すればよい。用語「保存的な置換技術」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。

例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。

なお、用語「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の類似性が高いとも表現できる。アミノ酸配列の同一性又は類似性の程度は、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。

上述の抗体結合ドメインがウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に含まれる場合、本発明のバイオナノカプセルの表面か、あるいはその外側に露出する部位に含まれていることが好ましい。例えば、ウイルス表面抗原タンパク質である場合、そのＮ末端に存在するＰｒｅＳ領域に含まれていることが好ましい。

なお、上述のように、バイオナノカプセルに含まれるウイルス表面抗原タンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であって、そのＮ末端及びＣ末端が欠失したものである場合には、斯かるタンパク質のＣ末端側に上述の抗体結合ドメインが含まれていることが好ましい（特許文献１４）。

上述した抗体結合ドメインは、バイオナノカプセル中に複数含まれていてもよい。また、上述した各種抗体結合ドメインは、１種類であってもよく、２種類以上含まれていてもよい。

上記抗体（ｄ）が脂質膜（ｂ）に担持されている場合も、上述の脂質に担持されている場合と同様に化学的な結合を介して担持されていてもよく、上述の抗体結合ドメインを介して抗体が結合することによって担持されていてもよい。すなわち、本発明のバイオナノカプセルを構成するウイルス様粒子（ａ）には、抗体結合ドメインがウイルス表面抗原タンパク質（ｃ）に含まれず、脂質膜（ｂ）に結合又は突き刺さった状態となっていてもよい。

本発明のバイオナノカプセルの平均粒子径は、Ｚ−平均粒子径として、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点等から、通常は２０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度である。好ましくは、通常は４５ｎｍ〜５５ｎｍ程度である。

本発明のバイオナノカプセルの電荷は、ζ電位として、通常は−３０ｍＶ〜−１０ｍＶ程度である。脾臓組織に効率的に送達される観点、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点、タンパク質や核酸等を送達する観点、生体内での毒性の観点等から、−１０ｍＶ〜−５ｍＶ程度が好ましい。なお、ζ電位は、下記の実施例にて詳述する方法にて測定すればよい。

本発明のバイオナノカプセルは、樹状細胞に作用させて取り込まれた後に、エンドソームにより長い期間止まることによって液性免疫システムを惹起し易い傾向となる。逆に、サイトゾルに移行して比較的長く止まることによって、細胞性免疫システムを惹起し易い傾向となる。

これらのバイオナノカプセルの局在は、その電荷を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、本発明のバイオナノカプセルが、リポソームを更に含む場合は、それを含めた全体の電荷を調整することで、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。

また、これらのバイオナノカプセルの局在は、その電荷および脂質の種類（エンドソーム膜を不安定化する逆ヘキサゴナル相（ヘキサゴナルＩＩ相ともいう。））を形成させやすい脂質、および、プロトンスポンジ効果を誘導しエンドソームを破壊する脂質を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、本発明のバイオナノカプセルの電荷と脂質の種類を調整すれば、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。

上述のように、本発明のバイオナノカプセルは一般的に負電荷を有する傾向であるために、後述するような本発明のバイオナノカプセルにリポソームが結合した態様とし、当該リポソームの電荷を調節することで、容易に本発明のバイオナノカプセル全体としての電荷を適宜設定することができる。そして、後述する様に、リポソームの電荷は、一般的に、その脂質組成の配合割合を調節することによって容易に設定することができる。なお、本発明のバイオナノカプセルの表面電荷の設定は、斯かるリポソームの電荷を設定することに限定されるものではない。

［製造方法］
本発明のバイオナノカプセルの製造方法は、特許文献９に記載されるような、公知の方法を採用すればよい。具体的には、上記ウイルス様粒子を構成するウイルス表面抗原タンパク質をコードする核酸を宿主細胞に導入し、斯かる細胞を培養してウイルス表面抗原タンパク質を発現させ、培養後の細胞からウイルス様粒子を回収する方法が挙げられる。

宿主細胞とは、原核細胞であっても真核細胞であってもよいが、核酸の導入、培養、遺伝子の発現量等といった観点から、酵母細胞が好ましい。なお、上述のように、ウイルス様粒子を構成するウイルス表面抗原タンパク質がＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であって、そのＮ末端及びＣ末端が欠失したものである場合には、大腸菌を宿主細胞として用いることが好ましい。

回収したウイルス様粒子は、超遠心分離法、アフィニティゲル、サイズ排除ゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー法等に供して精製すればよい。

このようにして得られたウイルス様粒子と、上述の抗体とを混合して、本発明のバイオナノカプセルとすればよい。混合の条件等は特に限定はされず、公知の方法を適宜選択すればよい。

なお、後述する様に、本発明のバイオナノカプセルが、更に抗原物質及び／又は核酸を含む場合の製造方法として、予めバイオナノカプセルと抗原物質及び／又は核酸を結合させる態様が存在する。このようなバイオナノカプセルを作製する場合は、上述のようにして製造したバイオナノカプセルに対して、エレクトロポーレーション法等といった公知の方法を採用すればよい。

本発明のバイオナノカプセルは、上述のバイオナノカプセルに対してさらにリポソームが結合していてもよい。この様な態様のバイオナノカプセル（以後、リポソーム結合バイオナノカプセルと呼ぶことがある。）の構造について、図１（Ｂ）の模式図にて示すリポソーム結合バイオナノカプセルの一つの態様を基に適宜説明する。但し、このようなリポソーム結合バイオナノカプセルは、当該図面のみから導き出されるものに限定はされない。

上述のリポソーム結合バイオナノカプセルは、バイオナノカプセル（ａ）とリポソーム（ｅ）とが結合しており、一体不可分の構造である。より具体的には、例えば特許文献８に示されているように、バイオナノカプセルは脂質膜（ｂ）を有しており、リポソーム（ｅ）とバイオナノカプセル（ａ）は、それぞれの脂質膜を介して膜融合している。また、リポソーム（ｅ）とバイオナノカプセル（ａ）は、どちらか一方に内包される必要は無く、単に一方がもう片方に突き刺さった状態となっていてもよい。

上述のリポソーム結合バイオナノカプセルは、通常バイオナノカプセル１質量部に対してリポソームが通常２〜１２質量部程度であり、より好ましくは６〜１０質量部程度である。

上述のリポソーム結合バイオナノカプセルの平均粒子径は、Ｚ−平均粒子径として、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点等から、通常は１００ｎｍ〜６００ｎｍ程度である。

上述のリポソーム結合バイオナノカプセルの電荷は、ζ電位として、通常は−３０ｍＶ〜２０ｍＶ程度である。脾臓組織に効率的に送達される観点、樹状細胞に効率的に送達される観点、樹状細胞内に効率的に侵入する観点、タンパク質や核酸等を送達する観点、生体内での毒性の観点等から、−２０ｍＶ〜０ｍＶ程度が好ましい。なお、ζ電位は、下記の実施例にて詳述する方法にて測定すればよい。

上述のリポソーム結合バイオナノカプセルも、上述のバイオナノカプセルと同様に、樹状細胞に作用させて取り込まれた後に、エンドソームにより長い期間止まることによって液性免疫システムを惹起し易い傾向となる。逆に、サイトゾルに移行して比較的長く止まることによって、細胞性免疫システムを惹起し易い傾向となる。

これらのリポソーム結合バイオナノカプセルの局在もまた、上述のバイオナノカプセルと同様に、その電荷を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、本発明のリポソーム結合バイオナノカプセルの電荷を調整すれば、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。

これらのリポソーム結合バイオナノカプセルの局在は、その電荷および脂質の種類（エンドソーム膜を不安定化する逆ヘキサゴナル相（ヘキサゴナルＩＩ相）を形成させやすい脂質、および、プロトンスポンジ効果を誘導しエンドソームを破壊する脂質）を調整することによって適宜選択することが可能となる。従って、上述のリポソーム結合バイオナノカプセルの電荷と、リポソームを構成する脂質の種類を調整すれば、惹起させたい免疫システムを適宜選択することも可能である。

（リポソーム）
上述のリポソーム結合バイオナノカプセルにおけるリポソームは、シングルラメラ構造（一枚膜）であってもマルチラメラ構造（多重膜）であってもよい。アニオン性リポソームであっても、カチオン性リポソームであってもよい。具体的なリポソームの電荷は、ζ電位として、通常−６０ｍＶ〜６０ｍＶ程度である。

この様なリポソームの平均粒子径は、Ｚ−平均粒子径として、通常は１００ｎｍ〜４００ｎｍ程度である。バイオナノカプセルと複合化し、その後、生体に投与することを考慮するとの観点から、１００ｎｍ〜３００ｎｍ程度が好ましく、更に好ましくは１００ｎｍ〜２００ｎｍ程度である。

なお、上記リポソームのζ電位及びＺ−平均粒子径の測定は、下記の実施例にて示す方法を採用すればよい。

［製造方法］
上記リポソームの製造方法は、特に限定されることは無く、上述の様に組成として例示した脂質を、適当な組成比で混合した後、公知の方法によって作製すればよい。例えば、バンガム法、超音波法、逆相蒸発法、多価アルコール法、加温法、噴霧乾燥法、メカノケミカル法、凍結融解法、フィルムローディング法、超臨界二酸化炭素法等が挙げられる。

なお、後述する様に、本発明のバイオナノカプセルが更にリポソーム及び抗原物質及び／又は核酸を含む場合の製造方法として、予め上記リポソームと抗原物質及び／又は核酸を結合させる態様が存在する。このようなリポソームを作成する場合は、リポソームを構成する脂質を混合する際と同時に、抗原物質及び／又は核酸を混合しておけばよい。抗原物質及び／又は核酸の混合量は、特に限定されることは無く、所望の量を適宜設定して混合すればよい。

作製したリポソームは、例えば適当なサイズの孔径を有するフィルターと共にエクストルーダーを用いて、平均粒子径に調整することができる。

［リポソーム結合バイオナノカプセルの製造方法］
上述のリポソーム結合バイオナノカプセルは、上述のバイオナノカプセルと上述のリポソームを混合することによって作製すればよい。

また、上述のバイオナノカプセルの製造方法において作成するウイルス様粒子と上述のリポソームとを結合させ、これによって得られたリポソーム結合バイオナノカプセルと上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を結合させてもよい。

バイオナノカプセルとリポソームの結合条件等は、後述の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルとリポソームの結合の条件等を適宜採用すればよく、上記リポソーム結合バイオナノカプセルと上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体の結合の条件等は、上述のバイオナノカプセルの製造方法にて説明したウイルス様粒子と上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体との結合の条件等を適宜採用すればよい。

上述のバイオナノカプセルと上述のリポソームの混合条件は、特に限定されることは無く、通常は２０℃〜６０℃程度の環境下で、３０分間〜１２０分間インキュベートすればよい。

また、インキュベート後は、場合に応じて作製したリポソーム結合バイオナノカプセルを精製すればよい。具体的な精製方法は公知の方法を採用すればよく、特に限定はされないが、例えば、超遠心分離法、アフィニティゲル、サイズ排除ゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー法等が挙げられる。

上述のリポソーム結合バイオナノカプセルと上述の樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を結合させる方法は、特に限定されることは無く、樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体と、上述のバイオナノカプセル又は本発明のリポソーム結合バイオナノカプセルとを混合した後に、通常は２０℃〜室温程度の環境下で、３０分間〜１２０分間インキュベートすればよい。

また、インキュベート後は、場合に応じて作製した樹状細胞を認識する抗体を担持するバイオナノカプセルを精製すればよい。具体的な精製方法は、上述した本発明のバイオナノカプセルの精製と同様に公知の方法を採用すればよい。なお、リポソームが結合しないバイオナノカプセルに対する抗体の結合方法も、これと同様にすればよい。

本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセル
本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、上述の本発明のバイオナノカプセルに、更に、抗原物質及び／又は核酸を含むものである。具体的には、上述の本発明のバイオナノカプセルにおけるウイルス様粒子（ａ）に含まれていればよい。

また、バイオナノカプセルが上述のようなリポソーム結合バイオナノカプセルである場合は、上記ウイルス様粒子（ａ）に含まれていてもよく、上記リポソーム（ｅ）に含まれていてもよい。

なお、「ウイルス様粒子（ａ）に含まれる」とは、抗原物質及び／又は核酸が、内包されていてもよく、脂質膜（ｂ）に突き刺さった状態であってもよい。同様に、「リポソーム（ｅ）に含まれる」も、抗原物質及び／又は核酸が内包されていてもよく、リポソームに突き刺さった状態であってもよい。

抗原物質は、特に限定はされないが、本発明のバイオナノカプセルは、生体内に投与することによって、樹状細胞へ積極的に送達され、樹状細胞内に取り込まれることから、ワクチンとして優れた機能を発揮する。従って、抗原物質とは、感染症等の原因となる細菌、ウイルス等の表面タンパク質、糖鎖、脂質等、若しくはそれらの一部であればよい。

核酸とは、特に限定はされず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等が挙げられる。このような核酸の塩基配列とは、上述した抗原物質をコードする塩基配列が好ましい。また、ＣｐＧモチーフ、ＰＡＴＲＥ配列、Ｃ３ｄ配列等を有する塩基配列であってもよい。ＣｐＧモチーフ等は免疫システムを惹起するアジュバンドとしての機能を発揮するので、上述した抗原物質、抗原物質をコードする塩基配列を有する核酸とともに用いることが有効である。

抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルは、個体内へ投与することによって、樹状細胞に効率的に到達できるものである。さらに、樹状細胞に到達した後に、樹状細胞内に侵入する作用も発揮する。樹状細胞とは生体における免疫システムにおいて、抗原を提示する細胞として非常に重要な役割を担う細胞であるために、本発明のバイオナノカプセルが抗原物質を含んでいる場合、樹状細胞が斯かる抗原物質を極めて効率的に提示することになり、抗原物質に対して細胞性免疫及び／又は液性免疫に関する免疫システムが惹起される。

また、樹状細胞等に核酸を送達すれば、哺乳動物における免疫システムが感作し易くなることが知られており、更に樹状細胞内に抗原物質となるペプチド等をコードする核酸を導入すれば、斯かる樹状細胞内で抗原物質となるペプチドが発現することによって、斯かる樹状細胞外に抗原物質としてのペプチドを提示し易くなることになる。

抗原物質及び／又は核酸を含む本発明のバイオナノカプセルを生体内に投与すれば、斯かる抗原物質に対する抗体を生体内にて著量産生させることができる。そして、この様な抗体の中には、上記抗原物質を中和する機能を持った抗体が含まれることは当然であるために、本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、ワクチンとして優れた機能を発揮する。

また、本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルは、樹状細胞に侵入した後、上述のような抗原物質に対する抗体を産生する液性免疫システムを惹起するのみならず、細胞性免疫システムも惹起する効果を発揮する。従って、優れたワクチンとしての機能を有する。

本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルの投与対象は、特に限定はされず、ワクチンとしての機能を所望する動物であれば、特に限定されることはないが、例えば、ウシ、ブタ、ニワトリ、ウマ、ヒツジ、ヒト、ヤギ、チンパンジー、ゴリラ等が挙げられる。

具体的な投与量も特に限定はされないが、例えば抗原物質を含むバイオナノカプセルを投与する場合は、抗原物質の量に換算して、通常は２ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよい。核酸を含むバイオナノカプセルを投与する場合は、核酸の量に換算して、通常１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよい。抗原物質及び核酸を含むバイオナノカプセルを投与する場合は、抗原物質と核酸の総量に換算して、通常３ｍｇ〜７０ｍｇ／ｋｇ程度を投与すればよい。

本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルの製造方法
本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルの製造方法は、特に限定されることは無く、上述の抗原物質及び／または核酸と、上述のバイオナノカプセル、又はリポソーム結合バイオナノカプセルとを混合した後に、通常は２０℃〜室温程度の環境下で、３０分間〜１２０分間インキュベートすればよい。

抗原物質及び／又は核酸が、直接上述のバイオナノカプセルに含まれる場合、これらを例えば公知の架橋剤などを用いて化学的に結合してもよい。また、リポソーム融合法を用いてバイオナノカプセル内に導入又は結合してもよい。そして、エレクトロポ―レーション法等の公知の物理的手段を用いてバイオナノカプセル内に導入又は結合してもよい。

なお、本発明のバイオナノカプセルがリポソームを有している場合、リポソームに抗原物質及び／又は核酸が結合していてもよい。具体的には、上述の本発明のバイオナノカプセルの製造時において、予め上記バイオナノカプセルと上記リポソームの結合前に、抗原物質及び／又は核酸と該バイオナノカプセル又は該リポソームと混合して結合させてもよく、バイオナノカプセルとリポソームを結合させた後にさらに混合して結合させてもよい。具体的な方法は、上記（バイオナノカプセル）及び（リポソーム）の［製造方法］にて詳述したとおりである。

また、インキュベート後は、場合に応じて得られたものを精製すればよい。具体的な精製方法は、上述した本発明のバイオナノカプセル又はリポソーム結合バイオナノカプセルの精製と同様に公知の方法を採用すればよい。

本発明の抗原物質及び／又は核酸導入方法
上述のように本発明のバイオナノカプセルが、更に抗原物質及び／又は核酸を含む場合、これを動物に投与することによって斯かる抗原物質及び／又は核酸を動物の樹状細胞に導入することができる。

すなわち、本発明の抗原物質及び／又は核酸を動物の樹状細胞へ導入方法は、ウイルス抗原タンパク質を含むウイルス用粒子であるバイオナノカプセルを動物に投与する工程を含み、当該バイオナノカプセルが樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を担持し、且つ抗原物質及び／又は核酸を含むことを特徴とする導入方法である。

投与対象の動物、投与量、投与方法等については、上記本発明の抗原物質及び／又は核酸を含むバイオナノカプセルにて詳述した通りとすればよい。

抗原物質及び／又は核酸導入剤
上述の様に、本発明のバイオナノカプセルは、抗原物質及び／又は核酸と共に樹状細胞内に侵入する作用を発揮することから、樹状細胞への抗原及び／又は核酸導入剤として有用である。

本発明の抗原物質及び／又は核酸導入剤は、上述した本発明のバイオナノカプセルを含むものである。抗原物質及び／又は核酸導入剤中の本発明のバイオナノカプセルの配合量は、特に限定はされないが、斯かる導入剤当たり、通常は、０．００１％〜９９．９％程度とすればよい。また、上述した本発明のバイオナノカプセルそのものを本発明の抗原物質及び／又は核酸導入剤としてもよい。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでも無い。

＜実験例１：バイオナノカプセルの作製＞
本実施例にて使用するバイオナノカプセル（以後ＢＮＣと称することがある。）を以下に示す方法にて作製した。具体的には、非特許文献５に記載の方法を用い、ＺＺドメインを有するＢ型肝炎ウイルス表面抗原Ｌタンパク質（以下、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質と称することがある。）を発現させるベクターを用いて酵母細胞を形質転換した後に、斯かる酵母細胞を培養し、ＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を主成分とするバイオナノカプセル（以下、ＺＺ―ＢＮＣとする。）を酵母細胞内から単離及び精製を行った。なお、比較実験用に、ＺＺドメインを有さない、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を主成分とするバイオナノカプセル（以下、ＳＴ−ＢＮＣとする。）を、同様の方法にて単離及び精製を行った。得られたＺＺ−ＢＮＣ及びＳＴ−ＢＮＣの濃度は、各種ＢＮＣの主成分となるタンパク質量に換算して測定した。

具体的な測定方法は、市販のタンパク質量測定キットである、ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社（ＩＬ，ＵＳＡ））を用いて測定した（以下の実験でも同様。）。

また、得られたＺＺ−ＢＮＣ及びＳＴ−ＢＮＣには、場合に応じて、それ自身の検出のために、Ｆｌｕｏｒｏｌｉｎｋ Ｃｙ５色素（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社 ＣＡ，ＵＳＡ）又はＣＦ７５０色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ社 ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて標識化処理を行った。斯かる処理はそれぞれの製品に添付されたプロトコルに従って行った。

次いで、得られたＺＺ−ＢＮＣ、及びＳＴ−ＢＮＣに対して、樹状細胞の表面タンパク質を認識する各種抗体を結合させた。ここで使用した抗体は、以下の表１に示す抗原、種、クローン、及び製造業者のものである。また、対照実験用に下記の表１に示す抗体以外に、マウスＩｇＧｓ（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ ｒｅｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ：シグマアルドリッチ）も、上記ＺＺ−ＢＮＣ及び、ＺＺドメインを有さないＳＴ−ＢＮＣに結合させた。

上記それぞれの抗体１μｇとＺＺ−ＢＮＣ（これが含有するタンパク質量に換算して５μｇ）を、５０μＭの架橋剤であるＢＳ^３（Ｐｉｅｒｃｅ社）の存在下にて混合して、両者を結合させ、さらに架橋を行った。なお、余剰のＢＳ^３は、グリシンを用いて不活化処理（マスキング処理）を施した。

得られた各種抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣの物理的性質について、以下の表２に示す。なお、表中のＺ−Ａｖｅｒａｇｅ（ｎｍ）はＺ−平均粒子径を示し、ζ−Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ（ｍＶ）はζ電位を示す。Ｚ−平均粒子径及びζ電位の測定は、共に動的光散乱光度計であるＺｅｔａｓｉｚｅｒ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用い、２５℃の水系溶媒中にて、常法に従って行った（以下の実験でも同様。）。ＰＤＩは、Ｚ−平均粒子径の多分散指数を示す。

そして、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｙ（ｍｏｌ）は、ＺＺ−ＢＮＣへの各種抗体の結合量を示し、ＺＺ−ＢＮＣの主成分であるＺＺドメインを含むＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質１モル当たりの量にて算出した。具体的な各種抗体のＺＺ−ＢＮＣへの結合量の測定は、水晶発振子マイクロバランス法に基づいた、アズワン社（Ｏｓａｋａ，ＪＡＰＡＮ）のＴｗｉｎ−Ｑ装置を用い、２５℃の条件下にて、常法に従って行った。

表２に示すように、各種抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣは、ＺＺドメインを有さない、従来のＳＴ−ＢＮＣと同様のＺ−平均粒子径（１００ｎｍ以下）及びζ電位（陰性荷電）であることが明らかとなった。また、ＺＺ−ＢＮＣに対しては、アルメニアンハムスター由来のＩｇＧをアイソタイプとする抗ＣＤ１１ｃ抗体が、ＺＺドメインに対して高い親和性を示すことが知られている、マウス由来のＩｇＧｓと同じ程度の効率で結合することが明らかとなった。

＜実験例２：ＢＮＣの樹状細胞への親和性＞
上述の各種抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣの樹状細胞への親和性を、フローサイトメトリーシステム（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎ Ｃａｎｔｏ ＩＩ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社：ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。

樹状細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌：６〜８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）の脾臓より、常法に従って単離した。樹状細胞の中でも、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）テクノロジー（ミルテニーバイオテク株式会社）に基いて更に精製した。

得られたＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞と、上記の抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣ（ＺＺ−ＢＮＣは、ｃｙ５色素によって標識化されている。）を４℃で３０分間インキュベートを行った後、Ｃｙ５の放出する波長を基に、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に親和性を有する、各種抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣの量を、Ｃｙ５色素の放出波長である６７０ｎｍを基に測定した。その結果を図２にて示す。

抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩが結合したＺＺ−ＢＮＣが、マウス脾臓由来のＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に対して特に高い親和性を示すことが明らかとなった。

また、抗体が結合していないＺＺ−ＢＮＣや、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧｓが結合したＺＺ−ＢＮＣといった、樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を有さないＺＺ−ＢＮＣであっても、上述の抗ＣＤ１１ｃ抗体や、抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣには劣るものの、脾臓由来のＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞への親和性が認められた。

これは、本実施例にて用いたＺＺ−ＢＮＣの主成分であるＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質が高マンノース糖鎖を有していることと、樹状細胞がマンノースレセプターを有しており、この二者が樹状細胞への結合に関与するからであると考えられる。
従って、本実施例におけるＢＮＣ及びそれを含むＺＺ−ＢＮＣ並びに樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣは、樹状細胞への結合に特に有効に用いられる。

＜実験例３：ＢＮＣの生体への投与＞
上述の方法にて作製した樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣのうち、抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣをマウス個体（雌：６〜８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）に投与し、その後のＺＺ−ＢＮＣのマウス個体内での局在を観察する実験を、生体観察システム（ＯＶ−１００；オリンパス：日本）を用いて行った。比較実験として、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧｓが結合したＺＺ−ＢＮＣと、抗体が結合していない単なるＺＺ−ＢＮＣ、及びＺＺドメインを有さないＳＴ−ＢＮＣも投与した。なお、それぞれのＢＮＣは予めＣＦ−７５０色素にて標識化されているものを使用した。

各種ＢＮＣを、それぞれの主成分となるタンパク質量に換算して１０μｇずつマウス個体に尾静脈注射によって投与し、投与後４０分でマウス個体に安楽死の処置を行った後、斯かるマウス個体から心臓、肺、腎臓、肝臓及び脾臓を摘出した。摘出したそれぞれの臓器を、ＣＦ−７５０色素の放出波長である７８０ｎｍを基に、上述の生体観察システムにて検出し、マウス個体への投与後の各種ＢＮＣの、斯かるマウス個体内での局在を観察した結果を図３に示す。

マウス個体に投与した全てのＢＮＣは、肝臓に局在することが明らかとなった。そして、各種ＢＮＣの中でも、脾臓から摘出したＣＤ１１陽性樹状細胞に対して高い親和性を示した、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣ及び抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣは、肝臓のみならず脾臓においても局在していることが明らかとなった。以上のことから、樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣをマウス個体に投与すれば、脾臓組織にも送達されることが明らかとなった。このことは、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣが脾臓細胞へのＤＤＳとして優れた効果を発揮することを示している。

次いで、Ｃｙ５色素で標識された各種ＢＮＣを、上述の実験と同様の方法でマウス個体に投与し、投与後４０分でマウス個体に安楽死の処置を行った後、斯かるマウスの脾臓から、常法に従って脾臓細胞を単離した。斯かる細胞とＦＩＴＣ標識化抗ＣＤ１１ｃ抗体を混合し、インキュベートした後、フローサイトメトリーシステムを用いてＣＤ１１陽性樹状細胞に結合する各種ＢＮＣの量をＦＩＴＣ（５２０ｎｍ）とＣｙ５色素の放出波長を基に解析した。結果を図４に示す。

マウス個体に投与した各種ＢＮＣのうち、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣ及び抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣが脾臓組織中のＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に対して高い親和性を示すことが明らかとなった。中でも、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣが、ＣＤ１１陽性樹状細胞の６２％に集積するといった、より高い親和性を示すことも明らかとなった。

非特許文献２に示すように、抗ＣＤ１１ｃのＦ（ａｂ´）_２が結合した抗原を皮下に投与したところ、４時間後では１．５％の樹状細胞にしか斯かる抗原が到達せず、１２時間後に８１．４％の樹状細胞に到達することが開示されている。

一方で、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体を担持するＺＺ−ＢＮＣは、投与後４時間で６２％もの樹状細胞に斯かるＺＺ−ＢＮＣが集積することが明らかである。これは、ＺＺ−ＢＮＣに結合する樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が、ＺＺ−ＢＮＣ表面に整列化されて担持されることによって、抗原抗体反応がより起こり易くなるために、樹状細胞の表面タンパク質を認識する効果が増大するためであると考えられる。

更に、インキュベートした後の細胞から、抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いてＣＤ１１陽性樹状細胞を精製し、精製後の細胞集団を共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ−１０００；オリンパス社：Ｊａｎａｎ）にて観察した。結果を図５に示す。

図中、ＣＤ１１ｃを緑色、抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＢＮＣを赤色にて表示する。抗ＣＤ１１ｃ抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣは、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の内部に存在していることが明らかである。このことから、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣをマウス個体に投与すれば、脾臓組織におけるＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞に到達し、更に斯かる樹状細胞内にＺＺ−ＢＮＣが取り込まれることが明らかとなった。

これは、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣが、膜融合ドメインに止まらず、膜透過ドメインを有しており、樹状細胞内に侵入する機能を有しているからであると考えられる。また、上記ＺＺ−ＢＮＣが樹状細胞表面に存在するＣＤ１１ｃに結合し、その後、斯かるＣＤ１１ｃによる貧食作用に基づいて、当該ＺＺ−ＢＮＣが樹状細胞内に取り込まれたものと考えられる。

従って、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣは、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞内への物質の導入に好適に用いることができる。また、斯かる樹状細胞は、ヒトをはじめとした種々の哺乳動物における免疫システムにおいて、抗原提示機能を発揮する重要な細胞であることから、本実施例における樹状細胞の表面タンパク質を認識する抗体が結合したＺＺ−ＢＮＣを抗原物質や核酸と共に用いることによって、斯かる抗原に対するワクチンとしての機能が発揮されることも期待される。

＜リポソームの作製＞
リポソームの作製は、常法に従って行った。具体的には、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ジエチルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノール塩酸（ＤＣ−６−１４）をそれぞれモル比で３：３：４となる組成で混合して作製した。得られたリポソームは、カチオン性リポソームであることが確認された。得られたリポソームのζ電位は５６．５ｍＶであり、Ｚ−平均粒子径は１２１ｎｍであった。

＜実験例４：リポソームが結合したＢＮＣの作製＞
ＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質量を１００μｇ含むＺＺ−ＢＮＣと、６００μｇの上述のカチオン性リポソームをｐＨ４のブリトン−ロビンソン緩衝液中で混合し、３７℃で３０分間インキュベートしてリポソームが結合したバイオナノカプセルを作製した。ここで得られたリポソーム結合ＢＮＣを、０〜４０％塩化セシウム密度勾配遠心法に供して精製を行った。精製後のリポソームが結合したバイオナノカプセル（以後、ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰとする。）はＰＢＳにて透析を行った。

得られたＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰは、ＺＺ−ＢＮＣの主成分であるＺＺドメインを有するＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を１９．５μｇ、カチオン性リポソームを６５．６μｇ含み、Ｚ−平均粒子径が４５５ｎｍ（ＰＤＩ；０．３３１）、ζ電位が−５．７６ｍＶであった。

なお、リポソームの含有量の測定は、市販の脂質測定キットであるコレステロールＥ−テスト（和光純薬：Ｊａｐａｎ）を用いて行った。

更に、上述のＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰに対し、抗原物質として日本脳炎ウイルスのＤ３抗原を結合させた。Ｄ３抗原は、日本脳炎ウイルスのエンベロープタンパク質のドメインの１つであり、非特許文献１に記載のように、大腸菌による発現系を用いて作製した。

１２０μｇのＺＺ−ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質及び４０４μｇのカチオン性リポソームを含む上記のＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰと、６０μｇの上記Ｄ３抗原を混合し、室温にて１時間インキュベートした（この工程にて得られたものを、以後ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３とする。）。その後、２４μｇの上記抗ＣＤ１１ｃ抗体を加え、ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ中のＺＺ−ＢＮＣに結合させた。最終的に得られたものを以後、α−ＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３とする。

＜実験例５：マウス個体への抗原を含むリポソームが結合したＢＮＣの投与＞
Ｄ３抗原の量に換算して２０μｇのα−ＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３及びＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３を、マウス個体（雌：６〜８週齢；日本ＳＬＣ社：ＪＡＰＡＮ）、尾静脈投与法によって投与した。また、同量のＤ３抗原を含むカチオン性リポソームとＤ３抗原の複合体（以下、ＬＰ−Ｄ３とする。）、及び同量のＤ３抗原のみも比較実験として投与した。投与したサンプルの各種物性について、表３に示す。

上記各種サンプルの投与から４週間後に、それぞれ同量の追加免疫を行った。初回の投与から４週後及び６週後に血液を回収し、Ｄ３抗原に対する抗体の力価の測定を行った。

抗体の力価の測定は、一般的に知られる間接ＥＬＩＳＡ法を用いて行った。具体的には、上記方法によって得られたＤ３抗原をマイクロプレートに固相化し、検出にはＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。結果を図６に示す。

Ｄ３抗原のみを用いてマウス個体に免疫付与した場合であっても、ＬＰ−Ｄ３を用いてマウス個体に免疫付与した場合であっても、マウス個体中において、初回免疫付与から４週間経っても、６週間経っても、抗Ｄ３抗体が殆ど産生されなかった。

一方で、Ｄ３抗原量に換算して同量のα−ＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３を用いてマウス個体を免疫付与した場合、初回免疫から４週間後にＤ３に対する抗体がマウス個体中にて産生されることが明らかとなり、６週間後にはマウス個体中にて産生される、Ｄ３抗原に対する抗体量が、劇的に増加していることが明らかとなった。

なお、抗ＣＤ１１ｃ抗体を有さないＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３を上述の通りＤ３抗原量に換算した等量を用いてマウス個体を免疫付与した場合、初回免疫から６週後にＤ３に対する抗体が、マウス固体中にて産生されていたものの、その産生量は、抗ＣＤ１１ｃに対する抗体を有するα−ＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３による免疫付与から４週後における産生量と同程度であり、Ｄ３抗原に対する抗体産生量としては、α−ＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ＬＰ−Ｄ３と比べて大いに劣るものであった。

＜実験例６：樹状細胞標的化ＢＮＣの投与経路検討実験＞
非特許文献３に記載の方法で、蛍光色素ＣＦ７５０標識抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ−ＢＮＣ（以後、αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）とする。）を用意し、これのタンパク質量１０μｇ相当を、マウスＢａｌｂ／ｃの尾根部（皮下注射：ＳＣ）または大腿部（筋肉内注射：ＩＭ）に投与し、１２時間後に屠殺し、腋窩リンパ節、鼠径リンパ節、膝窩リンパ節を直視できるように開腹した後、オリンパス社製Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージング装置で蛍光観察を行った。

結果を図７に示す。ＳＣ投与分は鼠径リンパ節に、ＩＭ投与分は鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節に蛍光が観察された。このことは、αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）が、従来のＩＶではなく、ＳＣ及びＩＭというワクチンとして通常の投与経路でも所属リンパ節に感染できる可能性を示している。

ついで、上記のαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）をＳＣ投与したマウスから鼠径リンパ節、上記αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）をＩＭ投与したマウスから膝窩リンパ節を摘出し、非特許文献３に記載の方法でＣＤ１１ｃ陽性細胞を単離し、ＦＡＣＳを用いて、リンパ節内の樹状細胞へのＺＺ−ＢＮＣの移行度合いを検討した。

結果を図８に示す、所属リンパ節内樹状細胞の１２．５％〜１５．６％にＺＺ−ＢＮＣが移行することが判明した。なお、陰性対照の蛍光色素ＣＦ７５０標識ＺＺ−ＢＮＣ（αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）の抗ＣＤ１１ｃ抗体を含まないもの。以後、ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ））の３倍の集積度合いであった。この結果は、ＺＺ−ＢＮＣ表層に提示されている酵母由来高マンノース型糖鎖が樹状細胞の表層のマンノース受容体と相互作用して集積していることも示唆している。つまり、「αーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ」は抗ＣＤ１１ｃ抗体と酵母由来高マンノース型糖鎖が共役的に樹状細胞を標的化していることが示唆された（図８（Ａ））。

更に、上記マウスにおいて、投与後８、１２、及び２４時間における所属リンパ節内の樹状細胞の全てに対する、αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）及びＺＺ−ＢＮＣ（ＣＦ７５０Ｌａｂｅｌｅｄ）の集積度合いを検討したところ、前者が後者よりも集積度合いは上昇していたが、両者とも全時点において有意にＺＺ−ＢＮＣは集積していた（図８（Ｂ））。なお、ＳＣ投与後１２時間における鼠径リンパ節内の樹状細胞を単離し、共焦点レーザー顕微鏡観察したところ、樹状細胞内にＺＺ−ＢＮＣが取り込まれていることも確認された（図９）。

＜実験例７：樹状細胞標的化ＢＮＣのアジュバント効果の実験＞
上述のαーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ、ＺＺ−ＢＮＣ、及び陽性対照としてＬＰＳの１０μｇを、ＳＣ又はＩＭでマウスに投与し、２日後に鼠径リンパ節又は膝窩リンパ節を摘出し、常法に従い樹状細胞を単離し、樹状細胞表面の活性化マーカー（樹状細胞がＴ細胞に抗原提示する際に発現する細胞表面分子）であるＣＤ８６及びＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩの発現量を、ＦＡＣＳを用いて定量した。

結果を図１０に示す。α―ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ、ＺＺ−ＢＮＣ、及びＬＰＳは同等の樹状細胞活性化能を有していた。以上から、α―ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ及びＺＺ−ＢＮＣは、アジュバントとして樹状細胞への抗原認識を促進する活性があることが示された。

＜実験例８：樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討１＞
非特許文献３に記載の方法では、カチオン性リポソームにＪＥＶ由来のＤ３抗原を包含して、その後、抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ−ＢＮＣを重合させたものが、有意に抗Ｄ３抗原に対する抗体を誘導できることを示したが、今回は、アニオン性リポソーム（ＤＰＰＣ：ＤＰＰＥ：ＤＰＰＧ−Ｎａ：コレステロール＝３：３：６：８（モル比）の脂質組成にて調製したものである。）にＤ３抗原タンパク質を包含させ、口径２００ｎｍ及び１００ｎｍのエクストリューダーで処理、及び限外濾過したところ、得られたリポソームにおける対脂質Ｄ３抗原の含量が２３．７％と高効率であることを確認した（以後、このリポソームをａＬＰ−Ｄ３とする。）。また、上述の方法に従って測定したＺ平均粒子径は１１０ｎｍ程度であり、ζ電位はー５３．１ｍＶ程度であった。

次に、常法にしたがって、ＺＺ−ＢＮＣをｐＨ４、３７℃、１時間で重合させ、抗ＣＤ１１ｃ抗体をＢＳ^３クロスリンカーで固定し、過剰クロスリンカーをグリシンでマスキングした。これを、抗ＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３とする。また、この様なＢＮＣのＺ平均粒子径は１００〜６００ｎｍ程度であり、ζ電位はー２０〜０ｍＶ程度である。

上述のａＬＰ−Ｄ３、ＳＴ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３（ＳＴ−ＢＮＣは上述のようなＺＺドメインを有さないＢＮＣであり酵母由来高マンノース糖鎖を提示する。）、ＺＺ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３、及びαーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３を、マウス（１群６匹）にＤ３量として２０μｇずつ、２週おきに３回ＩＭ、で投与した（０、２、及び４週目）。その際、０、４、及び６週目に採血を行い、６週目に半数マウス致死量の５０倍のＪＥＶを接種した。なお、陽性対象実験として化血研のＪＥＶワクチン接種群（投与抗原は多価、かつ２０μｇ以上である。）を同様に投与した。

結果を図１１に示す。陽性対象である化血研のＪＥＶワクチン接種群（投与抗原は多価かつ２０マイクログラム以上である）は完全にＪＥＶによる感染を防御した中で、αＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３も同様に完全にＪＥＶによる感染も防御した。なお、ＺＺ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３は半数のマウスが感染防御され、ＳＴ−ＢＮＣ−ａＬＰ−Ｄ３は１匹しか防御されなかったことから、酵母由来の高マンノース由来糖鎖のみの樹状細胞への標的化は感染防御において不十分と判断された。また、ＺＺドメイン自身もＢ細胞等に提示されるＩｇＧドメインを認識していると考えられ、その為、ＺＺ−ＢＮＣはＳＴ−ＢＮＣよりも樹状細胞標的化能が高まったと推測された。

さらに、抗ＣＤ１１ｃ抗体に直接Ｄ３抗原を結合させたもの（αーＣＤ１１ｃ−Ｄ３）は、全くＪＥＶによる感染を防御することが出来なかった。このことは、「１）アニオン性リポソームを介したＤ３抗原の樹状細胞への送達が、樹状細胞内での抗原プロセッシングに対して有効であり、直接樹状細胞内に送り込まれたＤ３は樹状細胞内で適切に抗原プロセッシングされないか或いは単純に分解していることを示唆している」又は「２）ＺＺ−ＢＮＣの表層に提示された抗ＣＤ１１ｃ抗体がＢＮＣの表層で整列化されており、斯かる抗体のアビディティが著しく抗体１分子と比較して高まったため、樹状細胞への標的化が効率よく行われたこと」の何れかを示唆している。

＜実験例９：樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗原搭載法の検討２＞
上述の実験例８において示唆された『２）』の可能性を検討するために、ＺＺ−ＢＮＣ表層に抗ＣＤ１１ｃ抗体を整列化して提示するとともに、リポソームを介さずにＤ３抗原を同時に提示する組成物を作製しこれについての検討を行った。具体的には、ＺＺ−ＢＮＣ表層のＦｒｅｅアミノ基にＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（ピアス社）を用いてピリジルジチオール化ＺＺ−ＢＮＣを作製した。、一方で、Ｄ３のＦｒｅｅアミノ基にＳＰＤＰ（ピアス社）を用いてピリジルジチオール化し、その後ＤＴＴで還元してチオール基に変換し、チオール化Ｄ３抗原とした。その後、ピリジルジチオール化ＺＺ−ＢＮＣとチオール化Ｄ３抗原をそれぞれ１：０．５〜１：４の重量比で混合し、４℃、１８時間反応させ、還元状態及び非還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色を行ったところ、ＺＺ−ＢＮＣ：Ｄ３抗原＝１：４でも十分にＤ３抗原がＺＺ−ＢＮＣに結合していることが判明した。得られたＢＮＣをＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３とする。また、下記表４は各条件で得られたＺＺ−ＢＮＣーＤ３のＺ−ａｖｅｒａｇｅ（ＰＤＩ）及びゼータ電位であり、上述の方法と同様にして測定したものである。

＜実験例１０：抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣへの抗体誘導実験＞
ＺＺ−ＢＮＣ：Ｄ３＝１：４で得られたＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３に対し、ＺＺ−ＢＮＣーＤ３に対して５分の１の重量となる抗ＣＤ１１ｃ抗体を加え、室温で１５分間静置し、クロスリンカーＢＳ３で室温１時間処理し、過剰クロスリンカーをグリシンで室温１５分処理してマスキングした。得られたものをα―ＣＤ１１ｃ−ＺＺーＢＮＣーＤ３とする。Ｄ３抗原量に換算して４０μｇのαーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３、及びＺＺ−ＢＮＣーＤ３を、マウス（１群５匹）に対しそれぞれ、ＩＶ（静脈内）、ＩＭ（筋肉内）、及びＳＣ（皮下）の経路で０、２週に接種し、４週目で血清中の抗Ｄ３−ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡで評価した。

結果を、図１２に示す。αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３は抗ＣＤ１１ｃ抗体提示していないＺＺ−ＢＮＣーＤ３と比較して高い効率で抗体が誘導されていた。以上から、今までのリポソーム（カチオン性またはアニオン性）を介して抗原を包含させなくても、化学的にＺＺ−ＢＮＣ表層に抗原提示させれば、同時に提示している抗ＣＤ１１ｃ抗体により樹状細胞への標的化が達成され、高い抗原性を発揮できるものと考えられた。また、αーＣＤ１１ｃ−ＺＺ−ＢＮＣ−Ｄ３はＩＶ、ＳＣ、及びＩＭのいずれの投与経路であっても、マウス個体において優れた抗体産生を誘導することが明らかとなった。

＜実験例１１：抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣを用いた感染防御実験＞
上述のαーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣーＤ３、ＺＺ−ＢＮＣーＤ３、ＳＴ−ＢＮＣーＤ３、を、マウス（１群６匹）にＤ３抗原量に換算して４０μｇずつ、２週おきに２回ＩＭで投与した（０，２週目）。その際、０，４週目に採血を行い、４週目に半数マウス致死量の５０倍のＪＥＶを接種した。これは、上述の図１１に示される実験よりも投与間隔が短く過激なチャレンジ実験である。

結果を図１３に示す。化血研のＪＥＶワクチン接種群（投与抗原は多価かつ４０マイクログラム以上である）は完全にＪＥＶ感染を防御した中で、α−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣーＤ３もほぼ同様（最終週で１匹死亡）にＪＥＶ感染を防御した。なお、ＺＺ−ＢＮＣーＤ３は半数のマウスが感染防御され、ＳＴ−ＢＮＣーＤ３は１匹しか防御されなかったことから、酵母由来の高マンノース由来糖鎖のみの樹状細胞への標的化は感染防御において不十分と判断された。また、ＺＺドメイン自身もＢ細胞等に提示されるＩｇＧドメインを認識していると考えられ、その為、ＳＴ−ＢＮＣよりも樹状細胞への標的化能が高まったと推測された。なお、抗ＣＤ１１ｃ抗体に直接Ｄ３抗原を結合させたもの（αーＣＤ１１ｃ−Ｄ３）は、全くＪＥＶ感染を防御することが出来なかった。このことは、ＺＺ−ＢＮＣの表層に提示された抗ＣＤ１１ｃ抗体はＢＮＣ表層で整列化されており、同抗体のアビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）が著しく抗体１分子と比較して高まったため、樹状細胞への標的化が効率よく行われたことを示唆している。なお、実験例８にて示唆される１）については、本実験から可能性はその低いと考えられた。

＜実験例１２：核酸として抗原を有する樹状細胞標的化ＢＮＣの実験＞
非特許文献３に記載の方法に従ってα−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ（抗ＣＤ１１ｃ抗体が１μｇでＺＺ−ＢＮＣが５μｇ）を作製し、カチオン性リポソーム（組成は非特許文献３に記載されたものであり、３０μｇ）に３μｇの蛍光色素Ｃｙ５標識プラスミドＤＮＡを複合体化したリポプレックス（ＬＰＸ）を混合し、３７℃、１時間（ｐＨ３）でインキュベートしてα−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−ＤＮＡを作製し、塩化セシウム密度勾配超遠心法（ＳＷ４１ローター、２３６００回転、２５℃、１６時間）で分離した。各フラクションを採取し、そのタンパク質量、及びＣｙ５蛍光強度を測定した。

この結果を図１４に示す。ＬＰＸ単独の場合は低密度画分に集積し、α−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ単独の場合は高密度画分に集積する条件で、上述のαーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−ＤＮＡは両画分の中間に集積していた。特に、上述の混合比で作製したα−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−ＤＮＡは、遊離のＬＰＸ及び遊離のα−ＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣは存在しなかった。これらの作製は煩雑な塩化セシウム密度勾配超遠心法を介さずに行うことができるので、各成分を上記量比で混合することにした。

上述の方法に従って、「αーＣＤ１１ｃ抗体提示ＣＦ７５０蛍光標識ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−ＤＮＡ」及び「ＣＦ７５０蛍光標識ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−ＤＮＡ」を作製し、マウスに尾静脈からＺＺ−ＢＮＣに換算して１０μｇに相当する量を投与し、１時間後にインビボイメージング装置を用いて、各主要臓器におけるＺＺ−ＢＮＣの濃度を蛍光強度で定量した。

結果を図１５に示す。上述の両ＢＮＣは、通常のナノメディシンと同様に肝臓、脾臓を中心に局在することが判明した。

次いで、上述の方法に従って、「抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、及び「Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」を作製し、ＤＮＡ６マイクログラム相当をマウス尾静脈（１群３匹）に投与し、１時間後に脾臓を摘出し、ＣＤ１１ｃ陽性細胞（樹状細胞）に含まれるＣｙ５陽性細胞の割合をＦＡＣＳで測定した。なお、これらのＺ平均粒子径とゼータ電位は、それぞれ上述の順に、４１０ｎｍ／１８．９ｍＶ、３５６ｎｍ／１８．７ｍＶ、２６８ｎｍ／４０．０ｍＶ及び＞１０００ｎｍ／−２５．１ｍＶであった。

結果を図１６に示す。「抗ＣＤ１１ｃ抗体提示ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「ＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」、「カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」及び「Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞（樹状細胞）のそれぞれ１１．２％、１４．４％、６．５％、及び０％にＤＮＡが集積していた。これは、ＢＮＣをＩＶ投与する場合、脾臓内の樹状細胞の標的化には抗ＣＤ１１ｃ抗体によりも、ＺＺ−ＢＮＣのＺＺドメインによるＩｇＧ Ｆｃ領域標的化および酵母由来の高マンノース糖鎖による樹状細胞への標的化が有効であることが判明した。しかし、この各分子の樹状細胞への標的化能は、ＩＶ以外の投与経路、異なるリポソーム組成、異なる各成分の組成比においては変動する可能性はある。

図５（実験例３：ＢＮＣの生体への投与）と同様に、「αーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム−Ｃｙ５蛍光標識ＤＮＡ」を接種されたマウスから単離した脾臓内の樹状細胞を、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

図１７に示すように、ＤＮＡ由来のＣｙ５蛍光が樹状細胞内に存在することが確認された。以上から、ＤＮＡワクチンを「αーＣＤ１１ｃーＺＺ−ＢＮＣ−カチオン性リポソーム」に搭載した場合、効率よくＤＮＡワクチンが樹状細胞に送達され、従来のＤＮＡワクチン単剤とくらべて高い免疫原性を示すことが期待された。

Claims (11)

1. 樹状細胞の表面タンパク質に対する抗体及びウイルス表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子を有するバイオナノカプセル。
2. ウイルス様粒子が、抗体結合ドメインを含む、請求項１に記載のバイオナノカプセル。
3. 抗体結合ドメインが、ウイルス表面抗原タンパク質に含まれる、請求項２に記載のバイオナノカプセル。
4. ウイルス表面抗原タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｌタンパク質である、請求項１〜３の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
5. 抗体が、ＣＤ１１ｃタンパク質又はそのオルソログを認識する抗体である、請求項１〜４の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
6. 更にリポソームを含む、請求項１〜５の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
7. リポソームがカチオン性である、請求項１〜６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
8. リポソームがアニオン性である、請求項１〜６の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
9. 更に、抗原物質及び／又は核酸を含む請求項１〜８の何れか１項に記載のバイオナノカプセル。
10. 請求項１〜８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルを含む、樹状細胞への抗原物質及び／又は核酸の導入剤。
11. 請求項１〜８の何れか１項に記載のバイオナノカプセルと、抗原物質及び／又は核酸を含むワクチン。

Images