JP5406017B2 - 抗腫瘍医薬の製造のための脂肪組織に由来する細胞の使用 - Google Patents
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Description
・セツキシマブは、ヒト上皮増殖因子レセプター(EGFR)の細胞外ドメインに特異的に結合するキメラモノクローナル抗体であり、EGFRを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害しアポトーシスを誘導する。
個体の生涯を通じて持続する相当な拡大能力に起因して、成人の白色脂肪組織は、豊富で取得が容易な細胞供給源を構成する。
−脂肪組織の30%〜60%の細胞を表し、トリグリセリドの蓄積(浮遊細胞画分)により特徴付けられる脂肪細胞画分。この画分は、非常に優勢な(99%)分化脂肪細胞及び脂質小滴(lipid droplet)中に豊富な幾らかの夾雑マクロファージから構成される;及び
−間質-血管画分(SVF)と呼ばれる非脂肪細胞画分。
間質-血管画分(従来、プレ脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化を研究するために使用されている)は、種々の細胞亜集団を含んでなる不均質な画分である(Planat-Bernard V.ら,Circulation,2004,109,656-663;Zuk PA.ら,Mol. Biol. Cell,2002,13,4279-95;Erickson GR.ら,Biochem. Biophys. Res. Commun.,2002,290,763-9;Cousin B.ら,Biochem. Biophys. Res. Commun.,2003,301,1016-22;Safford KM.ら,Biochem. Biophys. Res. Commun.,2002,294,371-9;国際出願WO 02/055678及び米国出願US 2003/0082152)。
−平滑筋細胞又は骨格筋細胞(国際出願WO 02/055678、欧州出願EP 1 077 254;米国特許6,555,374)、
−心筋細胞(国際出願WO 02/055678),
−内皮細胞、肝細胞、神経細胞又は大膠細胞(国際出願WO 01/62901),
−膵臓細胞(米国出願2003/0124721)、又は
−眼内間質細胞(国際出願WO 03/039481)。
−例えば脳の病状(例えば卒中、アルツハイマー病又はパーキンソン病)の治療に関して、神経組織を修復又は再構築するため;
−例えば進行性の肝臓変性に関して、肝組織を再構築するため;
−膵臓の或る種の内分泌障害において観察される膵臓組織の機能を改善するため;
−(例えば腫瘍切除後の)角膜組織又は結合組織損傷の治療に関して、眼内組織を修復又は再構築するため;及び
−特に虚血の治療に関して、機能的な血管ネットワークを完全又は部分的に再構築するため。
驚くべきことに、本発明者らは、今回、間質-血管画分及び該間質-血管画分から単離した細胞亜集団(SVFの初代培養後に培養支持体に接着する細胞からなる亜集団)からなる群より選択される髄外白色脂肪組織細胞の抗腫瘍活性を証明した。
下記において、用語「SVFの全ての細胞」又は「SVF」は同義である。
接着性細胞亜集団はSVFの全細胞集団の約50%〜60%を表す。
この使用の1つの有利な態様によれば、抗腫瘍医薬は、培養前又は培養後の単離細胞からなる。
−髄外白色脂肪組織から間質-血管画分を取得し;
−前記間質-血管画分を精製し;
−適切な液体培地中での初代培養、培養支持体(プラスチックなど)上での非接着性細胞の排除による接着性細胞の選択、適切な培地中でのコンフルエンス後の細胞回収、遠心分離及びペレット回収による、前記精製画分から前記亜集団の細胞を単離すること。
この態様の有利な実施形態によれば、細胞は医薬的に許容し得るキャリアと組み合わされる。
−細胞は、自己遺伝子の少なくとも1つの変異を含んでなってもよく
−細胞は、異種遺伝子の少なくとも1つのコピーを含有していてもよい。
前記遺伝的に改変された細胞は好ましくはヒト起源である。
上清は初代培養上清又は1若しくはそれより多く継代(二次培養又はそれ以上の培養)後に得られる培養上清である。
髄外脂肪組織は、動物起源又はヒト起源であり、好ましくは、髄外脂肪組織の間質-血管画分の細胞及びガン細胞は共に、治療すべき患者のものであり、治療すべき患者から事前に採取される。
前記使用の別の有利な実施形態によれば、ガンは固形ガン又は液性ガンである。
用語「胃腸管のガン」は、食道、胃、小腸、大腸又は結腸の腫瘍及び/又はガンを意味すると意図され、また胃腸管に付随する腺(例えば、肝臓、胆嚢、総胆管及び膵臓)のガン又は腫瘍も意味すると意図される。
この場合、接着性細胞亜集団とガン細胞系統との共培養物を使用するとき、ガン細胞系統は、有利にはCapan-1膵臓細胞系統(ATCC HTB-79)である。
本発明によれば、上記の抗腫瘍医薬の使用は、他の療法、特に手術、放射線療法、化学療法、免疫療法及び分化療法(differentiating therapy)と組み合わせてもよい。
−脂肪組織サンプルは、例えば局所麻酔下での脂肪吸引又は生検により、採取することが容易である;
−豊富性を考えると、ストックを直ぐに作成することができる;加えて、サンプル採取した組織は、それを採取した個体において直ぐに再生することができる;
−これら特性により、脂肪組織に由来する細胞は、同種移植(例えば、自己移植)又は異種移植に特に適切とされる;
−インビトロで規定培地中に細胞を維持し増やすことが可能であり、不死化することさえも可能である;更に、これら細胞はトランスフェクトすることができ、強力な分泌能力を有するので異種遺伝子を発現させるために使用することができる。したがって、治療用タンパク質、例えばプロドラッグを活性薬物に変換し得る酵素を発現させるためにそれらを使用することが可能である。
好ましくは、上清は初代培養上清又は初代共培養上清である。上清はまた、1又はそれより多く継代した後に得られる培養上清又は共培養上清でもある。
好ましくは、上清は初代培養上清又は初代共培養上清である。上清はまた、1又はそれより多く継代した後に得られる培養上清又は共培養上清でもある。
−図2:接着性細胞亜集団の腫瘍内注射後のインビボでの膵臓腫瘍重量の減少。A:間質-血管画分の細胞(白)又はPBS(コントロール)(黒)の腫瘍内注射後の腫瘍重量(mg)の決定;***:p<0.001。B:接着性細胞亜集団(右)又はPBS(左)の腫瘍内注射後に採取した腫瘍の写真。
−図4:DMEM:F12 OK培地、前記亜集団の細胞の培養上清(条件付け培地)、該亜集団の細胞とCapan-1細胞とからの共培養上清(共培養培地)又は10μg/mlのTNF-αを補充したDMEM:F12培地で処理したCapan-1細胞のパーセンテージ生存能のインビトロ決定。***:p<0.001。
1)使用培地
−DMEM F12-OK培地は、500mlのDMEM F12(Gibco reference 31330 038)あたり、5mlのASP(抗生物質+抗真菌剤の直ぐに使用できる溶液:0.25μg/mlアンホテリシン、100μg/mlストレプトマイシン、100μg/mlペニシリンG(Sigma reference A7292))、0.5mlの16mMビオチン(0.016mM最終濃度)(Sigma reference B4639)、0.5mlの18mMパントテン酸(Sigma P5155)(最終濃度0.018 mM)、0.5mlの100mMアスコルビン酸(Sigma A4034)(最終濃度100μM)を含んでなる。
−溶解緩衝液は、100mlの溶液A(100mlの殺菌H2O中2.08gのTris緩衝液(pH7.65))及び900mlの溶液B(1000mlの殺菌H20中8.3gのNH4Cl)を含んでなる。
−PBS溶液はGibcoから入手する(ref 14200-067)。
−トリプシン/EDTA溶液はGibcoから入手する(ref 25300-054)。
消化
脂肪組織は、皮膚脂肪組織切除術(dermolipectomy)又は脂肪吸引を受ける患者から得る:
必要な量の脂肪組織を滅菌ディッシュ中に秤量し、次いで全ての作業を培養フード(culture hood)下で行う。挟みで非常に細かく切り刻むことにより組織を機械的な解離に供し、得られた断片をPBSで濯ぐ。
採取した脂肪組織サンプルを、PBSを含有する滅菌ディッシュ中、顕微鏡下で解剖して、筋肉組織の全ての痕跡を除去し、次いで消化培地中で37℃にて30分間消化させる。消化は10分毎に手で撹拌することにより加速させる。
このプロトコルは、(必要のない)挟みによる組織の機械的解離工程を除いて、同一である。
濾過(25μmフィルター)(PA 25/21,25μm,Tissage de Tissue Techniques,Sailly-Saillisel)により未消化断片を除いた後、遠心分離(600g,10分間)によりSVF細胞を含有するペレットから成熟脂肪細胞を分離する。こうして単離した間質-血管細胞(ペレット)を2mlのDMEM:F12培地+10% NCS(新生仔ウシ血清)中に再懸濁し、計数し(グリッド細胞カウンター又はCoulter粒子カウンターで手作業で計数)、細胞を同じ培地に再懸濁する。同容量の溶解緩衝液を加え、細胞懸濁液を1600rpm(500g)にて5分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットをDMEM:F12 OK(ペレットのサイズに依存して500μl〜1ml)中に採取する。
上記の方法に従って粗製間質-血管画分(SVF)を取得後、細胞を、25cm2フラスコ(Nunc,アングルネック及びフィルターキャップ,ref 055422,Dominique Dutscher)中にディッシュあたり5×105〜106細胞の割合で播種し、DMEM:F12 OK培地において培養する。死細胞及び/又は非接着性細胞を全て除去するために、培養状態に置いた次の日に細胞をPBSで濯ぎ、次いでDMEM:F12 OK培地+10%NCS中で4〜7日間培養する。
ヒト膵臓ガンのマウスモデルを下記に示すとおりにセットする。このモデルは皮下レベルに異所性腫瘍を有する。
−Capan-1系統
Capan-1細胞は、ヒト膵臓腺ガンの肝臓転移に由来する(ATCC HTB-79)。Capan-1細胞は、培養フラスコ(reference BD Falcon T-175 353028)において、完全RPMI培養培地中で37℃及び5%CO2にてルーチンで培養し、70〜80%コンフルエンスに達したら継代する。
雌性胸腺欠損Swiss Nude(nu/nu)マウス(Charles River)は、実験時に6〜8週齢とする。受け入れ後、後の同定のためにSwiss nu/nuマウスの耳に入れ墨をし、次いで12時間の昼夜サイクルに従って、実験前にA2環境中で1週間飼育条件に順応させる(IFR31の畜産技術部,Toulouse)。換気ケージラックシステムで、ケージあたりに5匹のSwiss nu/nuマウスを収容する。
注射可能な細胞懸濁液の調製
Capan-1細胞培養培地を取り除き、細胞を10mlの滅菌PBSで濯ぐ。周囲温度にて5分間のインキュベーション後、PBSを取り除き、3mlのトリプシン/EDTA溶液で37℃にて5分間細胞を解離させる。次いで7mlの完全培地に細胞を採取し、次いでピペットで10サイクルの汲み上げ/逆流後に解離させ、次いで滅菌50mlチューブ(Falcon Blue Max 50ml 352070)に採集する。Coulter Z.I.細胞カウンターを用いて細胞を計数する。注射すべきマウスあたり107相当のCapan-1細胞を滅菌条件下で1400rpm(200g)にて5分間遠心分離する。
マウス(MSC(微生物学的に安全なキャビネット)フード下で厳格に取り扱う)を入れ墨により同定し、体重を測定し、次いで取り扱う前に0.1%イソフルオラン(isofluorane)(Aerrane,Baxter)で5分間麻酔する。この全身麻酔プロトコルにより個体を楽に取り扱うことが可能になり、結果の再現性が確実になる一方で、同時に動物のストレス後の実験的アーチファクトを予防できる。動物が睡眠に入ったことを観察した後、0.3mlの29Gを用いデッドスペースのない33mmツベルクリンシリンジにより1ml/hの速度で、動物の左脇腹にCapan-1細胞(100μl)を皮下注射する。注射部位を消毒し、清潔なリターを有するケージ中でマウスを再馴化させる。これら実験条件下で、麻酔の5〜7分後にマウスは意識を回復する。手術後24時間及び48時間に、注射したマウスのバイタルサインを目視で分析する。これら条件下で、測定した死亡率は0%である。
接着性細胞亜集団の注射は、胸腺欠損Swiss nu/nuマウスへのCapan-1腫瘍の移植の11〜14日後に行う。このときの平均腫瘍容積は250±18mm3である。上記のように、マウス(MSCフード下で厳格に取り扱う)を入れ墨により同定し、体重を測定し、次いで取り扱う前に0.1%イソフルオランで5分間麻酔する。動物が睡眠に入ったことを観察した後、細胞(50μlのPBS中5×105)を腫瘍中に直接か又は尾静脈中に注射する。
2例で、コントロールマウスに50μlの滅菌PBSを腫瘍内に又は全身性に注射する。注射部位を消毒し、清潔なリターを有するケージ中でマウスを再馴化させる。
Graphpad Instat V3.05ソフトウェアを用いて統計学的分析を行う。Student-Newman-Keuls多重比較検定を伴うANOVA片側検定を用いて分散分析を行う。0.05を下回る確率を統計学的に有意であるとみなす。
TUNEL技法(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性dUTP-ビオチンニック末端部標識)により、Capan-1細胞培養物又は実施例1.4に記載のマウスモデルに由来する膵臓腫瘍の切片で、ガン細胞のアポトーシスを検出する。この技法は、アポトーシスの間に生じるDNAフラグメントの遊離3'OH末端での標識ヌクレオチドの組み込みに基づく(Gavrieliら,1992,the Journal of cell Biology,Vol. 119,No. 3,pages 493-501)。ここでは、この技法はApopDETEKキット(EnzoDiagnostic,NY,USA)を製造業者の推奨に従って用いて行う。
髄外脂肪組織の間質-血管画分の細胞をCapan-1細胞に由来する膵臓腫瘍を発現しているSwiss nu/nuマウスの腫瘍中に又は全身性に注射して、該細胞の抗腫瘍効果を評価する。
マウスを作成し、Capan-1細胞を注射し、接着性細胞亜集団を注射する条件は、実施例1に記載されている。
接着性細胞亜集団の注射後、マウスの体重及び腫瘍の成長を、細胞注射後14日まで2日毎に測定して記録する。腫瘍成長は、生きている動物においてインサイチュで測定する。カリパス尺を用いて、下記の計算式に従ってCapan-1腫瘍の長さ(L)及び幅(l)を測定する:
腫瘍容積(mm3)=L2(mm)×l(mm)×0.52
時間tでの%腫瘍進行=[(t0での腫瘍容積)/(時間0での腫瘍容積)]×00;t0は接着性細胞亜集団又はPBSの注射に対応する。
腫瘍サイズを測定することによる腫瘍進行の決定に加えて、腫瘍重量もまた決定する。このために、細胞の腫瘍内注射の13日後にマウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、秤量し、写真を撮影する。
腫瘍進行阻害試験の結果を図1に示す。これらは、亜集団細胞注射の3、6及び13日後のCapan-1腫瘍サイズにそれぞれ46%±13%、38%±8%及び57%±14%の激しく有意な減少を示す。これらデータは、細胞の腫瘍内移入後にCapan-1膵臓腫瘍進行が激しく減少することにより明らかになる抗腫瘍効果を示す。この実験は、コントロール腫瘍の指数的な成長及び潰瘍化のために継続することができなかった。
接着性細胞亜集団の腫瘍内注射による腫瘍進行の減少についてのこれら研究と並行して、本発明者らは、これら細胞が腫瘍部位に移動し該部位で効果を発揮するかどうかを決定するために、細胞を血液を介して投与した。
実施例2に示した全ての結果(腫瘍中に局所的に注射するか又は尾静脈に全身性に投与した亜集団細胞による腫瘍進行の阻害を示す結果)は、髄外白色脂肪組織の間質-血管画分の細胞について抗腫瘍的役割を強く示唆する。
加えて、これら結果は、培養支持体への接着性に基づいて選択したSVF細胞を遠隔で全身血流に投与したときに該細胞が膵臓腫瘍を標的することを示す。
本発明者らはまた、インビボで得られた結果(実施例2)を確証及び検証するために、インビトロで、接着性細胞亜集団の培養上清の存在下にCapan 1細胞の生存能を測定した。
96ウェルの平底培養ディッシュ(Nunc 167008)中に、最終容量100μlにウェルあたり25,000細胞の割合にて六つ組みで(in sextuplicate)、Capan-1細胞を播種し、48時間後に細胞を濯ぎ、以下のもので処理する:
−100μlの完全RPMI培地(ポジティブコントロール、図4には示さず);
−10μg/mlのTNF-αを補充した100μlのDMEM:F12培地(生存能阻害についてのポジティブコントロール);
−100μlのDMEM:F12 OK培地;
−100μlの接着性細胞亜集団細胞の培養上清;又は
−100μlの接着性細胞亜集団細胞とCapan-1細胞との共培養上清。
2日(48時間)後、cell titer 96(商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit(Promega G3582)を用いて細胞生存能を測定する。得られた値は、3つの異なる亜集団細胞調製物に対応する3つの独立した実験の代表値である。
これら結果は、髄外白色脂肪組織の間質-血管画分の細胞によって条件付けられた培地が抗腫瘍効果を有し、この効果は該細胞をガン細胞(例えば、Capan-1系統の細胞)によって活性化させると増幅し得ることを示す。
本発明者らは、髄外白色脂肪組織の間質-血管画分の細胞並びに培養上清及び共培養上清の抗腫瘍効果がガン細胞のアポトーシスの誘導に起因するかどうかを調べた。
1)Capan-1細胞アポトーシスのインビトロ誘導
4-well Labtecks(Dutscher)中に、最終容量500μlにウェルあたり50,000細胞の割合にて三つ組み(in triplicate)でCapan-1細胞を播種して培養し、次いで濯ぎ、以下のもので処理する:
−500μlの接着性細胞亜集団細胞の培養上清;
−500μlの共培養上清1;
−500μlの共培養上清2。
24時間後、実施例1.7に示すようなTUNEL技法によりアポトーシスを評価する。
結果を図5に示す。
したがって、これら結果は、接着性細胞亜集団の細胞の培養上清及び接着性細胞亜集団の細胞の共培養上清が、インビトロでCapan-1細胞アポトーシスを誘導し得ることを示す。
マウスを作成し、Capan-1細胞を注射し、接着性細胞亜集団を腫瘍内注射する条件は、実施例1に記載されている。
接着性細胞亜集団の細胞の注射の5日後に、膵臓腫瘍生検を採取し、次いで切片を調製する。ネガティブコントロール用に、接着性細胞亜集団の細胞を与えていないマウスから、腫瘍切片を調製する。実施例1.7に示すようなTUNEL技法によって、これら2つのタイプの調製物においてアポトーシスを検出する。
コントロールマウスに由来する腫瘍の切片では標識は検出されない(図6A)。他方で、接着性細胞亜集団の細胞の注射を受けたマウスに由来する多くのガン細胞については核標識が観察される(図6B)。このことにより、これら細胞がアポトーシスに入っていることが示される。
これら結果は、接着性細胞亜集団の細胞がインビボでガン細胞のアポトーシスを誘導し得ることを示す。
Claims (11)
- 髄外白色脂肪組織の間質-血管画分から単離された接着性細胞亜集団又は該接着性細胞亜集団の培養上清を含んでなり、該接着性細胞が抗腫瘍剤を発現するように遺伝子改変されていない、腫瘍増殖を減速させるか又は阻害してガン細胞死を誘導し得る抗腫瘍医薬。
- 前記接着性細胞亜集団が、以下:
−髄外白色脂肪組織から間質-血管画分を取得し;
−該間質-血管画分を精製し;
−該精製画分から、適切な液体培地での初代培養、培養支持体上での接着性細胞の選択、適切な培地でのコンフルエンス後の該細胞の回収、遠心分離及びペレットの回収によって、前記細胞亜集団を単離することを含んでなる方法により取得することができることを特徴とする、請求項1に記載の抗腫瘍医薬。 - 前記細胞が医薬的に許容し得るキャリアと組み合わされることを特徴とする、請求項1又は2に記載の抗腫瘍医薬。
- 前記細胞が異種遺伝子を含んでなり、該異種遺伝子の翻訳産物がプロドラッグを腫瘍細胞に対して毒性の活性化合物に代謝し得る酵素であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗腫瘍医薬。
- 前記接着性細胞が未分化であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗腫瘍医薬。
- 前記上清が前記細胞亜集団とガン細胞又はガン細胞系統の細胞との共培養物から得られることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗腫瘍医薬。
- 前記ガンが固形ガンであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗腫瘍医薬。
- 前記ガンが胃腸管の固形ガンであることを特徴とする、請求項7に記載の抗腫瘍医薬。
- 前記固形ガンが膵臓ガン、胃ガン又は結腸直腸ガンであることを特徴とする、請求項8に記載の抗腫瘍医薬。
- 請求項1又は5に規定される髄外白色脂肪組織の接着性細胞、前記細胞の培養上清又は前記細胞とガン細胞若しくは適切なガン細胞系統の細胞との共培養物の上清からなる群より選択される抗腫瘍剤を含んでなる抗ガン療法におけるアジュバント。
- 請求項1又は5に規定される髄外白色脂肪組織の接着性細胞、前記細胞の培養上清又は前記細胞とガン細胞若しくは適切なガン細胞系統の細胞との共培養物の上清からなる群より選択される抗腫瘍剤の、腫瘍増殖を減速させるか又は阻害してガン細胞死を誘導し得、且つ前記細胞又は前記細胞の上清と相乗的に作用し得る他の抗腫瘍医薬についてのインビトロスクリーニングのための使用。
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