JP5392528B2 - 毒素またはウィルス含有汚染液の固相抽出方法および無毒化方法、並びにそれに用いる固相抽出用捕集剤および除染剤 - Google Patents
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Description
モノリス型シリカゲルは、最近、粒子状充填剤を用いたクロマトグラフィー分離カラムを上回る性能を発揮することが知られている(非特許文献10)。
さらに、これらの試薬は、非特異的で無害な一般物質にまで作用するため、除染効率は非常に低いものであり、生物化学テロ事案発生時や感染症流行時の現場事後管理を適切に行えるとは言い難い。
〔1〕下記一般式(1)
(式中、Lは親水性スペーサーであり、XはOまたはSであり、R1は−OHまたは−NHCOCH3であり;R2およびR3は、それぞれ独立して水素原子または下記式(2)
で示されるシアル酸残基(式中、−COOMは、−COOHまたはその生理的に許容される塩であり、Acはアセチル基を意味する。)である。)
で表されるラクトース誘導体を含む無機系多孔質体であって、
該ラクトース誘導体の末端アミノ基にアミド結合するカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が1g当たり0.25mmol以上、表面又は細孔内面に結合した該無機系多孔質体を流路の少なくとも一部に充填する工程、
該ラクトース誘導体と特異的に結合する毒素またはウィルスを含む汚染液を、該無機系多孔質体が充填された流路に流下させる工程を含み、
該汚染液中の毒素またはウィルスを該無機系多孔質体のラクトース誘導体に固定することにより該汚染液から固相抽出および除去する、汚染液の毒素またはウィルスの固相抽出方法および無毒化方法。
〔2〕 前記R2および前記R3が水素原子である、〔1〕に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔3〕 前記R2がシアル酸残基であり、前記R3が水素原子である、〔1〕に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔4〕 前記R2が水素原子であり、前記R3がシアル酸残基である、〔1〕に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔5〕 前記Lが下記式(3)
(式中、mは1〜5の整数である。)で示される基である、〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔6〕 前記毒素がリシン60である、〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔7〕 前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔8〕 前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、〔1〕〜〔7〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔9〕 前記無機系多孔質体が、3次元網目状に連続した孔径0.5〜500μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径0〜400nmの細孔とを有し、骨格径が500nm以上のモノリス型シリカゲルである、〔1〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔10〕 前記汚染液が、使用済み洗浄液である、〔1〕〜〔9〕のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
〔11〕 下記一般式(1)
(式中、Lは親水性スペーサーであり、XはOまたはSであり、R1は−OHまたは−NHCOCH3であり;R2およびR3は、それぞれ独立して水素原子または下記式(2)
で示されるシアル酸残基(式中、−COOMは、−COOHまたはその生理的に許容される塩であり、Acはアセチル基を意味する。)である。)
で表されるラクトース誘導体の末端アミノ基とアミド結合したカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が表面又は細孔内面に1g当たり少なくとも0.25mmol以上結合した無機系多孔質体を含む、毒素またはウィルス含有汚染液用の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔12〕 前記R2および前記R3が水素原子である、〔11〕に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔13〕 前記R2がシアル酸残基であり、前記R3が水素原子である、〔11〕に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔14〕 前記R2が水素原子であり、前記R3がシアル酸残基である、〔11〕に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔15〕 前記Lが下記式(3)
(式中、mは1〜5の整数である。)で示される基である、〔11〕〜〔14〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔16〕 前記毒素がリシン60である、〔11〕〜〔15〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔17〕 前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、〔11〕〜〔15〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔18〕 前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、〔11〕〜〔17〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔19〕 前記無機系多孔質体が、3次元網目状に連続した孔径0.5〜500μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径0〜400nmの細孔とを有し、骨格径が500nm以上のモノリス型シリカゲルである、〔11〕〜〔18〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
〔20〕 前記汚染液が、使用済み洗浄液である、〔11〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
ここで一体型多孔質体とは、3次元網目構造状の骨格と空隙(貫通孔)とが一体となった無機系多孔質体をいい、必ずしも骨格内に細孔(メソポア)を有しなくてもよい。
したがって、本発明に係る固相抽出方法および無毒化方法、並びに固相抽出用捕集剤および除染剤は、生物化学剤を用いたテロや感染症流行時に散布等された、大量の毒素やウィルスを迅速分析するための固相抽出用捕集剤および効率的に処理するための現場除染システムとして有効である。
本発明に係る毒素またはウィルスの無毒化に用いることができる無機系多孔質体は、下記一般式(1)
ハイブリット体とは、具体的にはメチル基やフェニル基など有機基がケイ素やチタンなどに結合した金属酸化物のことである。
なお、本明細書において骨格径とは、三次元網目構造を構成している骨格の太さをいう。
モノリス型シリカゲルの電子顕微鏡写真を図1に示す。
具体的には、例えば、まず100nm以上の巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゾルをゾルーゲル法によって作製し、そのバルク状ゲルを粉砕せずに様々な組成を持つ水溶液に浸漬することにより、巨大空孔の内壁が最大20nm程度の狭い細孔分布を持った、二重気孔の多孔質体に変化させることにより製造されたものを利用できる。
「ホルムアミドあるいは水溶性高分子等の共存物質を酸性水溶液に溶かし、それに金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基を有する有機金属化合物を添加して加水分解反応を行う。なお、共存物質が高分子成分の場合、混合時から均一状態になるまでに長時間を要するため、あらかじめ溶媒に高分子を溶解あるいは分散させておくのが望ましい、ホルムアミドなどの低分子成分のみを共存物質として含む系の場合にはその必要がないので、共存物質及び有機金属化合物を同時に混合して、加水分解してもよい。
そうすると、系のゾル−ゲル転移と重合反応に起因する溶媒相とゲル構成成分との相分離がほぼ同時に起こるような原料組成・温度を選んだ場合にのみ、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。
「ゾル−ゲル転移と相分離がほぼ同時に起こるような原料組成・温度」の一般的な範囲は定かでないが、高分子成分を用いる場合と、極性溶媒のみを用いる場合に大別すると、およそ次のような範囲となる。高分子成分を用いる場合、重量基準で、高分子成分0〜30%、金属アルコキシド20〜70%、溶媒0〜60%、加水分解のための水(触媒を含む)5〜50%の組成とし、0℃程度から、溶媒相の沸点程度までの温度で反応させる。極性溶媒のみを用いる場合、重量基準で、金属アルコキシド20〜50%、溶媒0〜60%、加水分解のための水5〜50%の組成とし、0℃程度から、溶媒相の沸点程度までの温度で反応させる。
有機金属化合物に含まれる有機官能基の極性が低い場合には、系がゾル−ゲル転移に至るまでに相分離が起こりやすい。このような場合、溶媒相の極性を下げたり、共存物質としての高分子の分子量あるいは添加量を調節することによって、相分離の起こる時期を遅らせるのが望ましい。
また、有機官能基中にカルボキシル基あるいはアミノ基のような、酸性あるいは塩基性の基が含まれる場合には、局所的なpH変化によって不均一なゲル形成反応が起こることを防ぐために、通常の加水分解条件よりも酸あるいは塩基触媒の量を加減するのが望ましい。すなわち、例えば、塩基性の有機官能基を含む有機金属化合物に対しては、加水分解の触媒としてかなり多い酸を使って、全体の反応が酸性条件下で進むようにするとよい。
有機官能基を含む有機金属化合物の加水分解・重合反応が遅いために、相分離がゾル−ゲル転移よりもはるかに早く起こってしまう場合には、加水分解性の官能基をより多く含む有機金属化合物を混合してゾル−ゲル転移を早めることにより、100ナノメートル以上の3次元網目状に連続したゲル骨格相と溶媒相とからなる構造を作製することができる。
上記の連続したゲル骨格相と溶媒相とからなる構造を持つゲルは、溶媒を気化させることによって収縮を伴って乾燥し、乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、有機官能基が分解されないような適当な温度および雰囲気下で熱処理を行い、共存物質のみを揮発・分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。
ただし、硫酸根や硝酸根などの無機系結晶は、有機官能基の分解温度よりも高温でなければ分解・揮発しない。従って、このような場合、既述の溶媒置換法によって、一旦触媒や共存物質等の不要物質を除去した後、加熱乾燥する必要がある。」
高精度かつ迅速に毒素またはウィルスを吸着あるいは捕捉する観点から、カルボキシル基修飾体の1g当たり、ラクトース誘導体が0.005mmol以上結合することが好ましく、0.5mmol以上結合することがより好ましい。
本発明に係る「エンドキャップ処理」とは、ラクトース誘導体修飾体上に存在する、遊離のカルボキシル基を特定の有機官能基と結合させる処理のことをいう。エンドキャップ処理後のラクトース誘導体修飾体は、遊離のカルボキシル基と標的毒素あるいは標的ウィルス以外の物質との非特異的な結合を防止することができるため、より選択的に標的毒素あるいはウィルスを吸着させることができる。
本発明に係るラクトース誘導体は例えば、下記に示すスキームにより合成することができる。
本発明に係るラクトース誘導体修飾体は、例えば、下記に示すスキームにより製造することができる。
本発明に係る汚染液の無毒化方法は、前記ラクトース誘導体修飾体を流路の少なくとも一部に充填する工程、およびラクトース誘導体と特異的に結合する毒素またはウィルスを含む汚染液を、該流路に流下させる工程を含む。
以下のスキーム3−1に従って2−[2−(2−アミノエトキシ)エトキシ]エトキシβ−D−ラクトシド 塩酸塩を合成した。
オクタアセチルラクトシド(和光純薬社製)19.1g(28.1mmol)をテトラヒドロフラン(和光純薬社製)150mLに溶かし、ベンジルアミン(アルドリッチ社製)7.5mLを加えた。1晩攪拌した後、反応混合物を濃縮し、その残渣を酢酸エチル(和光純薬社製)600mLに溶かした。分液ロートを用いて、酢酸エチル溶液を、特級塩酸(和光純薬社製)を希釈して調製した1Nの塩酸50mLで2回洗浄した。さらに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄した後、硫酸マグネシウム(和光純薬社製)で乾燥した。その溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル60,ヘキサン/酢酸エチル=2/3)により分離した。分離後の化合物に窒素雰囲気下で脱水ジクロロメタン(アルドリッチ社製)38.5mL、トリクロロアセトニトリル12.3mL、1,8−ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデセー7ーエン(東京化成社製)3.47mLを加え、1晩攪拌した後、反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル60,ヘキサン/酢酸エチル=1/1)により分離し、目的とする化合物(I)(9.8g,46%)を得た。
フラスコ内の粉末状のモレキュラーシーブ3A 400mg(アルドリッチ社製)をガスバーナーで加熱することにより活性化させた。フラスコが冷えた後に、化合物(I)2.85g(3.65mmol)をすばやく加え、窒素に置換した。そこに脱水ジクロロメタン(アルドリッチ社製)5mLと2−[2−(2−クロロエトキシ)エトキシ]エタノール(和光純薬社製)863mg(745L,5.12mmol)を入れ攪拌した。窒素雰囲気下、1時間室温で攪拌した後に、0℃に冷却し、ボロントリフルオリドエテラート(BF3・Et2O)300μL(アルドリッチ社製)をゆっくり加えた。2時間そのまま攪拌した後、モレキュラーシーブ3Aをろ過により除いた。そのろ液を酢酸エチル(和光純薬社製)90mLで希釈し、分液ロートを用いて水で9回洗浄した。有機層をさらに飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウム(和光純薬社製)で乾燥させた。乾燥させた溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(シリカゲル60,ヘキサン/酢酸エチル=1/1−1/2)による分離により目的とする化合物(II)(1.48g,52%)を得た。
化合物(II)(1.50g、1.91mmol)をN,N−ジメチルホルムアミド(和光純薬社製)15mLに溶解し、15−クラウン−5−エーテル(和光純薬社製)1滴とアジ化ナトリウム(アルドリッチ社製)621mg(9.55mmol)を加え、80℃で16時間攪拌した。未反応のアジ化ナトリウムをろ過により除いた後、ろ液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル(和光純薬社製)70mLに溶解させた。その溶液を分液ロートを用いて水、飽和食塩水の順で十分洗浄した後、硫酸マグネシウム(和光純薬社製)で乾燥させた。乾燥させた溶液を減圧濃縮することで目的とする化合物(III)(1.31g,86%)を得た。
化合物(III)(477mg、0.601mmol)をメタノール(和光純薬社製)10mLに溶解させ、触媒量のナトリウムメトキシド(和光純薬社製)を加えて室温で攪拌した。5.5時間後にイオン交換樹脂(Dowex(H+)form、ダウエックス社製)を加え10分攪拌した後、ろ過によりイオン交換樹脂を除いた。そのろ液を減圧濃縮することで目的とする化合物(IV)(296mg,99%)を得た。
化合物(IV)(126mg、0.252mmol)をメタノール(和光純薬社製)10mLに溶解し、そこに10等量の塩酸(和光純薬社製)と触媒量の水酸化パラジウムカーボン(アルドリッチ社製)を加え、水素に置換した。水素雰囲気下、室温で1.5時間攪拌した後、水酸化パラジウムカーボンをろ過により除き、そのろ液を減圧濃縮した。残渣をメタノールに溶解し、減圧濃縮を繰り返すことで塩酸を除き、目的の化合物(V)(128mg,99%)を得た。
以下のスキーム3−2に従い、シアリルラクトース3糖体を合成した。
組み換えラット由来アルファ2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼを用いて化合物(VIII)をシアル化し、シアリルラクトース3糖体化合物(VIII)を合成した。
2本のPCRチューブにそれぞれ2−[2−(2−アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ−β−D−ラクトシド塩酸塩(化合物(V))50mg(0.106mmol)、CMPシアル酸2ナトリウム塩(ヤマサ醤油社製)73mgを、7.2mg/mLの子牛血清アルブミン(BSA) (キシダ化学社製)と120mMの塩化マンガン(キシダ化学社製)とを含む1Mの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH6.3,100μL)に加え、溶かした。そこにアルカリフォスファターゼ(和光純薬社製)90U、アルファ2,3−(N)−シアリルトランスフェラーゼ250mU(カルビオケム社製)を加え、37℃でインキュベーションした。40時間インキュベーションした後、この反応混合物をODS(水、メタノール混合液)、およびBiogel P2カラムクロマトグラフィーで精製し、シアリルラクトース3糖体化合物(VIII)を合成し、ドナーを基にして21%(2本の合計29.9mg)の収量で得た。
組み換えフォトバクテリア由来アルファ2,6−シアリルトランスフェラーゼを用いて化合物(IX)をシアル化し、シアリルラクトース3糖体化合物(IX)を合成した。
2本のPCRチューブにそれぞれ、2−[2−(2−アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ−β−D−ラクトシド(化合物(V))48mg(0.101mmol)、CMPシアル酸2ナトリウム塩(ヤマサ醤油社製)64mgを、1.2mg/mLの子牛血清アルブミン(BSA) (キシダ化学社製)と20mMの塩化マンガン(キシダ化学社製)とを含む1Mの2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝液(pH6.3,0.5mL)に加え、溶かした。そこにアルカリフォスファターゼ(和光純薬社製)90U、アルファ2,6−シアリルトランスフェラーゼ200mUを加え、37℃でインキュベーションした。24時間インキュベーションした後、この反応混合物をODS(水、メタノール混合液)、およびBiogel P2カラムクロマトグラフィーで精製し、シアリルラクトース3糖体化合物(IX)を合成し、ドナーを基にして15%(2本の合計23.6mg)の収量で得た。
〔製造例1−1〕
トリエチレングリコールスペーサーを有するラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル(2.7μmolカルボキシル基/個))への導入(TGLac修飾モノリス型シリカゲルの合成)
1個当たり2.7μmol(1.2mmol/g)のカルボキシル基が修飾されたモノリス型シリカゲル(φ2.8×厚1mm、2.3mg、スルーポア:15〜20μm、メソポア:25〜30nm、細孔容積:0.8m3/t、ジーエルサイエンス社製)40個を、ディーンスターク管を用いてトルエン(和光純薬社製)中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧しトルエンを除去した。
2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理
製造例1−1で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルには未反応のカルボキシル基(遊離のカルボキシル基)が残っているため、2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理を行った。
未反応のカルボン酸をNHSで活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)104mg(0.54mmol)、及びNHS(和光純薬社製)62mg(0.54mmol)をDMF(和光純薬社製)0.252mLに溶解させた溶液に、ラクトース修飾モノリス型シリカゲルを20個加え、3回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを、2−アミノエタノール(和光純薬社製)が0.7mL入ったバイアル容器(容量1mL)に加え、3回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を300Wのマイクロ波(東京理化器械社製、MWO−1000)により80度(最大100度)で30分間加熱することにより、2−アミノエタノールによるエンドキャップを行った。加熱後、モノリス型シリカゲルをDMF、メタノールで洗浄し、さらに洗浄するためDMF(和光純薬社製)中で300Wのマイクロ波(東京理化器械社製、MWO−1000)により80度(最大100度)で30分間加熱した。加熱後、モノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、メタノール(和光純薬社製)で再度洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去することによって2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
トリエチレングリコールスペーサーを有するラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル(1.0μmolカルボキシル基/個))への導入(TGLac修飾モノリス型シリカゲルの合成)
製造例1−1と同様に、1個当たり1.0μmol(0.45mmol/g)のカルボン酸が修飾された多孔質モノリス型シリカゲル(φ2.8×厚1mm、2.2mg、スルーポア:15〜20μm、メソポア:25〜30nm、細孔容積:0.8m3/t、ジーエルサイエンス社製)40個を、ディーンスターク管を用いてトルエン(和光純薬社製)中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)201mg(1.05mmol)、NHS(和光純薬社製)124mg(1.08mmol)をDMF(和光純薬社製)0.505mLに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル40個を加えた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を3回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルを、DMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。
2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理
製造例2−1で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルには未反応のカルボキシル基(遊離のカルボキシル基)が残っているため、2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理を行った。
未反応のカルボン酸をNHSで活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)100mg(0.53mmol)、及びNHS(和光純薬社製)62mg(0.54mmol)をDMF(和光純薬社製)0.252mLに溶解させた溶液に、ラクトース修飾モノリス型シリカゲルを20個加え、3回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを、2−アミノエタノール(和光純薬社製)が4mL入ったバイアル容器(容量5mL)に加え、3回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を300Wのマイクロ波(東京理化器械社製、MWO−1000)により80度(最大100度)で30分間加熱することにより、2−アミノエタノールによるエンドキャップを行った。加熱後、モノリス型シリカゲルをDMF、メタノールで洗浄し、さらに洗浄するためDMF(和光純薬社製)中で300Wのマイクロ波(東京理化器械社製、MWO−1000)により80度(最大100度)で30分間加熱した。加熱後、モノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、メタノール(和光純薬社製)で再度洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去することによって2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
トリエチレングリコールスペーサーを有するアルファ2,3−シアリルラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル(1.0μmolカルボキシル基/個))への導入
1個当たり1.0μmol(0.45mmol/g)のカルボキシル基が修飾されたモノリス型シリカゲル(φ2.8×厚1mm、2.2mg、スルーポア:15〜20μm、メソポア:25〜30nm、細孔容積:0.8m3/t、ジーエルサイエンス社製)22個を、ディーンスターク管を用いてトルエン(和光純薬社製)中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧によりトルエンを除去した。
トリエチレングリコールスペーサーを有するアルファ2,6−シアリルラクトース誘導体のカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル(1.0μmolカルボキシル基/個))への導入
製造例3と同様に、1個当たり1.0μmol(0.45mmol/g)のカルボキシル基が修飾されたモノリス型シリカゲル(φ2.8×厚1mm、2.2mg、スルーポア:15〜20μm、メソポア:25〜30nm、細孔容積:0.8m3/t、ジーエルサイエンス社製)20個を、ディーンスターク管を用いてトルエン(和光純薬社製)中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
以下のスキーム4に従ってパラアミノフェニルラクトシド(pAPLac)を合成した。
パラアミノフェニル(pAP)スペーサーを介したラクトースのカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル(2.7μmolカルボキシル基/個))への導入(pAP修飾モノリス型シリカゲルの合成)(80℃で縮合させた場合)
製造例1−1と同様に、1個当たり2.7μmol(1.2mmol/g)のカルボン酸が修飾された多孔質モノリス型シリカゲル(φ2.8×厚1mm、2.3mg、スルーポア:15〜20μm、メソポア:25〜30nm、細孔容積:0.8m3/t、ジーエルサイエンス社製)50個を、ディーンスターク管を用いてトルエン(和光純薬社製)中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)259mg(1.35mmol)、NHS(和光純薬社製)155mg(1.35mmol)をDMF(和光純薬社製)0.63mLに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル50個を加えた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を3回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。
2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理
比較製造例1−1で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルには未反応のカルボキシル基(遊離のカルボキシル基)が残っているため、2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理を行った。
未反応のカルボン酸をNHSで活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)130mg(0.68mmol)、及びNHS(和光純薬社製)76mg(0.68mmol)をDMF(和光純薬社製)0.315mLに溶解させた溶液に、ラクトース修飾モノリス型シリカゲルを25個加え、3回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。活性エステル化されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを、2−アミノエタノール(和光純薬社製)が0.6mL入ったバイアル容器(容量5mL)に加え、3回、減圧脱気することによりモノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。減圧脱気した溶液を300Wのマイクロ波(東京理化器械社製、MWO−1000)により80度(最大100度)で30分間加熱することにより、2−アミノエタノールによるエンドキャップを行った。加熱後、モノリス型シリカゲルをDMF、メタノールで洗浄し、さらに洗浄するためDMF(和光純薬社製)中で300Wのマイクロ波(東京理化器械社製、MWO−1000)により80度(最大100度)で30分間加熱した。加熱後、モノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、メタノール(和光純薬社製)で再度洗浄した。このマイクロ波による加熱、洗浄操作をさらに一回繰り返した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩減圧することにより溶媒を除去し、2−アミノエタノールによるエンドキャップ処理が施されたラクトース修飾モノリス型シリカゲルを得た。
パラアミノフェニル(pAP)スペーサーを介したラクトースのカルボキシル基修飾モノリス型シリカゲル(2.7μmolカルボキシル基/個))への導入(pAP修飾モノリス型シリカゲルの合成)(160℃で縮合させた場合)
製造例1−1と同様に、1個当たり2.7μmol(1.2mmol/g)のカルボン酸が修飾された多孔質モノリス型シリカゲル(φ2.8×厚1mm、2.3mg、スルーポア:15〜20μm、メソポア:25〜30nm、細孔容積:0.8m3/t、ジーエルサイエンス社製)42個を、ディーンスターク管を用いてトルエン(和光純薬社製)中で加熱することにより脱水した。脱水後、減圧し、トルエンを除去した。
モノリス型シリカゲル表面上のカルボン酸を活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)82mg(0,428mmol)、NHS(和光純薬社製)52mg(0.449mmol)をDMF(和光純薬社製)0.257mLに溶かした溶液に、脱水および溶媒除去を行ったモノリス型シリカゲル42個を加えた。このモノリス型シリカゲルの入った溶液を3回、減圧脱気することにより、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。残っているカルボン酸をさらに活性エステル化するため、EDC(国産化学社製)82mg(428mmol)、NHS(和光純薬社製)52mg(449mmol)をDMF(和光純薬社製)0.257mLに溶かした溶液に、一度目の活性エステル化処理後のモノリス型シリカゲルを40個加えた。この溶液を3回、減圧脱気し、モノリス型シリカゲルに含まれる空気を除いた。そのまま室温で1晩放置し、NHSで活性エステル化されたモノリス型シリカゲルをDMF(和光純薬社製)、アセトン(和光純薬社製)で洗浄した。洗浄後のモノリス型シリカゲルを1晩、減圧し、溶媒を除去した。
モノリスに固定化した糖鎖の重量を測定するため、示差熱熱重量同時測定装置(TGDTA、EXSTAR6000、エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社製)を用いて重量減少率を測定した。
TG/DTA測定に用いたモノリスは50℃、14時間減圧下で乾燥させた。TG/DTA測定における昇温は、室温から130℃まで1分間あたり20度の速度で温度を上昇させた。130℃で5分間保った後、さらに130℃から800℃まで1分間あたり40℃の速度で温度を上昇させ、800℃で5分間保持した。
糖鎖が未修飾のカルボキシル基修飾モノリスを含め、それぞれのモノリスの重量減少率と、重量減少率から次の計算式に基づき計算したラクトースまたはラクトースと2−アミノエタノールの修飾量を以下の表1−2に示す。
修飾量(μg)={[ラクトース修飾モノリスの重量(mg)×[100(%)−130度までにおける重量減少率(%)]/100}×{[ラクトース修飾モノリスの重量減少率(%)−糖鎖未修飾モノリスの重量減少率(%)]/100}×1000
ラクトース誘導体の固定化量(nmol)=修飾量(μg)/(ラクトース誘導体の分子量−水の分子量)×1000
ラクトース修飾モノリスはカルボキシル基修飾モノリスにラクトースを修飾したものであり、その修飾量は糖鎖未修飾のカルボキシル基修飾モノリスの重量減少を引いた値になる。
SPRセンサーによる糖結合性タンパク質の検出
1)ラクトース固定化センサーチップの作成
Biacore社より市販されているSIA kit Auの金基板を、63μmol/Lのラクトシル−セラミドのチオオクト酸誘導体のメタノール(和光純薬社製)溶液2mLに、室温で24時間浸漬した。その後、メタノール、水の順で3回洗浄することにより、ラクトース固定化センサーチップを作成した。得られたセンサーチップは、自己組織化により高密度にラクトースが固定化されている。糖結合性タンパク質であるリシンと、センサーチップに高密度に固定化されたラクトースとの高い親和性を利用して、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いてリシンを高感度に検出、定量できる。
得られたラクトース固定化センサーチップを、市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore3000またはT−100、Biacore社製)に装着して、設定温度25℃、流速10μL/minでHEPES(10mM、pH:7.5、NaCl:0.15M)緩衝液を流した。計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。糖結合性タンパク質はリシン120(Ricinus communis agglutinin120、Vector社製)を用い、HEPES(10mM、pH:7.5、NaCl:0.15M)緩衝液で調製した。該HEPES緩衝液で1μg/mL(8.3 nM)に調製したリシン120溶液を、流速10μL/minで50μLインジェクトした。その結果、図2に示すように、リシン120の検出強度は実施例1で697RUであった。なお、「RU」は「Resonance unit」の略で、基板表面に物質が吸着、付着、固定化されると、その量に応じて値が増大することを意味する。Biacore社によると、1RU=約1pg/mm2である。
製造例1−1、1−2および比較製造例1−1、1−2で調製した、4種類のラクトース修飾モノリス型シリカゲルをエッペンドルフのチップ先に熱で融着させることにより取り付けた。HEPES(10mM、pH:7.5、NaCl:0.15M)緩衝液で調製した各濃度のリシン120(Ricinus communis agglutinin 120、Vector製)100μg/mL・100μL、10μg/mL・100 μL、1μg/mL・200μLを、それぞれトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル(未エンドキャッピング)を取り付けたエッペンドルフのチップへ入れ、吐出、吸引を10往復繰り返してモノリス型シリカゲルにリシン120を吸着させた。それらの溶液を100μg/mLの濃度では該HEPES緩衝液で100倍(10×10)に希釈し、10μg/mLの濃度では該HEPES緩衝液で10倍に希釈した。この希釈操作により、モノリス型シリカゲルにリシン120が全く吸着していない場合のリシン120の濃度は1μg/mLになる。なお1μg/mLの濃度ではモノリス型シリカゲルを通した溶液をそのまま使用した。
その結果、図3に示すように、エンドキャップ処理が施された該ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通した溶液(100μg/mLの濃度では100倍(10×10)に希釈、10μg/mLの濃度では10倍に希釈、1μg/mLでは希釈なし)のセンサーグラムの強度は、100μg/mLでは154RU、10μg/mLでは190RU、1μg/mLでは500RUであった。モノリス型シリカゲルに通していない溶液(1μg/mL)のリシン120のセンサーグラムの検出強度903RUとの差がモノリス型シリカゲルに吸着された量である。
また同様の手順で、比較製造例1−1で調製した、pAPスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲルによるリシン120の吸着能を評価した。
表面プラズモン共鳴(SPR)によるリシン60の吸着能の評価
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いたリシン120の吸着能の評価と同様の手順で、製造例1−1で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルのリシン60(Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン社製)の吸着能を評価した。
Bradford法を用いたラクトース修飾モノリス型シリカゲルのリシン60除染能の定量的評価
製造例1−1、1−2、及び比較製造例1−1、1−2で調製したラクトース修飾モノリス型シリカゲルをエッペンドルフのチップにそれぞれ取り付け、超純水(MilliQ水)または500mMの塩化ナトリウム水溶液で調製したリシン60溶液(150μg/mL、100μL)による吐出、吸引を10往復繰り返すことにより、該モノリス型シリカゲルにリシン60溶液を通した。
ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されたリシン60の溶出実験
ラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されたリシン60が、モノリス型シリカゲル表面上のラクトースと結合して吸着されているのかを調べるため、下記の手順でラクトース修飾モノリス型シリカゲルに吸着されたリシン60の溶出実験を行った。
なお、50mMのラクトース水溶液50μLをBradford試薬に加え、その595nmの吸光度が有意に変化しないことから、50mMのラクトース水溶液が、本測定に影響しないことを確認した。
Bradford法を用いたBSA(Bovine Serum Albumin)の吸着評価
製造例2−1で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、製造例2−2で調製したエンドキャップ処理を施したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、および未修飾のカルボン酸モノリス型シリカゲル(未エンドキャッピング、1個当たり1.0μmolカルボン酸修飾)のそれぞれを取り付けたエッペンドルフのチップに、実施例3−1と同様、超純水(MilliQ水)または500mMの塩化ナトリウム水溶液で調整したBSA(150μg/mL、100μL)をそれぞれ入れ、吐出、吸引を10往復繰り返した。
Bradford法を用いたN−アセチルグルコサミン、N−アセチルノイラミン酸結合性タンパク質WGA(Wheat germ agglutinin、小麦胚芽レクチン)の吸着評価
製造例2−1で調製したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、製造例2−2で調製したエンドキャップ処理を施したトリエチレングリコールスペーサーのラクトース修飾モノリス型シリカゲル、および未修飾のカルボン酸モノリス型シリカゲル(未エンドキャッピング、1個当たり1.0μmolカルボン酸修飾)のそれぞれを取り付けたエッペンドルフのチップに実施例3−1、実施例4−1と同様、超純水(MilliQ水)または500mMの塩化ナトリウム水溶液で調製したWGA(150μg/mL、100μL)をそれぞれ入れ、吐出、吸引を10往復繰り返した。
SPRセンサーによる糖結合性タンパク質の検出
1)アルファ2,3−シアリルラクトース及びアルファ2,6−シアリルラクトース固定化センサーチップの作成
特開2006−347908号公報に記載されているアルファ2,3−シアリル−N−アセチルラクトサミニド及びアルファ2,6−シアリル−N−アセチルラクトサミニドのチオオクト酸誘導体の合成方法と同様に、N−ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)で活性化したチオオクト酸と、アルファ2,3−シアリルラクトース又はアルファ2,6−シアリルラクトースとを、DMF中で反応させることにより、アルファ2,3−シアリルラクトース及びアルファ2,6−シアリルラクトースのチオオクト酸誘導体を合成した。
製造例3、4で調製した、2種類のシアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルをエッペンドルフのチップ先に熱で融着させることにより取り付けた。
HEPES(10mM、pH:7.5、NaCl:0.15M)緩衝液で調製した各濃度のヘマグルチニン100μg/mL・100μL、10μg/mL・100 μL、1μg/mL・100μLをそれぞれシアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルを取り付けたエッペンドルフのチップへ入れ、吐出、吸引を10往復繰り返してシアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルにヘマグルチニンを吸着させた。それらの溶液を100μg/mLの濃度では該HEPES緩衝液で100倍(10×10)に希釈し、10μg/mLの濃度では該HEPES緩衝液で10倍に希釈した。この希釈操作により、モノリス型シリカゲルにヘマグルチニンが全く吸着していない場合のインフルエンザのヘマグルチニンの濃度は1μg/mLになる。なお1μg/mLの濃度ではモノリス型シリカゲルを通した溶液をそのまま使用した。
アルファ2,3−シアリルラクトース固定化センサーチップを市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore3000、Biacore社製)に装着後、設定温度25℃、流速10μL/minでHEPES緩衝液(10mM、pH:7.5、NaCl:0.15M)を流して、計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。製造例3で調製したアルファ2,3−シアリルラクトース修飾モノリス型シリカゲルに通し、さらに希釈した液(100μg/mLの濃度では100倍(10×10)に希釈、10μg/mLの濃度では10倍に希釈)、または1μg/mLの濃度では通した液を、この表面プラズモン共鳴バイオセンサーにそれぞれ50μL(5分間)打ち込み、センサーグラムを測定した。また比較のためモノリス型シリカゲルに通していない1μg/mLの濃度のヘマグルチニンのHEPES緩衝液(10mM、pH:7.5、NaCl:0.15M)50μL(5分間)を標準として打ち込み、センサーグラムを測定した。
Claims (18)
- 下記一般式(1):
で表されるラクトース誘導体を含む無機系多孔質体であって、
該ラクトース誘導体の末端アミノ基にアミド結合するカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が1g当たり0.25mmol以上、表面又は細孔内面に結合し、かつ該ラクトース誘導体が1g当たり0.005mmol以上結合した該無機系多孔質体を流路の少なくとも一部に充填する工程、
該ラクトース誘導体と特異的に結合する毒素またはウィルスを含む汚染液を、該無機系多孔質体が充填された流路に流下させる工程を含み、
該汚染液中の毒素またはウィルスを該無機系多孔質体のラクトース誘導体に固定することにより該汚染液から固相抽出および除去する、汚染液の毒素またはウィルスの固相抽出方法および無毒化方法。 - 前記R2および前記R3が水素原子である、請求項1に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記R2がシアル酸残基であり、前記R3が水素原子である、請求項1に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記R2が水素原子であり、前記R3がシアル酸残基である、請求項1に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記毒素がリシン60である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、請求項1〜6のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記無機系多孔質体が、3次元網目状に連続した孔径0.5〜500μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径0〜400nmの細孔とを有し、骨格径が500nm以上のモノリス型シリカゲルである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 前記汚染液が、使用済み洗浄液である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の固相抽出方法および無毒化方法。
- 下記一般式(1):
で表されるラクトース誘導体の末端アミノ基とアミド結合したカルボキシル基を含め、総カルボキシル基が表面又は細孔内面に1g当たり少なくとも0.25mmol以上結合し、かつ該ラクトース誘導体が1g当たり0.005mmol以上結合した無機系多孔質体を含む、毒素またはウィルス含有汚染液用の固相抽出用捕集剤および除染剤。 - 前記R2および前記R3が水素原子である、請求項10に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記R2がシアル酸残基であり、前記R3が水素原子である、請求項10に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記R2が水素原子であり、前記R3がシアル酸残基である、請求項10に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記毒素がリシン60である、請求項10〜13のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記ウィルスがサーズウィルス、またはインフルエンザウィルスである、請求項10〜13のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記ラクトース誘導体のアミノ基とアミド結合していない前記無機系多孔質体上の遊離のカルボキシル基がエンドキャップ処理された、請求項10〜15のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記無機系多孔質体が、3次元網目状に連続した孔径0.5〜500μmの貫通孔と、無機系多孔質体の表面および該貫通孔の内壁面に形成された孔径0〜400nmの細孔とを有し、骨格径が500nm以上のモノリス型シリカゲルである、請求項10〜16のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
- 前記汚染液が、使用済み洗浄液である、請求項10〜17のいずれか一項に記載の固相抽出用捕集剤および除染剤。
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