JP5386208B2 - フジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、フジツボ類キプリス幼生の生理活性の判定方法に関する。

水中の岩やコンクリート壁などの基盤に固着または付着している生物は、付着生物（汚損生物と呼ばれる場合もある。）と呼ばれ、例えば、甲殻綱、まん脚亜綱に属する節足動物であるフジツボ類は代表的な海産付着生物である。

フジツボ類は、内湾性の種から外洋性の種まで多くの種からなり、海域の環境条件や基盤によって種特有の生息場所を持つことが知られている。

フジツボ類の生活史のうち、繁殖に関わるステージの概略は、以下のとおりである。すなわち、付着成体間で交尾し受精後、浮遊期であるノープリウス幼生を孵出し、このノープリウス幼生が脱皮を繰り返した後、付着期であるキプリス幼生（付着期幼生）となり、さらにキプリス幼生が基盤に付着し、幼フジツボヘと変態する。この繁殖時期は、各種に特有のものである。

因みにキプリス幼生は、図１に示すように、左右に側扁した紡錘形の透明の甲皮（殻）１をもった幼生であり、腹面前方には一対の第１触角２、腹面後半部には６対の胸肢３が甲皮１の内部から伸びている。

第１触角２は、付着のために先端が吸盤状となった器官であり、セメント腺４からセメント管５を経て分泌される接着物質（キノン架橋結合蛋白質）は付着器官の表面に分泌されて基盤と固着する。なお、キプリス幼生は、基盤への接近と離脱を繰り返しながら基盤との適性を調べ、その間、離脱可能な一時付着をした後、最終的に決定された定着地点に永久固着する。なお、図中の符号６は油細胞、７は複眼、８は胸部を示している（例えば、特許文献１参照）。

このようなフジツボ類が、様々な海洋構造物や船底、発電所などの海水取水施設の熱交換器や復水器などの配水管内に大量に付着することにより、流体抵抗増加、船速低下・燃費増大、取水ポンプ負荷の増大、冷却効率低下、細管閉塞等の様々な被害を及ぼす場合がある。

キプリス幼生の基盤への一時付着の際にその付着を妨げ、その後の固着を防除することができればこのような被害を縮小することができると考えられる。そのための効率的な駆除剤候補物質のスクリーニングには、キプリス幼生の生理活性および付着活性を判定する簡便な方法が不可欠である。

特開２００４−１２４６７号公報

これまで、フジツボ類のキプリス幼生の生理活性を判定するには、一個体ずつ光学顕微鏡下で観察し、動きの有無によって生死の判別を行う必要があった。そのため、この方法では、個体数が多い場合に時間がかかった。

そこで、本発明は、効率よくキプリス幼生の生理活性を判定するための生理活性判定方法を提供することを目的としてなされた。

フジツボ類のキプリス幼生は４００〜４４０ｎｍの励起光照射した際に種固有の自家蛍光分布パターンを示す（特開２００４−１２４６７）。本願の発明者らは、フジツボ類キプリス幼生期幼生の自家発光の蛍光分布パターンが、その幼生の生理活性および付着活性を反映して変化すること、すなわち、幼生が正常な時に認められる蛍光顆粒が、幼生が弱ると分散し、死亡すると消失する、というパターンを示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係る生理活性測定方法は、フジツボ類キプリス幼生に対して励起光を照射する工程と、照射された前記キプリス幼生が発光する蛍光分布パターンを検出する工程と、を含むことを特徴とする。

ここで、前記蛍光分布パターンを検出する工程が、生理活性判定対象のフジツボ類キプリス幼生個体が発光する発光分布パターンを、同種フジツボキプリス幼生の指標個体が発光する蛍光分布パターンと比較することを含むことが好ましい。

さらに、前記励起光の波長が４００〜４４０ｎｍであり、照射された前記キプリス幼生が発光する蛍光の吸収波長が４７５ｎｍ以上であることが好ましい。

前記フジツボ類が、タテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、およびヨーロッパフジツボから成る群から選ばれることが好ましい。

また、本発明に係る生理活性測定法は、照射された前記キプリス幼生が発光する蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに取り込み、この情報をコンピュータにあらかじめ登録しておいた蛍光分布パターン認識情報と比較することにより、前記フジツボ類キプリス幼生の生理活性を判定することが好ましい。

本発明に係るフジツボ類キプリス幼生の駆除剤候補物質のスクリーニング方法は、駆除剤候補物質で前記フジツボ類キプリス幼生を処理し、本発明に係る上記いずれかの「生理活性測定方法」によりフジツボ類キプリス幼生の生理活性を判定することを特徴とする。

本発明により、効率よくフジツボ類キプリス幼生の生理活性を判定するための生理活性判定方法を提供することができる。

フジツボ類のキプリス幼生の器官の配置を説明する側面図である。 本発明の一実施形態であるタテジマフジツボの蛍光顆粒分布を示す図である。 本発明の一実施形態であるシロスジフジツボの蛍光顆粒分布を示す図である。

以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝フジツボ類付着幼生の生理活性測定方法＝＝
本発明に係る「生理活性判定方法」は、フジツボ類キプリス幼生に対して励起光を照射する工程と、照射された前記キプリス幼生が発光する蛍光分布パターンを検出する工程とを含む。ここで、「生理活性」とはフジツボ類の健康状態のレベルのことであり、例えば、フジツボ類が弱ると生理活性が低下し、フジツボ類が死ぬと生理活性は無くなる。したがって、生理活性をフジツボ類が健康であるか否か、あるいは生理的に正常であるか否かを示す指標に用いることができる。

本発明で生理活性判定の対象となる「フジツボ類」は、甲殻類(Crustacea)まん脚亜綱(Cirripadia)完胸目(Thoracica)に分類される動物であって、上記の蛍光分布パターンを得ることができる範囲で特に制限されないが、タテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、およびヨーロッパフジツボ等、フジツボ型亜目（Balanomorpha）に属する動物であることが好ましい。

生理活性判定に用いるこれらのフジツボ類キプリス幼生は、人工飼育個体であっても、プランクトンネットや海水ポンプ等で得られた天然の個体であっても、特に制限はない。

この蛍光照射およびフジツボ類キプリス幼生の発光する蛍光画像取得のための装置は、上記の励起波長の蛍光を発し、取得するための光源ランプやフィルタを備えていれば特に制限はなく、例えば落射蛍光実態顕微鏡をはじめとする各種蛍光顕微鏡を用いることができる。具体的には、フジツボ類付着性幼生の入った海水を満たしたガラス容器内に所定波長の励起光を照射し、所定の吸収フィルタを介して落射蛍光実態顕微鏡に取り付けたクールドCCDカメラなどで撮影すればよい。

本発明の判定方法において用いる励起波長は、３３０〜４９０ｎｍであることが好ましいが、特に、３３０〜３８５ｎｍ、４００〜４４０ｎｍ、あるいは、４６０〜４９０ｎｍのいずれかであって、これらの場合、発光する蛍光のうちそれぞれ３８５ｎｍ以上、４７５ｎｍ以上、５１０ｎｍ以上の波長を選択的に観察することがより好ましい。これにより、フジツボ類以外の生物が発光する蛍光はほとんどなく、フジツボ類付着性幼生の発する蛍光のみを明瞭に区別することができる。

キプリス幼生の正常個体の「蛍光分布パターン」はフジツボの種によって異なるため、このパターンで種判別できる（特願２００３−２９４０１３）。本発明の生理活性判定方法では、生理活性判定対象とするフジツボ類キプリス幼生個体（以下、判定対象個体と称する）の蛍光分布パターンを、同種のフジツボ付着幼生の指標個体の蛍光分布パターンと比較することによって、判定対象個体の生理活性を判定する。ここで「指標個体」は、生理活性判定対象の個体と同一個体であっても異なる個体であってもよく、正常個体であっても、薬物処理等によって生理活性の低下したことが判明している個体であってもよい。また、指標個体が一個体であっても複数個体であってもよい。指標個体の蛍光分布パターンは、予め調べられ、写真やコンピュータなどに記録されたものであっても、判定対象個体と同時に調べられたものであってもよい。

指標個体と判定対象個体の蛍光分布パターンの比較は、当業者が目視することによって行ってもよいが、客観的に評価される基準によって主観的な誤差なく判定を行うため、比較結果から判定を下す際の指標が作成されていることが好ましい。例えば、あらかじめ取得した一つあるいは複数の蛍光画像からパターンを割り出し、蛍光分布パターンチャート等を作成してもよい。

さらに好ましい「蛍光分布パターン」の比較のため、上記CCDカメラ等で撮影された蛍光画像を、コンピュータを用いて画像解析し、これを自動的に識別してもよい。その際には、フジツボ類キプリス幼生が発光する蛍光パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに取り込み、この情報をコンピュータにあらかじめ登録しておいた蛍光分布パターンと比較することにより行ってもよい。この場合、例えば、米国立衛生研究所製 NIH Image、三谷商事社製 Mac ScopeまたはWin ROOF 等の汎用の画像解析ソフトウェアを利用できる。

判定対象個体の蛍光分布パターンを、指標個体の蛍光分布パターンと比較した結果、「指標個体」が正常個体の場合には、判定対象個体の蛍光分布パターンがその指標個体の蛍光分布パターンと同様のパターンであれば正常と判定され、異なるパターンであれば生理活性が低下していると判定される。一方で、「指標個体」が生理活性の低下した個体である場合には、判定対象個体の蛍光分布パターンがその指標個体の蛍光分布パターンと同様のパターンであれば生理活性が低下していると判定され、異なるパターンであれば、そのパターンによって、正常であるか、さらに生理活性が低下しているかのどちらかであると判定される。

＝＝フジツボ類キプリス幼生の駆除剤候補物質のスクリーニング方法＝＝
このようなフジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法を用いて、フジツボ類キプリス幼生の駆除剤候補物質をスクリーニングし、駆除剤を特定することができる。

まず、フジツボ類キプリス幼生を駆除剤候補物質で処理し、その後生理活性を判定し、生理活性が低下するような物質を選択することによって、駆除剤を特定することができる。処理から判定までの時間は正確に判定が行える範囲で制限はないが、２４時間以上が好ましく、４８時間以上がさらに好ましい。

本実施例では、フジツボキプリス幼生の硫酸銅への暴露による幼生の生理活性の低下によって、蛍光分布パターンが変化することを示す。

[試験生物]
人工飼育タテジマフジツボ、あるいは、シロスジフジツボから孵出したノープリウス幼生を回収し、１Ｌビーカー内海水中（約２３℃）でキプリス幼生まで飼育した。このキプリス幼生を６．５℃のろ過海水内でさらに数日維持した。

[薬剤暴露実験]
６穴プレートに５０ｐｐｍ硫酸銅添加ろ過海水を入れ、上記各種のフジツボキプリス幼生を投入し、８時間薬剤暴露処理を行った。このキプリス幼生をろ過海水で数回洗浄した後、ろ過海水を入れた２４穴プレートの各穴に一個体ずつを収容し、幼生の変態および蛍光顆粒の分布の変化を落射蛍光実態顕微鏡下で観察した。対照群として、未処理の各フジツボキプリス幼生を同様にろ過海水中で飼育し、観察した。励起波長は４００〜４４０ｎｍ、吸収波長は４７５ｎｍ以上を用いた。なお、硫酸銅は従来からフジツボ類防除剤として用いられている（特開２００３−１４６８１１）。

図２Ａおよび、図３Ａに示すように、処理前のタテジマフジツボおよびシロスジフジツボの付着性幼生蛍光分布は各種に特異的なパターンを示していた（特願２００３−２９４０１３）。タテジマフジツボでは頭部および後部において蛍光顆粒が斑点状に分布する。一方シロスジフジツボでは幼生体部前縁および後縁において蛍光顆粒が縁取り状に分布する。

図２ＥおよびＦに示すように、暴露処理後のタテジマフジツボキプリス幼生の蛍光顆粒は未処理（図２Ｄ）と比較し幼生の体の中央側へ分散していた。このように蛍光顆粒が分散した暴露処理後の幼生は、その後正常に変態することなく死亡した。一方対照群のタテジマフジツボキプリス幼生は、観察を始めて２４時間後（図２Ｂ）および４８時間後（図１Ｃ）にも蛍光顆粒の分布に変化がなく、その後正常な付着性幼フジツボに変態した。

シロスジフジツボキプリス幼生においては、暴露処理群では処理直後の蛍光顆粒分布に変化はないものの（図３Ｃ）、処理後４８時間までに蛍光顆粒が幼生の体の中央側へ分散した（図３Ｄ）。一方対照群の幼生においては、４８時間後にも蛍光顆粒の分布は変化せず、正常に発生を続けた（図３Ｂ）。

このように、硫酸銅への暴露によるフジツボ類キプリス幼生の生理活性および付着活性の低下と、蛍光顆粒の分散は相関する。この蛍光顆粒の分散は類似のパターンを再現よく示し、正常に発生中の付着性幼生蛍光分布は各種に特異的なパターンを示すことから、フジツボ類キプリス幼生の生理活性の簡易指標として用いることができる。

１ 甲皮
２ 第一触角
３ 胸肢
４ セメント腺
５ セメント管
６ 油細胞
７ 複眼
８ 胸部

Claims (6)

1. フジツボ類キプリス幼生に対して励起光を照射する工程と、
   照射された前記キプリス幼生が発光する自家蛍光分布パターンを検出する工程と、
   前記照射されたキプリス幼生が発光する自家蛍光分布パターンが、前記キプリス幼生の種に特異的な自家蛍光分布パターンと異なるパターンであるかどうかを判断する工程と、
   を含むフジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法。
2. フジツボ類キプリス幼生に対して励起光を照射する工程と、
   照射された前記キプリス幼生が発光する自家蛍光分布パターンを検出する工程と、
   前記照射されたキプリス幼生が発光する自家蛍光分布パターンが、前記幼生の体から消失しているか否かを判断する工程と、
   を含むフジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法。
3. 前記励起光の波長が３３０〜３８５ｎｍ、４００〜４４０ｎｍ、あるいは、４６０〜４９０ｎｍであり、照射された前記キプリス幼生が発光する蛍光の吸収波長がそれぞれ４２０ｎｍ以上、４７５ｎｍ以上、５１０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のフジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法。
4. 前記フジツボ類が、タテジマフジツボ、アメリカフジツボ、アカフジツボ、サンカクフジツボ、オオアカフジツボ、サラサフジツボ、イワフジツボ、シロスジフジツボ、およびヨーロッパフジツボから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のフジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法。
5. 照射された前記キプリス幼生が発光する蛍光分布パターンをデジタル画像情報としてコンピュータに取り込み、この情報をコンピュータにあらかじめ登録しておいた蛍光分布パターン認識情報と比較することにより、前記フジツボ類の生理活性を判定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のフジツボ類キプリス幼生の生理活性判定方法。
6. フジツボ類キプリス幼生の駆除剤候補物質のスクリーニング方法であって、
   前記駆除剤候補物質で前記フジツボ類キプリス幼生を処理し、請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって前記フジツボ類キプリス幼生の生理活性を判定することを特徴とする方法。