JP5385561B2 - Method for producing sugar - Google Patents
Method for producing sugar Download PDFInfo
- Publication number
- JP5385561B2 JP5385561B2 JP2008207290A JP2008207290A JP5385561B2 JP 5385561 B2 JP5385561 B2 JP 5385561B2 JP 2008207290 A JP2008207290 A JP 2008207290A JP 2008207290 A JP2008207290 A JP 2008207290A JP 5385561 B2 JP5385561 B2 JP 5385561B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellulose
- raw material
- crystallinity
- containing raw
- sugar
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y02E50/17—
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は、糖の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing sugar.
パルプ等のセルロース含有原料を粉砕して得られるセルロースは、セルロースエーテルの原料、化粧品、食品、バイオマス材料等の工業原料に用いられる。特に近年、環境問題への取り組み等からバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法等でエタノールや乳酸等へ変換する試みがなされている(例えば、特許文献1)。セルラーゼ等の酵素を利用してバイオマスから糖を製造する際には、その前処理工程としてセルロース結晶構造が非晶化されたセルロースにすることが有用である。例えば、特許文献1には、塩化リチウム/ジメチルアセトアミド等のセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化させることが開示されている。
また、パルプを粉砕機で機械的に処理して、セルロースの結晶化度を低減する方法が知られている(例えば、特許文献2〜5参照)。
特許文献2の実施例1及び4には、シート状パルプを振動ボールミル又は二軸押出機で処理する方法が開示され、特許文献3の実施例1〜3には、パルプをボールミルで処理する方法が開示され、特許文献4の実施例1及び2には、パルプを加水分解等の化学的処理をして得られたセルロース粉体を、ボールミルさらには気流式粉砕機で処理する方法が開示され、特許文献5には、パルプを水に分散させた状態で振動ボールミル等の媒体ミルで処理する方法が開示されている。
しかし、これらの方法は、セルロースの結晶化度を低減させるにあたり効率性及び生産性が満足できるものではない。
Cellulose obtained by pulverizing cellulose-containing raw materials such as pulp is used as industrial raw materials such as cellulose ether raw materials, cosmetics, foods, and biomass materials. In recent years, in particular, attempts have been made to produce sugar from biomass materials and to convert it into ethanol, lactic acid, or the like by a fermentation method or the like from efforts to address environmental problems (for example, Patent Document 1). When sugar is produced from biomass using an enzyme such as cellulase, it is useful to use cellulose having an amorphous cellulose crystal structure as a pretreatment step. For example, Patent Document 1 discloses that cellulose is made amorphous by using a cellulose solvent such as lithium chloride / dimethylacetamide.
Moreover, the method of processing a pulp mechanically with a grinder and reducing the crystallinity degree of a cellulose is known (for example, refer patent documents 2-5).
Examples 1 and 4 of Patent Document 2 disclose a method of treating sheet-like pulp with a vibrating ball mill or a twin screw extruder, and Examples 1 to 3 of Patent Document 3 disclose a method of treating pulp with a ball mill. Examples 1 and 2 of Patent Document 4 disclose a method of treating cellulose powder obtained by chemical treatment such as hydrolysis of pulp with a ball mill or an airflow type pulverizer. Patent Document 5 discloses a method of treating a pulp with a medium mill such as a vibrating ball mill in a state where the pulp is dispersed in water.
However, these methods are not satisfactory in efficiency and productivity in reducing the crystallinity of cellulose.
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いる方法(特許文献6)、過酸化水素を用いて熱水処理したセルロース又はヘミセルロースを酵素処理する方法(特許文献7及び8)が知られている。
しかし、これらの方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。
On the other hand, as a saccharification method of cellulose, there are known a method using a specific cellulase (Patent Document 6) and a method of hydrolyzing cellulose or hemicellulose treated with hydrogen peroxide (Patent Documents 7 and 8). Yes.
However, these methods are not satisfactory in terms of saccharification efficiency and productivity.
本発明は、セルロース含有原料からセルロースI型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを基質としてセルラーゼ等の酵素反応を行うことで、糖を効率的に得ることができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。 In the present invention, sugar can be efficiently obtained by performing an enzymatic reaction such as cellulase using a cellulose-containing raw material as a substrate and a non-crystallized cellulose having a reduced degree of crystallinity of cellulose I, and has excellent productivity. It aims at providing the manufacturing method of sugar.
本発明者らは、特定のセルロース含有原料を出発原料として、ロッドを充填した振動ミルで前処理(非晶化)を行った後にセルラーゼの等の酵素反応を行うことにより、前記課題を解決できることを見出した。
すなわち本発明は、下記計算式(1)で示されるセルロースI型結晶化度が33%を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロースの含有量が20質量%以上であり、かつ該セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースI型結晶化度を33%以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び/又はヘミセルラーゼを作用させ糖化する、糖の製造方法である。
セルロースI型結晶化度(%)=〔(I22.6−I18.5)/I22.6〕×100 (1)
〔I22.6は、X線回折における格子面(002面)(回折角2θ=22.6°)の回折強度、I18.5は、アモルファス部(回折角2θ=18.5°)の回折強度を示す〕
The present inventors can solve the above-mentioned problems by carrying out an enzyme reaction such as cellulase after performing a pretreatment (amorphization) with a vibration mill filled with a rod using a specific cellulose-containing material as a starting material. I found.
That is, the present invention is a method for saccharifying amorphous cellulose prepared from a cellulose-containing raw material having a cellulose I-type crystallinity of more than 33% represented by the following formula (1), wherein water is removed from the raw material. The cellulose content in the remaining components was 20% by mass or more, and the cellulose-containing raw material was treated with a vibration mill filled with a rod to reduce the cellulose I-type crystallinity to 33% or less. This is a method for producing sugar, in which after the crystallized cellulose is prepared, cellulase and / or hemicellulase is allowed to act on the amorphous cellulose.
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the grating plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). ]
本発明の糖の製造方法は、その前処理においてセルロース含有原料からセルロースI型結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率良く得ることができるので、酵素の反応により糖を効率よく生産することができる。 The sugar production method of the present invention can efficiently produce non-crystallized cellulose having a reduced cellulose I-type crystallinity from the cellulose-containing raw material in the pretreatment, so that the sugar is efficiently produced by enzymatic reaction. be able to.
本発明は、下記計算式(1)で示されるセルロースI型結晶化度が33%を超えるセルロース含有原料から調製した非晶化セルロースを糖化する方法であって、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロースの含有量が20質量%以上であり、かつ該セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、該セルロースI型結晶化度を33%以下に低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び/又はヘミセルラーゼを作用させ、糖化することを特徴とする糖の製造方法である。
セルロースI型結晶化度(%)=〔(I22.6−I18.5)/I22.6〕×100 (1)
〔I22.6は、X線回折における格子面(002面)(回折角2θ=22.6°)の回折強度、I18.5は、アモルファス部(回折角2θ=18.5°)の回折強度を示す〕
以下、本発明を詳細に説明するが、本明細書において、セルロースI型結晶化度を単に「結晶化度」ということがある。
The present invention is a method for saccharifying non-crystalline cellulose prepared from a cellulose-containing raw material having a cellulose I-type crystallinity of more than 33% represented by the following calculation formula (1), wherein the residue obtained by removing water from the raw material The amorphous content in which the cellulose content is 20% by mass or more and the cellulose-containing raw material is treated with a vibration mill filled with a rod to reduce the cellulose I-type crystallinity to 33% or less. This is a method for producing sugar, characterized in that cellulase and / or hemicellulase is allowed to act on the non-crystalline cellulose after preparing the cellulose.
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the grating plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). ]
Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the present specification, cellulose I type crystallinity may be simply referred to as “crystallinity”.
〔セルロース含有原料〕
本発明に用いられるセルロース含有原料は、該原料から水を除いた残余の成分中のセルロース含有量が20質量%以上、好ましくは40質量%以上、より好ましくは60質量%以上のものである。
本発明に用いられるセルロース含有量とはセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
前記セルロース含有原料には特に制限はなく、各種木材チップ、剪定枝材、間伐材、枝木材等の木材類;木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプ等のパルプ類;新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙等の紙類;稲わら、とうもろこし茎等の植物茎・葉類;籾殻、パーム殻、ココナッツ殻等の植物殻類等が挙げられる。これらの中では、パルプ類、紙類、植物殻類、及び木材類が好ましく、パルプ類や紙類がより好ましい。
市販のパルプの場合、水を除いた残余の成分中のセルロース含有量は、一般には75〜99重量%であり、他の成分はリグニン等を含む。また、市販のシート状パルプのセルロースI型結晶化度は、通常60%以上である。
セルロース含有原料中の水分含量は、20質量%以下が好ましく、15質量%以下がより好ましく、10質量%以下が特に好ましい。セルロース含有原料中の水分含量が20質量%以下であれば、容易に粉砕できるとともに、後述する粉砕処理により結晶化度を容易に低下させることができ、その後の糖の生産を効率よく行うことができる。
[Cellulose-containing raw material]
The cellulose-containing raw material used in the present invention has a cellulose content in the remaining components excluding water from the raw material of 20% by mass or more, preferably 40% by mass or more, more preferably 60% by mass or more.
The cellulose content used in the present invention means the total amount of cellulose and hemicellulose.
There is no restriction | limiting in particular in the said cellulose-containing raw material, Various wood chips, pruned branch materials, thinning materials, branch wood, etc .; Wood pulp manufactured from wood, Cotton linter pulp obtained from the fiber around cotton seeds Pulps such as newspapers, corrugated cardboard, magazines, fine paper, etc .; plant stems and leaves such as rice straw and corn stalks; plant shells such as rice husks, palm husks and coconut husks. Among these, pulps, papers, plant shells, and woods are preferable, and pulps and papers are more preferable.
In the case of commercially available pulp, the cellulose content in the remaining components excluding water is generally 75 to 99% by weight, and other components include lignin and the like. Moreover, the cellulose I type crystallinity degree of a commercially available sheet-like pulp is 60% or more normally.
The water content in the cellulose-containing raw material is preferably 20% by mass or less, more preferably 15% by mass or less, and particularly preferably 10% by mass or less. If the water content in the cellulose-containing raw material is 20% by mass or less, it can be easily pulverized, and the crystallinity can be easily reduced by the pulverization process described later, and the subsequent sugar production can be efficiently performed. it can.
〔セルロースI型結晶化度〕
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースI型結晶化度を33%以下に低下させたものである。セルロースI型結晶化度は、X線回折法による回折強度値からSegal法により算出したもので、下記計算式(1)により定義される。
セルロースI型結晶化度(%)=〔(I22.6−I18.5)/I22.6〕×100 (1)
〔I22.6は、X線回折における格子面(002面)(回折角2θ=22.6°)の回折強度、I18.5は、アモルファス部(回折角2θ=18.5°)の回折強度を示す〕
結晶化度が33%以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、例えば、セルロースエーテルの製造において、アルカリを加えた際にアルカリセルロース化が容易に進行し、結果としてセルロースエーテル化反応の反応転化率を向上させることができる。この観点から、結晶化度としては、20%以下が好ましく、10%以下がより好ましく、分析でセルロースI型結晶が検出されない0%が特に好ましい。なお、計算式(1)で定義されたセルロースI型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースI型結晶化度は0%とする。
ここで、セルロースI型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースI型とは、天然セルロースの結晶形のことである。セルロースI型結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が大きいほど、セルロースの結晶性が高く、非結晶部分が少ないため、硬度、密度等は増すが、伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は低下する。
[Cellulose type I crystallinity]
The non-crystallized cellulose prepared in the present invention has a cellulose I-type crystallinity reduced to 33% or less. Cellulose type I crystallinity is calculated by the Segal method from the diffraction intensity value by the X-ray diffraction method, and is defined by the following calculation formula (1).
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the grating plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). ]
If the degree of crystallinity is 33% or less, the chemical reactivity of cellulose is improved. For example, in the production of cellulose ether, alkali celluloseization easily proceeds when an alkali is added, resulting in cellulose etherification reaction. The reaction conversion rate can be improved. From this viewpoint, the degree of crystallinity is preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and particularly preferably 0% in which cellulose I-type crystals are not detected by analysis. The cellulose I type crystallinity defined by the calculation formula (1) may be a negative value in calculation, but in the case of a negative value, the cellulose I type crystallinity is 0%.
Here, the cellulose I type crystallinity is the ratio of the amount of crystal region of cellulose to the total amount. Cellulose type I is a crystalline form of natural cellulose. Cellulose type I crystallinity is also related to the physical and chemical properties of cellulose, and the higher the value, the higher the crystallinity of cellulose and the less non-crystalline parts. Flexibility, solubility in water and solvents, and chemical reactivity are reduced.
〔振動ミル〕
本発明では、前記セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで粉砕処理する。ロッドを充填した振動ミルで粉砕処理することにより、原料中のセルロースを効率的に非晶化させることができる。
本発明で用いられる振動ミルとしては、中央化工機株式会社製の振動ミル、株式会社吉田製作所製の小型振動ロッドミル1045型、ドイツのフリッチュ社製の振動カップミルP−9型、日陶科学株式会社製の小型振動ミルNB−O型等を用いることができる。処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
[Vibration mill]
In the present invention, the cellulose-containing raw material is pulverized by a vibration mill filled with a rod. By pulverizing with a vibration mill filled with a rod, the cellulose in the raw material can be efficiently amorphized.
As a vibration mill used in the present invention, a vibration mill manufactured by Chuo Kako Co., Ltd., a small vibration rod mill 1045 type manufactured by Yoshida Seisakusho Co., Ltd., a vibration cup mill P-9 type manufactured by Fritsch, Germany, and Nichito Kagaku Co., Ltd. A small vibration mill NB-O type or the like made from can be used. The processing method may be either a batch type or a continuous type.
〔ロッド〕
振動ミルに充填するロッドとは棒状の媒体であり、ロッドの断面が四角形、六角形等の多角形、円形、楕円形等のものを用いることができる。
ロッドの材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
ロッドの外径としては、好ましくは0.5〜200mm、より好ましくは1〜100mm、更に好ましくは5〜50mmの範囲である。ロッドの長さとしては、粉砕機の容器の長さよりも短いものであれば特に限定されない。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ロッドのかけら等が混入して粉末セルロースが汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。
ロッドの充填率は、振動ミルの機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは10〜97%、より好ましくは15〜95%の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロースとロッドとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの容積に対するロッドの見かけの体積をいう。
振動ミルの処理時間としては、振動ミルの種類、ロッドの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは0.01〜50hr、より好ましくは0.05〜20hr、更に好ましくは0.1〜10hrである。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは5〜250℃、より好ましくは10〜200℃である。
〔rod〕
The rod filled in the vibration mill is a rod-shaped medium, and a rod having a cross section of a polygon such as a square or a hexagon, a circle or an ellipse can be used.
There is no restriction | limiting in particular as a material of a rod, For example, iron, stainless steel, an alumina, a zirconia, silicon carbide, silicon nitride, glass etc. are mentioned.
The outer diameter of the rod is preferably in the range of 0.5 to 200 mm, more preferably 1 to 100 mm, and still more preferably 5 to 50 mm. The length of the rod is not particularly limited as long as it is shorter than the length of the crusher container. If the size of the rod is in the above range, a desired pulverizing force can be obtained, and the cellulose can be efficiently amorphized without contaminating the powdered cellulose by mixing fragments of the rod and the like.
The filling range of the rod is preferably in a range of 10 to 97%, more preferably 15 to 95%, although a suitable range varies depending on the type of vibration mill. When the filling rate is within this range, the contact frequency between the cellulose and the rod is improved, and the grinding efficiency can be improved without hindering the movement of the medium. Here, the filling rate refers to the apparent volume of the rod relative to the volume of the vibration mill.
The treatment time of the vibration mill cannot be determined unconditionally depending on the type of vibration mill, the type of rod, the size, the filling rate, etc., but from the viewpoint of reducing the crystallinity, it is preferably 0.01 to 50 hr, more preferably 0.05-20 hr, more preferably 0.1-10 hr. Although processing temperature does not have a restriction | limiting in particular, From a viewpoint of preventing deterioration by a heat | fever, Preferably it is 5-250 degreeC, More preferably, it is 10-200 degreeC.
上記の処理方法により、前記セルロース含有原料から、セルロースI型結晶化度が33%以下の非晶化セルロースを効率よく得ることができ、振動ミル処理の際に、ミル内部に粉砕物が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる非晶化セルロースの平均粒径は、この非晶化セルロースを工業原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは25〜150μm、より好ましくは30〜100μmである。特に平均粒径が25μm以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
By the above-mentioned treatment method, amorphous cellulose having a cellulose I-type crystallinity of 33% or less can be efficiently obtained from the cellulose-containing raw material, and the pulverized product is fixed inside the mill during the vibration mill treatment. Without being dry.
The average particle size of the obtained amorphous cellulose is preferably 25 to 150 μm, more preferably 30 to 100 μm, from the viewpoint of chemical reactivity and handleability when the amorphous cellulose is used as an industrial raw material. In particular, when the average particle size is 25 μm or more, it is possible to suppress the occurrence of “maco” when the non-crystalline cellulose is brought into contact with a liquid such as water.
また、本発明における振動ミル処理には、ロッドを充填した振動ミルでの粉砕、非晶化をより効率的に行う観点から、嵩密度が100kg/m3以上のセルロース含有原料を用いることが好ましく、120kg/m3以上がより好ましく、150kg/m3以上が更に好ましい。この嵩密度が100kg/m3以上であれば、セルロース含有原料が適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、振動ミルへ原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。一方、この嵩密度の上限としては、取扱い性及び生産性の観点から、好ましくは500kg/m3以下、より好ましくは400kg/m3以下、更に好ましくは350kg/m3以下である。これらの観点から、この嵩密度としては、好ましくは100〜500kg/m3、より好ましくは120〜400kg/m3、更に好ましくは150〜350kg/m3である。 In addition, in the vibration mill treatment in the present invention, it is preferable to use a cellulose-containing raw material having a bulk density of 100 kg / m 3 or more from the viewpoint of more efficiently performing pulverization and amorphousization in a vibration mill filled with rods. 120 kg / m 3 or more is more preferable, and 150 kg / m 3 or more is more preferable. If this bulk density is 100 kg / m 3 or more, the cellulose-containing raw material has an appropriate volume, so that handleability is improved. Moreover, since the amount of raw materials charged into the vibration mill can be increased, the processing capacity is improved. On the other hand, the upper limit of the bulk density is preferably 500 kg / m 3 or less, more preferably 400 kg / m 3 or less, and still more preferably 350 kg / m 3 or less from the viewpoint of handleability and productivity. From these viewpoints, the bulk density is preferably 100 to 500 kg / m 3 , more preferably 120 to 400 kg / m 3 , and still more preferably 150 to 350 kg / m 3 .
振動ミルに供給するセルロース含有原料は、振動ミル中に粉砕原料を効率的に分散させる観点から、平均粒径が0.01〜1mmの範囲にあるものが好ましい。この平均粒径が1mm以下であれば、振動ミル中に供給する際に、振動ミル中に粉砕原料を効率的に分散させることができ、長時間を要することなく所定の粒径に到達することができる。一方、この平均粒径の下限としては、生産性の観点から、0.01mm以上が好ましい。これらの観点から、この平均粒径としては、0.01〜0.7mmがより好ましく、0.05〜0.5mmが更に好ましい。なお、上記の平均粒径及び嵩密度は、実施例に記載の方法により測定することができる。 The cellulose-containing raw material supplied to the vibration mill preferably has an average particle size in the range of 0.01 to 1 mm from the viewpoint of efficiently dispersing the pulverized raw material in the vibration mill. If this average particle size is 1 mm or less, when supplying into the vibration mill, the pulverized raw material can be efficiently dispersed in the vibration mill and reach a predetermined particle size without requiring a long time. Can do. On the other hand, the lower limit of the average particle diameter is preferably 0.01 mm or more from the viewpoint of productivity. From these viewpoints, the average particle diameter is more preferably 0.01 to 0.7 mm, and even more preferably 0.05 to 0.5 mm. In addition, said average particle diameter and bulk density can be measured by the method as described in an Example.
〔振動ミル粉砕の前処理〕
本発明では、振動ミルに供給するセルロース含有原料を前処理することが好ましい。例えば、セルロース含有原料を押出機で処理することで、セルロース含有原料の嵩密度及び平均粒径を、前述の好ましい範囲にすることができる。
セルロース含有原料を押出機に投入する前には粗粉砕しておくことが好ましい。粗粉砕物の大きさとしては、好ましくは1〜50mm、より好ましくは1〜30mmである。1〜50mmに粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができ、粉砕に要する負荷を軽減することができる。
[Pretreatment of vibration mill grinding]
In this invention, it is preferable to pre-process the cellulose containing raw material supplied to a vibration mill. For example, by processing the cellulose-containing raw material with an extruder, the bulk density and the average particle diameter of the cellulose-containing raw material can be set to the above-described preferable ranges.
It is preferable to coarsely pulverize the cellulose-containing raw material before feeding it into the extruder. The size of the coarsely pulverized product is preferably 1 to 50 mm, more preferably 1 to 30 mm. By roughly pulverizing to 1 to 50 mm, the extruder treatment can be performed efficiently and easily, and the load required for pulverization can be reduced.
セルロース含有原料を粗粉砕する方法としては、シュレッダー又はロータリーカッターを使用する方法が挙げられる。ロータリーカッターを使用する場合、得られる粗粉砕物の大きさは、スクリーンの目開きを変えることにより、制御することができる。スクリーンの目開きは、1〜50mmが好ましく、1〜30mmがより好ましい。スクリーンの目開きが1mm以上であれば、適度な嵩高さを有する粗粉砕物が得られ取扱い性が向上する。スクリーンの目開きが50mm以下であれば、後の粉砕処理において、粉砕原料として適度な大きさを有するために、負荷を低減することができる。 Examples of the method for coarsely pulverizing the cellulose-containing raw material include a method using a shredder or a rotary cutter. When a rotary cutter is used, the size of the coarsely pulverized product obtained can be controlled by changing the opening of the screen. The opening of the screen is preferably 1 to 50 mm, more preferably 1 to 30 mm. If the opening of the screen is 1 mm or more, a coarsely pulverized product having an appropriate bulkiness is obtained, and the handleability is improved. If the opening of the screen is 50 mm or less, it has an appropriate size as a pulverized raw material in the subsequent pulverization process, so that the load can be reduced.
前記セルロース含有原料、好ましくは前記粗粉砕したセルロース含有原料を押出機で処理することにより、圧縮せん断力を作用させ、セルロースの結晶構造を破壊して、セルロース含有原料を粉末化させることができる。
圧縮せん断力を作用させて機械的に粉砕する方法として、従来よく用いられる衝撃式の粉砕機、例えば、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等では、粉砕物が綿状化して嵩高くなり、取扱い性を損ない、質量ベースの処理能力が低下する。一方、押出機を用いることにより、所望の平均粒径及び嵩密度を有する粉砕原料が得られ、取扱い性を向上させることができる。
By treating the cellulose-containing raw material, preferably the coarsely pulverized cellulose-containing raw material, with an extruder, a compressive shear force can be applied to break the crystal structure of the cellulose, whereby the cellulose-containing raw material can be powdered.
As a method of mechanically pulverizing by applying a compressive shear force, conventionally used impact type pulverizers such as a cutter mill, a hammer mill, a pin mill, etc., make the pulverized material fluffy and bulky. And the mass-based throughput is reduced. On the other hand, by using an extruder, a pulverized raw material having a desired average particle diameter and bulk density can be obtained, and handleability can be improved.
押出機としては、単軸、二軸のどちらの形式でもよいが、搬送能力を高める等の観点から、二軸押出機が好ましい。
二軸押出機としては、シリンダの内部に2本のスクリューが回転自在に挿入された押出機であり、従来から公知のものが使用できる。2本のスクリューの回転方向は、同一でも逆方向でもよいが、搬送能力を高める観点から、同一方向の回転が好ましい。
また、スクリューの噛み合い条件としては、完全噛み合い、部分噛み合い、非噛み合いの各形式の押出機のいずれでもよいが、処理能力を向上させる観点から、完全噛み合い型、部分噛み合い型が好ましい。
The extruder may be either a single-screw type or a twin-screw type, but a twin-screw extruder is preferable from the viewpoint of increasing the conveyance capability.
The twin screw extruder is an extruder in which two screws are rotatably inserted into a cylinder, and conventionally known ones can be used. The rotation directions of the two screws may be the same or opposite directions, but the rotation in the same direction is preferable from the viewpoint of increasing the conveyance capability.
The screw engagement conditions may be any of full-engagement, partial meshing, and non-meshing extruders. However, from the viewpoint of improving the processing capability, the complete meshing type and the partial meshing type are preferable.
押出機としては、強い圧縮せん断力を加える観点から、スクリューのいずれかの部分に、いわゆるニーディングディスク部を備えることが好ましい。
ニーディングディスク部とは、複数のニーディングディスクで構成され、これらを連続して、一定の位相で、例えば90°ずつに、ずらしながら組み合わせたものであり、スクリューの回転にともなって、狭い隙間にセルロース含有原料を強制的に通過させることで極めて強いせん断力を付与することができる。スクリューの構成としては、ニーディングディスク部と複数のスクリューセグメントとが交互に配置されることが好ましい。二軸押出機の場合、2本のスクリューが、同一の構成を有することが好ましい。
As an extruder, it is preferable to provide what is called a kneading disk part in any part of a screw from a viewpoint of applying a strong compressive shear force.
The kneading disc part is composed of a plurality of kneading discs, which are combined continuously and shifted in a constant phase, for example by 90 °, with a narrow gap as the screw rotates. An extremely strong shearing force can be imparted by forcibly passing the cellulose-containing raw material. As a configuration of the screw, it is preferable that the kneading disk portion and the plurality of screw segments are alternately arranged. In the case of a twin screw extruder, it is preferable that the two screws have the same configuration.
処理方法としては、前記セルロース含有原料、好ましくは前記粗粉砕したセルロース含有原料を押出機に投入し、連続的に処理する方法が好ましい。せん断速度としては、10sec-1以上が好ましく、20〜30000sec-1がより好ましく、50〜3000sec-1が特に好ましい。せん断速度が10sec-1以上であれば、有効に粉砕が進行する。その他の処理条件としては、特に制限はなく、好ましくは処理温度5〜200℃である。
また、押出機によるパス回数としては、1パスでも十分効果を得ることができるが、セルロースの結晶化度及び重合度を低下させる観点から、1パスで不十分な場合は、2パス以上行うことが好ましい。また、生産性の観点からは、1〜10パスが好ましい。パスを繰返すことにより、粗大粒子が粉砕され、粒径のばらつきが少ない粉末状セルロース含有原料を得ることができる。2パス以上行う場合、生産能力を考慮し、複数の押出機を直列に並べて処理を行ってもよい。
As a processing method, the cellulose-containing raw material, preferably the coarsely pulverized cellulose-containing raw material, is charged into an extruder and continuously processed. The shear rate is preferably 10 sec -1 or more, more preferably 20~30000sec -1, 50~3000sec -1 is particularly preferred. If the shear rate is 10 sec −1 or more, pulverization proceeds effectively. Other treatment conditions are not particularly limited, and preferably a treatment temperature of 5 to 200 ° C.
Also, as the number of passes by the extruder, a sufficient effect can be obtained even with one pass, but from the viewpoint of reducing the crystallinity and the degree of polymerization of cellulose, if one pass is insufficient, perform two or more passes. Is preferred. Further, from the viewpoint of productivity, 1 to 10 passes is preferable. By repeating the pass, coarse particles are pulverized and a powdery cellulose-containing raw material with little variation in particle size can be obtained. When performing two or more passes, in consideration of production capacity, a plurality of extruders may be arranged in series for processing.
〔セルラーゼ等の酵素による糖化〕
上述した処理にて得られた非晶化セルロースは、その結晶化度が低いためにセルラーゼによる酵素処理により、効率よくグルコースもしくは、セロビオース、セロトリオースといったオリゴ糖等の混合物を得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合等を考慮すると単糖まで分解することが好ましい。ここでいうセルラーゼとは、セルロースのβ-1,4-グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼ等と称される酵素の総称である。また、キシラナーゼ等のヘミセルラーゼを同時に作用させることにより、糖化の効率を上げることが可能である。
[Saccharification with enzymes such as cellulase]
Since the non-crystalline cellulose obtained by the above-described treatment has a low crystallinity, it is possible to efficiently obtain a mixture of glucose or oligosaccharides such as cellobiose and cellotriose by enzymatic treatment with cellulase. Considering the case of using it for ethanol fermentation or lactic acid fermentation after saccharification treatment, it is preferable to decompose to monosaccharide. Cellulase as used herein refers to an enzyme that hydrolyzes the glycosidic bond of β-1,4-glucan of cellulose, and is a generic term for enzymes called endoglucanase, exoglucanase or cellobiohydrolase, β-glucosidase, and the like. is there. Moreover, it is possible to raise the efficiency of saccharification by making hemicellulases, such as xylanase, act simultaneously.
かかる糖化の処理に使用されるセルラーゼやヘミセルラーゼとしては特に制限はなく、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものを使用することができる。セルラーゼの例としてはセルクラスト1.5L(ノボザイムズ社)等のトリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)由来のセルラーゼ製剤やバチルス エスピー(Bacillus sp.) KSM-N145(FERM P-19727)株由来のセルラーゼ、またはバチルス エスピー (Bacillus sp.) KSM-N252(FERM P-17474)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-N115(FERM P-19726)、バチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-N440(FERM P-19728)、バチルス エスピー(Bacillus sp.) KSM-N659 (FERM P-19730)等の各株由来のセルラーゼ、更には、トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、アスペルギルス アクレアタス(Aspergillus acleatus)、クロストリジウム サーモセラム(Clostridium thermocellum)、クロストリジウム ステルコラリウム(Clostridium stercorarium)、クロストリジウム ジョスイ(Clostridium josui)セルロモナス フィミ(Cellulomonas fimi)、アクレモニウム セルロリティクス(Acremonium celluloriticus)、イルペックス ラクテウス(Irpex lacteus)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス ホリコシ(Pyrococcus horikoshii)由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。これらの中で、好ましくはトリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、あるいはフミコーラ インソレンス(Humicola insolens)由来のセルラーゼ、例えばセルクラスト1.5L(ノボザイムズ社)、TP−60(明治製菓株式会社)、あるいはウルトラフロL(ノボザイムズ社)を用いることにより、効率良く糖が製造できる。 The cellulase and hemicellulase used for the saccharification treatment are not particularly limited, and commercially available cellulase preparations and those derived from animals, plants, and microorganisms can be used. Examples of cellulases include cellulase preparations derived from Trichoderma reesei such as Cellcrust 1.5L (Novozymes), cellulases derived from Bacillus sp. KSM-N145 (FERM P-19727), or Bacillus sp (Bacillus sp.) KSM-N252 (FERM P-17474), Bacillus sp. (Bacillus sp.) KSM-N115 (FERM P-19726), Bacillus sp. (Bacillus sp.) KSM-N440 (FERM P-19728), Bacillus sp (Bacillus sp.) KSM-N659 (FERM P-19730) cellulase from each strain, such as, furthermore, Trichoderma viride (Trichoderma viride), Aspergillus Akureatasu (Aspergillus acleatus), Clostridium thermocellum (Clostridium thermocellum), Clostridium ester Korariumu (Clostridium stercorarium), Clostridium josui (Clostridium josui) cellulose Eggplant Fimi (Cellulomonas fimi), Acremonium cell Lori caustics (Acremonium celluloriticus), Irupekkusu Rakuteusu (Irpex lacteus), Aspergillus niger (Aspergillus niger), Humicola insolens (Humicola insolens) derived cellulase mixtures and Pyrococcus horikoshii (Pyrococcus horikoshii) from And thermostable cellulase. Among these, preferably a cellulase derived from Trichoderma reesei , Trichoderma viride , or Humicola insolens , such as Cell Crust 1.5L (Novozymes), TP-60 (Meiji Seika Co., Ltd.) Company) or Ultraflo L (Novozymes) can be used to produce sugar efficiently.
また、ヘミセルラーゼの例としてはバチルス エスピー(Bacillus sp.)KSM-N546(FERM P-19729)由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)、トリコデルマ ビリデ(Trichoderma viride)、フミコーラ インソレンス(Humicola insolens)、バチルス アルカロフィルス(Bacillus alcalophilus)由来のキシラナーゼ、更には、サーモマイセス(Thermomyces)、オウレオバシジウム(Aureobasidium)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、クロストリジウム(Clostridium)、サーモトガ(Thermotoga)、サーモアスクス(Thermoascus)、カルドセラム(Caldocellum)、サーモモノスポラ(Thermomonospora)属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。また上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
これらの酵素を単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。またこれらの酵素に対してβ-グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ-グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)由来の酵素(例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム188やメガザイム社製β-グルコシダーゼ)やトリコデルマ リーゼ(Trichoderma reesei)、ペニシリウム エメルソニイ(Penicillium emersonii)由来の酵素等が挙げられる。
Further, hemicellulase Bacillus sp Examples (Bacillus sp.) KSM-N546 (FERM P-19729) of Kishinaraze from other Aspergillus niger (Aspergillus niger), Trichoderma viride (Trichoderma viride), Humicola insolens (Humicola insolens) , Bacillus alcalophilus (Bacillus alcalophilus) derived from a xylanase, further, Thermomyces (Thermomyces), Ou Leo bus Shijiumu (Aureobasidium), Streptomyces (Streptomyces), Clostridium (Clostridium), Thermotoga (Thermotoga), Thermoascus (Thermoascus) Xylanase derived from the genus Caldocellum , Thermomonospora, and the like. An enzyme having hemicellulase activity contained in the cellulase mixture can also be used.
Although these enzymes can be used alone, it is effective to use these enzymes in combination for more efficient sugar production. Moreover, the efficiency of sugar production can be improved by further adding a specific cellulase component such as β-glucosidase to these enzymes. Examples of β-glucosidase to be added include enzymes derived from Aspergillus niger (for example, Novozymes 188 or Megazyme β-glucosidase), Trichoderma reesei , Penicillium emersonii ii. An enzyme etc. are mentioned.
上述した処理により得られた非晶化セルロースをセルラーゼによる酵素処理で糖化する場合の反応条件について、前処理により得られた非晶化セルロースの結晶化度や使用する酵素により適宜選択することができる。例えば、セルラーゼとしてノボザイムズ社製のセルクラスト1.5Lを使用し、パルプ由来の結晶化度0%のセルロースを基質とする場合は、0.5〜20%(w/v)の基質懸濁液に対してセルクラスト1.5Lを0.001〜15%(v/v)(タンパク質として0.00017〜2.5%相当)となる様に添加し、pH2〜10(用いる酵素の種類により適当なpHを選ぶことが好ましく、セルクラスト1.5Lを用いる場合、好ましくはpH3〜7、特に好ましくはpH5付近)の緩衝液中、反応温度10〜90℃(用いる酵素の種類により適当な温度を選ぶことが好ましく、セルクラスト1.5Lを用いる場合、好ましくは20〜70℃、特に好ましくは約50℃)で、反応時間30分〜5日間、好ましくは0.5〜3日間反応させることにより糖を製造することができる。 About the reaction conditions in the case of saccharifying the non-crystallized cellulose obtained by the process mentioned above by the enzyme process by a cellulase, it can select suitably by the crystallinity of the non-crystallized cellulose obtained by the pre-process, and the enzyme to be used. . For example, when 1.5 L of cell crust manufactured by Novozymes is used as cellulase and cellulose having a crystallinity of 0% derived from pulp is used as a substrate, the substrate suspension is 0.5 to 20% (w / v). Cellulose 1.5L is added to 0.001-15% (v / v) (corresponding to 0.00017-2.5% as protein) to pH 2-10 (appropriate depending on the type of enzyme used) It is preferable to select a suitable pH, and when 1.5 liters of cell crust is used, the reaction temperature is preferably 10 to 90 ° C. (preferably depending on the type of enzyme used) in a buffer solution of pH 3 to 7, particularly preferably around pH 5. The reaction is preferably performed at a temperature of 20 to 70 ° C., particularly preferably about 50 ° C. when a cell crust of 1.5 L is used, and a reaction time of 30 minutes to 5 days, preferably 0.5 to 3 days. It can be produced sugar by Rukoto.
非晶化セルロース又はセルロース含有原料の平均粒径、嵩密度、X線回折強度、及び水分含量の測定は、下記に記載の方法により行った。また、非晶化セルロース等の各種セルロースの糖化反応は、下記に記載の条件により行った。
(1)平均粒径の測定
平均粒径は、レーザー回折/散乱式粒度分布測定装置「LA−920」(株式会社堀場製作所製)を用いて測定した。測定条件は、粒径測定前に超音波で1分間処理し、測定時の分散媒体として水を用い、温度25℃にて測定した。
(2)嵩密度の測定
嵩密度は、ホソカワミクロン株式会社製の「パウダーテスター」を用いて測定した。測定は、ふるいを振動させて、サンプルをシュートを通じ落下させ、規定の容器(容量100mL)に受け、該容器中の非晶化セルロースの質量を測定することにより算出した。
The average particle size, bulk density, X-ray diffraction intensity, and moisture content of the non-crystalline cellulose or cellulose-containing raw material were measured by the methods described below. Moreover, the saccharification reaction of various celluloses, such as an amorphous cellulose, was performed on condition of the following.
(1) Measurement of average particle diameter The average particle diameter was measured using a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring apparatus “LA-920” (manufactured by Horiba, Ltd.). The measurement conditions were that the sample was treated with ultrasonic waves for 1 minute before the particle size measurement, water was used as a dispersion medium at the time of measurement, and the measurement was performed at a temperature of 25 ° C.
(2) Measurement of bulk density The bulk density was measured using "Powder Tester" manufactured by Hosokawa Micron Corporation. The measurement was performed by vibrating the sieve, dropping the sample through a chute, receiving it in a specified container (capacity 100 mL), and measuring the mass of amorphous cellulose in the container.
(3)X線回折強度の測定
X線回折強度は、株式会社リガク製の「Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer」を用いて以下の条件で測定し、上記計算式(1)に基づいてセルロースI型結晶化度を算出した。
測定条件は、X線源:Cu/Kα−radiation,管電圧:40kv,管電流:120mA,測定範囲:2θ=5〜45°で測定した。測定用サンプルは面積320mm2×厚さ1mmのペレットを圧縮し作製した。X線のスキャンスピードは10°/minで測定した。
(4)水分含量の測定
水分含量は、赤外線水分計(株式会社ケット科学研究所製、「FD−610」)を使用し、150℃にて測定を行った。
(5)セルロース含有量の測定
粉砕したサンプルをエタノール・ベンゼン混合溶剤(1:1)で6時間ソックスレー抽出を行い、さらにエタノールで4時間ソックスレー抽出行って、抽出後のサンプルを60℃で真空乾燥した。得られた試料2.5gに水150mL、亜塩素酸ナトリウム1.0gおよび酢酸0.2mLを加え、70〜80℃で1時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウムおよび酢酸を加えて加温する操作を繰り返し行い、試料が白く脱色するまで3〜4回処理を繰り返した。白色の残渣をグラスフィルター(1G−3)でろ過し、冷水およびアセトンで洗浄した後、105℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求め、下記式によりセルロース含有量を算出した。
セルロース含有量(質量%)=[残渣重量(g)/試料採取量(g)]×100
(3) Measurement of X-ray diffraction intensity X-ray diffraction intensity was measured using the “Rigaku RINT 2500VC X-RAY diffractometer” manufactured by Rigaku Corporation under the following conditions, and based on the above formula (1), cellulose I The type crystallinity was calculated.
The measurement conditions were X-ray source: Cu / Kα-radiation, tube voltage: 40 kv, tube current: 120 mA, measurement range: 2θ = 5-45 °. The measurement sample was prepared by compressing a pellet having an area of 320 mm 2 × thickness of 1 mm. The X-ray scan speed was measured at 10 ° / min.
(4) Measurement of moisture content The moisture content was measured at 150 ° C using an infrared moisture meter ("FD-610", manufactured by Kett Scientific Laboratory).
(5) Measurement of cellulose content The ground sample was subjected to Soxhlet extraction with ethanol / benzene mixed solvent (1: 1) for 6 hours, further Soxhlet extraction with ethanol for 4 hours, and the sample after extraction was vacuum-dried at 60 ° C. did. To 2.5 g of the obtained sample, 150 mL of water, 1.0 g of sodium chlorite and 0.2 mL of acetic acid were added, and the mixture was heated at 70 to 80 ° C. for 1 hour. Subsequently, an operation of adding sodium chlorite and acetic acid and heating was repeated, and the treatment was repeated 3 to 4 times until the sample was decolorized white. The white residue was filtered through a glass filter (1G-3), washed with cold water and acetone, dried at 105 ° C. until a constant weight was obtained, the residue weight was determined, and the cellulose content was calculated according to the following formula.
Cellulose content (mass%) = [residue weight (g) / sampled amount (g)] × 100
(6)糖化反応
酵素による糖化反応は以下の様な条件で行った。適当量の非晶化セルロース等の各種セルロース基質を3mLの酵素反応液(100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、30μg/mLテトラサイクリン(防腐剤として添加)、蓋つきスクリュー管(No.5, φ27×55mm マルエム社)に懸濁し、適量の酵素を加えて50℃で振とう攪拌(150rpm、タイテック株式会社製恒温振とう機「BR−15CF」)しながら、所定の時間で反応させた。反応終了後、遠心分離(17,000×g、5分間)によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を以下に示すDNS法及びHPLC法によって定量した。また対照として未反応の酵素反応液についても同様の解析を行った。
(7)DNS法(生物化学実験法 還元糖の定量法 学会出版センター)による糖の定量
DNS溶液(0.5% 3,5−ジニトロサリチル酸、30%酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、1.6%水酸化ナトリウム)1mLに適量の上清液を加え、100℃で5分間加熱発色させ、冷却後、波長535nmで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より上清中の還元糖量を計算した。なお、本法では生成糖の種類によりグルコースとは発色の程度が異なるため、以下のHPLC法等とは異なる値が得られる場合もある。
(8)HPLC法による糖の定量
Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステム;カラム:CarboPac PA1(Dionex社 4×250mm)、検出器:ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液:A液;100mM水酸化ナトリウム溶液、B液;1M酢酸ナトリウムを含む100mM水酸化ナトリウム溶液、C液;超純水を用いた。注入から初期濃度A液10%:C液90%、0〜15分A液95%:B液5%のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として0.01%(w/v)のグルコース(和光純薬工業株式会社製)、キシロース(和光純薬工業株式会社製)、キシロビオース(和光純薬工業株式会社製)、セロビオース(生化学工業株式会社製)を用いた。
(9)タンパク質の定量
DCプロテインアッセイキット(Bio Rad社製)を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
(6) Saccharification reaction The enzymatic saccharification reaction was carried out under the following conditions. 3 mL of enzyme reaction solution (100 mM citrate buffer (pH 5.0), 30 μg / mL tetracycline (added as preservative)), screw tube with lid (No. 5, The suspension was suspended in Φ27 × 55 mm (Marem Co., Ltd.), an appropriate amount of enzyme was added, and the mixture was reacted at 50 ° C. with shaking (150 rpm, constant temperature shaker “BR-15CF” manufactured by Taitec Corporation) for a predetermined time. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation (17,000 × g, 5 minutes), and the amount of reducing sugar released into the supernatant was quantified by the DNS method and HPLC method shown below. As a control, the same analysis was performed for an unreacted enzyme reaction solution.
(7) DNS method (Biochemical experiment method Quantitative method for reducing sugar: Quantitative analysis of the scientific society) DNS solution DNS solution (0.5% 3,5-dinitrosalicylic acid, 30% sodium potassium tartrate tetrahydrate, 1.6 An appropriate amount of the supernatant was added to 1 mL of (% sodium hydroxide), and the mixture was heated and colored at 100 ° C. for 5 minutes. After cooling, colorimetric determination was performed at a wavelength of 535 nm. The amount of reducing sugar in the supernatant was calculated from a calibration curve using glucose as the standard sugar. In this method, since the degree of color development differs from that of glucose depending on the type of sugar produced, a value different from the following HPLC method and the like may be obtained.
(8) Quantification of sugar by HPLC method
Dionex DX500 chromatography system; column: CarboPac PA1 (Dionex 4 × 250 mm), detector: ED40 pulsed amperometric detector, eluent: solution A; 100 mM sodium hydroxide solution, solution B; 1M sodium acetate Contains 100 mM sodium hydroxide solution, solution C; ultrapure water was used. From the injection, sugars were analyzed with a linear gradient of 10% initial concentration A solution: 90% C solution, 0-15 minutes, A solution 95%: B solution 5%. 0.01% (w / v) glucose as standard (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylobiose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cellobiose (Seikagaku Corporation) Used).
(9) Protein quantification Using a DC protein assay kit (Bio Rad), the protein amount was calculated from a calibration curve using bovine serum albumin as a standard protein.
製造例1
〔シュレッダー処理〕
シート状木材パルプ(Borregard社製「Blue Bear Ultra Ether」、800mm×600mm×1.5mm、結晶化度81%、セルロース含有量96質量%、水分含量7質量%)、をシュレッダー(株式会社明光商会製、「MSX2000−IVP440F」)にかけ、約10mm×5mm×1.5mmのチップ状パルプにした。
〔振動ミル処理〕
得られたチップ状のパルプを振動ミル(中央化工機株式会社製、「MB−1」、容器全容量3.5L)に100g投入し、ロッドとして、直径25mm、長さ218mm、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド16本を振動ミルに充填(充填率49%)して、振幅8mm、円回転1200cpmの条件で、3時間処理を行った。振動ミル処理後に得られた非晶化セルロースの平均粒径は80μmであった。また、得られた非晶化セルロースの温度は、処理に伴う発熱により、85℃であった。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた非晶化セルロースを前記振動ミルから取り出し、得られた非晶化セルロースの平均粒径を測定し、X線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表1に示す。
Production Example 1
[Shredder treatment]
Shredder (Meiko Shokai Co., Ltd.) sheet wood pulp ("Blue Bear Ultra Ether" manufactured by Borregard, 800 mm x 600 mm x 1.5 mm, crystallinity 81%, cellulose content 96 mass%, water content 7 mass%) Manufactured, “MSX2000-IVP440F”) to obtain a chip-like pulp of about 10 mm × 5 mm × 1.5 mm.
[Vibration mill treatment]
100 g of the obtained chip-like pulp was put into a vibration mill (manufactured by Chuo Kako Co., Ltd., “MB-1”, container total capacity 3.5 L), and as a rod, diameter 25 mm, length 218 mm, material stainless steel, cross section Sixteen rods having a circular shape were filled in a vibration mill (filling rate 49%), and the treatment was performed for 3 hours under the conditions of an amplitude of 8 mm and a circular rotation of 1200 cpm. The average particle size of the amorphous cellulose obtained after the vibration mill treatment was 80 μm. Moreover, the temperature of the obtained amorphous cellulose was 85 degreeC by the heat_generation | fever accompanying a process.
After completion of the treatment, no pulp sticking matter was found on the wall or bottom of the vibration mill. The obtained amorphous cellulose was taken out from the vibration mill, the average particle size of the obtained amorphous cellulose was measured, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 1.
製造例2
〔押出機処理〕
製造例1と同じ粉砕原料を実施例1と同じシュレッダー処理して得たチップ状パルプを、二軸押出機(株式会社スエヒロEPM製、「EA−20」)に2kg/hrで投入し、せん断速度660sec-1、スクリュー回転数300rpm、外部から冷却水を流しながら、1パス処理した。なお、前記二軸押出機は、完全噛み合い型同方向回転二軸押出機であり、2列に配置されたスクリューは、スクリュー径40mmのスクリュー部と、互い違い(90°)に12ブロックを組み合わせたニーディングディスク部とを有し、2本のスクリューは、同じ構成を有するものである。また、二軸押出機の温度は、処理にともなう発熱により、30〜70℃であった。
押出機処理後に得られたパルプは、平均粒径121μm、嵩密度254kg/m3であった。
〔振動ミル処理〕
次に、押出機処理後に得られたパルプを用いて、製造例1と同様の振動ミル粉砕を行い、非晶化セルロースを得た。粉砕終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物は見られなかった。結果を表1に示す。
Production Example 2
(Extruder processing)
Chip-like pulp obtained by subjecting the same pulverized raw material as in Production Example 1 to the same shredder treatment as in Example 1 was charged into a twin-screw extruder (“EA-20” manufactured by Suehiro EPM Co., Ltd.) at 2 kg / hr, and sheared. One-pass processing was performed while flowing cooling water from the outside at a speed of 660 sec −1 , a screw rotation speed of 300 rpm. The twin-screw extruder is a fully meshing type co-rotating twin-screw extruder, and the screws arranged in two rows are combined with a screw portion having a screw diameter of 40 mm and 12 blocks alternately (90 °). The two screws have the same configuration. The temperature of the twin screw extruder was 30 to 70 ° C. due to heat generated by the treatment.
The pulp obtained after the extruder treatment had an average particle size of 121 μm and a bulk density of 254 kg / m 3 .
[Vibration mill treatment]
Next, using the pulp obtained after the extruder treatment, vibration mill pulverization was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain amorphous cellulose. After completion of the pulverization, no fixed pulp was found on the wall or bottom of the vibration mill. The results are shown in Table 1.
製造例3
振動ミルに充填したロッドとして、直径30mm、長さ218mm、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド13本を振動ミルに充填(充填率57%)し、振動ミルの処理時間を1hrに変更したこと以外は製造例2と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表1に示す。
Production Example 3
As a rod filled in the vibration mill, 13 rods with a diameter of 30 mm, a length of 218 mm, stainless steel, and a circular cross section were filled in the vibration mill (filling rate 57%), and the processing time of the vibration mill was changed to 1 hr. Amorphous cellulose was obtained by the same method and conditions as in Production Example 2 except for the above. The results are shown in Table 1.
製造例4
振動ミルに充填したロッドの本数を14本に変更して振動ミルに充填(充填率62%)した以外は製造例2と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表1に示す。
Production Example 4
Amorphized cellulose was obtained by the same method and conditions as in Production Example 2, except that the number of rods filled in the vibration mill was changed to 14 and the vibration mill was filled (filling rate 62%). The results are shown in Table 1.
製造例5
振動ミルに充填したロッドとして、直径36mm、長さ218mm、材質ステンレスのロッド8本を用いて振動ミルに充填(充填率51%)し、振動ミルの処理時間を1hrに変更したこと以外は製造例2と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表1に示す。
Production Example 5
Manufactured except that the vibration mill is filled with a rod with a diameter of 36 mm, a length of 218 mm, and made of stainless steel (filling rate 51%) and the processing time of the vibration mill is changed to 1 hr. Amorphized cellulose was obtained by the same method and conditions as in Example 2. The results are shown in Table 1.
製造例6
振動ミルに充填したロッドとして、直径30mm、長さ218mm、材質ステンレスのロッド11本を用いて振動ミルに充填(充填率48%)し、振動ミルの処理時間を3hrに変更したこと以外は製造例2と同様の方法及び条件で非晶化セルロースを得た。結果を表1に示す。
Production Example 6
Manufactured except that the vibration mill is filled with a rod with a diameter of 30 mm, a length of 218 mm and made of stainless steel (filling rate 48%), and the processing time of the vibration mill is changed to 3 hr. Amorphized cellulose was obtained by the same method and conditions as in Example 2. The results are shown in Table 1.
製造例7〜10
セルロース含有原料として、上質紙(製造例7:セルロース含有量83質量%、水分含量5.7質量%)、ダンボール(製造例8:セルロース含有量84質量%、水分含量7.2質量%)、新聞紙(製造例9:セルロース含有量83質量%、水分含量7.7質量%)、籾殻(製造例10:セルロース含有量60質量%、水分含量13.6質量%)を用いて、製造例1に記載の方法及び条件でシュレッダー処理した後、製造例2の方法及び条件で押出機処理した。押出機処理後に得られたセルロース含有原料の性状は、それぞれ製造例7:上質紙/平均粒径71μm/嵩密度274kg/m3、製造例8:ダンボール/平均粒径93μm/嵩密度216kg/m3、製造例9:新聞紙/平均粒径61μm/嵩密度303kg/m3、製造例10:籾殻/平均粒径85μm/嵩密度380kg/m3であった。
更に製造例6の方法及び条件で振動ミル処理を行って、それぞれ非晶化セルロース(製造例7:上質紙/結晶化度0%/平均粒径42μm、製造例8:ダンボール/結晶化度0%/平均粒径48μm、製造例9:新聞紙/結晶化度0%/平均粒径55μm、製造例10;籾殻/結晶化度0%/平均粒径48μm)を得た。
Production Examples 7 to 10
As cellulose-containing raw materials, fine paper (Production Example 7: Cellulose content 83% by mass, moisture content 5.7% by mass), cardboard (Production Example 8: Cellulose content 84% by mass, moisture content 7.2% by mass), Production Example 1 using newspaper (Production Example 9: cellulose content 83% by mass, moisture content 7.7% by mass) and rice husk (Production Example 10: cellulose content 60% by mass, moisture content 13.6% by mass) After shredding with the method and conditions described in 1., the extruder was treated with the method and conditions of Production Example 2. The properties of the cellulose-containing raw materials obtained after the extruder treatment were as follows: Production Example 7: fine paper / average particle size 71 μm / bulk density 274 kg / m 3 , Production Example 8: cardboard / average particle size 93 μm / bulk density 216 kg / m 3. Production Example 9: Newspaper / average particle size 61 μm / bulk density 303 kg / m 3 , Production Example 10: rice husk / average particle size 85 μm / bulk density 380 kg / m 3 .
Further, the vibration mill treatment was carried out by the method and conditions of Production Example 6 to produce amorphous cellulose (Production Example 7: fine paper / crystallinity 0% / average particle size 42 μm, Production Example 8: cardboard / crystallinity 0). % / Average particle size 48 μm, Production Example 9: newspaper / crystallinity 0% / average particle size 55 μm, Production Example 10: rice husk / crystallinity 0% / average particle size 48 μm).
製造例11〜12
[剪定枝の粗粉砕処理]
セルロース含有原料として、棒状の街路樹の剪定枝(製造例11:φ10mm×300mm、水分含量12質量%)、棒状のみかん木の剪定枝(製造例12:φ10mm×500mm、セルロース含有量64質量%、水分含量22質量%)を用いて、プラスチック粉砕機(森田精機工業株式会社製 JC-2型)にかけ、約2mm×3mm×1mmのチップ状にした。その後、得られたチップ状の街路樹及びみかん木の剪定枝の水含有量をそれぞれ2.3質量%、3.5質量%になるまで乾燥機にて乾燥させた。得られたチップ状のみかん木の剪定枝の嵩密度は、224kg/m3であった。
[剪定枝の振動ミル処理]
得られたチップ状の剪定枝を用いて製造例6の方法及び条件で振動ミル処理を行い、それぞれ非晶化セルロース(製造例11;街路樹の枝/結晶化度0%/平均粒径49μm、製造例12;みかん木の枝/結晶化度0%/平均粒径44μm)を得た。
Production Examples 11-12
[Coarse pulverization of pruned branches]
As cellulose-containing raw materials, pruned branches of rod-shaped street trees (Production Example 11: φ10 mm × 300 mm, moisture content 12% by mass), pruned branches of rod-shaped mandarin trees (Production Example 12: φ10 mm × 500 mm, cellulose content 64% by mass) And a moisture content of 22% by mass) was applied to a plastic pulverizer (JC-2 type manufactured by Morita Seiki Kogyo Co., Ltd.) to form a chip of about 2 mm × 3 mm × 1 mm. Then, it dried with the drier until the water content of the pruned branch of the obtained chip-shaped roadside tree and a mandarin tree became 2.3 mass% and 3.5 mass%, respectively. The bulk density of the pruned branch of the chip-shaped mandarin tree thus obtained was 224 kg / m 3 .
[Vibration milling of pruned branches]
The obtained chip-shaped pruned branches were subjected to vibration mill treatment under the method and conditions of Production Example 6 to produce amorphous cellulose (Production Example 11; roadside tree branch / crystallinity 0% / average particle size 49 μm). Production Example 12: tangerine tree branch / 0% crystallinity / average particle size 44 μm).
比較製造例1
製造例1と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状パルプを得た。次に、このチップ状パルプを、転動ミル(日陶科学株式会社製、「ポットミル ANZ-51S」、容器容積1.0L、10mmφジルコニアボールを1.8kg充填、充填率53%)に100g投入し、回転数100rpmの条件で48時間処理を行った。得られたパルプは、粉末化が起こらず、殆どチップ状のままだった。前記の方法により、得られたパルプのX線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表2に示す。
Comparative production example 1
A shredder process was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 100 g of this chip-like pulp is put into a rolling mill (manufactured by Nippon Ceramic Science Co., Ltd., “Pot Mill ANZ-51S”, container volume 1.0 L, 10 mmφ zirconia balls are filled 1.8 kg, filling rate 53%). Then, the treatment was performed for 48 hours under the condition of a rotation speed of 100 rpm. The obtained pulp did not pulverize and remained almost chip-like. By the above method, the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity of the obtained pulp. The results are shown in Table 2.
比較製造例2
製造例1と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、カッターミル(株式会社ダルトン製、「パワーミルP−02S型」)に500g投入し、回転数3000rpmの条件で0.5hr処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表2に示す。
Comparative production example 2
A shredder treatment was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-shaped pulp was put into a cutter mill (manufactured by Dalton Co., Ltd., “Power Mill P-02S type”), and subjected to a treatment for 0.5 hr under the condition of a rotational speed of 3000 rpm. The obtained pulverized product became cottony and could not obtain amorphous cellulose. The results are shown in Table 2.
比較製造例3
製造例1と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、ハンマーミル(株式会社ダルトン製、「SAMPLE-MILL」)に500g投入し、回転数13500rpmの条件で0.5hr処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表2に示す。
Comparative production example 3
A shredder treatment was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-like pulp was put into a hammer mill ("SAMPLE-MILL" manufactured by Dalton Co., Ltd.) and treated for 0.5 hr under the condition of a rotational speed of 13500 rpm. The obtained pulverized product became cottony and could not obtain amorphous cellulose. The results are shown in Table 2.
比較製造例4
製造例1と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次に、このチップ状のパルプを、ピンミル(ホソカワミクロン株式会社製、「コロプレックス」)に500g投入し、回転数13000rpmの条件で0.25hr処理を行った。得られた粉砕品は、綿状化してしまい、非晶化セルロースを得ることはできなかった。結果を表2に示す。
Comparative production example 4
A shredder treatment was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Next, 500 g of this chip-like pulp was put into a pin mill (Hosokawa Micron Co., Ltd., “Coloplex”), and treated for 0.25 hr under the condition of a rotational speed of 13000 rpm. The obtained pulverized product became cottony and could not obtain amorphous cellulose. The results are shown in Table 2.
比較製造例5
製造例1と同様にシュレッダー処理を行い、チップ状のパルプを得た。次いで二軸押出機処理を行い、粉砕機処理を行わずに粉末パルプを得た。前記の方法により、得られた粉末パルプの平均粒径を測定し、X線回折強度から結晶化度を算出した。結果を表2に示す。
Comparative Production Example 5
A shredder treatment was performed in the same manner as in Production Example 1 to obtain chip-like pulp. Subsequently, a twin-screw extruder process was performed, and powder pulp was obtained without performing a pulverizer process. The average particle diameter of the obtained powder pulp was measured by the above method, and the crystallinity was calculated from the X-ray diffraction intensity. The results are shown in Table 2.
比較製造例6〜11
製造例7〜10のセルロース含有原料を用いて同様にシュレッダー処理及び押出機処理を行い、または製造例11〜12の街路樹の剪定枝、みかん木の剪定枝についても同様にプラスチック粉砕機による粗粉砕処理を行い、次いで振動ミル処理を行わずに粉末またはチップ状のセルロース(比較製造例6:上質紙/結晶化度71%/平均粒径71μm、比較製造例7:ダンボール/結晶化度71%/平均粒径93μm、比較製造例8:新聞紙/結晶化度56%/平均粒径61μm、比較製造例9:籾殻/結晶化度47%/平均粒径85μm、比較製造例10:街路樹の剪定枝/結晶化度51%/大きさ:2mm×3mm×1mm、比較製造例11:みかん木の剪定枝/結晶化度46%/大きさ:2mm×3mm×1mmを得た。
Comparative production examples 6-11
The shredder process and the extruder process are similarly performed using the cellulose-containing raw materials of Production Examples 7 to 10, or the pruned branches of the roadside trees and the pruned branches of the mandarin orange trees of Production Examples 11 to 12 are similarly roughened by a plastic grinder. Powdered or chip-like cellulose without pulverization and then vibration milling (Comparative Production Example 6: fine paper / crystallinity 71% / average particle size 71 μm, comparative production example 7: cardboard / crystallinity 71 % / Average particle size 93 μm, comparative production example 8: newspaper / crystallinity 56% / average particle size 61 μm, comparative production example 9: rice husk / crystallinity 47% / average particle size 85 μm, comparative production example 10: roadside tree Pruned branch / crystallinity 51% / size: 2 mm × 3 mm × 1 mm, Comparative Production Example 11: pruned branch of mandarin orange / crystallinity 46% / size: 2 mm × 3 mm × 1 mm.
実施例1及び比較例1
実施例1として、製造例6における押出機処理とロッドを充填した振動ミル処理によって調製した非晶化セルロース(結晶化度0%、粒径57μm)、ならびに比較例1として同じく製造例6の非晶化セルロース調製時の前処理として押出機処理のみを行って調製した粉末パルプ(結晶化度76%、粒径156μm)のセルラーゼ酵素標品(セルクラスト1.5L、ノボザイムズ社製)による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末パルプ0.15gを3mLの酵素反応液(100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、3%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質0.5%相当)、30μg/mLテトラサイクリン)に懸濁し、50℃で振とう攪拌しながら反応時間18時間、26時間及び42時間の酵素反応を行った。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をDNS法によって定量(グルコース換算)した。結果を表3に示す。
Example 1 and Comparative Example 1
As Example 1, non-crystallized cellulose (crystallinity 0%, particle size 57 μm) prepared by extruder processing and vibration mill processing filled with rods in Production Example 6, and Comparative Example 1 also non-production Example 6 Saccharification reaction with cellulase enzyme preparation (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes) of powder pulp (crystallinity 76%, particle size 156 μm) prepared by performing only the extruder treatment as pretreatment at the time of preparing crystallized cellulose Went. 3 mL of enzyme reaction solution (100 mM citrate buffer (pH 5.0), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg) / ML tetracycline), and the enzyme reaction was performed for 18 hours, 26 hours, and 42 hours with shaking and stirring at 50 ° C. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 3.
実施例2〜4及び比較例2〜4
実施例2〜4として、前述の製造例6の条件で非晶化セルロースを調製した(実施例2〜4:結晶化度0%/平均粒径57μm)。比較例2〜4は、前述の比較製造例5の条件で調製した粉末パルプ(比較例2〜4:結晶化度76%/平均粒径156μm)を使用した。これらの、セルラーゼ酵素標品(セルクラスト1.5L、ノボザイムズ社製)による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末パルプ0.15gを3mLの酵素反応液中、50℃で振とう攪拌しながら3日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例2及び比較例2:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、3%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質0.5%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例3及び比較例3:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、1.5%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質0.25%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例4及び比較例4:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.6%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質0.1%相当)、30μg/mLテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をDNS法によって定量(グルコース換算)した。結果を表4に示す。
Examples 2 to 4 and Comparative Examples 2 to 4
As Examples 2 to 4, amorphous cellulose was prepared under the conditions of Production Example 6 described above (Examples 2 to 4: Crystallinity 0% / average particle size 57 μm). In Comparative Examples 2 to 4, powder pulp (Comparative Examples 2 to 4: crystallinity 76% / average particle size 156 μm) prepared under the conditions of Comparative Production Example 5 described above was used. A saccharification reaction was performed with these cellulase enzyme preparations (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). An enzyme reaction was carried out for 3 days while shaking and agitating 0.15 g of amorphous cellulose or powdered pulp at 50 ° C. in a 3 mL enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was Example 2 and Comparative Example 2: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 3 and Comparative Example 3: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 1.5% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to protein 0.25%), 30 μg / mL tetracycline, Example 4 And Comparative Example 4: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 0.6% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.1% protein), 30 μg / mL tetracycline. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 4.
実施例5
実施例2で得られた糖化液上清(反応72時間)を、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて以下に示す方法によって分析した。
カラム:CarboPac PA1(Dionex社 4×250mm)、検出器:ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液:A液;100mM水酸化ナトリウム溶液、B液;1M酢酸ナトリウムを含む100mM水酸化ナトリウム溶液、C液;超純水
注入から初期濃度A液10%:C液90%、0〜15分A液95%:B液5%のリニアグラジエントにより分析した。標準として0.01%(w/v)のグルコース(和光純薬工業株式会社製)、キシロース(和光純薬工業株式会社製)、キシロビオース(和光純薬工業株式会社製)、セロビオース(生化学工業株式会社製)を用いた。グルコースは保持時間約5.5分、キシロースは約6.5分、キシロビオースは約14分、セロビオースは約14.5分にピークが現われた。糖化液上清は100倍希釈し、10μLを注入した。結果を表5に示す。
Example 5
The saccharified solution supernatant (reaction 72 hours) obtained in Example 2 was analyzed by the following method using a Dionex DX500 chromatography system.
Column: CarboPac PA1 (Dionex 4 × 250 mm), detector: ED40 pulsed amperometric detector, eluent: solution A; 100 mM sodium hydroxide solution, solution B; 100 mM sodium hydroxide solution containing 1M sodium acetate, C Liquid: Ultrapure water From the injection, the initial concentration was analyzed by linear gradient of 10% of liquid A: 90% of liquid C, 0-15 minutes, 95% of liquid A: 5% of liquid B. 0.01% (w / v) glucose as standard (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), xylobiose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cellobiose (Seikagaku Corporation) Used). Glucose showed peaks at a retention time of about 5.5 minutes, xylose at about 6.5 minutes, xylobiose at about 14 minutes, and cellobiose at about 14.5 minutes. The saccharified solution supernatant was diluted 100 times and 10 μL was injected. The results are shown in Table 5.
実施例6〜11
前述の製造例6の条件で調製した非晶化セルロース(結晶化度0%/平均粒径57μm)のセルラーゼ酵素製剤(実施例6〜8:TP−60、明治製菓株式会社製、タンパク質650mg/g、実施例9〜11:ウルトラフロL、ノボザイムズ社製、50mgタンパク質/mL)による糖化反応を行った。非晶化セルロース0.15gを3mLの酵素反応液中、50℃で振とう攪拌しながら3日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例6:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.83%(w/v)TP−60(タンパク質0.54%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例7:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.42%(w/v)TP−60(タンパク質0.28%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例8:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.17%(w/v)TP−60(タンパク質0.11%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例9:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、10%(v/v)ウルトラフロL(タンパク質0.5%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例10:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、5%(v/v)ウルトラフロL(タンパク質として0.25%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例11:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、2%(v/v)ウルトラフロL(タンパク質0.1%相当)、30μg/mLテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をDNS法によって定量(グルコース換算)した。結果を表6に示す。
Examples 6-11
Cellulase enzyme preparation (Examples 6 to 8: TP-60, manufactured by Meiji Seika Co., Ltd., protein 650 mg / ml) of amorphous cellulose (crystallinity 0% / average particle size 57 μm) prepared under the conditions of Production Example 6 above. g, Examples 9 to 11: Saccharification reaction was performed using Ultraflo L, manufactured by Novozymes, 50 mg protein / mL. The enzyme reaction was performed for 3 days while shaking and stirring 0.15 g of amorphous cellulose in a 3 mL enzyme reaction solution at 50 ° C. The enzyme reaction solution was Example 6: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 0.83% (w / v) TP-60 (corresponding to protein 0.54%), 30 μg / mL tetracycline, Example 7: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 0.42% (w / v) TP-60 (corresponding to 0.28% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 8: 100 mM citrate buffer (pH 5.0) ), 0.17% (w / v) TP-60 (corresponding to 0.11% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 9: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 10% (v / v) Ultraflo L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 10: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 5% (v / v) Ultraflo L (tamper) 0.25% as a quality), 30 μg / mL tetracycline, Example 11: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 2% (v / v) Ultraflo L (corresponding to 0.1% protein), 30 μg / mL tetracycline. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 6.
実施例12及び13
実施例12及び13として、前述の製造例6の条件で調製した非晶化セルロース(結晶化度0%/平均粒径57μm)のセルラーゼ酵素製剤(実施例12:セルクラスト1.5L、ノボザイムズ社製、実施例13:セルクラスト1.5L及びβ−グルコシダーゼとしてノボザイム188、ノボザイムズ社製)による糖化反応を行った。非晶化セルロース0.15gを3mLの酵素反応液中、50℃で振とう攪拌しながら3日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例12:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.6%(v/v)セルクラスト(タンパク質0.1%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例13:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、0.6%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質として0.1%相当)、0.03%(v/v)ノボザイム188(タンパク質0.0075%相当)、30μg/mLテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をDNS法によって定量(グルコース換算)した。結果を表7に示す。
Examples 12 and 13
As Examples 12 and 13, a cellulase enzyme preparation of amorphous cellulose (crystallinity 0% / average particle size 57 μm) prepared under the conditions of Production Example 6 described above (Example 12: Cellcrust 1.5 L, Novozymes) Manufactured, Example 13: Cellulose 1.5L and saccharification reaction with β-glucosidase as Novozyme 188, manufactured by Novozymes) were performed. The enzyme reaction was performed for 3 days while shaking and stirring 0.15 g of amorphous cellulose in a 3 mL enzyme reaction solution at 50 ° C. The enzyme reaction solution was Example 12: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 0.6% (v / v) cell crust (corresponding to 0.1% protein), 30 μg / mL tetracycline, Example 13: 100 mM Citrate buffer (pH 5.0), 0.6% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.1% as protein), 0.03% (v / v) Novozyme 188 (protein 0.0075) % Equivalent), 30 μg / mL tetracycline. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 7.
実施例14及び15
実施例12及び13で得られた糖化液上清(反応75時間)を、前述の実施例5と同様に、Dionex社のDX500クロマトグラフィーシステムにて分析した。結果を表8に示す。
Examples 14 and 15
The saccharified solution supernatant (reaction 75 hours) obtained in Examples 12 and 13 was analyzed with a DX500 chromatography system manufactured by Dionex as in Example 5 described above. The results are shown in Table 8.
実施例16〜18及び比較例5〜7
実施例16〜18として、前述の製造例7〜9で得られた非晶化セルロース(実施例16:上質紙/結晶化度0%/平均粒径42μm、実施例17:ダンボール/結晶化度0%/平均粒径48μm、実施例18:新聞紙/結晶化度0%/平均粒径55μm)、及び比較例5〜7として、前述の比較製造例6〜8で得られた粉末セルロース(比較例5:上質紙/結晶化度71%/平均粒径71μm、比較例6:ダンボール/結晶化度71%/平均粒径93μm、比較例7:新聞紙/結晶化度56%/平均粒径61μm)を使用し、セルラーゼ酵素標品(セルクラスト1.5L、ノボザイムズ社製)による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース0.15gを3mLの酵素反応液中、50℃で振とう攪拌しながら3日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、実施例16〜17及び比較例5〜6:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、1.5%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質0.25%相当)、30μg/mLテトラサイクリン、実施例18及び比較例7:100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、12%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質2%相当)、30μg/mLテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をDNS法によって定量(グルコース換算)した。結果を表9に示す。
Examples 16-18 and Comparative Examples 5-7
As Examples 16 to 18, the non-crystallized cellulose obtained in the above Production Examples 7 to 9 (Example 16: fine paper / crystallinity 0% / average particle size 42 μm, Example 17: cardboard / crystallinity) 0% / average particle size 48 μm, Example 18: newspaper / crystallinity 0% / average particle size 55 μm), and Comparative Examples 5-7 as powdered cellulose obtained in Comparative Production Examples 6-8 (Comparison) Example 5: fine paper / crystallinity 71% / average particle size 71 μm, comparative example 6: cardboard / crystallinity 71% / average particle size 93 μm, comparative example 7: newspaper / crystallinity 56% / average particle size 61 μm ) Was used to carry out a saccharification reaction using a cellulase enzyme preparation (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes). The enzyme reaction was carried out for 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. in 0.1 mL of amorphous cellulose or powdered cellulose in 3 mL of the enzyme reaction solution. The enzyme reaction solutions were Examples 16 to 17 and Comparative Examples 5 to 6: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 1.5% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.25% protein) 30 μg / mL tetracycline, Example 18 and Comparative Example 7: 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 12% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 2% protein), 30 μg / mL tetracycline . After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 9.
実施例19〜21及び比較例8〜10
実施例19〜21として、前述の製造例10〜12で得られた非晶化セルロース(実施例19:籾殻/結晶化度0%/平均粒径48μm、実施例20:街路樹の剪定枝/結晶化度0%/平均粒径49μm、実施例21:みかん木の枝/結晶化度0%/平均粒径44μm)、及び比較例8〜10として、前述の比較製造例9〜11で得られた粉末あるいはチップ状のセルロース(比較例8:籾殻/結晶化度47%/平均粒径85μm、比較例9:街路樹の剪定枝/結晶化度51%/大きさ:2mm×3mm×1mm、比較例10:みかん木の剪定枝/結晶化度46%/大きさ:2mm×3mm×1mm)を使用し、セルラーゼ酵素標品(セルクラスト1.5L、ノボザイムズ社製)による糖化反応を行った。非晶化セルロースまたは粉末セルロース0.15gを3mLの酵素反応液中、50℃で振とう攪拌しながら3日間の酵素反応を行った。酵素反応液は、100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)、3%(v/v)セルクラスト1.5L(タンパク質0.5%相当)、30μg/mLテトラサイクリンとした。反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量をDNS法によって定量(グルコース換算)した。結果を表10に示す。
Examples 19-21 and Comparative Examples 8-10
As Examples 19 to 21, the non-crystalline cellulose obtained in the above Production Examples 10 to 12 (Example 19: rice husk / 0% crystallinity / average particle size 48 μm, Example 20: pruned branch of street tree / Example 21: tangerine tree branch / crystallinity 0% / average particle size 44 μm), and Comparative Examples 8 to 10 as obtained in the above Comparative Production Examples 9 to 11 Powdered or chip-like cellulose (Comparative Example 8: rice husk / crystallinity 47% / average particle size 85 μm, comparative example 9: pruned branch of street tree / crystallinity 51% / size: 2 mm × 3 mm × 1 mm Comparative Example 10: Pruned branch of mandarin orange tree / crystallinity 46% / size: 2 mm × 3 mm × 1 mm) and saccharification reaction with cellulase enzyme preparation (Cell Crust 1.5 L, manufactured by Novozymes) It was. The enzyme reaction was carried out for 3 days with shaking and stirring at 50 ° C. in 0.1 mL of amorphous cellulose or powdered cellulose in 3 mL of the enzyme reaction solution. The enzyme reaction solution was 100 mM citrate buffer (pH 5.0), 3% (v / v) cell crust 1.5 L (corresponding to 0.5% protein), 30 μg / mL tetracycline. After completion of the reaction, the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation, and the amount of reducing sugar released in the supernatant was quantified (converted to glucose) by the DNS method. The results are shown in Table 10.
表1及び表2から、製造例1〜6の非晶化セルロースの製造方法は、比較製造例1〜5に比べて、セルロースの結晶化度を低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができ、生産性に優れることが分かる。また、製造例1と比較製造例1とを比べると、振動ミルの媒体にロッドを用いた場合は、セルロースの結晶化度を0%に低下させた非晶化セルロースを効率的に得ることができることが分かる。更に、製造例1〜6で得られた非晶化セルロースは、比較製造例2〜5に比べて、適度な平均粒径を有していた。
表3及び表4の結果から、実施例1〜4に示した本発明の糖の製造方法は比較例1〜4に比べてその生産性が高く、また表5の結果から、生成糖の大部分がグルコースであり、発酵によるエタノールや乳酸の生産のための原料の製造方法として有用であることが分かる。更に表6の結果から酵素製剤の種類を問わず効率的な糖製造が可能であること、また表7及び表8の結果から、セルラーゼ製剤に更にβ−グルコシダーゼを追加することでより効率的な糖製造が可能なことが分かる。更に表9及び表10の結果から、本発明の糖の製造方法は、パルプのみならず、上質紙、ダンボールや新聞紙等の紙類、籾殻等の植物殻類等、また各種木材等、各種セルロース含有原料に対して有効であることが分かる。
From Table 1 and Table 2, the manufacturing method of the non-crystalline cellulose of Production Examples 1 to 6 efficiently obtains non-crystalline cellulose having a reduced crystallinity of cellulose as compared with Comparative Production Examples 1 to 5. It can be seen that it is excellent in productivity. Further, comparing Production Example 1 and Comparative Production Example 1, when a rod is used as the medium of the vibration mill, it is possible to efficiently obtain amorphous cellulose having a cellulose crystallinity reduced to 0%. I understand that I can do it. Furthermore, the non-crystalline cellulose obtained in Production Examples 1 to 6 had an appropriate average particle size as compared with Comparative Production Examples 2 to 5.
From the results of Table 3 and Table 4, the production methods of the sugars of the present invention shown in Examples 1 to 4 have higher productivity than Comparative Examples 1 to 4, and from the results of Table 5, the production sugars are large. It turns out that a part is glucose and is useful as a manufacturing method of the raw material for production of ethanol and lactic acid by fermentation. Furthermore, from the results in Table 6, it is possible to produce sugar efficiently regardless of the type of enzyme preparation. From the results in Tables 7 and 8, it is more efficient by adding β-glucosidase to the cellulase preparation. It turns out that sugar production is possible. Furthermore, from the results of Tables 9 and 10, the sugar production method of the present invention is not limited to pulp, but also high-quality paper, paper such as cardboard and newspaper, plant shells such as rice husks, various woods, and various celluloses. It turns out that it is effective with respect to a containing raw material.
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸等の発酵生産等に有用である。 The sugar production method of the present invention is excellent in productivity and can efficiently obtain sugar. The obtained sugar is useful for production of fermentation such as ethanol and lactic acid.
Claims (7)
セルロースI型結晶化度(%)=〔(I22.6−I18.5)/I22.6〕×100 (1)
〔I22.6は、X線回折における格子面(002面)(回折角2θ=22.6°)の回折強度、及びI18.5は、アモルファス部(回折角2θ=18.5°)の回折強度を示す〕 A method for saccharifying non-crystalline cellulose prepared from a cellulose-containing raw material having a cellulose I-type crystallinity of more than 33% represented by the following calculation formula (1), wherein water is removed from the raw material The cellulose content is 20% by mass or more , the moisture content of the cellulose-containing raw material is 20% by mass or less, and the cellulose-containing raw material is a raw material pretreated with an extruder , and the cellulose-containing raw material is After processing with a vibration mill filled with a rod to prepare an amorphous cellulose having a cellulose I crystallinity reduced to 33% or less, cellulase and / or hemicellulase is allowed to act on the amorphous cellulose for saccharification. , Production method of sugar.
Cellulose type I crystallinity (%) = [(I 22.6 -I 18.5 ) / I 22.6 ] × 100 (1)
[I 22.6 is the diffraction intensity of the lattice plane (002 plane) (diffraction angle 2θ = 22.6 °) in X-ray diffraction, and I 18.5 is the diffraction intensity of the amorphous portion (diffraction angle 2θ = 18.5 °). Show
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008207290A JP5385561B2 (en) | 2007-12-27 | 2008-08-11 | Method for producing sugar |
PCT/JP2008/073265 WO2009084492A1 (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Process for producing saccharide |
KR1020107014066A KR20100102133A (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Process for producing saccharide |
ES08868615T ES2393164T3 (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Saccharide Production Procedure |
CN2008801205938A CN101896615B (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Process for producing saccharide |
CA2710504A CA2710504A1 (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Process for producing saccharide |
US12/810,586 US20110003341A1 (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Process for producing saccharide |
EP08868615A EP2225387B1 (en) | 2007-12-27 | 2008-12-16 | Process for producing saccharide |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007338060 | 2007-12-27 | ||
JP2007338060 | 2007-12-27 | ||
JP2008207290A JP5385561B2 (en) | 2007-12-27 | 2008-08-11 | Method for producing sugar |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009171951A JP2009171951A (en) | 2009-08-06 |
JP5385561B2 true JP5385561B2 (en) | 2014-01-08 |
Family
ID=41027801
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008207290A Expired - Fee Related JP5385561B2 (en) | 2007-12-27 | 2008-08-11 | Method for producing sugar |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5385561B2 (en) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012005359A (en) * | 2010-06-22 | 2012-01-12 | Kao Corp | Method for manufacturing monosaccharide, disaccharide, and/or oligosaccharide |
WO2012077684A1 (en) * | 2010-12-09 | 2012-06-14 | 花王株式会社 | Method for producing sugar |
BR112014001536B1 (en) * | 2011-07-25 | 2021-01-26 | Kao Corporation | method for making pulverized material and vibrant spray |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62236801A (en) * | 1986-04-08 | 1987-10-16 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Production of soluble cellulose |
JP2001095594A (en) * | 1999-09-30 | 2001-04-10 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Production of glucose and cellooligosaccharide |
JP2001238690A (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-04 | Tsukishima Kikai Co Ltd | Method for saccharifying waste paper |
JP4581320B2 (en) * | 2002-09-27 | 2010-11-17 | 日本製紙株式会社 | Powdered cellulose and process for producing the same |
JP2005068140A (en) * | 2003-08-07 | 2005-03-17 | Nippon Paper Chemicals Co Ltd | Method for producing cellooligosaccharide |
JP5126728B2 (en) * | 2004-11-12 | 2013-01-23 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Lignocellulosic biomass processing method |
JP4431106B2 (en) * | 2004-12-27 | 2010-03-10 | 日本製紙ケミカル株式会社 | Method for producing cellooligosaccharide |
JP2006290972A (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-26 | Asahi Kasei Chemicals Corp | Gelatinizing agent having highly dispersible cellulose composite and at least one polysaccharide |
JP4866689B2 (en) * | 2005-09-08 | 2012-02-01 | 日清製粉株式会社 | Method for saccharification of lignocellulosic plant material |
JP2007082415A (en) * | 2005-09-20 | 2007-04-05 | Asahi Kasei Chemicals Corp | Gelling agent |
-
2008
- 2008-08-11 JP JP2008207290A patent/JP5385561B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009171951A (en) | 2009-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2225387B1 (en) | Process for producing saccharide | |
JP6063661B2 (en) | Method for producing pulverized material | |
WO2010050223A1 (en) | Saccharide production process and ethanol production process | |
JP5442284B2 (en) | Pretreatment method for enzymatic hydrolysis treatment of herbaceous biomass and ethanol production method using herbaceous biomass as raw material | |
JP5339250B2 (en) | Method for producing enzyme solution and method for producing sugar | |
WO2013136940A1 (en) | Method for producing saccharide | |
JP5385561B2 (en) | Method for producing sugar | |
JP2013230142A (en) | Method for producing organic acid | |
JP5019421B2 (en) | Method for producing sugar | |
JP5385563B2 (en) | Method for producing sugar | |
JP5693286B2 (en) | Saccharification method of woody biomass | |
JP2011010617A (en) | Cellulose-containing raw material for producing sugar | |
JP2014117207A (en) | Manufacturing method of sugar | |
WO2013038940A1 (en) | Method for producing sugar | |
CN114277067B (en) | Method for producing PHA material by utilizing bast fibers | |
JP7411178B2 (en) | Method for producing alcohol from wood materials containing cellulose | |
JP2014176300A (en) | Method for producing sugars | |
JP2015159755A (en) | Method for producing ethanol from lignocellulose-containing biomass | |
JP2013255430A (en) | Method for producing sugar | |
JP2022084519A (en) | Methods for producing porous cellulose particles | |
JP2013192472A (en) | Method for producing sugar | |
KR20150117598A (en) | Apparatus and Method for Simultaneous Operation of Refining Cellulosic Biomass and Mixing Enzymes | |
WO2011162249A1 (en) | Method for manufacturing a monosaccharide, a disaccharide, and/or an oligosaccharide | |
JP2014117208A (en) | Manufacturing method of sugar | |
WO2012077684A1 (en) | Method for producing sugar |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110614 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130423 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130624 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130910 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131004 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |