JP5362349B2 - タンパク質を精製する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、組換えタンパク質を、好熱性細菌に由来する特定のグループの陽性に荷電したタグを用いることによって精製する方法に関する。
細菌又は真核生物からの天然の又は非天然の組換えタンパク質の精製は、しばしば幾つかの工程を必要とする。標的蛋白質の精製において工程数を減らした方法は、組換えタンパク質の安価で効率的な産生に有利である。小さな高度に塩基性のドメインに融合した標的蛋白質の精製は、Graslund等およびGraslund等〔Graslund et al., Protein Eng. 2000 ,13(10):703-709, Graslund et al., J Chromatogr A. 2002, 942(1-2):157-166およびGraslund et al., Journal of Biotechnology, 2002, 96: 93-102〕によって開示されている。これらの文献は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて大腸菌で発現された異なる標的タンパク質を精製するための、S.aureusのプロテインAのZドメインの小さく高度に塩基性で安定な変異体の合理的なデザインを記載している。Zドメインの高度に塩基性の誘導体を融合タグとして使用することは、WO00/6343に開示されている。
一側面において、本発明は、組換えタンパク質を精製するための方法に関し、該方法は好熱性細菌からの高度に塩基性のタンパク質を精製タグとして、陽イオン交換クロマトグラフィーの精製工程に使用することを備える。
MSKTIVRKNESIDDALRRFKRAVSKTGTLQEVRKREFYEKPSVRRKKKSEAARKRK(配列番号1);
MGKKTVGVKKRLAKAYKQNRRAPVWITVKTKRSVFGSPKRRHWRRSKLKV(配列番号2);
MKRTYQPSRRKRKRTHGFLARKRTPGGRRVLKNRRRKGRWRLTV(配列番号3);
MGKGDRRTRRGKIWRGTYGKYRPRKKK(配列番号4)および
MAKVKMKTNRSAAKRFKVTAKGKIKRWKSGGAHYNTKKSSKRKRHLRKHTYVKDNMLKHVKALLKEF(配列番号5)。
MPKHSKRYLEARKLVDRTKYYDLDEAIELVKKTATAKFDETIELHIQTGIDYRKPEQHIRGTIVLPHGTGKEVKVLVFAKGEKAKEALEAGADYVGAEDLVEKIEKEGFLDFDVAIATPDMMRIIGRLGKILGPRGLMPSPKSGTVTQEVAEAVKEFKKGRIEVRTDKTGNIHIPVGKRSFDNEKLKENIIAAIKQIMQMKPAGVKGQFIKKVVLASTMGPGIKLNLQSLLKE(配列番号20),
MAQVDLLNVKGEKVGTLEISDFVFNIDPNYDVMWRYVDMQLSNRRAGTASTKTRGEVSGGGRKPWPQKHTGRARHGSIRSPIWRHGGVVHGPKPRDWSKKLNKKMKKLALRSALSVKYRENKLLVLDDLKLERPKTKSLKEILQNLQLSDKKTLIVLPWKEEGYMNVKLSGRNLPDVKVIIADNPNNSKNGEKAVRIDGLNVFDMLKYDYLVLTRDMVSKIEEVLGNEAGKALTA(配列番号21),
MRYEYVPLKDQYEKEIVPALMKEFNYKNIHQVPKLVKIVINMGIGEGSRNYDLIERHANELAKITGQKPIVTRARKSISNFKIRKGMPIGLKVTLRGARMYNFLYKLINIVLPKVRDFRGLDPNSFDGRGNYSFGLSEQLVFPELNPDEVRRIQGMDITIVTTAKTDQEARRLLELFGMPFKRG(配列番号22),
MSRLAKKPIVLPQGVTVEIKDNVVKVKGPKGELSQEFLPYVKIEVEGNEV WVRPNEEQIIRKSDWRKVKMFQGTYWSLIRNMVVGVTEGYKKELEIVGIGYRAQLQGNTLVMNLGYAHPVVYEIPSDVKIEVPAPNRIIVSGIDKQRVGQVAAEIRAFRPPNVYTGKGIRYVGEVVRQKEGKKA(配列番号23),
MKVILLRDVPKIGKKGEIKEVSDGYARNYLIPRGFAKEYTEGLERAIKHEKEIEKRKKEREREESEKILKELKKRTHVVKVKAGEGGKIFGAVTAATVAEEISKTTGLKLDKRWFKLDKPIKELGEYSLEVSLPGGVKDTIKIRVEREE(配列番号24),
MLTRQQKELIVKEMSEIFKKTSLILFADFLGFTVADLTELRSRLREKYGDGARFRVVKNTLLNLALKNAEYEGYEEFLKGPTAVLYVTEGDPVEAVKIIYNFYKDKKADLSRLKGGFLEGKKFTAEEVENIAKLPSKEELYAMLVGRVKA PITGLVFALS GILRNLVYVLNAIKEKKSE(配列番号25),
MARYFPVQKTTMIKPEEVERKWYVVDASGKVLGRLATRIAKILMGKHKPN YTPHVDTGDYVIVVNADKVVLTGKKLDQKVYYWHSGYPGGLKSLTARQML EKHPERLIWLAVKRMLPKNRKGRKMLKRLKVYASPEHPHQAQKPEPIEL(配列番号26),
MRLEDLRPTPGAMKKRKRVGRGPGSGHGKTSGRGHKGQKARGSGKVHIWFEGGQTPLQRRLPKRGFKNINKKVYAVVNVKVLEERFEANEEVTPEKLIERKIIKDLKDGVKILGDGELTKPLVVKAHAFSKSAVEKIESAGGKAEVI(配列番号27),
MRHRVKRHKLGRYGSHRKSLLRNLSREIVEHGSIVTTTAKAKALKTFMDKLVSKAIEAATTDDRARSVHLRRQINAVLGDRRLTNKLVDEIAKNYVGRRGGYVRVLRIGFRRGDAAEMSLVQLVEASSQEG(配列番号28),
MDHLVKIIEKKYEKKEIPDFRPGDTVRVHVKVIEGDRERTQVFEGIVIAKRGSGINKTFTVRRIGSHGVGVERIFPVHSPVVEKIEVVRKGKVRRAKLYYLRNVRGKIRIKERRD(配列番号29),
MRVKRAVHAKKKRKKYLKAAKGYRGALSRRYKLAKQMYVRSKWYSYVGRKQKKRDMRKLWITRINIAARNEGLKYSELIHGLKLAGVSINRKMLSELAVNDPEAFKEYVKIAKEALAS(配列番号30),
MLYAIVETAGRQYRVEEGKILYTEKQKDYSPGDEIVFDRVVFVRKDGEVLVGKPYVEGAKVVGKVLEHAKARKVKTVKYRPRKNSKVEKGHRQWYTAIKIEKIEL(配列番号31),
MKQEKLSLHDVLIRPIITEKALILREQRKYVFEVNPLANKNLVKEAVEKLFNVKVEKVNILNMKPKPKRRGIFEGKTRSWKKAVVTLKEGYTIKELEGEH(配列番号32),
MAHKKSGGVAKNGRDSLPKYLGVKVGDGQIVKAGNILVRQRGTRFYPGKNVGMGRDFTLFALKDGRVKFETKNNKKYVSVYEE(配列番号33),
MKASELRNYTDEELKNLLEEKKRQLMELRFQLAMGQLKNTSLIKLTKRDI ARIKTILRERELGIRR(配列番号34),
MPKKLKIKLVKSPIGYSWDQKDTVKRLGLKKLNQVVIKDDLPQIRGMIRK VKHLVEVEEIEEGGSNA(配列番号35),
MKRTYQPSRRKRKRTHGFLARKRTPGGRRVLKNRRRKGRWRLTV(配列番号36),
MPKVKTNRSAAKRFRITKNGKIMRNHAYRSHKTGKKRRNALRALRKKDVVSSADKNRVLRLLGKK(配列番号37),
MGQKVHPRGFRLGLSADWQAKWFNEKNYKEWLLEDEEIRKIIKNKYYHAGISEIYVERPDAERINITVKTARPGIIIGRKGSEITSLREELERKFNRRVVINIEEIKTPELDAQLVAESIASRIEKRASYKVAMKRAIMNAMRKGAQGIKVMVAGRLGGAEIARREWYLRGRLPLQKIKAIIDYGTATAWTKYGTIGIKVWIYKGDADI(配列番号38),
METQGVMKEIQYEEFEEKIIEIRRTSKVTKGGKNLSFRVVAIVGNKNGKVGLGIGKAREVPEAIRKAISAAKRNIVEVPVINGTIPHEVIGRQDASKVLLKPAAPGTGIIAGGTVRAVVELAGIQNILTKSLGSTNPLNLALATMNGLKNLLDPRKVAKLRDISVEEVFKGVRRENNA(配列番号39),
MVSLDPEKKNEIIKEFQIHENDTGSVEVQIALLTARIKHLTEHLRKHPKDFHSRRGLMKMIGRRRKMLKYLRHKKPEVYRELIAKLGIRK(配列番号40),
MGRSRKKGPYVDRKLLEKIRKLNETGEKKVIKTWSRASMIIPEMVGHTIAVYNGMKHIPVYITENMIGHRLGEFAPTRRFGGHADKKAKKGELKK(配列番号41)および
MPNIKSAKKRVRVSEKRRLRNKAYKTFFKNRIKEVLKAIENKEPKEVVLELTRKAQAAIDKAVSKGVIHKNQGARRKARLFEKVNEYLRTLETTQE(配列番号42)。
好熱性細菌の株は、~50゜Cから水の沸点以上にわたる至適温度で同定されてきた。極度に高い温度で生存する株は、超好熱菌(hyperthermophiles)または好熱菌(thermophiles)と呼ばれ、80゜C(176゜F)以上の至適温度を有する。好熱性細菌は、温泉、温かい土壌(hot soils)、地熱の噴出孔(geothermal vents)および高温が存在する他の場所で発生する。RS21_BACST(配列番号1)がクローン化され、タグとして使用された細菌(Bacillus stearothermophillus)は、例えば、多くの土壌で65゜C以上で成長する。高温で生存するために、これらの生物体は中温菌(mesophiles)のものと比較してより安定なタンパク質を進化させてきた。
哺乳類細胞におけるDNAの転写を方向付けるための適切なプロモーターの例は、SV40プロモーター(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864)、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 - 814)、CMVプロモーター(Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985)、またはアデノウイルス2主要後期プロモーター(Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982)である。
本発明において、「好熱性微生物(Thermophilic microorganisms)」は、約 50゜C〜約 100゜Cで至適に成長する生物を意味し、通常、30〜37 ゜Cの温度で至適に成長する中温菌(mesophiles)と対照される。「好熱性細菌(thermophilic bacteria)」の用語は、同様に超好熱性細菌を包含する。
精製タグ 配列番号1および異なるリンカーに融合された大腸菌におけるhGHのクローニングおよび発現
1. クローニング
配列番号1は、好熱菌(Bacillus stearothermophillus)のシークエンスされたゲノムに由来する30Sリボソームタンパク質S21である。タグの分子量は6.7 kDaと計算され、タグのpIは11.3と計算された。ヒトhGHに融合された場合に、配列番号6を有するリンカーを含んでいる融合タンパク質(NNC20)は、29.9 kDaの分子量および9.2のpIを有するだろう。
95゜C: 3 min.(変性)
94゜C: 45 sec(変性)
50゜C: 45 sec(アニーリング)
72゜C: 45 sec(伸長)
15サイクル
72゜C: 10min
第2のPCR反応に関して、第1反応からのPCR産物の1/50希釈物を鋳型として使用した。また、前記遺伝子の5’および3’-端を含んでいるプライマーを使用して、完全長のタグを増幅した。第2のPCR反応に関するPCR条件は、最初のものと同じであった(但し、アニーリング温度は54゜Cに、サイクル数は25に増加された)。
hGHの融合構築物をコード化しているプラスミドで形質転換した大腸菌BL21細胞を、37゜CでOD600を~0.6にまで成長させた。温度を、次に25゜Cに約30min低下させた。0.5または1mMのIPTGを、培養物に3時間添加した。細胞を、次に遠心分離で収穫した。SDS-PAGE分析によって、正しいサイズのhGH融合タンパク質が大腸菌中に誘導されることが可視化された。IPTGでの誘導後に得られた完全長の融合タンパク質の量に差を示す異なる構築物間の比較。このようにNNC20.3を、NNC20、NN20.1、NN20.2およびNN20.2に関して観察されたよりも高収量で発現させた。
最初に、異なる塩濃度およびpHを有している異なる緩衝液中に溶解したペレットを用いる結合アッセイによって、次の事項が示された;その事項とは、前記融合タンパク質が、9までのpHと0.3 MのNaClまでの塩濃度とでSPセファロースFFマトリックス(アマシャムファルマシア)に効率的に結合することである。このことは、配列番号1-hGHタンパク質を、非常に少ない他のタンパク質のみが前記マトリックスに結合できるはずであろう条件で精製できることを指摘している。
緩衝液A: 25mM リン酸ナトリウム, 5mM EDTA, pH8, 0.3M NaCl
緩衝液B: 25mM リン酸ナトリウム, 5mM EDTA, pH8,1M NaCl,
緩衝液C: 2M NaCl
事前に充填されたSP FF(HR5/5)カラム(アマシャムファルマシア)を、緩衝液Aを5カラム容量(CV;column volumes)適用することによって平衡化した。NNC20を含有している適用物を、前記カラムに適用し、非結合のサンプルを緩衝液Aで20CVで洗浄した。0-50%緩衝液Bのグラジエントを、20CVで使用した。最終的に、緩衝液Cを10CV用いた定組成ステップ(isocratic step)を、標的タンパク質を前記カラムから溶出させるために使用した。
NNC20.3を、pNNC20に関して記載したとおり大腸菌(BL21)中で発現させた(但し、僅か0.5 mMのIPTGを融合タンパク質を誘導するために使用した)。40mlの培養物からのペレットを、OD600を5まで、25 mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7に溶解し、細胞片を遠心分離で除去した。生じた上清を、濾過滅菌し、以下の緩衝液を用いたAKTAエキスプロラ(流速 0.5ml/min)で精製した、使用した該緩衝液を以下に示す:
緩衝液 A: 25mM リン酸ナトリウム pH7
緩衝液 B: 25mM リン酸ナトリウム pH7および1M NaCl
SP FFマトリックス(アマシャムファルマシア)を手で充填した1 mlカラムを、緩衝液Aで5カラム容量(CV)で平衡化した。NNC20.3を含有している適用物を、前記カラムに適用し、非結合のサンプルを緩衝液Aを7CV適用することで洗浄した。0-100%の緩衝液Bのグラジエントを、融合タンパク質が約0.5Mの濃度のNaClで溶出される間に20CV使用した。主なピークに存在する融合タンパク質の純度は、ImageJ分析ソフトウェア(Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2005)を用いて約90%であると見積もられた。図3Aは、およそ最大半減(half maximal)の伝導率でNNC20.3の溶出を示しているクロマトグラムを示す。
大腸菌における配列番号2、配列番号15およびhGHの融合構築物のクローニングおよび発現
配列番号2は、好熱菌(Archaeoglobus fulgidus)のシークエンスされたゲノムに由来する30Sリボソームタンパク質L39である。
緩衝液A: 20mM リン酸カリウム pH7
緩衝液B: 20mM リン酸カリウム pH7 および 1M NaCl
SP FFマトリックス(アマシャムファルマシア)を手で充填した1 mlカラムを、緩衝液Aで5カラム容量(CV)で平衡化した。タグを付けたhGHを含んでいる適用物を前記カラムに適用し、未結合のサンプルを緩衝液Aを5CVで適用することによって洗浄した。0-100%緩衝液Bのグラジエントを20CVで使用し、その間に標的タンパク質を溶出した。主なピークに存在する標的タンパク質の純度は、約90%であると見積もられた。図3Bは、配列番号2、配列番号15、およびhGHの融合産物の約 0.8M NaClでの溶出を示しているクロマトグラムである。
hGH_Leu-Alaバリアントのクローニング。
Thermotoga maritimaから増幅された精製タグを有する23のhGH-Leu-Ala構築物を、Rosetta(DE3)系統に形質転換した。細胞を、~0.4〜0.6のOD600に37゜Cで成長させた。次に温度を、30゜Cに約30min低下させた。0.5 IPTGを、培養物に3時間添加した。全ての構築物は、予想されたサイズの明瞭なタンパク質バンドを呈した。発現レベルは、構築物の間で幾らか異なっていた。それら全ては、10mMリン酸緩衝液中で超音波処理後に約50%から80%以上の間の可溶性を示した。
緩衝液 A: 25 mM Na2HPO4 NaH2PO4 pH7
緩衝液 B1:25 mM Na2HPO4 NaH2PO4 pH7 0.5M NaCl
緩衝液 B2: 25 mM Na2HPO4 NaH2PO4 pH7 1M NaCl
1) カラムを5mlの水, 2mlの緩衝液A, 3mlの緩衝液B2で洗浄する
2) 6mlの緩衝液Aで平衡化する
3) 細胞上清を適用し、フロースルー(FT)を収集する
4) 3mlの緩衝液Aで洗浄し、FTを収集する
5) 2mlの緩衝液B1で溶出し、FTを収集する
6) 2mlの緩衝液B2を溶出し、FTを収集する
ACSH122およびACSH200は、0.5MのNaClで殆ど完全に溶出された。また、ACSH198, ACSH199およびACSH74は、0.5および1MのNaClの両方で溶出され、前記カラムとの強い相互作用が指摘された。融合タンパク質はACSH74に関するフロースルー中に全く観察されなかったが、残りのものは結合の効率性に差を示した。
ACSH74の精製
ACSH74を、BL21(DE3)で発現させ、例1のNN20.3に関して記載のとおり精製した。結果は、NN20.3に関して得られた結果と殆ど同じであり、C末端におけるLeu-Ala伸展部が前記タグと前記SP FFとの結合に影響しなかったことを指摘している。
40mlの培養物からのペレットを、例1のNN20.3に関して記載のとおり25 mMのNaPO4(pH7)中で超音波処理した。精製を、AKTAエキスプロラ(アマシャムファルマシア)で、流速5 ml/minでHiTrap5ml SP FFカラム(アマシャムファルマシア)と以下に記す緩衝液とを用いて行った:
緩衝液 A: 25mM リン酸ナトリウム, pH 7
緩衝液 B: 25mM リン酸ナトリウム, pH 7 + 1M NaCl
前記カラムを、緩衝液Aを5カラム容量(CV)適用することで平衡化した。ACSH131またはACSH130を含有している適用物を、前記カラムに適用し、未結合のサンプルを緩衝液Aを7カラム容量を適用することで洗浄した。0-100%の緩衝液Bのグラジエントを、20CVで使用した。ACSH131およびACSH130を、前記カラムから約50%の緩衝液B(0.5 NaCl)で溶出した。ACSH131およびACS130の双方に関して、SP FFへの結合は、NN20,NN20.3およびACSH74に関して観察されたものよりも効率が低いが、純度は同様に高いレベルであった。
インスリンアンタゴニストS661融合タンパク質のクローニング
S661は、インシュリンレセプターアンタゴニストである。前記ペプチドは、1つのジスルフィドブリッジ(disulphide bridge)を具備し、以下に記す配列を有する:
配列番号43: GSLDESFYDWFERQLGGGSGGSSLEEEWAQIQCEVWGRGCPSY。
98゜C 30 sec,
98゜C 10sec(変性)
50゜C 30 sec(アニーリング)
72゜C 15 sec(伸長)
10 サイクル
72゜C 5 min
第1のPCR産物を、2%アガロースゲルから切り出し、GFXキット(GE Health care)で精製し、1/50に希釈し、最終のPCR反応のために鋳型として使用した。第2のPCR反応を、XhoIおよびBamHIクローニング部位を含んでいる最も末端の2つのプライマーで、同じ条件を用いて行なった(但し、最初の反応に関して、アニーリング温度として55゜Cが使用され、15サイクルが使用された)。予想されたサイズのバンドを、2%アガロースゲルから切り出し、GFXキット(GE Health care)で精製し、製造者によって記載されたとおりpCRIITOPOベクター(インビトロゲン)へと連結した。正しい配列を有するクローンを、単離した。S661挿入物を、XhoIおよびBamHIで放出させ、hGH-Leu-AlaがXhoI/BamHIで切り出される異なるhGH-Leu-Ala構築物のベクター部に連結した。これによって、異なるリンカーを有するS661配列のN末端に連結された異なる精製タグを有する以下の構築物が作出された、つまり:
pACSH197-ACSH201を、Rosetta(DE3)(Novagen)に形質転換した。これらを、製造者の記載にしたがってアンピシリンおよびクロラムフェニコールの存在下で培養した。細胞を、~0.4〜0.6のOD600まで37゜Cで成長させた。温度を、次に30゜Cに約30min低下させた。次に、タンパク質合成を、0.5mMのIPTGで3時間30゜Cで誘導した。誘導したタンパク質を有する細胞を、遠心分離で収穫した。SDSでの評価によって、全ての構築物が、発現レベルおよび可溶性が若干の差異を伴うが、予想されたサイズのタンパク質を発現したことが示された。
ACSH200を200mlの培地で30゜Cで3時間発現させた大腸菌Rosetta(DE3)の40ml培養物(最終的なOD600=1.6)からの細胞を、10 mlの25mMリン酸ナトリウムpH8.5で超音波処理した。細胞片を、遠心分離で除去した。そして、適用物を、濾過滅菌し、20mlまで25mMリン酸ナトリウム緩衝液で希釈した。溶解度は、この融合タンパク質に関して>80%であった。精製を、AKTA エキスプロラ(アマシャム ファルマシア)でHiTrap SP-FF, 5mlカラムを用いて5ml/minの流速で行なった。以下の緩衝液を使用した、即ち:
緩衝液 A: 50mM リン酸ナトリウム, pH 8.5
緩衝液 B: 50 mM リン酸ナトリウム, pH 8.5 + 1 M NaCl
5mlのSP FF(HR5/5)カラム(アマシャムファルマシア)を、緩衝液Aを5カラム容量(CV)適用することによって平衡化した。ACSH200を含有している適用物を、前記カラムに適用し、非結合のサンプルを緩衝液Aで5CVで洗浄した。0-100%の緩衝液Bのグラジエントを、20CVで使用した。ACSH200を、約 30 %の緩衝液B(0.3 M NaCl)で溶出した(図3A)。溶出した融合タンパク質を含有しているフラクションを、収集した。クロマトグラムの主なピークに存在する融合タンパク質の純度を、SDS-PAGE(図3B)およびソフトウェア分析で評価した。タンパク質はフロースルー中で検出されず、全てのタンパク質がSP FFカラムに結合したことを指摘している。ACSH200の主なピークの範囲のフラクションのクマシー染色したSDS PAGEゲルによって、タンパク質の純度は~90%であると評価された。類似する精製をpH7で行い、同じmAUシグナルが得られた(しかしながら、幾分低い純度である)、このことは精製されたタンパク質の回収が緩衝液のpH 8.5で影響されなかったことを指摘している。このことは有利である。というのも、より少ない夾雑タンパク質が、pH 8.5で前記カラムに結合できるからである。
精製で得たフラクション25を、リン酸ナトリウム緩衝液で1:1で希釈し、20uLをLC-MSD_TOF(Agilent technologies)機器で、分析用のPoroshell 300SB-C8, Micro Bore 1.0 x 75 mm, 5 micron(Agilent Technologies)カラムを用い、流速0.3 ml/minおよびカラム温度70゜Cの標準的なHPLC条件で分析した:グラジエント溶出は20minで形成され、8.8 mMのギ酸アンモニウムを0.1%ギ酸水中に含有するもの(緩衝液A)およびアセトニトリル(緩衝液B)を用いて以下の通り実施した:
LC-MS分析でえられたTIC(全イオン数)クロマトグラムは、主に1つのピークを示した。このピークの抽出されたデコンボリューションスペクトラム(extracted deconvoluted spectrum)は、14810.41 Daの質量を有するピークを示した;これはN末端メチオニン(これは大腸菌のメチオニンアミノペプチダーゼによって除去される)がないACSH200の予想された質量14810.45 Daに非常に近い(図4C)。融合タンパク質の分子量は、50mM DTTで1時間処理することによって~2Da変化した。全体として、これによって次の事項が示唆される;その事項とは、ジスルフィドブリッジが、前記タンパク質において正しく樹立され、これによってRL27_THEMA(配列番号33)タグがジスルフィドブリッジの正しい樹立に干渉しないことが示されることである。
ACSH199およびACSH198の精製を、ACSH200に関する記載のとおり実施した。
大腸菌の夾雑物の熱沈降
モデルタンパク質としてのACSH200に関して、タグの熱安定性により融合タンパク質を溶液中に保持しえる間に、大腸菌夾雑物を高温で熱沈殿できるかどうかが調査された。
精製タグに融合させたヒトアミリンのクローニング:
ヒトアミリンは、次の37aaを含んでいる小さいペプチドホルモンである:
配列番号44: KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY
ヒトアミリン配列のヌクレオチド配列は、大腸菌中での至適な発現に至適化されたコドンである。コード配列は、~50bp長の6プライマーと全体のヒトアミリン配列にわたる~20bpのオーバーラップとを用いるSOE PCRで産生された。同じ一般的な方法論およびクローニング部位(XhoI/BamHI)を、例4のS661に関して記載されたとおり使用した。次の構築物をクローン化した:
発現を、例4のS661構築物に関して記載されたとおり実施した。正しいサイズのタンパク質バンドを、全ての構築物に関して取得した。二重のバンドがACSH202,ACSH203に関して観察され、LC-MS分析は未知の大腸菌プロテアーゼによるアミリン配列の切断を指摘した。
ACSH204の精製を、例4に記載のとおり緩衝液Aおよび緩衝液B(但し、pH7)を用いて、上記のとおり実施した。フラクションを収集し、分析した。
Claims (33)
- 真核生物または原核生物の宿主細胞において発現された組換えタンパク質を精製するための方法であって、9を超えるpIを有する、好熱性細菌からの塩基性のタンパク質を前記組換えタンパク質の精製タグとして、陽イオン交換クロマトグラフィーの精製工程に使用することを備え、前記精製タグが、配列番号1、2、24、31、32および33により表されるペプチド配列の群から選択される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグは、10を超えるpIを有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグは、9および12.5の間のpIを有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、好熱性細菌からのタンパク質がリボソームタンパク質である方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグは、システイン残基を含まない方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグ中のアミノ酸残基の少なくとも 15%が塩基性アミノ酸残基LysおよびArgである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグ中のアミノ酸残基の20%〜30%が塩基性アミノ酸残基LysおよびArgである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグ中のアミノ酸残基の35%〜50%が塩基性アミノ酸残基LysおよびArgである方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグが、
MSKTIVRKNESIDDALRRFKRAVSKTGTLQEVRKREFYEKPSVRRKKKSEAARKRK(配列番号1);および
MGKKTVGVKKRLAKAYKQNRRAPVWITVKTKRSVFGSPKRRHWRRSKLKV(配列番号2)からなるペプチド配列の群から選択される方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記好熱性細菌は、50℃より高い成長至適温度を有している古細菌または真正細菌である方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記好熱性細菌は、 50℃〜 100℃の成長至適温度を有する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記精製タグは、標的タンパク質に与えられる精製タグのインビトロ切断のための切断部位を含むリンカー配列を具備する方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記リンカーは、1〜30のアミノ酸残基を有する方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記リンカーは、1〜15のアミノ酸残基を有する方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記リンカーは、Pro, Leu および Alaからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記リンカーは、エンテロキナーゼ切断部位、Xa因子切断部位、トロンビン切断部位、TEV プロテアーゼ切断部位、およびHRV14 3Cプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される切断部位を含む方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記リンカーが、RRGGSDDDDK(配列番号6);SSSDDDDK(配列番号7);SSSSTSSSSTDDDDK(配列番号8);SSSSTLAAPFDDDDK(配列番号9);ALAAPFDDDDK(配列番号15)からなる群から選択されるペプチド配列を有する方法。
- 組換え型のタンパク質を作出するための方法であって、i)適切な宿主において、配列番号1、2、24、31、32または33により表される、N末端またはC末端の精製タグを含んでいるタンパク質を発現させること、ii)発現したタンパク質を、陽イオン交換カラムに適用すること、及びiii)前記タンパク質を、適切な溶出液で溶出することを備え、前記精製タグは9を超えるpIを有する方法。
- 請求項18に記載の方法であって、好熱性細菌からのタンパク質がリボソームタンパク質である方法。
- 請求項18に記載の方法であって、iv)引き続き前記精製タグを適切な切断剤(cleaving agent)で切断するための切断部位を切断して、標的タンパク質を生じさせることを備える方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記精製タグ中のアミノ酸残基の少なくとも15%〜30%が塩基性アミノ酸残基LysおよびArgである方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記精製タグ中のアミノ酸残基の少なくとも35%〜50%が塩基性アミノ酸残基LysおよびArgである方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記好熱性細菌は、50℃より高い成長至適温度を有している古細菌または真正細菌である方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記宿主が、細菌および真菌類から選択される方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記タグは、標的タンパク質に与えられる精製タグのインビトロ切断のための切断部位を含むリンカー配列を具備する方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記リンカーは、1〜30のアミノ酸残基を有する方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記リンカーは、1〜15のアミノ酸残基を有する方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記リンカーは、Pro, Leu および Alaからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記切断部位は、エンテロキナーゼ切断部位、Xa因子切断部位、トロンビン切断部位、TEV プロテアーゼ切断部位、およびHrv14 3Cプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される方法。
- 請求項18に記載の方法であって、さらに工程ii)の陽イオン交換カラム工程の前に、熱不安定(thermolable)な宿主細胞の夾雑物を沈殿させるための熱沈殿工程を備える方法。
- 請求項12〜17, 20および25〜28の何れか1項に記載の方法であって、前記標的タンパク質が、ヒトhGH又はその機能的なアナログである方法。
- 請求項31に記載の方法であって、前記標的タンパク質が、hGH-Leu-AlaまたはSer-hGHである方法。
- 請求項30に記載の方法であって、30〜200mMのNaClが、熱沈殿工程の前に添加される方法。
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