TWI490333B - 用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法 - Google Patents

用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI490333B
TWI490333B TW102148375A TW102148375A TWI490333B TW I490333 B TWI490333 B TW I490333B TW 102148375 A TW102148375 A TW 102148375A TW 102148375 A TW102148375 A TW 102148375A TW I490333 B TWI490333 B TW I490333B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
bacterium
genus
alkaline protease
cultivating
medium
Prior art date
Application number
TW102148375A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201525133A (zh
Inventor
Yin Lung Han
Tai Rong Guo
Jo Shu Chang
Yung Chong Lou
Chieh Lun Cheng
Wan Ju Yu
Chih Hsi Liu
Original Assignee
Ind Tech Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ind Tech Res Inst filed Critical Ind Tech Res Inst
Priority to TW102148375A priority Critical patent/TWI490333B/zh
Priority to US14/229,596 priority patent/US9790463B2/en
Application granted granted Critical
Publication of TW201525133A publication Critical patent/TW201525133A/zh
Publication of TWI490333B publication Critical patent/TWI490333B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Description

用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬 ( Tepidimonas )之菌的培養基以及方法
本發明係關於微生物之培養，且特別關於用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的培養基以及培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法。
嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌為革蘭氏陰性(gram-negative)、絕對好氧(strictly aerobic)、氧化酶(oxidase)與過氧化氫酶(catalase)陽性、桿狀、微嗜熱之細菌。
本發明之發明人於先前自臺灣花蓮縣安通溫泉之水樣，經菌株的純化、分離後，獲得一新穎的嗜熱菌，命名為微嗜熱乙型溫單胞菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)。此菌株Tepidimonas fonticaldi sp.nov.所分泌的胞外蛋白具有優良的金屬離子鍵結效能，且不受高溫、高壓、酸鹼度的環境條件影響，而可有效地防止鍋爐設備、地表管線、地熱生產井、工業廢水或硬水中的金屬鹽的結垢，特別是碳酸鈣的生成，以維持機器的運轉，並降低操作時間與成本。
然而，由於嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的生長與自體代謝蛋白速率緩慢，導致蛋白 取得不易，因此目前亟需新穎之培養方法與培養基。
本發明提供一種用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的培養基，包括：一碳源，為一有機酸，其係擇自於由乙酸、乳酸與丁酸所組成之群組；一氮源，其係擇自於由硫酸銨、硝酸銨、氯化銨與尿素所組成之群組；磷酸鹽；氯化鎂；一酵母萃取物；以及微量元素。
本發明還提供一種用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的方法，包括：將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌以一培養基進行培養，其中該培養基，包括：一碳源，為一有機酸，其係擇自於由乙酸、乳酸與丁酸所組成之群組；一氮源，其係擇自於由硫酸銨、硝酸銨、氯化銨與尿素所組成之群組；磷酸鹽；氯化鎂；一酵母萃取物；以及微量元素。
第1A、1B與1C圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在1/5-TSB培養基與文獻培養基培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )、菌液酸鹼度及蛋白濃度。
第2A圖與第2B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同培養溫度下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )，與不同培養溫度對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質之影響。
第3A圖與第3B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同培養初始酸鹼度下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )，與不同培養初始酸鹼度對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質之影響。
第4A圖與第4B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同攪拌速率下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )，與不同攪拌速率對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質之影響。
第5A、5B與5C圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同醣類碳源下培養隨時間測得之菌體吸光度(OD600 )、菌液酸鹼度與蛋白濃度。
第6A圖與第6B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在醣類及有機酸環境下，在不同時間點所測得之碳源濃度與菌體吸光度(OD600 )。
第6C圖則顯示不同碳源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白之影響。
第7圖顯示，不同氮源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白之影響。
第8A圖與第8B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同氮源濃度下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )與蛋白濃度。碳源添加濃度固定為2.0g/L。
第9A圖與第9B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在固定碳源添加濃度2.0g/L(碳重0.8g)，不同碳氮比下，在不同時間點所測得的菌體吸光度(OD600 )與蛋白濃度。
第10A圖與第10B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在固定氮源添加濃度0.53g/L(氮重0.11g)，不同碳氮比下，在不同時間點所測得的菌體吸光度(OD600 )與蛋白濃度。
第11圖顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同碳氮比下，在48、72、96培養小時所測得之蛋白濃度。
第12A與第12B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在1/5-TSB、文獻培養基及本發明培養基培養下，在不同時間點所測得的菌體吸光度(OD600 )與蛋白濃度。
第13A圖與第13B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在1/5-TSB培養基、含Na2 HPO4 ．12H2 O之本發明培養基與含NaHCO3 之本發明培養基培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
第14A圖與第14B圖分別顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在含酵母萃取物之本發明培養基與不含酵母萃取物之培養基培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
第15A圖與第15B圖分別顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，以本發明培養基培養，在中溫(35℃)和高溫(55℃)培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
第16A圖與第16B圖分別顯示，遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )SPS-1037或水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )CLN-1，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白 濃度。
在本發明一實施態樣中，本發明提供一種用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的培養基。
本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基可包括，但不限於，一碳源、一氮源、磷酸鹽、氯化鎂、一酵母萃取物、與微量元素。
於上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基中，上述碳源為一有機酸，而上述有機酸之例子可包括，但不限於，乙酸(acetate)、乳酸(lactate)與丁酸(butyrate)等。在一實施例中，於本發明之培養基中的上述碳源可為乙酸。
又，於上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基中，上述氮源之例子可包括，硫酸銨((NH4 )2 SO4 )、硝酸銨(NH4 NO3 )、氯化銨(NH4 Cl)與尿素(urea)等，但不限於此。在一實施例中，於本發明之培養基中的上述氮源可為硫酸銨。
於上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基中，適合之磷酸鹽的例子可包括，但不限於，磷酸氫二鈉(Na2 HPO4 )、磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )、磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )等與上述之任意組合。
在一實施例中，於本發明之培養基中的上述磷酸鹽可包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。在另一實施例中，於本發明之培養基中的上述磷酸鹽可僅包括磷酸二氫鉀，而於此實施 例中，本發明之培養基還可更包括一碳酸鹽類，如碳酸氫鈉(NaHCO3 )。
另，於上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基中，微量元素可包括，例如，鋅(Zn)、錳(Mn)、硼(B)、鈷(Co)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鉬(Mo)等，但不限於此。在一實施例中，於本發明之培養基中的上述微量元素可包括，鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。於此實施例中，各元素可分別為下述形態，但不限於此：鋅可為硫酸鋅(ZnSO4 )之形態，錳可為氯化錳(MnCl2 )之形態，硼可為硼酸(H3 BO3 )之形態，鈷可為氯化鈷(CoCl2 )之形態，銅可為氯化銅(CuCl2 )之形態，鎳可為氯化鎳(NiCl2 )之形態，而鉬可為鉬酸鈉(Na2 MoO4 )之形態。
再者，於上述本發明培養基中，碳源的含量可為約0.2g/L-10g/L，氮源的含量可為約0.2g/L-10g/L，磷酸鹽的含量可為約0.2g/L-25g/L，氯化鎂的含量可為約0.01g/L-5g/L，酵母萃取物的含量可為約0.2g/L-15g/L，而微量元素的含量可為約0.01g/L-1g/L。
於上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基中，碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-40，而在另一實施例中，碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-20。
上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，適用於培養任何嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌。上述嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌的例子可包括，但不限於，微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi )、遲緩 微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )、水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )、臺灣溫單胞菌(Tepidimonas taiwanesis )等。
在一實施例中，上述本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，適用於微嗜熱乙型變形桿菌的。上述微嗜熱乙型變形桿菌可以是，在2011年11月21日公開寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)之微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)，其寄存編號為BCRC 80391，而此菌也在2011年11月28日公開寄存於比利時菌種保存中心(Laboratorium voor.Microbiologie Gent' Belgium；LMG)，其寄存編號為LMG26746，目前此菌為可公開自由分讓。上述微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391具有分泌具胞外蛋白的能力。而微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391在以本發明培養基培養之情況下，能夠有效分泌其胞外蛋白。
此外，在本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，適用於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391之培養的一實施例中，本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基之碳源可為乙酸，而氮源可為硫酸銨。
又，對於此培養基而言，於一特定實施例中，乙酸的含量可為約0.2g/L-5g/L，硫酸銨的含量可為約0.4g/L-3g/L，磷酸鹽的含量可為約1.0g/L-12g/L，氯化鎂的含量可為約0.01g/L-0.5g/L，酵母萃取物的含量可為約0.2g/L-5g/L，而微量元素的含量可為約0.01g/L-0.3g/L。
對於上述之特定實施例而言，此培養基之磷酸鹽可包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。或者，對於上述之特定實施例而言，於此培養基中的磷酸鹽可僅包括磷酸二氫鉀，而培養基則還更包括碳酸氫鈉(NaHCO3 )。
又，對於上述之特定實施例而言，此培養基之微量元素可包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。又，各元素可分別為下述形態，但不限於此：鋅可為硫酸鋅(ZnSO4 )之形態，錳可為氯化錳(MnCl2 )之形態，硼可為硼酸(H3 BO3 )之形態，鈷可為氯化鈷(CoCl2 )之形態，銅可為氯化銅(CuCl2 )之形態，鎳可為氯化鎳(NiCl2 )之形態，而鉬可為鉬酸鈉(Na2 MoO4 )之形式。
此外，對於上述之特定實施例而言，碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-20，或者可為約11。
在本發明另一實施態樣中，本發明提供一種用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的方法。
本發明之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法可包括下述步驟，但不限於此。
將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌以一培養基進行培養，而其中上述培養基可包括，但不限於，一碳源、一氮源、磷酸鹽、氯化鎂、一酵母萃取物與微量元素。又，上述碳源為一有機酸，而上述有機酸之例子可包括，但不限於，乙酸(acetate)、乳酸(lactate)與丁酸(butyrate)等。在一實施例中，上述碳源可為乙酸。且，上述氮源之例子可包括，硫酸銨((NH4 )2 SO4 )、硝酸銨(NH4 NO3 )、氯化銨(NH4 Cl)與尿素(urea)等，但不限於此。在一實施例中，於上述氮源可為 硫酸銨。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約30-70℃。在一實施例中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約30-60℃。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約pH 5-pH 9。在一實施例中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約pH 6-pH 9。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中，係以約0-500rpm的攪拌速率來培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌。在一實施例中，係以約0-200rpm的攪拌速率來培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養時間約12-120小時。在一實施例中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養時間約46-120小時。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法所使用之培養基中，適合之磷酸鹽的例子可包括，但不限於，磷酸氫二鈉(Na2 HPO4 )、磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、磷酸二氫鈉(NaH2 PO4 )、磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )等與上述之任意組合。
在一實施例中，於本發明之培養基中的上述磷酸鹽可包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。在另一實施例中，於本發明之培養基中的上述磷酸鹽可僅包括磷酸二氫鉀，而於此實施 例中，本發明之培養基還可更包括一碳酸鹽類，如碳酸氫鈉(NaHCO3 )。
另，於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法所使用之培養基中，微量元素可包括，例如，鋅(Zn)、錳(Mn)、硼(B)、鈷(Co)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鉬(Mo)等，但不限於此。在一實施例中，上述微量元素可包括，鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。於此實施例中，各元素可分別為下述形態，但不限於此：鋅可為硫酸鋅(ZnSO4 )之形態，錳可為氯化錳(MnCl2 )之形態，硼可為硼酸(H3 BO3 )之形態，鈷可為氯化鈷(CoCl2 )之形態，銅可為氯化銅(CuCl2 )之形態，鎳可為氯化鎳(NiCl2 )之形態，而鉬可為鉬酸鈉(Na2 MoO4 )之形態。
再者，於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法所使用之培養基中，碳源的含量可為約0.2g/L-10g/L，氮源的含量可為約0.2g/L-10g/L，磷酸鹽的含量可為約0.2g/L-25g/L，氯化鎂的含量可為約0.01g/L-5g/L，酵母萃取物的含量可為約0.2g/L-15g/L，而微量元素的含量可為約0.01g/L-1g/L。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法所使用之培養基中，碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-40，而在另一實施例中，碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-20。
於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中所培養之嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌，可為任何嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌。而上述嗜熱性鹼性蛋白酶 生產菌屬的菌的例子可包括，但不限於，微嗜熱乙型變形桿菌、遲緩微嗜熱菌、水生微嗜熱菌、臺灣溫單胞菌等。
在一實施例中，於上述本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中所培養之嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌，可為微嗜熱乙型變形桿菌。而，上述微嗜熱乙型變形桿菌可以是，在2011年11月21日公開寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)之微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)，其寄存編號為BCRC 80391，而此菌也在2011年11月28日公開寄存於比利時菌種保存中心(Laboratorium voor.Microbiologie Gent' Belgium；LMG)，其寄存編號為LMG26746，目前此菌為可公開自由分讓。上述微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391具有分泌具胞外蛋白的能力。而微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391在以本發明方法培養之情況下，能夠有效分泌其胞外蛋白。
此外，在本發明培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法中所培養之嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬的菌為微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391之培養的一實施例中，於本發明方法所使用之培養基中，碳源可為乙酸，而氮源可為硫酸銨。
又，對於本發明上述培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391之培養方法而言，在一特定實施例中，於此方法所使用之培養基中，乙酸的含量可為約0.2g/L-5g/L，硫酸銨的含量可為約0.4g/L-3g/L，磷酸鹽的含量可為約1g/L-12 g/L，氯化鎂的含量可為約0.01g/L-0.5g/L，酵母萃取物的含量可為約0.2g/L-5g/L，而微量元素的含量可為約0.01g/L-0.3g/L。
在上述之特定實施例中，此方法所使用之培養基的磷酸鹽可包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。或者，對於上述之特定實施例而言，此方法所使用之培養基的磷酸鹽可僅包括磷酸二氫鉀，而此培養基則還更包括碳酸氫鈉(NaHCO3 )。
又，對於上述之特定實施例而言，於此方法中所使用之培養基的微量元素可包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。又，各元素可分別為下述形態，但不限於此：鋅可為硫酸鋅(ZnSO4 )之形態，錳可為氯化錳(MnCl2 )之形態，硼可為硼酸(H3 BO3 )之形態，鈷可為氯化鈷(CoCl2 )之形態，銅可為氯化銅(CuCl2 )之形態，鎳可為氯化鎳(NiCl2 )之形態，而鉬可為鉬酸鈉(Na2 MoO4 )之形式。
此外，對於上述之特定實施例而言，於此方法中所使用之培養基碳源與氮源之碳氮重量比可為約1-20，或者可為約11。
在上述之特定實施例中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌可培養於約30-60℃，例如55℃。
且在上述之特定實施例中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌可培養於可培養於約pH 6-pH 9，例如pH 7或pH 8。
再者，對於上述之特定實施例而言，於本發明方法中，係以約0-200rpm的攪拌速率來培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌，例如200rpm。
且在上述之特定實施例中，嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養時間約46-120小時。
實施例
1.實驗材料與方法
1.1菌株活化及增殖培養
分別將微嗜熱乙型變形(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391、遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )(購自德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)，編號SPS-1037)與水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )(購自德國微生物菌種保存中心，編號CLN-1)，以滅過菌的接菌環將凍菌管內之菌體刮取後，溶解於3mL的1/5-TSB(Tryptocase Soy Broth)(其詳細成分參見下方表1)液態培養基中，並將其於55℃，以200rpm之攪拌速率培養1~2天以進行活化。菌株活化完成後，再將經活化後的菌株1mL植入100mL的實驗用培養基中，並將其以200rpm之攪拌速率，於55℃，培養3~5天來進行增殖，以便於後續實驗進行。
1.2菌株培養環境建立以及培養基組成
於此實驗中，根據不同之實驗設計來確認目標菌株的最適生長環境因子及培養基組成，以有效提升菌體濃度或進一步促進菌體分泌蛋白之速率。
1.2.1已知培養基之測試
分別以1/5-TSB培養基與文獻Albuquerquea et al.,2006(Albuquerquea L.,Tiagob I.,Veri' ssimob A.and da Costaa M.S.,2006,Tepidimonas thermarum sp.nov.,a new slightly thermophilic betaproteobacterium isolated from the Elisenquelle in Aachen and emended description of the genus Tepidimonas.Systematic and Applied Microbiology 29：450-456.)中所揭示用於培養Tepidimonas thermarum sp.nov.菌株之培養基(以下稱為文獻培養基)來培養測試菌株。文獻培養基的組成，如下方表2所示。
1.2.2適合培養條件之確認
A.環境因子之測試
以上述文獻培養基為培養基，於各種培養溫度、培養初始pH值與培養攪拌速率來培養測試菌株，以確認適合之培養溫度、pH值與攪拌速率。試驗方法如下：
(1)培養溫度之測試
以200rpm之轉速、不控制初始pH值下，分別以溫度50℃、55℃、60℃、65℃及70℃之溫度來培養測試菌株。
(2)初始pH值探討
確定最佳培養溫度後，在此最佳溫度、以200rpm之轉速，分別將測試菌株培養於pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0及pH 9.0。
(3)攪拌速率之測試
確定最佳培養溫度與pH值後，在此最佳溫度與初始pH值，分別以0rpm、100rpm與200rpm之攪拌速率來培養 菌株。
B.培養基組成之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並添加、剔除及/或取代其中部分成分(包含碳源、氮源等)以形成各種修飾培養基。且之後，以含有各種之碳源、氮源、碳源濃度、氮源濃度與碳氮比之修飾培養基來培養測試菌株，以獲得適合培養。
(1)碳源之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並分別添加做為碳源之葡萄糖、蔗糖、澱粉、乙酸、乳酸及丁酸以形成含有不同碳源之修飾培養基。之後，分別以上述含有不同碳源之修飾培養基來培養測試菌株，以確認適合之碳源。
(2)氮源之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並將文獻培養基中之氮源分別置換為硫酸銨、硝酸銨及尿素或不進行置換(氯化銨)以形成含有不同氮源之修飾培養基。之後，分別以上述含有不同氮源之修飾培養基來培養測試菌株，以確認適合之氮源。
(3)碳源濃度之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並將上方試驗中所確認之一適合碳源以不同添加量添加至修飾培養基，以形成具有不同碳源濃度之修飾培養基。之後，分別以上述具有不同碳源濃度之修飾培養基培養測試菌株，以確認適合之碳源濃度範圍。
(4)氮源濃度之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並將上方試驗中所確認之一適合氮源(取代於文獻培養基中存在之氮源)以不同添加量添加至修飾培養基，以形成具有不同氮源濃度之修飾培養基。之後，分別以上述具有不同氮源濃度之修飾培養基培養測試菌株，以確認適合之氮源濃度範圍。
(5)碳氮比之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並將上方試驗中所確認之一適合碳源與一適合之氮源(取代於文獻培養基中存在之氮源)以不同之碳氮重量比添加至修飾培養基，以形成具有不同之碳氮重量比的修飾培養基。之後，分別以上述具有不同之碳氮重量比的修飾培養基培養測試菌株，以確認適合之碳氮重量比範圍。
(6)以NaHCO3 取代Na2 HPO4 ．12H2 O之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並將上方試驗中所確認之一適合碳源與一適合之氮源(取代於文獻培養基中存在之氮源)以適合之添加量與重量比添加至修飾培養基，並將Na2 HPO4 ．12H2 O取代為或不取代為NaHCO3 ，以形成Na2 HPO4 或含NaHCO3 的修飾培養基。之後，分別以上述修飾培養基來培養測試菌株，以評估NaHCO3 取代Na2 HPO4 ．12H2 O的可能性。
(7)酵母萃取物之測試
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並將上方試驗中所確認之一適合碳源與一適合之氮源(取代於文獻培養 基中存在之氮源)以適合之添加量與重量比添加至修飾培養基，並剔除或不剔除酵母萃取物，以形成具有或不具有酵母萃取物的修飾培養基。之後，分別以上述具有或不具有酵母萃取物的修飾培養基來培養測試菌株，以酵母菌萃取物是否為必須。
1.2.3對於適合培養基之培養測試
A.培養溫度之測試
根據將前方試驗所確認出之一適合之培養基配方配置出一適合之培養基。之後，以此適合培養基以200rpm之轉速、初始pH值為7，分別以中溫35℃與高溫55℃來培養一測試菌株。
B.不同菌株之培養測試
根據將前方試驗所確認出之一適合之培養基配方配置出一適合之培養基。之後，以此適合培養基以200rpm之轉速、初始pH值為7，以55℃來分別培養不同之測試菌株。
2.結果
2.1已知培養基之測試
於本發明之實驗中，在菌株篩選及菌體活化時使用的TSB培養基為市售的商業化培養基。TSB培養基適用於大部分的微生物生長培養用，並無專一性，且價格較高。
為了降低菌株培養與菌株蛋白生產的成本，並有效掌握菌株生長的營養需求，此實驗利用上述之文獻培養基來進行一測試菌株，微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391的培養。微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391，在2011年11月21日公開寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center；BCRC)，而此菌也在2011年11月28日公開寄存於比利時菌種保存中心(Laboratorium voor.Microbiologie Gent' Belgium；LMG)，其寄存編號為LMG26746，目前此菌為可公開自由分讓。上述微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391具有分泌具胞外蛋白的能力。微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391具有分泌其胞外蛋白之能力。
在本實驗中，在55℃、攪拌速率200rpm、初始pH值未控制操作條件下，探討文獻培養基對嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391之生長以及蛋白生產的影響。第1A、1B與1C圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在1/5-TSB培養基與文獻培養基培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )、菌液酸鹼度及蛋白濃度。
由第1A與1C圖可看出嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在1/5-TSB培養基或文獻培養基中皆可培養生長，並可分泌蛋白，同時，隨著培養時間的增加，菌體濃度與蛋白濃度也隨之上升。
雖然微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在文獻培養基下培養，其所生產的菌體濃度、蛋白濃度皆不及以1/5-TSB為培養基時高，然，1/5-TSB的培養基成份大部分為複合性成分，而以研究角度來看，較難掌握確切的影響因子。此外， 1/5-TSB為商業化培養基，售價昂貴，若使用於菌株的量產，將降低市場競爭性。相較之下，文獻培養基的成份價格相對較低，具有較佳之研究價值。
因此，於本發明之後的實驗中，將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並添加、剔除及/或取代其中部分成分(包含碳源、氮源等)以形成各種修飾培養基，以確認適合之培養基的碳源、氮源、碳源濃度、氮源濃度與碳氮比，用以提升培養系統中菌株的菌體濃度及蛋白產量。
2.2適合培養條件之確認
A.環境因子之測試
(1)培養溫度之測試
微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391為嗜熱菌株，而嗜熱菌的最適生長溫度範圍為50~60℃，最高不超過90℃。因此，在本實驗中，將經活化後的菌株取1mL植入100mL之液態文獻培養基中，以使起始菌體濃度為約為OD600 0.01~0.02，且之後以200rpm之轉速、不控制初始pH值下，分別將其培養於50℃、55℃、60℃、65℃及70℃，並於不同時間點進行採樣，且分析培養液中的菌體吸光度(OD600 )、蛋白濃度及菌液酸鹼度。
第2A圖與第2B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同培養溫度下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )，與不同培養溫度對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質之影響。
根據第2A圖與第2B圖可知，當培養溫度在50℃及55℃時，有利於菌株的生長，且在菌株接種後24小時內，菌體的生長即達到對數生長期(exponential/log phase)，在此期間內，菌體的代謝作用最為旺盛，培養液中的菌體數目隨時間以指數方式增加。
另外，根據第2B圖可知，當培養溫度控制在55℃時，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌的蛋白濃度與蛋白生產速率皆比溫度控制為50℃時還要好。
(2)培養初始pH值之測試
確認適合之培養溫度後，於本實驗中以適合之溫培養溫度之一，55℃進行菌株培養，並探討培養初始pH值對於菌株之影響。將微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391以約OD600 0.01~0.02之起始菌體濃度、200rpm之轉速與55℃之培養溫度，分別培養於初始pH值為pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0及pH 9.0的液態文獻培養基中。
第3A圖與第3B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同培養初始酸鹼度下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )，與不同培養初始酸鹼度對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質之影響。
根據第3A圖可知，當初始pH值範圍為7.0至8.0時有利於菌株的生長。當培養液之初始酸鹼度控制在pH 7.0時，菌體生長的遲滯期(lag phase)較初始酸鹼度控制在pH 8.0時來得長，而此顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在pH 8.0環境下較易生長。
又，根據第3A圖與第3B圖可知，當初始酸鹼度控制為pH 8.0時，該環境對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391所生產的蛋白濃度與蛋白生產速率皆比初始酸鹼度控制為pH 7.0時還要好。
(3)攪拌速率之測試
在本實驗中，以適合之培養溫度之一，55℃以及適合之初始pH值pH8.0下進行菌株培養，並探討攪拌速率對於菌株之影響。將微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391以約OD600 0.01~0.02之起始菌體濃度、55℃之培養溫度以及pH 8.0之初始pH值，分別培養於其攪拌速率為0、100與200rpm的液態文獻培養基中。
第4A圖與第4B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同攪拌速率下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )，與不同攪拌速率對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白質之影響。
根據第4A圖可知，當攪拌速率範圍為0~200rpm，菌體皆可生長，其中以攪拌速率200rpm時菌體生長最佳。
而，第4B圖顯示，當攪拌速率控制在200rpm時，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391所分泌的蛋白濃度與蛋白生產速率皆比攪拌速率控制在0rpm或100rpm時還要好。
B.培養基組成之測試
(1)碳源之測試
於本實驗中，先將單碳醣類的葡萄糖(glucose)、雙碳醣類的蔗糖(sucrose)及多碳醣類的澱粉(starch)做為碳源，以 探討不同醣類碳源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生產蛋白的影響。
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，並分別添加葡萄糖、蔗糖與澱粉以形成含有不同碳源之修飾培養基，而葡萄糖、蔗糖、澱粉的添加量參照1/5-TSB中葡萄糖(dextrose)的用量(表1)分別為0.5g/L。之後，分別以上述含有不同碳源之修飾培養基來培養測試菌株。
不同醣類碳源的測試結果如第5A、5B與5C圖所示。第5A、5B與5C圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在不同醣類碳源下培養隨時間測得之菌體吸光度(OD600 )、菌液酸鹼度與蛋白濃度。
根據第5A圖可知，當以不同之醣類為碳源時，菌株之生長並無顯著差異性，且菌株生產蛋白的濃度亦不高，約僅達10mg/L(參見第5C圖)。
為了找出能有效供應菌體生長並有效分泌蛋白的碳源，本實驗除以葡萄糖作為碳源外，更進一步採用乙酸(acetate)、乳酸(lactate)與丁酸(butyrate)等有機酸作為碳源。乙酸、乳酸、丁酸的添加量同樣為0.5g/L。實驗過程除定時採樣量測在不同碳源環境下的菌體吸光度(OD600 )與蛋白濃度外，更以液態層析儀分析試驗系統中碳源濃度隨時間變化的情形，藉以了解菌株對碳源的利用率。結果如第6A、6B與6C圖所示。
第6A圖與第6B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在醣類及有機酸環境下，在不同時間點所測得之 碳源濃度與菌體吸光度(OD600 )，而第6C圖則顯示不同碳源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白之影響。
由第6A圖可知，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391幾乎不會利用簡單的醣類碳源(葡萄糖)，且當以葡萄糖為碳源時，菌體的生長亦較緩慢，菌體吸光度(OD600 )最高僅約0.4(第6B圖)；然而，若以有機酸為碳源時(乙酸、乳酸與丁酸)，微生物在22小時的反應時間內可將系統中的乙酸及乳酸消耗殆盡，丁酸則在33小時左右被菌株完全分解(第6B圖)。菌體吸光度(OD600 )在有機酸環境下約可達0.6~0.7，為醣類碳源的1.5~1.9倍(第6B圖)。
第6B圖顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在以丁酸為碳源的環境下其OD600 約達0.7，為所有測試碳源中最高者，其次依序為乳酸、乙酸；但，若以菌株在對數生長期(exponential/log phase)的成長速率來看，則成長速率為乳酸>乙酸>丁酸；而由菌體成長時的遲滯期(lag phase)來看，則以乙酸為碳源時之遲滯期顯著短於以乳酸及丁酸為碳源時的狀況。若由最大蛋白生產速率來看(第6C圖)，則以乙酸為碳源時最佳，丁酸次之，其蛋白的生產速率分別為每小時1.2mg/L及0.94mg/L。
綜合前述，在溫度55℃、攪拌速率200rpm和初始酸鹼度pH 8.0，起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02之固定生長條件下，以乙酸做為碳源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，具有最高之具體生長濃度以及最高之蛋白濃度與蛋白生產速率效果，因此選定乙酸為目標碳源來進行後續氮源評估的部 份。
(2)氮源之測試
本實驗將氯化銨(NH4 Cl)、硫酸銨((NH4 )2 SO4 )、硝酸銨(NH4 NO3 )與尿素(urea)做為氮源，以探討不同氮源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生產蛋白的影響。
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，在碳源為乙酸、培養溫度55℃、攪拌速率200rpm、初始酸鹼度pH 8.0、起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02下的固定生長條件下，分別以氯化銨(NH4 Cl)、硫酸銨((NH4 )2 SO4 )、硝酸銨(NH4 NO3 )與尿素(urea)為氮源以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391。四種不同氮源於培養基中之含量分別為：氯化銨(NH4 Cl)0.30g/L、硫酸銨((NH4 )2 SO4 )0.74g/L、硝酸銨(NH4 NO3 )0.22g/L與尿素(urea)0.17g/L。不同氮源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白之影響如第7圖所示。
所探討的四種氮源對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的最大蛋白產率及蛋白濃度皆可大幅提升，尤其是蛋白產率的提升效果特別顯著。第7圖顯示，四種不同氮源中以硫酸銨的提升蛋白質產率效果最佳，最大蛋白產率由未添加時的1.2mg/L/hr提升到約5.4mg/L/hr。因此，接下來的實驗就以乙酸為碳源，硫酸銨為氮源來進行培養基最適化濃度的探討。
(3)碳源濃度之測試
本部分實驗主要探討固定氮源添加濃度(硫酸銨0.74g/L)下，改變碳源(乙酸)濃度對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生產蛋白之影響。
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，在氮源為硫酸銨(0.74g/L)、培養溫度55℃、攪拌速率200rpm、初始酸鹼度pH 8.0、起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02下的固定生長條件下，分別將培養基之碳源(乙酸)濃度配置為0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L以培養微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391。
最佳碳源濃度的評估方式以微生物的比生長速率(μ)大小做為參考依據，比生長速率即每小時單位質量的菌體所增加的菌體量，為微生物生長速率的參數。
根據在不同碳源濃度培養下隨時間所分別測得的菌體吸光度(OD600 )可知，當碳源濃度為0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L時，最終菌體吸光度分別為0.539、0.562、1.012、1.300、1.302、0.314；而由對數菌體濃度-時間圖之回歸結果所求得的各碳源濃度之比生長速率分別為0.140、0.170、0.525、0.527、0.190、0.115hr-1 (參見表3)。
由以上述數據得知，就比生長速率而言，當乙酸濃度為2.0g/L及3.0g/L時，此兩個濃度之比生長速率彼此相當 接近，且較其他乙酸添加濃度時高。而就經濟成本的成面考量，為了能有效降低菌株生產成本，可考慮以碳源為2.0g/L時為最適添加濃度。所以此碳源濃度進行後續的氮源濃度探討。
(4)氮源濃度之測試
本實驗主要探討固定碳源添加濃度(乙酸2.0g/L)下，改變氮源(硫酸銨)濃度對嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生產蛋白之影響。
將文獻培養基做為修飾培養基之基礎，在碳源為乙酸(2.0g/L)、培養溫度55℃、攪拌速率200rpm、初始酸鹼度pH 8.0、起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02下的固定生長條件下，分別將培養基之氮源(硫酸銨)濃度配置為0.74g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L以培養嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391，其中培養時間為84小時。
由實驗結果可發現，氮源濃度的多寡顯著影響菌體的生長。當氮源濃度高達4.0g/L以上，實驗系統中過高的硫酸銨濃度會對菌株產生生長抑制，當測試系統中僅添加少量的0.74g/L氮源時，最終菌體吸光度為所有測試濃度中最高者(參見表4與第8A圖)。
又，在不同氮源濃度下，系統中所產生之蛋白質之濃度，則可參見表4與第8B圖。若以0.74g/L的硫酸銨添加量來看，系統中所產生之約30mg/L的蛋白濃度相較於未進行碳、氮源濃度測試前所產生的20mg/L(參見第7圖中所顯示之硫酸銨蛋白質濃度)則提升約1.5倍。因此，以乙酸添加濃度為2.0g/L、硫酸銨添加濃度為0.74g/L來進行後續的碳氮比探 討。
(5)碳氮比之測試
不同碳氮比對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白影響的實驗主要分兩階段進行，第一階段主要探討固定碳重量下，不同的碳氮比對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響；第二階段主要探討固定氮重量下，不同的碳氮比對微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分泌蛋白的影響。所有試驗在55℃、轉速200rpm、初始酸鹼度pH 8.0與起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02的培養條件進行，其中培養時間為96小時。
(i)固定碳重量
本實驗依據上方碳源測試的結果，將乙酸濃度固定在2g/L，並調整氮源濃度，以形成具有不同碳氮比(C/N)的配方，詳細配方參見表5。
表5、固定碳重下不同的碳氮比之配方
結果顯示，系統中過高的氮源濃度會抑制菌體的生長，此現象與上方所述氮源濃度測試結果中相吻合。然而，測試系統中的氮源濃度若過低，亦不利於菌體的生長。當氮源添加為0.4g/L時，菌體吸光度為1.144，較氮源添加為0.53g/L時的菌體吸光度1.396來的低(參見表6與第9A圖)。
又，就蛋白濃度而言，由表6與第9B圖可知，當碳氮比為7.07時，測試系統中的蛋白濃度達到最高(36.63mg/L)。
所以，綜合前述結果可知，在固定碳重下(乙酸濃度2.0g/L)，碳氮比為7.07(硫酸銨濃度0.53g/L)時，可獲得較佳的菌體濃度及蛋白濃度(36.63mg/L)。因此，碳氮比測試的第二階段-固定氮重量試驗，則以固定硫酸銨濃度在0.53g/L下，改變碳源濃度來進行。之後綜合比較分析固定碳重及固定氮重下的試驗結果，評選出最適合適微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生長的碳氮比。
表6、固定碳重下不同碳氮比試驗組的菌體吸光度及蛋白濃度
(ii)固定氮重量
本實驗依據上方碳源測試的結果，將硫酸銨濃度固定在0.53g/L，並調整碳源濃度，以形成具有不同碳氮比(C/N)的配方，詳細配方參見表7。
結果顯示，系統中的菌體吸光度大致上會隨著碳源濃度的增加而增加，但當碳源添加濃度高過最適添加濃度後，過量的乙酸會對系統中的菌體造成生長抑制。固定氮重下，不同碳氮比試驗組的菌體吸光度參見表8及第10A圖。由實 驗數據可知，碳氮比為11時，系統中的菌體吸光度達最高，當碳氮比為1及碳氮比為15時，試驗系統中的菌體濃度均偏低，顯示過高或過低的碳源濃度不利於菌體成長。
除了由菌體濃度來進行固定氮源下的最適碳氮比評估外，另依據系統中的蛋白濃度來評估(表8與第10B圖)。同樣的，系統中的蛋白濃度與菌體濃度成正比，菌體濃度愈高，其所分泌的蛋白濃度亦愈高。因此，碳氮比研究的第二階段選定出在固定氮重下(硫酸銨濃度0.53g/L)，碳氮比為11(乙酸濃度3.11g/L)時為最佳。
(iii)綜合評比
將第一階段(固定碳重)及第二階段(固定氮重)在48、72、96小時的蛋白濃度分析結果進行整理並顯示於第11圖中。由第11圖可得知，蛋白濃度在碳氮比為7.07~15範圍間 顯著優於碳氮比為1~5.1範圍，而在碳氮比為7.07~15範圍間，又以碳氮比為11時的菌株生產蛋白濃度為最佳，且因此，最終選定碳氮比為11時為微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的最佳培養添加濃度。
綜合前述各種試驗之結果，於本實驗中建立了一新穎之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的培養基配方。詳細配方參見表9。
進一步在相同培養條件下，將微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391分別以1/5-TSB、文獻培養基(Albuquerquea et al.,2006；表2)及本發明培養基(表9)培養，並測定其菌體吸光度與蛋白質濃度。
根據表10及第12A圖與第12B圖可知，無論是對於菌體生長或是蛋白的濃度而言，皆是以本發明培養基具有較佳之功效。
(6)以NaHCO3 取代Na2 HPO4 ．12H2 O之測試
於本實驗中，以菌株原生環境中存量不少的碳酸氫根離子來取代培養基中的磷酸氫根離子，以確認碳酸氫根離子是否更適合菌株生長，且可進一步降低培養成本。
以NaHCO3 取代本發明培養基(表9)中的Na2 HPO4 ．12H2 O3 ，以探討培養基組成的改變對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生長和蛋白生產之影響。經取代之培養基成分如表11所示。
NaHCO3 添加之培養基
所有試驗在55℃、轉速200rpm與起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02的培養條件進行(含Na2 HPO4 之培養基為pH 8.0；含Na2 HPO4 之培養基為pH 7.0或pH 8.0)，其中培養時間為96小時。
第13A圖與第13B圖分別顯示，微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在1/5-TSB培養基、含Na2 HPO4 ．12H2 O之本發明培養基與含NaHCO3 之本發明培養基培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
根據第13A圖與第13B圖可知，若以NaHCO3 取代Na2 HPO4 ．12H2 O進行微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391的培 養，在初始酸鹼度控制在pH 7.0時，培養系統中的菌體濃度及蛋白濃度皆與以Na2 HPO4 ．12H2 O培養時差距不大，且使用NaHCO3 取代Na2 HPO4 ．12H2 O可使培養基成本由原本的每公升21.22元降至7.83元。
酵母萃取物之測試
本實驗探討目前本發明培養基中，唯一複合培養成份酵母萃取物的存在對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391生長和蛋白生產之影響。
剔除酵母萃取物之培養基成分如表12所示(無剔除酵母萃取物之培養基成分如表11所示)。所有試驗在55℃、轉速200rpm、初始酸鹼度pH 7.0與起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02的培養條件進行，其中培養時間為96小時。
第14A圖與第14B圖分別顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在含酵母萃取物之本發明培養基與不含酵母萃取物之培養基培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
根據第14A圖與第14B圖可知，若將酵母萃取物剔除，則菌體無法生長且也無法產生蛋白質。
2.3本發明培養基的適用範圍測試
A.培養溫度之測試
於本實驗中，探討微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391以本發明培養基(表11)分別在中溫(35℃)和高溫(55℃)下培養對菌株生長和蛋白生產之影響。所有試驗在55℃、轉速200rpm、初始酸鹼度pH 7.0與起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02的培養條件進行，其中培養時間為96小時。
第15A圖與第15B圖分別顯示微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391在中溫(35℃)和高溫(55℃)培養下，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
根據第15A圖與第15B圖可知，在以本發明培養基培養下，不論於中溫(35℃)和高溫(55℃)，菌體皆可生長並產生蛋白質，且以高溫培養時具有加之效果。
B.不同菌株之培養測試
於本實驗中，探討微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391本發明培養基(表11)分別對於微嗜熱乙型變形桿菌BCRC 80391同屬菌株遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )SPS-1037或水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )CLN-1之生長和蛋白生產之影響。所有試驗在55℃、轉速200rpm、初始酸鹼度pH 7.0與起始菌體濃度約為OD600 0.01~0.02的培養條件進行，其中培養時間為96小時。
第16圖與第16B圖分別顯示，遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )SPS-1037或水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )CLN-1，在不同時間點所測得之菌體吸光度(OD600 )及蛋白濃度。
由第16A與16B圖可知，本發明之培養基可使遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )SPS-1037或水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )CLN-1生長並且產生蛋白質。
由上述可知，本發明之培養基適用於各種培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的培養。

Claims (41)

  1. 一種用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的培養基，包括：一碳源，其為乙酸；一氮源，其為硫酸銨；磷酸鹽；氯化鎂；一酵母萃取物；以及微量元素，其中該碳源的含量為約0.2g/L-10g/L，該氮源的含量為約0.2g/L-10g/L，該磷酸鹽的含量為約0.2g/L-25g/L，該氯化鎂的含量為約0.01g/L-5g/L，該酵母萃取物的含量為約0.2g/L-15g/L，而該微量元素的含量為約0.01g/L-1g/L。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，該碳源與該氮源之碳氮重量比為約1-40。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該磷酸鹽包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該培養基更包括碳酸氫鈉。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該微量元素包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌包括微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi )、遲緩微嗜熱菌(Tepidimonas ignava )、水生微嗜熱菌(Tepidimonas aquatica )或臺灣溫單胞菌(Tepidimonas taiwanesis )。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌為該微嗜熱乙型變形桿菌。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該微嗜熱乙型變形桿菌為微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該乙酸的含量為約0.2g/L-5g/L，該硫酸銨的含量為約0.4g/L-3g/L，該磷酸鹽的含量為約1g/L-12g/L，該氯化鎂的含量為約0.01g/L-0.5g/L，該酵母萃取物的含量為約0.2g/L-5g/L，而該微量元素的含量為約0.01g/L-0.3g/L。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該磷酸鹽包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該培養基更包括碳酸氫鈉。
  14. 如申請專利範圍第10項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該微量元素包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳與鉬。
  15. 如申請專利範圍第10項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，該碳源與該氮源之碳氮重量比為約1-20。
  16. 如申請專利範圍第10項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，其中該用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的培養基，該碳源與該氮源之碳氮重量比為11。
  17. 一種用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌的方法，包括：將一嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬(Tepidimonas )之菌以一培養基進行培養，其中該培養基，包括：一碳源，其為乙酸；一氮源，其為硫酸銨；磷酸鹽；氯化鎂； 一酵母萃取物；以及微量元素，其中該碳源的含量為約0.2g/L-10g/L，該氮源的含量為約0.2g/L-10g/L，該磷酸鹽的含量為約0.2g/L-25g/L，該氯化鎂的含量為約0.01g/L-5g/L，該酵母萃取物的含量為約0.2g/L-15g/L，而該微量元素的含量為約0.01g/L-1g/L。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約30-70℃。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約pH 5-pH 9。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中以約0-500rpm之攪拌速度來培養該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌。
  21. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該碳源與該氮源之碳氮重量比為約1-40。
  22. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該磷酸鹽包括磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀。
  23. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該培養基更包括碳酸氫鈉。
  25. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該微量元素包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳、鉬。
  26. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌包括微嗜熱乙型變形桿菌、遲緩微嗜熱菌、水生微嗜熱菌或臺灣溫單胞菌。
  27. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌為該微嗜熱乙型變形桿菌。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該微嗜熱乙型變形桿菌為微嗜熱乙型變形桿菌(Tepidimonas fonticaldi sp.nov.)BCRC 80391。
  29. 如申請專利範圍第17項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該乙酸的含量為0.2g/L-5g/L，該硫酸銨的含量為約0.4g/L-3g/L，該磷酸鹽的含量為約1.0g/L-12g/L，該氯化鎂的含量為約0.01g/L-0.5g/L，該酵母萃取物的含量為約0.2g/L-5g/L，而該微量元素的含量為約0.01g/L-0.3g/L。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該磷酸鹽包括磷酸氫二鈉與 磷酸二氫鉀。
  31. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該磷酸鹽為磷酸二氫鉀。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該培養基更包括碳酸氫鈉。
  33. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該微量元素包括鋅、錳、硼、鈷、銅、鎳、鉬。
  34. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該碳源與該氮源之碳氮重量比為約1-20。
  35. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該培養基的碳源與氮源重量比為11。
  36. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約30-60℃。
  37. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約55℃。
  38. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約pH 6-pH 9。
  39. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性 蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌係培養於約pH 7或pH 8。
  40. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中以約0-200rpm之攪拌速度來培養該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌。
  41. 如申請專利範圍第29項所述之用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌的方法，其中以約200rpm之攪拌速度來培養該嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬之菌。
TW102148375A 2013-12-26 2013-12-26 用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法 TWI490333B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102148375A TWI490333B (zh) 2013-12-26 2013-12-26 用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法
US14/229,596 US9790463B2 (en) 2013-12-26 2014-03-28 Culturing medium and method for culturing a bacterium of genus Tepidimonas

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102148375A TWI490333B (zh) 2013-12-26 2013-12-26 用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201525133A TW201525133A (zh) 2015-07-01
TWI490333B true TWI490333B (zh) 2015-07-01

Family

ID=53481039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102148375A TWI490333B (zh) 2013-12-26 2013-12-26 用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9790463B2 (zh)
TW (1) TWI490333B (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8137929B2 (en) 2005-04-15 2012-03-20 Novo Nordisk Health Care Ag Basic protein purification tags from thermophilic bacteria
US7695834B1 (en) 2008-10-15 2010-04-13 Ut-Battelle, Llc Microbial fuel cell with improved anode
CA2782431C (en) 2009-12-07 2015-08-11 Omya Development Ag Process for bacterial stabilizing of aqueous ground natural calcium carbonate and/or precipitated calcium carbonate and/or dolomite and/or surface-reacted calcium carbonate-comprising mineral preparations
DK2596702T3 (en) 2011-11-25 2015-08-10 Omya Int Ag A method for stabilizing the bacterial content of the aqueous ground natural calcium carbonate and / or precipitated calcium carbonate and / or dolomite and / or surface-treated calcium carbonate-comprising mineral products
WO2013090769A2 (en) * 2011-12-14 2013-06-20 Kiverdi, Inc. Method and apparatus for growing microbial cultures that require gaseous electron donors, electron acceptors, carbon sources, or other nutrients
CN102628025A (zh) 2012-04-09 2012-08-08 天津大学 一种培养高温嗜热菌的营养液配方及其配置方法和应用
CN103204589A (zh) * 2013-03-06 2013-07-17 付永全 用生物方法处理和稳定工业循环水水质的方法
CN103215213B (zh) * 2013-05-20 2015-04-08 黑龙江八一农垦大学 一种用于餐厨垃圾厌氧发酵的复合菌剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Luciana Albuquerque et al. Tepidimonas thermarum sp. nov., a new slightly thermophilic betaproteobacterium isolated from the Elisenquelle in Aachen and emended description of the genus Tepidimonas. Syst Appl Microbiol. 2006 Sep;29(6):450-6. Epub 2006 Jan 10. Claudia Moreira et al. Tepidimonas ignava gen. nov., sp. nov., a new chemolithoheterotrophic and slightly thermophilic member of the beta-Proteobacteria. Int J Syst Evol Microbiol. 2000 Mar;50 Pt 2:735-42. Eric Degryse et al. A comparative analysis of extreme thermophilic bacteria belonging to the genus Thermus. Archives of Microbiology May 30, 1978, Volume 117, Issue 2, pp 189-196 Wen-Ming Chen et al. Tepidimonas fonticaldi sp. nov., a slightly thermophilic betaproteobacterium isolated from a hot spring. Int J Syst Evol Microbiol. 2013 May;63(Pt 5):1810-6. doi: 10.1099/ijs.0.043729-0. Epub 2012 Sep 14. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20150184121A1 (en) 2015-07-02
TW201525133A (zh) 2015-07-01
US9790463B2 (en) 2017-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107435030B (zh) 一种副地衣芽孢杆菌以及制备富生物纳米硒益生菌的方法
CN105567624B (zh) 一种发酵产乳酸链球菌素的乳酸乳球菌乳亚种用增效剂及其使用方法
CN106754472A (zh) 一株果蔬发酵用植物乳杆菌grx15及其应用
Jindal et al. Optimization, characterization, and flow properties of exopolysaccharides produced by the cyanobacterium Lyngbya stagnina
KR101134324B1 (ko) 미생물 대량 생산을 위한 분말 배지
Hunduma et al. Effect of altitude on microbial succession during traditional enset (Ensete ventricosum) fermentation
CN108485976B (zh) 一种重金属抗性微生物的筛选方法
JP2008263972A (ja) 真菌類と細菌類の混合培養方法
TWI490333B (zh) 用於培養嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之菌的培養基以及方法
CN103099162B (zh) L-乳酸酸菜的制作方法
CN109722408B (zh) 促使枯草芽孢杆菌产芽孢的方法
JP2008245597A (ja) 微生物の増殖促進方法及び活性向上方法
NO331278B1 (no) Anvendelse av en steril næringssammensetning avledet fra biomassen til en bakteriekultur som et vekstmedium for mikrooganismer, fremgangsmåte for dyrkning samt mikroorganismevekstsubstrat
CN104498414A (zh) 一种工业化盐渍蔬菜生产中乳酸菌扩培液及菌剂制备方法
Ayertey et al. Screening, isolation and characterization of lactic acid bacteria strains in fermenting cocoa heaps from the Eastern Region of Ghana
TWI541353B (zh) 產生嗜熱性鹼性蛋白酶生產菌屬（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）之胞外蛋白的方法
Trinh et al. Optimization of culture conditions for Acetobacter aceti TISTR 102 in coconut water with supplementary banana juice.
RU2430157C1 (ru) Стимулятор роста молочнокислых бактерий в молоке
Chakraborty et al. Cellulase activity enhancement of bacteria isolated from oil-pump soil using substrate and medium optimization
Gauri et al. Effects of zinc on cell viability and cell surface components of rhizobium sp isolated from root nodules of Trifolium alexandrinum
CN103436451A (zh) 一株产红色素青钱柳内生菌及其发酵产红色素方法
RU2320716C2 (ru) Плотная питательная среда для культивирования микобактерий
CN112175859B (zh) 枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法
CN109294949B (zh) 结冷胶裂解酶产生菌及其用途
KR101183306B1 (ko) 곡물세척수 발효용 발효제와 이를 이용한 곡물세척수 발효액 및 곡물세척수 발효액 제조방법