JP5332995B2

JP5332995B2 - ゲル分離媒体の形成法

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Publication number: JP5332995B2
Application number: JP2009168403A
Authority: JP
Inventors: 達也増子; 覚誠阿久津; 幸司坂入
Original assignee: Toppan Inc
Current assignee: Toppan Inc
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2029-07-17
Also published as: JP2011022054A

Description

本発明はゲル分離媒体の形成法に関し、例えば、タンパク質分離のための二次元電気泳動に用いる電気泳動用ゲル分離媒体の形成法に関する。

ヒトゲノムプロジェクトが終了した現在では、タンパク質のプロファイリングの研究が盛んに行われている。またそのような研究の分野だけでなく医療などの分野からも、患者のタンパク質の分析から知見を得ることによる、より適切な診断技術が要求されている。

タンパク質を分離するための方法として現在最も有力であるのが二次元電気泳動による分離である。個々のタンパク質が持っている電荷、分子量という二つの性質による分離方法を組み合わせたものである。

タンパク質を分子量により分離する方法として最も多く用いられているものはSDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)と呼ばれ、架橋構造をもったアクリルアミドポリマーによる水性ゲル中に、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)処理により電荷を帯びたタンパク質を導入し、電気泳動させるものである。この際ポリアクリルアミドが架橋構造を有することから分子ふるいとしての効果を持ち、タンパク質は分子量ごとに分離される。

SDS-PAGEにおける分離媒体は一般的に、タンパク質の電気泳動に適した硬度および分子ふるい効果を持たせたポリアクリルアミド水性ゲルからなるゲル(以下「分離ゲル」と称する)と、分離ゲルよりも低濃度のポリアクリルアミド水性ゲルからなるゲル(以下「濃縮ゲル」と称する)との二つで構成されている。この二つのゲルは接触しており、タンパク質は最初に濃縮ゲルに導入され、濃縮ゲルを通った後に分離ゲルに導入される。この際正確な分離を行うにはこの二つのゲルの界面が水平に形成されていることが重要である。

この時用いられるポリアクリルアミド水性ゲルは、アクリルアミドモノマーとＮ,Ｎ'-メチレンビスアクリルアミド(ＢＩＳ)のような架橋剤、トリスヒドロキシメチルアミノエタン-HCl水溶液などの緩衝溶液、水の混合物に過硫酸アンモニウム、Ｎ,Ｎ,Ｎ'，Ｎ'‐テトラメチルエチレンジアミンのようなラジカル重合開始剤を導入して得られる溶液(ゲル前駆溶液と称する)を、ゲル形成容器に充填し、重合の進行でゲル化させることにより作製される。

このようなポリアクリルアミド水性ゲルによるタンパク質の分離の方法が、臨床の現場などに普及していくためには、再現性や作業の煩雑さの観点から、分析者が利用しやすいカセット状の形成物にあらかじめゲルが形成されているプレキャストゲルカセットなどが再現性よく安価に作成されることが望まれる。

通常SDS-PAGEにおける分離媒体の形成法は、ゲル形成のための容器に分離ゲル前駆体を充填した後その上に、たとえば水を重層溶媒として重層し、重層した水の存在下でゲルを形成させ、その後重層溶媒を取り除き濃縮ゲル前駆溶液を充填すると言った方法(非特許文献１)である。この場合の水の役割はゲル界面を水平に形成し、ラジカル重合を阻害する酸素の接触を防ぐものである。

しかしながら上記の方法で作製したゲルは分離ゲルと濃縮ゲルの界面が好ましい状態で形成されるものの、濃縮ゲル前駆溶液を充填する前に重層した水を取り除く必要があるために、工程が煩雑であり、また界面を乱さないよう慎重な操作が必要とされる。また重合が進行し十分にゲル化するまでは、重層した水を除去することができず次の工程に進むことができない。こうした問題は工業的な大量生産を考えた場合不利である。

また分離ゲル前駆溶液を充填した後に、ゲル形成を待たずに濃縮ゲル前駆溶液を充填する方法も考えられる。その場合はゲル作製に要する時間は短くすむものの、分離ゲルと濃縮ゲルの界面の乱れ、混ざりが生じることが予想される。これらのことは大量生産時における生産性、再現性の問題点として懸念される。

タンパク質実験ハンドブック、羊土社、２００３年８月１５日発行、ｐ５８−５９

よって本発明における課題は、ゲルを形成するための容器に異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填する工程を有するゲル分離媒体の形成法において、二種類のゲル間の界面が乱れることなく水平となり、しかもゲルの形成が簡便かつ再現性よく行えるゲル分離媒体の形成法を提供することである。

請求項１に記載の発明は、ゲルを形成するための容器に、異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填し、二つのゲル間の界面を水平に形成するゲル分離媒体の形成法であって、
一種類目のゲル前駆溶液を該容器に充填した後に、該二種類のゲル前駆溶液よりも低い密度を有する疎水性の溶媒を重層したのち、二種類目のゲル前駆溶液を充填することを特徴とするゲル分離媒体の形成法である。
請求項２に記載の発明は、前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒の密度が０．８０ｇ／ｃｍ³以下であることを特徴とする請求項１に記載のゲル分離媒体の形成法である。
請求項３に記載の発明は、前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に重層される溶媒が、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-ヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタンおよび2,2-ジメチルブタンからなる群から選択された少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１または２に記載のゲル分離媒体の形成法である。

本発明のゲル分離媒体の形成法は、一種類目のゲル前駆溶液を該容器に充填した後に、該二種類のゲル前駆溶液よりも低い密度を有する重層溶媒を重層したのち、該二種類目のゲル前駆溶液を充填することを特徴としているので、一種類目のゲル前駆溶液のゲル化を待つことなく二種類目のゲル前駆溶液を重層できる。これによりゲル形成の時間が短縮され、工業的生産に有利となる。また、二つのゲル間で再現性よく水平な界面が形成される。さらに、重層溶媒の適切な選択により、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて用いる重層溶媒が疎水性であることにより、ゲル前駆溶液と重層溶媒とが混合することなく、両者は自動的に分離される（具体的には重層溶媒が上部に集まる）。そのため重層溶媒の取り出し作業が効率的に行える。

(Ａ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの構成部材の図であり、(Ｂ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの図である。

本発明に使用可能なゲルを形成するための容器は、例えば図１に示されるカセットが挙げられる。図１(Ａ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの構成部材の図であり、(Ｂ)は本発明の実施形態の説明に用いるカセットの図である。図１（Ａ）に示すカセットの構成部材は、凹部を有するカセット構成部１とカセット構成部２を適切な手段で接合することにより、図１（Ｂ）に示すようにゲル前駆溶液充填口５が形成されたゲル形成容器３が得られる。バッファー接触口４はシール材により封止したのちに用いる。このシール材はホットメルト性を有するフィルムや、開口部を密封できるような樹脂によるキャップでも良い。

カセット構成部１及びカセット構成部２の材質はゲル形成に問題がなく、また電気泳動に問題がない材質であればよく、好ましくはポリメタクリル酸メチル樹脂などのアクリル系樹脂であるが、その他の樹脂製またはガラス製であっても差し支えない。

以下、充填の仕方について説明する。以下の実施形態１は一種類目のゲル前駆溶液を充填し、溶媒を重層した後、重層溶媒が存在している状態で二種類目のゲル前駆溶液を充填する方法である。

実施形態１
図１（Ｂ）に示したカセットに、ゲル前駆溶液充填口５から分離ゲル前駆溶液を充填した後に、該二種類のゲル前駆溶液よりも低い密度を有する溶媒、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-ヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタンおよび2,2-ジメチルブタンからなる群から選択された少なくとも一種の溶媒を重層する。重層溶媒は複数を混合して用いてもよい。この際、従来の水を重層溶媒として用いた場合と同様に一種類目のゲル前駆溶液と重層溶媒の接触部は水平な界面が形成される。

その後、一種類目のゲル前駆溶液が十分にゲル化する前、かつ、重層溶媒が残っている状態で二種類目のゲル前駆溶液を充填する。
なお、重層溶媒の密度が０．８０ g/cm³以下であれば、二種類目のゲル前駆溶液を充填した際に、重層溶媒と二種類目のゲル前駆溶液が混ざり合うことなく、重層溶媒の上層への移動がスムーズに起こるため好ましい。
また、二種類目のゲル前駆溶液と重層される溶媒の密度差は、０．１５〜０．３５g/cm³であるのが好ましい。

この方法では従来の連続充填と比較して、二種類目のゲル前駆溶液が重層溶媒部分を通過して一種類目のゲル前駆溶液と接触することから、界面が大きく歪むことなく充填することが可能である。重層する溶媒の適切な選択により、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて重層される溶媒が疎水性であることにより、ゲル前駆溶液と重層する溶媒とが混合することなく、両者は自動的に分離される（具体的には重層される溶媒が上部に集まる）。そのため溶媒の取り出し作業が効率的に行える。

なお、重層する溶媒が低沸点であれば（例えば７０℃以下）、重層溶媒を気化によって取り除くことができ、好ましい。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されない。

ゲル形成領域の膜厚が１ｍｍで容量が５ｍｌであるゲル形成容器３と同様の構造のカセットに、以下の表１に示す組成を持つ分離ゲル前駆溶液（密度約１．０３ｇ／ｃｍ³）を、ゲル前駆溶液充填口５から充填した後、ジエチルエーテル0.5 mlを重層した。その後、分離ゲル前駆溶液のゲル化が完了する前に、さらに以下の表２に示す組成の濃縮ゲル前駆溶液（密度約１．０２ｇ／ｃｍ³）を充填した。ジエチルエーテルの密度は約０．７１ｇ／ｃｍ³である。

表１
アクリルアミド水溶液(固形分濃度30w/v%)：１．３３４ml
（アクリルアミド水溶液の固形分は、アクリルアミドとＢＩＳの重量比が２９．２：０．８である混合物の水溶液である。）
1.5 M Tris-HCl 水溶液(pH 8.8)：１．０００ml
過硫酸アンモニウム水溶液(固形分濃度10w/v%)：０．０４０ml
テトラメチルエチレンジアミン：０．００４ml
蒸留水：１．６２２ml

表２
アクリルアミド水溶液(固形分濃度30w/v%)：０．１００ml
（アクリルアミドとＢＩＳの重量比が２９．２：０．８である混合物の水溶液である。）
1.5 M Tris-HCl 水溶液(pH 8.8)：０．０８３ml
過硫酸アンモニウム水溶液(固形分濃度10w/v%)：０．０２０ml
テトラメチルエチレンジアミン：０．００２ml
蒸留水：０．７９５ml

この時濃縮ゲル前駆溶液がジエチルエーテルの層を通過し分離ゲル前駆溶液の上部に水平な層を形成し、ジエチルエーテル層は上部に移動した。この方法を用いた場合では濃縮ゲルの充填の速度にかかわらず、水平な界面の形成が確認された。

以上説明したように本発明によれば、ゲルを形成するための容器に異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填する工程を有するゲル分離媒体の形成法において、従来技術よりも二種類のゲル間の界面が乱れることなく水平となり、しかもゲルの形成が簡便かつ再現性よく行える。したがって本発明の方法を利用すれば、例えばタンパク質分離のための研究、もしくは臨床の用途で使用されるプレキャストゲルの作製に有用である。

１・・・カセット構成部
２・・・カセット構成部
３・・・ゲル形成容器
４・・・バッファー接触口
５・・・ゲル前駆溶液充填口

Claims

ゲルを形成するための容器に、異なる組成を持つ二種類のゲル前駆溶液を充填し、二つのゲル間の界面を水平に形成するゲル分離媒体の形成法であって、
一種類目のゲル前駆溶液を該容器に充填した後に、該二種類のゲル前駆溶液よりも低い密度を有する疎水性の溶媒を重層したのち、二種類目のゲル前駆溶液を充填することを特徴とするゲル分離媒体の形成法。
前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に、重層される溶媒の密度が０．８０ｇ／ｃｍ³以下であることを特徴とする請求項１に記載のゲル分離媒体の形成法。
前記一種類目のゲル前駆溶液を充填した後に重層される溶媒が、ジエチルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-ヘキサン、2-メチルペンタン、3-メチルペンタンおよび2,2-ジメチルブタンからなる群から選択された少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１または２に記載のゲル分離媒体の形成法。