JP5328603B2 - 良性の家族性新生児痙攣（ｂｆｎｃ）および他の癲癇において突然変異されたｋｃｎｑ２およびｋｃｎｑ３−カリウムチャンネル遺伝子 - Google Patents

良性の家族性新生児痙攣（ｂｆｎｃ）および他の癲癇において突然変異されたｋｃｎｑ２およびｋｃｎｑ３−カリウムチャンネル遺伝子 Download PDF

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Description

本発明は良性の家族性新生児痙攣（ＢＦＮＣ）ならびにローランド癲癇および若年性ミオクローヌス癲癇の分子的基礎に関する。
本出願はナショナル・インスティテューツ・オブ・ヘルス、ベセスダ、メリーランド州によって設立された補助金番号Ｒ０１−ＮＳ３２６６６下に政府の指示によりなされた。
関連出願の相互参照
本出願は、それに対して優先権を主張し、引用して本明細書に一体化させる１９９７年１０月２４日出願のシリアルナンバー６０／０６３，１４７に関する。
世界中で約２０００万ないし４０００万の人々が癲癇障害にかかっている全身性特発性癲癇（ＩＧＥ）が全ての癲癇障害の５０％を引き起こし、通常、遺伝的ベースを有する（Plouin、1994）。遺伝されたＩＧＥのほとんどは複雑で非単一遺伝子の病気である。ＩＧＥの１つのタイプは良性の家族性新生児痙攣（ＢＦＮＣ）、新生児の優性的に遺伝された障害である（Ronenら、1993；HauserおよびKurland、1975）。ＢＦＮＣ（ＯＭＩＭ １２１２００）は新生児の常染色体に優性的に遺伝された癲癇である。この特発性全身性癲癇は、典型的に、生まれて２日ないし４日に発作が開始する。発作の自然的寛解は２ないし１５週間の間に起こる（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。発作は典型的には緊張性体位、眼の徴候および他の自律性特徴で開始し、これはついでしばしば慢性的運動および運動自律性まで進行する。これらの新生児は通常発作間に成育し、それらの神経学的調査および後の進展は正常な脳機能を示す（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。しかしながら、正常な神経学的進展にもかかわらず、発作は、一般的集団における癲癇の２％累積生涯危険性と比較して、ほぼ１６％のＢＦＮＣの場合に人生で後で再発する（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。
ＢＦＮＣの遺伝的不均一性が観察されている（Ryanら、1991）。二つの遺伝子座、ＥＢＮ１およびＥＢＮ２は染色体２０ｑ１３（Leppertら、1989；Malafosseら、1992）および染色体８ｑ２４（Lewisら1993；Steinleinら、1995）に対する連鎖分析によってマッピングされている。
本発明の遺伝子ならびに関連遺伝子の命名法は時間とともに変化してきた。ヒトからの本発明の遺伝子の二つは今日ではＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３と言われる。これらは元来は、おのおの、ＫＶＥＢＮ１およびＫＶＥＢＮ２と命名されてきた。二つの組の名称は同等であり相互交換的に使用することができるが、認められている命名法は今日ではＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３であり、これらの名称を本明細書中で用いる。また、関連する遺伝子ＫＣＮＱ１は元来は文献中ではＫＶＬＱＴ１と呼ばれていたが、再度、認められている名称が今日ではＫＣＮＱ１であって、この名称を本明細書中で用いる。
大家系における連鎖分析は、ＢＦＮＣマップの原因である本明細書中ではＫＣＮＱ２と呼ばれる遺伝子がマーカーＤ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ１９に近い染色体２０ｑ１３．３にマッピングされることを示した（Leppertら、1989）。最初の報告に続いて、二つのセンターはＥＢＮ１（癲癇良性新生児タイプ１）遺伝子座（Ryanら、1991；Malafosseら、1992；Steinleinら、1992）と呼ばれる染色体２０上の同一の二つの遺伝子マーカーに対するＢＦＮＣの連鎖を確認した。より末端側のマーカーＤ２０Ｓ２４は、染色体２０連鎖家族においてＢＦＮＣ表現型を持つ完全な共分離を示す。ＢＦＮＣ遺伝子座について末端側フランキングマーカーを見出すことは、おそらくは、テロメアにそれが隣接するため成功してはいない。このテロメア領域は、物理的距離と比較した場合、マーカー間の高い組換え率によって特徴づけられる（Steinleinら、1992）。事実、Steinleinらは、３つのマーカーＤ２０Ｓ１９、Ｄ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ２４が同一の４５０Ｍｂ ＭｌｕI制限断片上に含有されることを示した（Steinleinら、1992）。ＫＣＮＱ２を見出しそれを調べるために用いた本研究における家族の全ては染色体２０ｑマーカーに対する連鎖を示し、３．０より大のＬＯＤ得点を持ち、あるいはＢＦＮＣに合致する臨床的発現を持つプロバンドを有する（Leppertら、1993）。各対象および対照は、そのホーム協会におけるインスティテューショナル・レビュー・ボード・フォー・ヒューマン・サブジェクト・リサーチによって認可されたこれらの実験において参加する同意書に署名した。ＢＦＮＣの原因である遺伝子を見出すために、本発明者らは、単一の家族において顕微鏡下欠失でもってＢＦＮＣ領域を狭め、この欠失において候補ｃＤＮＡを同定し、ついで、他のＢＦＮＣ家族における突然変異につき調査した。該遺伝子を同定し、配列決定した。いくつかの区別される突然変異がこの遺伝子で見出された。これらは大きな欠失、３つのミスセンス突然変異、３つのフレームシフト突然変異、２つのナンセンス突然変異および１つのスプライス部位突然変異を含む。これらの突然変異の１つは実施例に記載されるローランド癲癇と関連づけられる。
第２の染色体遺伝子座ＥＢＮ２もＢＦＮＣにつき同定されている。Lewisら（1993）は、ＢＦＮＣに罹った単一のヒスパニック家族において染色体８ｑ２４上のマーカーに対する連鎖を示した。この第２の遺伝子座についての証拠も白人種家系で報告されている（Steinleinら、1995）。ＥＢＮ２の原因である本明細書中でＫＣＮＱ３と呼ばれる遺伝子は照射ハイブリッドマップ上でマーカーＤ８Ｓ２５６およびＤ８Ｓ２８４の間にて、染色体８にマップされた（Lewisら、1995）。ＫＣＮＱ３は本開示の実施例に設定されているごとく同定された。同一マーカー間隔にて染色体８ｑ２４に以前関連付けられた大きなＢＦＮＣ家族における突然変異につき、ＫＣＮＱ３をスクリーニングした（Ryanら、1991；Lewisら、1993）。ミスセンス突然変異はＢＦＮＣ表現型を持つ完全な共分離にて臨界的なポア領域で見出された。また、同一の保存されたアミノ酸がＬＱＴ患者のＫＣＮＱ１で突然変異されている（Wangら、1996）。さらに、ｓｔａｒｇａｚｅｒ（ｓｔｇ）遺伝子座（Noebelsら、1990；Lettsら、1997）を保有するマウス染色体１５のセグメントは、ヒト８ｑ２４領域と相同であり、ｓｔｇ表現型はＩＧＥ、アプサンス癲癇の通常の形態に近い。Ｋ+チャンネルの同一ファミリーのＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３および他の未発見遺伝子は、他のより通常のＩＧＥについても強力な候補である。若年性ミオクローヌス癲癇を持つ１の個体が見出されており、そのものは、後記する実施例に示すＫＣＮＱ３の代替エキソンにおいて突然変異を有する。
ＩＧＥは多くの異なるタイプの発作を含む。通常のＩＧＥは、全身性緊張性−間代性発作（ＧＴＣＳ）、幼年時代のアプサンス癲癇（ＡＥＣ）、若年性アプササンス癲癇）（ＪＡＥ）および若年性ミオクローヌス癲癇（ＪＭＥ）を含む。ReutensおよびBerkovic（1995）が、異なるＩＧＥ症状の間の境界が区別されないことを示しており、これは、神経学的およびおそらくは遺伝学的関係がこれらの症状の間に存在することを示唆する。興味あることには、非パラメーター連鎖方法を用い、Zaraら、（1995）は多数のケースのＩＧＥを持つ家族のパネルにおいて染色体８ｑ２４の癲癇遺伝子座の関与についても証拠を得た。さらに、集団実験において、Steinleinら（1997）は、最近複数形態のＩＧＥを持つ非関連患者の群において、物理的にＫＣＮＱ２に近い染色体２０ｑ１３．３上でＣＨＲＮＡ４遺伝子座における弱い対立遺伝子関連を記載している。最後に、癲癇突然変異マウスＳｔａｒｇａｚｅｒ（ｓｔｇ）（Noebelsら、1990）はスパイク波癲癇の遺伝モデルである。これは劣性突然変異であり、表現型はヒトＩＧＥの通常の形態、アプサンス癲癇に関連する。Ｓｔｇはヒト８ｑ２４領域と相同な領域においてマウス染色体１５にマッピングされている。罹患マウスにおける突然変異についてのＫＣＮＱ３のマウスホモログのスクーリニングは、同一の遺伝子がＢＦＮＣおよびＳｔａｒｇａｚｅｒ表現型双方の原因であるという仮説であるのを評価するであろう。
本発明はＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３双方およびそれらの遺伝子産物、該遺伝子における突然変異、突然変異した遺伝子、野生型および突然変異した遺伝子のためのプローブ、およびＢＦＮＣの診断および予防方法に指向される。該遺伝子のおのおのはカリウムチャンネル蛋白質をコードする。本発明は、ＢＦＮＣを持ついくつかの家族がＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３いずれかにおいて突然変異を有することを示す。ＢＦＮＣは、試験すべき個体のＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、各ＤＮＡ配列を、正常なＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３遺伝子の既知のＤＮＡ配列と比較することによって、本発明により診断される。あるいは、試験すべき個体のＫＣＮＱ２遺伝子および／またはＫＣＮＱ３遺伝子はＢＦＮＣを引き起こす突然変異につきスクリーニングすることもできる。ＢＦＮＣの予測は、実行者が、現存の医療的治療を用いてこの障害を予防することを可能とするであろう。さらに、ローランド癲癇に関連するＫＣＮＱ２中の突然変異が見出されており、ＪＭＥに関連するＫＣＮＱ３中の突然変異が見出されている。また、これらの２つの形態の癲癇は本発明に従って診断することができる。
ヒトＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３に相同なマウス遺伝子が発見されており、配列決定され、該配列が開示される。マウスＫＣＮＱ２遺伝子は部分的にしか単離され、配列決定されておらず（配列番号：８８に示される）、３’末端はいまだ見出されていない。完全なマウスＫＣＮＱ３遺伝子が単離され、配列決定されている（配列番号：９０に示される）。
発明の背景を明らかにし、実施に関連するさらなる詳細を提供するために用いられる刊行物および他の資料は引用して本明細書に一体化させ、おのおの、便宜のために添付した引用のリストにグループ分けされる。
本発明は良性の家族性新生児痙攣（ＢＦＮＣ）ならびにローランド癲癇および若年性ミオクローヌス癲癇の分子的基礎に関する。
本発明は良性の家族性新生児痙攣（ＢＦＮＣ）ならびにローランド癲癇および若年性ミオクローヌス癲癇の分子的基礎を示す。さらに詳しくは、本発明は、ＫＣＮＱ２遺伝子またはＫＣＮＱ３遺伝子いずれかの分子変異体がこれらの３つの形態の癲癇の病気発生に関与することを決定した。遺伝子型分析は、ＫＣＮＱ２が１０の無関係家族においてＢＦＮＣに連鎖し、ＫＣＮＱ３が１つの他の家族においてＢＦＮＣに連鎖することを示す。さらに、１の家族の２の個体におけるＫＣＮＱ２遺伝子中の１つの突然変異がローランド癲癇と関連付けられ、ＫＣＮＱ３中に突然変異を持つ１の個体は若年性ミオクローヌス癲癇を持つと診断された。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３遺伝子の分析はＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを持つ対象の早期診断を提供するであろう。該診断方法は、試験すべき個体のＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３遺伝子のＤＮＡ配列を分析し、ついでそれを天然非変異体遺伝子のＤＮＡ配列と比較することを含む。第二の具体例において、試験すべき個体のＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３遺伝子は、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを引き起こす突然変異につきスクリーニングされる。これらの癲癇を予測する能力は、Ｋ+イオンチャンネルを直接的または間接的に変調する薬物のごとき医療的治療で病気を妨げることを可能とするであろう。
本発明は、カリウムチャンネルの種々の遺伝欠陥がＢＦＮＣ、ローランド癲癇の原因であることを示す。この知見はヒトにおけるチャンネル障害の増大するリストに付け加えられる（Ptacek、1997）。興味あることに、この結果、Ｋ+イオンチャンネルを直接的または間接的に変調する薬物が発作障害の治療で助けになるであろうことを示唆する。
本特許出願は少なくとも１つの色付き図面を含む。色付き図面を持つこの特許のコピーは請求および必要な手数料の支払いにより特許商標局によって提供されるであろう。
罹患個体におけるｎｕｌｌ対立遺伝子を示す、ＴａｑIで切断し、ＶＮＴＲマーカーＤ２０Ｓ２４でプローブした（Ｉ、II、IIIおよびIVとしてリストされた４世代を示す）家系１５４７ゲノムＤＮＡのサザンブロット。線Ａは箱中に示された遺伝子型誤遺伝を示し；線Ｂは修正された遺伝子型を示す。「Ｎ」は非浸透個体を示す。 Ｄ２０Ｓ２４の欠失を示す、Ｐ１−ＫＯ９−７（図２Ｃ）およびＰ１−ＫＯ９−６ｂ（図２Ｂ）ゲノムＰ１クローンおよび１２ｋｂ Ｄ２０Ｓ２４ ＲＦＬＰマーカー（図２Ａ）でプローブした家系１５４７の罹患個体からの細胞系の中期スプレッド。 ヒトメンバー（ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３およびＫＣＮＱ１）とＫＱＴ−様ファミリーのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ相同体（ｎＫＱＴ１）との間のアミノ酸整列。６つの膜貫通ドメインおよびコアは対応する配列の上方に位置した実線によって示される。膜貫通ドメイン中の保存された荷電アミノ酸は灰色で強調される。ＫＣＮＱ２の配列は配列番号：２であり、ＫＣＮＱ３の配列は配列番号：７であり、ｎＫＱＴ１の配列は配列番号：３であって、ＫＣＮＱ１の配列は配列番号：４である。 図４は、染色体２０に連鎖したＢＦＮＣを持つ三世代家系を示す。ＢＦＮＣ個体は、黒色の丸および四角で塗り潰したものによって示される。データは、家系１５０４からのものであり、これは、ＫＣＮＱポアにおける変異体を示す。図面の下方部分は、罹患個体においてのみ存在する変異体形態の共分離を示す。配列解析は、罹患個体における２つの塩基対挿入の存在を明らかとし、上方の２つの（変異体）バンドを示す ＫＣＮＱ３遺伝子座の照射ハイブリッドマッピング。対内ＬＯＤ得点は中央線の上方に示し、ｃＲ5000でのマーカー対の間の距離は、下方に示す。また、隣接する遺伝子座についての逆位に対する可能性は、各マーカー対について与える。 染色体８に連鎖したＢＦＮＣを持つ三世代家系を示す。ＢＦＮＣ個体は、黒色の丸および四角を塗り潰すことによって示される。非浸透個体III−８は、記号ＮＰによって示される。図面の下方部分は、罹患した、非浸透個体にのみ存在する１８７ｂｐ ＳＳＣＰ変異体の共分離を示す（矢印）。 ＫＣＮＱ２につき、イントロン−エキソン配列を示す。エキソン配列は太線で示し、プライマー配列はイタリック体で示す。プライマー配列は、表４で見出される。該配列は配列番号：１００−１１４である。 ＫＣＮＱ３につき、イントロン／エキソン配列を示す。エキソン配列は上方に示され、イントロンは下方に示され、プライマー配列は下線が施される。プライマー配列は、表６に見出される。該配列は、配列番号：１１５−１２９である。図８Ｉは、ＪＭＥ患者に見出される別の方法でスプライシングされたエキソンを示す。図８Ｎは、３’イントロン領域における「Ｎ」を示す。この「Ｎ」は、この領域で見出されるＡｌｕ反復を表す。
配列表の簡単な記載
配列番号：１は、ＫＣＮＱ２についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号：２は、ＫＣＮＱ２についてのアミノ酸配列である。
配列番号：３は、ｎＫＱＴ１についてのアミノ酸配列である。
配列番号：４は、ＫＣＮＱＩについてのアミノ酸配列である。
配列番号：５は、ＫＣＮＱ２のアミノ酸５４４をコードする２つのエキソンを中断するイントロンの３’末端のイントロン／エキソン接合におけるヌクレオチド配列である。
配列番号：６は、ＫＣＮＱ３についてのｃＤＮＡ配列である。
配列番号：７は、ＫＣＮＱ３についてのアミノ酸配列である。
配列番号：８−９は、体細胞ハイブリッドパネル遺伝子型タイプ分けで用いられるプライマーである（実施例７）。
配列番号：１０−１１は、染色体８照射ハイブリッドパネルを遺伝子型に分けるプライマーである(実施例８)。
配列番号：１２−１７は、全長ｃＤＮＡを得るためにＲＡＣＥを実行するのに使用されるプライマーである(実施例９)。
配列番号：１８−１９は、ＫＣＮＱ３についてのＳＳＣＰ変異体を同定したＰＣＲ断片を調製するのに使用されるプライマーである。
配列番号：２０−２１は、２つの核酸の間の％相同性の計算を示すための仮説的核酸配列である。
配列番号：２２−５３は、ＫＣＮＱ２の一部を増幅するためのプライマーである。
配列番号：５４−８７は、ＫＣＮＱ３の一部を増幅するためのプライマーである。
配列番号：８８は、部分的マウスＫＣＮＱ２である。
配列番号：８９は、配列番号：８８によってコードされる部分的マウスＫＣＮＱ２である。
配列番号：９０は、マウスＫＣＮＱ３である。
配列番号：９１は、配列番号：９０によってコードされるマウスＫＣＮＱ３である。
配列番号：９２は、ＫＣＮＱ３で見出される別のエキソンである。
配列番号：９３−９４は、ヒトＫＣＮＱ３の５’末端を増幅するためのマウス配列をベースとするためのプライマ−である。
配列番号：９５は、ヌクレオチド２７３６後にＧＧＧＣＣ挿入を持つ突然変異したヒトＫＣＮＱ２である。
配列番号：９６は、配列番号：９５によってコードされる突然変異したヒトＫＣＮＱ２である。
配列番号：９７−９９は、ＫＣＮＱ２の一部を増幅するためのプライマーである。
配列番号：１００−１１４は、ＫＣＮＱ２についてのイントロン／エキソン配列である(図７Ａ−Ｏ)。
配列番号：１１５−１２９は、ＫＣＮＱ３についてのイントロン／エキソン配列である(図８Ａ−Ｏ)。
本発明は、ＢＦＮＣがＫＣＮＱ２遺伝子およびＫＣＮＱ３遺伝子にマップされる、これらの遺伝子の分子変異体がＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの病気発生を引き起こし、またはそれに関与するという判断に指向される。より詳細には、本発明は、ＫＣＮＱ２遺伝子およびＫＣＮＱ３遺伝子における突然変異、ならびにＢＦＮＣ、ローランド癲癇およびＪＭＥの診断におけるそれらの使用に関する。さらに、本発明は、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇／またはＪＭＥを引き起こすＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３遺伝子変異体の存在につきヒトをスクリーニングする方法に指向される。これらの形態の癲癇は今日では早期に(即ち、徴候が出現する前にかつ明確に)検出できるので、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを有するとして同定される個体で良好な治療するオプションが利用できるであろう。また、本発明は、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを治療または予防するのに有用な薬物につきスクリーニングする方法に指向される。
本発明は、突然変異を同定するためのＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。かかる方法は、さらに、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の一部を増幅する工程を含むことができ、さらに、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の該部分の増幅用プライマーであるポリヌクレオチド組を供する工程を含むことができる。該方法は、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇、ＪＭＥの診断または予後いずれかで使用される突然変異を同定するのに有用である。
良性の家系性新生児痙攣は、新生児の癲癇を引き起こす常染色体の優性遺伝する障害である。この特発性全身性癲癇は、典型的には、生まれて２日ないしは４日に発作が開始する。該発作の自然的緩解は、２週間ないし１５週間の間に起こる（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。発作は典型的には緊張性体位、眼の徴候および他の自律的特徴で開始する。これは、次いで、しばしば間代性運動および運動自律性まで進行する。これらの新生児は発作の間に成育し、それらの神経学的調査および後の進展は正常な脳機能を示す（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。しかし、正常な神経学的進展にもかかわらず、一般的な集団における癲癇の２％累積的生涯危険性と比較して、ほぼ１６％のＢＦＮＣケースで後で再発する（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。
大家系における連鎖分析は、ＢＦＮＣの原因である遺伝子がマーカーＤ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ１９近くの染色体２０ｑ１３．３にマップされることを示した（Leppertら、1989）。最初の報告後に、２つのセンターは、ＥＢＮ１（癲癇良性新生児タイプ１）遺伝子座と呼ばれる染色体２０上の同一の２つの遺伝子マーカーに対するＢＦＮＣの連鎖を確認した（Ryanら、1991；Malafosseら、1992）。より末端側のマーカーＤ２０Ｓ２４は、染色体２０連鎖家族において、ＢＦＮＣ表現型を持つ完全な共分離を示す。ＢＦＮＣ遺伝子座についての末端側プランキングマーカーを見出すことは、おそらくは、それがテロメアに近接しているために成功していない。このテロメア領域は、物理的距離と比較した場合、マーカー間の高い組換え率によって特徴付けられる（Steinleinら、1992）。事実、Steinleinらは、３つのマーカーＤ２０Ｓ１９、Ｄ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ２４が同一の４５０Ｍｂ ＭｌｕＩ制限断片に含有されることを示した（Steinleinら、1992）。ＫＣＮＱ２についての本研究での家族の全ては、３．０より大のＬＯＤ得点でもって染色体２９ｑマーカーに対する連鎖を示すか、あるいは、ＢＦＮＣと合致する臨床的発現を持つプロバンドを有する（Leppertら、1993）。ＢＦＮＣの原因であるこの遺伝子を見出すために、本発明者らは、単一家族において顕微鏡下欠失を持つＢＦＮＣ領域を狭め、この欠失における候補ｃＤＮＡを同定し、次いで、他のＢＦＮＣ家族における突然変異を調べた。
また、第２の染色体遺伝子座ＥＢＮ２もＢＦＮＣにつき同定されている。Lewisら（1993）は、ＢＦＮＣに罹った単一のヒスパニック家族において、染色体８ｑ２４上のマーカーに対する連鎖を示した。また、この第２の遺伝子座についての証拠は、白人家系で報告されている（Steinleinら、1995）。ＥＢＮ２についての遺伝子、ＫＣＮＱ３が今回発見され、本開示で詳細に記載されるごとく、特徴付けられた。
最後に、本発明は、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇、ＪＭＥを治療または予防するのに有用な薬物を同定するための薬物候補をスクリーニングする方法に指向される。薬物スクリーニングは、卵母細胞、哺乳動物細胞、またはトランスジェニック動物のごとき細胞において突然変異体ＫＣＮＱ２または突然変異体ＫＣＮＱ３を発現させ、次いで、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３カリウムチャンネルに対する薬物候補の効果を検定することによって行われる。該効果は、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子を用いて得られたＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３カリウムチャンネル活性と比較される。
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３遺伝子が、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇およびＪＭＥを引き起こすことに関与する証拠は、異常ＫＣＮＱ２もしくは異常ＫＣＮＱ３遺伝子産物をまたは該遺伝子産物の異常レベルを生じさせる罹患家系メンバーから抽出されたＤＮＡにおいて配列を見出すことによって得られる。かかる罹患性対立遺伝子は大きな家系において該病気と共に共分離する。それらは、一般的集団における個体におけるよりも、癲癇を持つ非家系個体でかなり高い頻度で存在するであろう。カギとなるのは、遺伝子産物の正常な機能に対する明白な破壊を引き起こすのに十分な程にひどい突然変異を見出すことである。これらの突然変異は、多数の形態を取りうる。ほとんどのひどい形態は、異常蛋白質を遺伝子がコードするようにするフレームシフト突然変異、あるいは、蛋白質発現をかなり変化させるものである。破壊度が低い破壊的突然変異は、システイン残基からまたはそれへの、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への変化あるいはその逆、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への変化あるいはその逆のごとき、生産された蛋白質に対する優意な効果を有する小さなインフレーム欠失および非保存的塩基対置換、あるいは二次的または三次的蛋白質構造に影響するであろう他の突然本位を含むであろう。サイレント突然変異または保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異は、一般的には蛋白質機能を破壊すると予測される。
本発明の診断および予後方法によると、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の改変が検出される。加えて、該方法は、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子を検出し、この遺伝子座の結果としての癲癇の原因の欠如を確認することによって行うことができる。「野生型遺伝子の改変」は、コーディングおよび非コーディング領域中の欠失、挿入および点突然変異を含めた全ての形態の突然変異を含む。欠失は全遺伝子のもの、あるいは遺伝子の部分のみのものであってよい。点突然変異の結果、停止コドン、フレームシフト突然変異またはアミノ酸置換が生じる。体細胞突然変異は、ある種の組織においてのみ起こり、生殖系では遺伝されないものである。生殖系突然変異は、身体の組織のいずれかにおいて見出すことができ、遺伝される。点突然変異事象は、遺伝子のプロモーターにおけるごとく調節領域で起こる可能性があり、ｍＲＮＡの発現の喪失または減少に至る。また、点突然変異は、適当なＲＮＡプロセッシングを排除し、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子産物の発現の喪失またはｍＲＮＡの安定性または翻訳効率の減少に至る。
有用な診断技術は、限定されるものではないが、さらに後記で詳細に記載するごとき蛍光イン・サイチュハイブリダゼーション（ＦＩＳＨ）、直接的ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖立体配座分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析、金ナノ粒子およびＰＣＲ−ＳＳＣＰで修飾された核酸を用いるハイブリダイゼーションを含む。また、ＤＮＡマイクロチップ技術の最近開発された技術は有用である。
ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの存在は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の突然変異につきヒトのいずれかの組織をテストすることによって確認することができる。たとえば、生殖系ＫＣＮＱ２突然変異を遺伝した個体はＢＦＮＣを発病する傾向にあるであろう。これは、個体の身体のいずれかの組織からのＤＮＡをテストすることによって測定することができる。最も単純には、血液を採取し、血液の細胞からＤＮＡを抽出することができる。加えて、出産前診断は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の突然変異につき胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞をテストすることによって達成することができる。野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子の改変は、たとえば、点突然変異または欠失によるか否かにかかわらず、本明細書中に記載する手段のいずれかによって検出することができる。
ＤＮＡ配列変異を検出するのに用いることができるいくつかの方法がある。直接的ＤＮＡ配列決定、手動配列決定または自動蛍光配列決定は配列の変異を検出することができる。もう１つのアプローチは、１本鎖立体配座多形アッセイ(ＳＳＣＰ)（Oritaら、1989）である。特にもし、ＤＮＡ断片のサイズが２００ｂｐより大であるが、ほとんどのＤＮＡ配列変異を検出するように最適化できるならば、この方法は、全ての配列変化を検出しない。低下した検出感度は、不利であるが、ＳＳＣＰで可能な増大したスループットはそれを、リサーチベースの突然変異検出用の配列決定に指向するための魅力的で活動的な代替法とする。ＳＳＣＰゲル上でシフトされた移動度を有する断片を配列決定して、ＤＮＡ配列変異の正確な性質を決定する。２つの相補的なＤＮＡ鎖の間のミスマッチの検出に基づく他のアプローチは、クランプト変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）（Sheffieldら、1991）、ヘテロデュプレックス分析（ＨＡ）（Whiteら、1992）、および化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Grompeら、1989）を含む。前記した方法のいずれも大きな欠失、複製、または挿入を検出せず、またそれらは、蛋白質の転写または翻訳に影響する調節突然変異を検出しないであろう。蛋白質切形アッセイまたは不斉アッセイのごとき突然変異のこれらのクラスを検出するであろう他の方法は、特異的タイプの突然変異のみを検出し、ミスセンス突然変異を検出しないであろう。ＤＮＡ配列変異を検出する現在利用可能な方法のレビューは、Grompe（1993）による最近のレビューで見出すことができる。一旦突然変異が知られると、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションのごとき対立遺伝子特異的検出アプローチを用いて、その同一突然変異につき非常に多数の他の試料を迅速にスクリーニングすることができる。かかる技術は金ナノ粒子で標識されたプローブを利用して目に見える色彩結果を生じさせることができる（Elghanianら、1997）。
ＤＮＡ配列において多形を検出するための迅速な予備的分析は、１以上の制限酵素、好ましくは非常に多数の制限酵素で切断されたＤＮＡの一連のサザンブロットを調べることによって行うことができる。各ブロットは、一連の正常な個体および一連のＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥケースを含有する。ＫＣＮＱ２遺伝子座近くのまたはそれを含む配列でプローブした場合に、対照ＤＮＡとは長さが異なるハイブリダイズする断片を呈するサザンブロットは、可能な突然変異を示す。非常に大きな制限断片を生ずる制限酵素を用いれば、パルスド・フイールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用する。
点突然変異の検出は当該分野でよく知られた技術を用いて、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子の分子クローニングおよび該対立遺伝子の配列決定によって達成することができる。また、遺伝子または遺伝子の部分を、たとえば、ＰＣＲまたは他の増幅技術によって増幅することができ、増幅された遺伝子または遺伝子の増幅された部分を配列決定することができる。
罹患性対立遺伝子の存在を確認するためのより複雑であるが、依然として間接的なテスト用の６つのよく知られた方法がある；
１）一本鎖立体配座分析（ＳＳＣＰ）（Oritaら、1989）；２）変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Wartellら、1990；Sheffieldら、1989）；３）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Finkelsteinら、1990；Kinszlerら、1991）；４）対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（Connerら、1983）；５）Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔＳ蛋白質のごとき、ヌクレオチドミスマッチを認識する蛋白質の使用（Modrich、1991）；および６）対立遺伝子−特異的ＰＣＲ（RuanoおよびKidd、1989）。対立遺伝子−特異的ＰＣＲでは、それらの３’末端において特定のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３突然変異にハイブリダイズするプライマーを用いる。特定の突然変異が存在しなければ、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開番号第０３３２４３５号およびNewtonら、1989に開示されているごとくAmplification Refractary Mutation System (ＡＲＭＳ)を用いることができる。クローニング、配列決定および増幅によって遺伝子の挿入および欠失を検出することもできる。加えて、遺伝子または周囲のマーカー遺伝子用の制限断片長多形（ＲＦＬＰ）プローブを用いて、対立遺伝子の改変または多形断片における挿入のスコア取りをすることができる。かかる方法は、特に、その個体で見出される突然変異の存在につき、罹患個体の親族をスクリーニングするのに有用である。当該分野で公知の挿入および欠失を検出するためには他の技術を用いることができる。
最初の３つの方法（ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ）において、新しい電気泳動バンドが出現する。配列の変化は、一本鎖の、分子内塩基対合において差を引き起こすので、ＳＳＣＰは異なって移動するバンドを検出する。ＲＮａｓｅ保護は、突然変異体ポリヌクレオチドの２以上のより小さな断片への切断を含む。ＤＧＧＥは、変性グラジエントゲルを用いて野生型配列と比較した突然変異体配列の移動速度の差を検出する。対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいて、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、該アッセイはハイブリダイゼーションシグナルの存在または不存在を検出することによって行われる。ｍｕｔＳアッセイにおいて、蛋白質は、突然変異体および野生型配列の間のヘテロデュプレックスにおいてヌクレオチドミスマッチを含有する配列にのみ結合する。
本発明によるとミスマッチは、２つの鎖が１００％相補性ではない、ハイブリダイズした核酸デュプレックスである。総じての相同性の欠如は欠失、挿入、逆位または置換によるものである。ミスマッチ検出を用いて遺伝子またはそのｍＲＮＡ産物における点突然変異を検出することができる。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、非常に多数の試料に対して実行するのにより単純である。ミスマッチ切断技術の例はＲＮａｓｅ保護方法である。本発明の実施において、該方法は、ヒト野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子コーディング配列に対して相補的な標識リボプローブの使用を含む。リボプローブおよび個人から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡいずれかを一緒にアニールし（ハイブリダイズさせ）、引き続いて、デュプレックスＲＮＡ構造中のいくつかのミスマッチを検出することができる酵素ＲＮａｓｅ Ａで消化する。もしミスマッチがＲＮａｓｅ Ａによって検出されれば、それはミスマッチの部位で切断する。かくして、アニールされたＲＮＡ調製物を電気泳動ゲルマトリックスで分離した場合、もしミスマッチがＲＮａｓｅ Ａによって検出され、切断されたならば、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡについての全長ＲＮＡデュプレックスよりも小さなＲＮＡ産物が観察されるであろう。リボプローブはｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はないが、いずれかのセグメントでありえる。もし、リボプローブがｍＲＮＡまたは遺伝子セグメントのみを含むならば、ミスマッチにつき全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングするために多数のこれらのプローブを用いるのが望ましいであろう。
同様にＤＮＡプローブを用いて、酵素的または化学的切断を介してミスマッチを検出することができる。たとえば、Cottonら、1988；Shenkら、1975；Novackら、1986参照。別法として、マッチしたデュプレックスに対するミスマッチしたデュプレックスの電気泳動移動度の検出によってミスマッチを検出することができる。たとえば、Cariello、1988参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブいずれかでは、突然変異を含有する細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡは、ハイブリダイゼーション前にＰＣＲ（後記参照）を用いて増幅することができる。また、当該変化が特に欠失および挿入のごとき目に見える再配置であるならば、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子のＤＮＡの変化はサザンハイブリダイゼーションを用いて検出することもできる。
ＰＣＲの使用によって増幅されているＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子のＤＮＡ配列は、対立遺伝子−特異的プローブを用いてスクリーニングすることもできる。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、その各々は、既知の突然変異を保有する遺伝子配列の領域を含む。例えば、１のオリゴマーは長さが約３０ヌクレオチドであってよく、これは遺伝子配列の一部に対応する。かかる対立遺伝子−特異的プローブのバッテリーの使用によって、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、当該遺伝子において従前に同定された突然変異を同定することができる。対立遺伝子−特異的プローブと増幅されたＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行うことができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブへのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子−特異的プローブにおけるごとく、組織中の同一突然変異の存在を示す。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、１００％相補性ではない即ち、ミスマッチがあれば結合は起こらない核酸への当該最初の核酸の結合を同時に防止しつつ、最初の核酸（プローブ）の８塩基対ストレッチが核酸の１００％完全に相補的な８塩基対ストレッチに結合することを可能とする条件と定義される。
マイクロチップ技術を介する核酸分析の最近開発された技術も本発明に適用することができる。この技術においては、文字通り数千の区別されるオリゴヌクレオチドプローブがシリコンチップ上のアレイ中に形成される。分析すべき核酸を蛍光標識し、チップ上のプローブにハイブリダイズさせる。また、これらの核酸マイクロチップを用い、核酸−蛋白質相互作用を調べることもできる。この技術を用い、突然変異の存在を測定し、または分析すべき核酸の配列決定さえでき、あるいは注目する遺伝子の発現レベルを測定することができる。該方法は、一度に数千も多いプローブの平行したプロセッシングのうちの１つであり、分析の速度を驚異的に増加させることができる。この技術を用いるいくつかの論文が公表されている。これらのうちのいくつかは、Haciaら、1996；Shoemakerら、1996；Cheeら、1996；Lockhartら、1996；DeRisiら、1996；Lipshutzら、1995である。この方法は、乳癌遺伝子ＢＲＣＡ１中の突然変異につき人々をスクリーニングするのにすでに用いられている（Haciaら、1996）。この新しい技術はChemical and Engineering News（Borman、1996）中のニュース論文でレビューされており、編集の主題であった（Nature Genetics、1996）。また、Fodor（1997）参照。
候補遺伝子座における突然変異についての最もはっきりしたテストは、患者からのゲノムＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３配列を対照集団からのそれと直接的に比較することである。別法として、例えばＰＣＲによる増幅の後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定し、それにより、候補遺伝子のエキソン構造の決定の必要性をなくすることができる。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のコーディング領域の外側にある患者からの突然変異は、当該遺伝子の近くまたはそれ内のイントロンおよび調節配列のごとき非コーディング領域を調べることによって検出することができる。非コーディング領域の突然変異が重要である初期の指摘は、対照個体と比較した、患者における異常なサイズまたは豊富性のメッセンジャーＲＮＡ分子を明らかにするノザンブロット実験に由来することができる。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ ｍＲＮＡ発現の改変は、当該分野で公知のいくつかの技術によって検出することができる。これらは、ノザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。ｍＲＮＡ発現の減少は野生型遺伝子の改変を示す。野生型遺伝子の改変は野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質の改変につきスクリーニングすることによって検出することもできる。例えば、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３と免疫反応性のモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。同族抗原の欠如は突然変異を示す。また、突然変異体対立遺伝子の産物につき特異的な抗体を用いて突然変異体遺伝子産物を検出することもできる。かかる免疫学的アッセイは当該分野で公知のいずれの便宜な様式によって行うこともできる。これらは、ウエスタンブロット、免疫組織化学アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む。改変されたＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質を検出するいずれかの手段を用いて野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の改変を検出することができる。蛋白質結合測定のごとき機能的アッセイを用いることができる。加えて、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３生化学機能を検出するアッセイを用いることができる。突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子産物の発見は、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の改変を示す。
また、突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子または遺伝子産物は、血清、便、尿および唾液、痰のごとき他のヒト身体試料で検出することもできる。組織中の突然変異体遺伝子または遺伝子産物の検出につき前記した同一の技術を他の身体試料に適用することができる。かかる身体試料をスクリーニングするこによって、単純な初期診断をＢＦＮＣ、ローランド癲癇、ＪＭＥにつき達成することができる。
本発明のプライマー対はＰＣＲを用いる特定のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定で有用である。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３についての一本鎖ＤＮＡプライマーの対を、染色体２０上のＫＣＮＱ２遺伝子または染色体８上のＫＣＮＱ３遺伝子内またはその周りの配列にアニールして遺伝子それ自体の増幅するＤＮＡ合成の起点とすることができる。これらのプライマーの完全な組は配列をコードする遺伝子、すなわち、エキソンのヌクレオチドの全ての合成を可能とする。プライマーの組は、好ましくは、イントロンおよびエキソン配列双方の合成を可能とする。対立遺伝子−特異的プライマーを用いることもできる。かかるプライマーは特定のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３突然変異体対立遺伝子のみにアニールし、かくして、鋳型としての突然変異体対立遺伝子の存在下で産物を増幅するのみである。
増幅された配列の引き続いてのクローニングを容易とするために、プライマーはその５’末端に付着させた制限酵素部位を有することができる。かくして、プライマーの全てのヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するのに必要な数個のヌクレオチドを除き、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３配列あるいはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に隣接する配列に由来する。かかる酵素および部位は当該分野でよく知られている。プライマーそれ自体は当該分野でよく知られている技術を用いて合成することができる。一般的に、プライマーは、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機を用いて作成することができる。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３の配列が与えられれば、特定のプライマーの設計は当業者の技量の範囲内のものである。
本発明によって提供される核酸プローブは多数の目的で有用である。それらは、ゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションおよびすでに述べた点突然変異を検出するＲＮａｓｅ保護方法で用いることができる。該プローブはＰＣＲ増幅産物を検出するのに用いることができる。また、それらを用いて、他の技術を用い、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子またはｍＲＮＡでのミスマッチを検出することもできる。
野生型ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３遺伝子を持つほとんどの個体はＢＦＮＣを有しないことが判明した。しかしながら、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子産物の機能に干渉する突然変異はＢＦＮＣの病因に関与する。かくして、機能の喪失、または改変された機能を有する蛋白質を生産する改変された（または突然変異体）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の存在は、発作の危険性を増大するＢＦＮＣを直接的に引き起こす。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子突然変異を検出するには、生物学的試料を調製し、分析すべき対立遺伝子の配列および野生型対立遺伝子の配列の間の差異につき分析する。突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＭＱ３対立遺伝子は、前記した技術のうちいずれかによってまず同定することができる。ついで、突然変異体対立遺伝子を配列決定して、特定の突然変異体対立遺伝子の特異的突然変異を同定する。別法として、突然変異体対立遺伝子は、通常の技術を用い、突然変異体（改変された）蛋白質を同定することによって最初に同定することができる。ついで、突然変異体対立遺伝子を配列決定して各対立遺伝子につき特異的突然変異を同定する。突然変異、特に蛋白質の改変された機能をもたらすものは、従って、本発明の診断および予後方法で用いられる。
これは、Ｋ+チャンネルが関与する最初のヒト特発性全身性癲癇である。ＢＦＮＣは、Ｕｎｖｅｒｒｉｃｈｔ−Ｌｕｎｄｂｏｒｇタイプの進行性ミオクローヌス癲癇のごとき他の症状を伴う変性的特徴のない真実の特発性癲癇であると考えられる。従って、ニューロン励起を直接的に調節する遺伝子における改変がこの癲癇障害を引き起こすのは驚くべきことではない。電圧依存性カリウムチャンネルは、Ｎａ+およびＣａ++電圧依存性イオンチャンネルによって脱分極されたニューロン膜を再分極させる。Ｋ+チャンネルは、グルタメートおよびアセチルコリンを含めた、励起性神経伝達物質イオンチャンネルの活性化に続いてニューロン膜を再分極させると考えられる。機能が低下した突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３チャンネルの存在において、活性化された励起性リガンドおよび電圧依存性チャンネルは長い間開いたままであろう（KeatingおよびSanguinetti、1996；Meldrum、1995；McNamara、1994）。励起性系のかかる未チェックの活性は、癲癇表現型に至り得る。突然変異体ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３チャンネルの電気生理学的分析は、いかにして本研究において同定された突然変異が癲癇表現型を生じるかについて見解をもたらすであろう。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３は遅延した整流ＫＣＮＱ１チャンネルと同様の生物物理学特性を有するであろう。ＫＣＮＱ１アルファサブユニットはｍｉｎＫベータサブユニットと共に組み立てられて、心臓中のヘテロマルチマーＩKsチャンネルを形成する（Sanguinettiら、1996）。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３サブユニットは脳においてｍｉｎＫ−様βサブユニットとともに組み立てることが可能である。また、この相互作用は、ＫＣＮＱ１の場合のように、得られたヘテロマルチマーチャンネルのゲーティング特性を変えるであろう。
Ｋ+チャンネルにおける突然変異はただひとつの他の場合、ｗｅａｖｅｒマウス（ＧＩＲＫ２遺伝子中の単一のミスセンス突然変異が自然発生発作を生じる）において癲癇と関連付けられている（Patilら、1995；Signoriniら、1997）。Ｋ+チャンネルにおける突然変異は染色体中１１上の長ＱＴ症候群および染色体１２上の運動失調／ミオキミアのごとき他のヒト障害に関連付けられてきた（Wangら、1996；Neyroudら、1997；Russellら、1996；ChandyおよびGutman、1995；Browneら、1994）。長ＱＴはそのうち２つがＫ+チャンネル遺伝子ＨＥＲＧおよびＫＣＮＱ１である４つの遺伝子座と関連付けられている。ＫＣＮＱ１において、突然変異ホットスポットはポアおよびＳ６ドメインにおいて同定されており、ここに、これらの領域におけるミスセンス突然変異はＬＱＴ中の突然変異を引き起こす病気の大部分を説明する（Russellら、1996；Wangら、1996）。
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３遺伝子の発見の最初の公表以来、いくつかのより多い刊行物がある。Iannottiら（1998）はＫＣＮＱ２の２つのスプライス変異体があることを見出した。これらはそのＣ−末端が異なる長いおよび短い形態である。該長い形態はもっぱらヒト脳（成人および胎児）で発現され、そこではそれは膠細胞よりもむしろニューロンに制限される。該短い形態は成人の脳では、弱く発現されるが、胎児の脳および精巣では支配的であるIannottiら（1998）。Gribkoffら（1998）は、アフリカツメガエル卵母細胞中においてＫＣＮＱ２のマウス相同体をクローン化し、発現させ、二電極電圧クランプ実験を行った。Dworetzkyら（1998）は、ＫＣＮＱ２のマウス相同体をクローン化し、該遺伝子の３’領域において別のスプライス変異体を認めている。彼らは、ノザンブロットを行い、マウス遺伝子を発現するアフリカツメガエル卵母細胞中で分極を測定した。Yangら（1998）は、ヒトＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３をクローン化し発現させた。彼らは、電圧依存性の迅速に活性化するＫ+−選択的電流を誘導するにおいて該コードされた蛋白質はＫＣＮＱ１のように作用するが、ＫＣＮＱ１とは対照的に、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３蛋白質誘導電流は、ＫＣＮＱ１の共発現によって増加されないことに気がついている。しかしながら、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３の共発現の結果、電流振幅が実質的に相乗的に増加する（Yangら、1998）。最後に、Biervertら（1998）は、ヒトＫＣＮＱ２をクローン化し、それをアフリカツメガエル卵母細胞中で発現させた。
定義
本発明は以下の定義を使用する。
「ポリヌクレオチドの増幅」はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ増幅（またはリガーゼ鎖反応、ＬＣＲ）およびＱ−ベータレプリカ−ゼの使用に基づく増幅方法のごとき方法を使用する。また、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡおよび核酸配列ベースの増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）が有用である。これらの方法はよく知られており、当該分野で広く実施されている。たとえば、米国特許第４６８３１９５号および第４６８３２０２号およびInnisら、1990（ＰＣＲについて）；WuおよびWallace、1989（ＬＣＲについて）；米国特許第５２７０１８４号および第５４５５１６６号およびWalkerら、1992（ＳＤＡについて）；Spargoら、1996（好熱性ＳＤＡについて）および米国特許第５４０９８１８号、Fahyら1991およびCompton、1991（３ＳＲおよびＮＡＳＢＡについて）参照。ＰＣＲを実施するための試薬およびハードウェアは商業的に入手可能である。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３領域あるいはその中の標的領域に近接してそれをはさむ領域中の配列に相補的であり、それに特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成したＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３配列は直接的に配列決定することができる。別法としてしかしながらあまり望ましくはないが、増幅された配列は配列分析に先立ってクローン化することができる。酵素的に増幅されたゲノムセグメントの直接的クローニングおよび配列分析のための方法は、Scharfら、1986によって記載されている。
「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物ストランド」とは、標的配列を含有することが疑われる、および生物学的試料を含めた種々のタイプの試料に存在する可能性がある、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを言う。
「抗体」 また、本発明は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドおよびその断片に、またはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３領域からのポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびその断片、ならびにその免疫学的結合同等体を提供する。「抗体」なる用語は均一な分子集団、または複数の異なる分子集団からなる血清産物のごとき混合物に言及するのに使用される。ポリペプチドはペプチド合成機で合成により調製し、担体分子（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングさせ、数ヶ月間に渡ってウサギに注射することができる。ウサギ血清を、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片に対する免疫反応性についてテストする。モノクローナル抗体は、蛋白質ポリペプチド、融合蛋白質またはその断片をマウスに注射することによって作成することができる。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたはその断片との特異的免疫反応性についてテストされる。HarlowおよびLane、1988参照。これらの抗体はアッセイならびに医薬で有用であろう。
一旦十分な量の所望のポリペプチドが得られたなら、それを種々の目的で使用することができる。典型的な用途は結合につき特異的な抗体の生産である。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、当該分野でよく知られたイン・ビトロまたはイン・ビボの技術によって生産することができる。ポリクローナル抗体の生産では、適当な標的免疫系（典型的にはマウスまたはウサギ）が選択される。動物に適した方法によって、および免疫学者によく知られた他のパラメーターによって、実質的に精製された抗原が免疫系に提示される。注射用の典型的な部位は四肢、筋肉内投与、腹腔内投与または皮膚内投与である。もちろんマウスまたはウサギに代えて他の種で置き換えることができる。ついで、当該分野で公知の技術を用いてポリクローナル抗体を精製し、所望の特異性につき調製する。
免疫学的応答は通常免疫アッセイで検定される。通常、かかる免疫アッセイは、たとえば、同一の細胞によって、および抗原として同様に生産された抗原の源のある精製を含む。種々の免疫アッセイ方法は当該分野でよく知られている。たとえば、HarlowおよびLane、1988またはGoding、1986参照。
１０-8Ｍ-1、好ましくは１０-9ないし１０-10Ｍ-1またはそれよりも強い親和性を持つモノクローナル抗体は、典型的には、例えば、HarlowおよびLane、1988またはGoding、1986に記載されている標準的な手法によって作成されるであろう。簡単に述べると、適当な動物を選択し、それに続いて所望の免疫化プロトコルを行う。適当な時間の後、かかる動物の脾臓を切り出し、適当な選択条件下、個々の脾臓細胞を典型的には不滅化骨髄腫細胞に融合させる。しかる後、細胞をクローン的に分離し、各クローンの上澄みを抗原の所望の領域に特異的な適当な抗体のその生産につきテストする。
他の適当な技術は抗原性ポリペプチドへのリンパ球のイン・ビトロでの暴露を含み、あるいは別法としてファージまたは同様のベクター中における抗体のライブラリーの選択へのイン・ビトロ暴露を含む。例えば、Huseら、1989参照。本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾してまたは修飾することなく用いることができる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合または非共有結合させることによって標識される。非常に種々の標識およびコンジュゲーション技術が公知であり、科学および特許文献双方において専ら報告されている。適当な標識は放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、ケミルミネッセンス剤、磁性粒子等を含む。かかる標識の使用を教示する特許は米国特許第３８１７８３７号；第３８５０７５２号；第３９３９３５０号；第３９９６３４５号；第４２７７４３７号；第４２７５１４９号および第４３６６２４１号を含む。また、組換え免疫グロブリンを生産することもできる。（米国特許第４８１６５６７号参照）。
「結合パートナー」とは、たとえば、抗原および抗原−特異的抗体または酵素およびその阻害剤のような、高い特異性でもってリガンド分子に結合することができる分子をいう。一般に、特異的結合パートナーは十分な親和性を持って結合して、単離条件下で、分析物コピー／相補性ストランドデュプレックス（ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの場合）を固定化しなければならない。特異的結合パートナーは当該分野で知られており、たとえば、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、多数の公知の受容体−リガンドカップル、および相補的ポリヌクレオチド鎖を含む。相補性ポリヌクレオチド結合パートナーの場合、該パートナーは通常は長さが少なくとも約１５塩基であり、長さが少なくとも４０塩基であってよい。１５より短い（例えば、８塩基）、１５および４０の間、４０塩基より大きい長さを使用することのできるのは当業者によってよく認識されている。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチドアナログよりなるものであってよい。さらに結合パートナーは本明細書中に記載のごとく、たとえば、２−ハイブリッド酵母スクリーニングアッセイを用いて同定することができる。
「生物学的試料」とは、限定されるものではないが、例えば血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部セクション、呼吸管、腸管、および尿生殖器管、涙、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織およびイン・ビトロ細胞培養成分の試料を含めた、個体からの分析物ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有することが疑われる、組織または流体の試料を言う。
「コードする」。ポリヌクレオチドは、もしそれが天然の状態において、あるいは当業者によく知られた方法によって操作された場合、それが転写および／または翻訳されてｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドもしくはその断片を生じることができるならば、ポリペプチドを「コードする」といわれる。アンチセンス鎖はかかる核酸の相補体であって、コーディング配列はそれから推定することができる。
「単離された」または「実質的に純粋な」。「単離された」または「実質的に純粋な」核酸（たとえば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、天然ヒト配列または蛋白質を天然で伴う他の細胞成分、たとえば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列および蛋白質から実質的に分離されたものである。該用語はその天然に生じる環境から取り出された核酸配列または蛋白質を含み、組換えもしくはクローン化ＤＮＡ単離体および化学的に合成されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成されたアナログを含む。
「ＫＣＮＱ２対立遺伝子」とは、ＫＣＮＱ２遺伝子座の正常対立遺伝子ならびにＢＦＮＣおよび／またはローランド癲癇を引き起こす変異を担うＫＣＮＱ２の対立遺伝子を言う。
「ＫＣＮＱ３対立遺伝子」とは、ＫＣＮＱ３遺伝子座の正常対立遺伝子ならびにＢＦＮＣおよび／またはＪＭＥを引き起こす変異を担うＫＣＮＱ３の対立遺伝子を言う。
「ＫＣＮＱ２遺伝子座」、「ＫＣＮＱ２遺伝子」、「ＫＣＮＱ２核酸」または「ＫＣＮＱ２ポリヌクレオチド」は、おのおの、正常組織で発現されることが予測される、そのすべてがＫＣＮＱ２領域にあるポリヌクレオチドをいい、そのうちのある対立遺伝子はＢＦＮＣおよび／またはローランド癲癇を生じる。ＫＣＮＱ２遺伝子座はコーディング配列、介入配列および転写および／または翻訳を制御する調節エレメントを含ませる意図である。ＫＣＮＱ２遺伝子座はＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変異体を含ませる意図である。
「ＫＣＮＱ３遺伝子座」、「ＫＣＮＱ３遺伝子」、「ＫＣＮＱ３核酸」または「ＫＣＮＱ３ポリヌクレオチド」は、おのおの、正常組織で発現されることが予測される、そのすべてがＫＣＮＱ３領域にあるポリヌクレオチドをいい、そのうちのある対立遺伝子はＢＦＮＣおよび／またはＪＭＥを生じる。ＫＣＮＱ３遺伝子座はコーディング配列、介入配列および転写および／または翻訳を制御する調節エレメントを含ませる意図である。ＫＣＮＱ３遺伝子座はＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変異体を含ませる意図である。
これらの用語は、核酸に適用される場合、ヒトＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチド、断片、相同体または変異体（たとえば蛋白質融合または欠失を含む）をコードする核酸を言う。本発明の核酸は、天然ＫＣＮＱ２−またはＫＣＮＱ３−をコードする遺伝子または天然ＫＣＮＱ２−またはＫＣＮＱ３−をコードする遺伝子もしくはその一部との実質的相同性を有するものに由来する、あるいはそれに実質的に同様な配列を有するであろう。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子または核酸は、おのおの、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドのアミノ酸配列に対して影響を有しないサイレント配列遺伝子ならびにその機能に実質的に影響しないＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドのアミノ酸配列変異体に至る対立遺伝子を含めた、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の正常対立遺伝子を含む。これらの用語はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの機能に悪影響する一以上の突然変異を有する対立遺伝子を含む。突然変異は、おのおの、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３機能の部分的もしくは完全な喪失の結果となる、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドのアミノ酸配列の有害な変化を生じるＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３核酸配列の変化であり得るかまたは、有効なＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３発現の喪失またはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの異常形態の生産の結果となる核酸配列の変化であり得る。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３核酸は配列番号：１（ＫＣＮＱ２）または配列番号：６（ＫＣＮＱ３）に示されるものであってよく、あるいはそれは示された配列の一以上のヌクレオチドの１以上の付加、挿入、欠失および置換である変化によって示されるものとは異なる前記した対立遺伝子または変異体もしくは誘導体であってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化の結果、遺伝暗号によって決定されるごとく、蛋白質レベルにおけるアミノ酸変化がもたらされ得る。
かくして、本発明の核酸は配列番号：１および６に示された配列とは異なる配列を含むことができるが、依然として、配列番号：２（ＫＣＮＱ２）および７（ＫＣＮＱ３）に示される同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする。すなわち、本発明の核酸は遺伝暗号の結果として変性する配列を含む。他方、コードされたポリペプチドは、配列番号：２および７に示されるアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸配列だけ異なるアミノ酸配列を含むことができる。配列番号：２および７に示されたアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体、誘導体または対立遺伝子であるポリペプチドをコードする核酸も本発明によって提供される。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子は、おのおの、（ａ）（ｉ）高度にストリンジェントな条件下で、配列番号：１または配列番号：６に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズする（Ausubelら、1992）、および（ii）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に機能的に同等の遺伝子産物をコードするいずれものＤＮＡ配列、（ｂ）（ｉ）中程度のストリンジェント条件のごときより低いストリンジェント条件下で、配列番号：２または配列番号：７に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズする（Ausubelら、1992）および（ii）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３と機能的に同等な遺伝子産物をコードするいずれものＤＮＡ配列をいう。また、本発明は本明細書中に記載された配列の相補体である核酸分子を含む。
本発明のポリヌクレオチド組成物はＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマー、センスおよびアンチセンス両ストランドを含み、当業者に容易に認識されるように、化学的にまたは生化学的に修飾することができ、あるいは非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有することができる。かかる修飾は、たとえば、標識、メチル化、１以上の天然ヌクレオチドのアナログでの置換、非荷電結合（たとえばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート）、荷電結合（たとえば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、ペンダント部位（たとえば、ポリペプチド）、インターカレーター（たとえば、アクリジン、プソラレン）、キレーター、アルキレーター、および修飾された結合（たとえば、アルファアノマー核酸）のごときヌクレオチド間修飾を含む。水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。かかる分子は当該分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が当該分子の骨格中のリン酸結合の代わりに置き換えられるものを含む。
本発明はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３領域の全てまたは一部を含む組換え核酸を提供する。組換え構築体は、宿主細胞中で自律的に複製できる。あるいは、組換え構築体は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることができる。かかる組換えポリヌクレオチドは、その起源または操作によって１）天然ではそれが会合しないポリヌクレオチドの全部または一部と会合しない；２）天然ではそれが連結するもの以外のポリヌクレオチドに連結する；３）天然には生じない、ゲノムｃＤＮＡ、半合成もしくは合成起源のポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸がＲＮＡを含む場合、示された配列への言及は、Ｔの代わりにＵで置き換えた、ＲＮＡ同等体に言及するものと解釈されるべきである。
従って、天然には生じない配列を含む組換え核酸が本発明によって提供される。野生型配列を使用することもできるが、それは例えば欠失、置換または挿入によってしばしば改変されるであろう。種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを本発明の核酸の天然源としてスクリーニングすることができるが、あるいは例えばＰＣＲによってゲノムＤＮＡまたは他の天然源に存在する配列を増幅することによってかかる核酸を提供することができる。ｃＤＮＡライブラリーの選択は、通常は、所望の蛋白質に対してｍＲＮＡが豊富な組織源に対応する。ファージライブラリーは通常が好ましいが、他のタイプのライブラリーを用いることもできる。ライブラリーのクローンをプレート上に広げ、スクリーニング用の基材上に移し、変性させ、所望の配列の存在につきプローブする。
本発明で使用されるＤＮＡ配列は、通常は、少なくとも約５個のコドン（１５個のヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７−１５個のコドン、最も好ましくは少なくとも約３５個のコドンを含むであろう。１以上のイントロンを存在させることもできる。ヌクレオチドのこの数は、通常、ＫＣＮＱ２−またはＫＣＮＱ３−をコードする配列と特異的にハイブリダイズする成功したプローブに必要な最小長さのあたりである。この意味で約８個のヌクレオチド、より一般的には８−１７個のヌクレオチドと低いオリゴマーは特にチップ技術との関係でプローブで用いることができる。
核酸操作用技術は一般的には、例えば、Sambookら、1989またはAusubelら、1992に記載されている。制限酵素等のようなかかる技術を適用するのに有用な試薬は当該分野で広く知られており、New England BioLabs、Boehringer Mannheim、Amersham、Promega、U.S. Biochemicals、New England Nuclearのような販売者、および多数の他の入手源から商業的に入手可能である。本発明の融合蛋白質を生産するのに使用される組換え核酸配列は、天然または合成配列に由来することができる。多くの天然遺伝子配列は種々のｃＤＮＡから、またはゲノムライブラリーから、適当なプローブを用いて得ることができる。例えば、GenBank、National Institute of Health参照。
本明細書で用いるＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子座または領域または対立遺伝子の「一部」とは、少なくとも約８個のヌクレオチド、または好ましくは約１５個のヌクレオチド、またはより好ましくは少なくとも約２５個のヌクレオチドの最小サイズを有するものと定義され、少なくとも約４０個のヌクレオチドの最小サイズを有することができる。この定義は８−４０個のヌクレオチドならびに４０ヌクレオチドより大の範囲の全てのサイズを含む。かくして、この定義は、８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００個のヌクレオチドの核酸、またはこれらの値の範囲内のいずれかの数のヌクレオチド（例えば９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７０、１２１、等のヌクレオチド）を有する核酸または５００個を超えるヌクレオチドを有する核酸を含む。本発明は配列番号：１または配列番号：６に由来する少なくとも８個のヌクレオチドを有する全ての新規な核酸、その相補的または機能的同等の核酸配列を含む。本発明は先行技術に存在する核酸を含まない。即ち、本発明は配列番号：１または配列番号：６に由来する少なくとも8個のヌクレオチドを有する全ての核酸を含み、ただし、それは先行技術に存在する核酸を含まないものとする。
「ＫＣＮＱ２蛋白質」または「ＫＣＮＱ２ポリペプチド」とは、ＫＣＮＱ２遺伝子座によってコードされる蛋白質またはポリペブチド、その変異体または断片を言う。「ポリペプチド」なる用語はアミノ酸のポリマーまたはその同等体を言い、産物の特異的長さを言わない；かくして、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はポリペプチドの修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を言わず、またはそれを排除する。例えば、（非天然アミノ酸等を含む）アミノ酸の１以上のアナログを含有するポリペプチド、置換された結合ならびに当該分野で知られた他の修飾を持つポリペプチド（天然および非天然）が該定義に含まれる。通常は、かかるポリペプチドは天然ＫＣＮＱ２配列に対して少なくとも約５０％相同であり、好ましくは約９０％を超え、より好ましくは少なくとも約９５％相同である。高いまたは低いストリンジェンシー条件下でＫＣＮＱ２−をコードする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる蛋白質および、ＫＣＮＱ２蛋白質に対する抗血清によって補償される密接に関連するポリペプチドまたは蛋白質が含まれる。
「ＫＣＮＱ３蛋白質」または「ＫＣＮＱ３ポリペプチド」とは、ＫＣＮＱ３遺伝子座によってコードされる蛋白質またはポリペブチド、その変異体または断片を言う。「ポリペプチド」なる用語はアミノ酸のポリマーまたはその同等体を言い、産物の特異的長さを言わない；かくして、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はポリペプチドの修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を言わず、またはそれを排除する。例えば、（非天然アミノ酸等を含む）アミノ酸の１以上のアナログを含有するポリペプチド、置換された結合ならびに当該分野で知られた他の修飾を持つポリペプチド（天然および非天然）が該定義に含まれる。通常は、かかるポリペプチドは天然ＫＣＮＱ３配列に対して少なくとも約５０％相同であり、好ましくは約９０％を超え、より好ましくは少なくとも約９５％相同である。高いまたは低いストリンジェンシー条件下でＫＣＮＱ３−をコードする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる蛋白質および、ＫＣＮＱ３蛋白質に対する抗血清によって補償される密接に関連するポリペプチドまたは蛋白質が含まれる。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドは配列番号：２または配列番号：７に示されるものであってよく、これは単離されたおよび／または精製された形態であってよく、それが天然では会合している物質を含まず、または実質的に含まない。原核生物細胞での発現によって生産されるかまたは合成により製造されれば、該ポリペプチドはグリコシル化のごときナイーブな翻訳後プロセッシングを欠く。あるいは、本発明はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの配列変異体、対立遺伝子または誘導体であるポリペプチドに指向される。かかるポリペプチドは、１以上のアミノ酸の１以上の付加、置換、欠失または挿入によって、配列番号：２または配列番号：７に記載されたものとは異なるアミノ酸配列を有することができる。好ましいかかるポリペプチドは、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３機能を有する。
置換変異体は、典型的には、当該蛋白質内の１以上の部位においてもう１つのものに代えての１のアミノ酸の交換を含有し、他の機能または特性の喪失なくして蛋白質分解切断に対する安定性のごときポリペプチドの１以上の特性を変調するように設計することができる。アミノ酸置換は、極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／または関連する残基の両親媒性における同様性に基づいてなすことができる。好ましい置換は保存的であるもの、即ち１のアミノ酸が同様の形状および電荷のもので置き換えられたものである。保存的置換は当該分野でよく知られており、典型的には以下の基：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニン内の置換を含む。
ある種のアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位またはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドと相互作用する蛋白質上の結合部位のごとき構造との相互作用結合能力を認識できるように失うことなく、蛋白質構造において他のアミノ酸の代わりに置き換えることができる。蛋白質の生物学的機能活性を規定するのはその蛋白質の相互作用能力および性質であるので、蛋白質配列およびその基礎となるＤＮＡコーディング配列においてあるアミノ酸置換をなすことができ、そうでなければ同様の特性を持つ蛋白質を得ることができる。かかる変化を作成するにおいて、アミノ酸の水治法指標をコードすることができる。蛋白質に相互作用的生物学的機能を付与するにおける疎水性アミノ酸指標の重要性は一般的には当該分野で理解されている（KyteおよびDoolittle、1982）。あるいは、同様のアミノ酸の置換は親水性をベースとして効果的になすことができる。蛋白質に相互作用的生物学的機能を付与するにおける親水性の重要性は一般的には当該分野で理解されている（米国特許４５５４１０１号）。ポリペプチドを設計するにおける疎水性指標または親水性度の使用はさらに米国特許第５６９１１９８号で記載されている。
相同性につき比較したポリペプチド配列の長さは一般的には少なくとも約１６アミノ酸、通常は少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも２８残基、好ましくは約３５を超える残基である。
「作動可能に連結した」とは、そのように記載されている構成要素がその意図したように機能する相互関係にある近接位置を言う。例えば、プロモーターが、その転写または発現に影響するならば、該プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結している。
ペプチドミメティックまたはミメティックという用語はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの本質的生物学的活性を有する物質を言うことを意図する。ペプチドミメティックは蛋白質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子でありうる（Johnsonら、1993）。ペプチドミメティックの使用の背後に有る合理性は、蛋白質のペプチド骨格が、抗体および抗原、酵素および基質またはスカフォールド蛋白質のごとき分子相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向させるように主として存在することである。ペプチドミメティックは、天然分子に似た分子相互作用を可能とするように設計される。ミメティックは全くペプチドでなくてもよいが、それは天然ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの本質的生物学的活性を保有するであろう。
「プローブ」。ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの病気素因となるＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子に関連するポリヌクレオチド多形は、高ストリンジェントないし中程度ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的配列のそれとで安定なハイブリッドを形成する、ポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって検出される。もし該プローブが標的配列に対して完全に相補性にあると予測されるならば、高ストリンジェンシー条件が使用されるであろう。もし、あるミスマッチングが予測されるならば、例えば、もし変異体が、プローブが完全には相補性でない結果をもっと予測されるならば、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは低下させることができる。非特異的／有害な結合を排除する、すなわち、ノイズを最少化させる条件が選択される。（本開示を通じて「ストリンジェント条件」を用いると単純に述べれば、それは「高ストリンジェンシー条件」が使用されると読むべきことを意図することに注意されたし）。かかる表示では中性ＤＮＡ多形ならびに突然変異を同定するので、これらの表示は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３罹患性対立遺伝子の検出を示すにはさらに分析を必要とする。
ＫＣＮＱ２対立遺伝子用のプローブは、ＫＣＮＱ２領域の配列に、そのｃＤＮＡ、その機能的同等の配列または相補体に由来するものであってよい。ＫＣＮＱ３対立遺伝子用のプローブは、ＫＣＮＱ３領域の配列に、そのｃＤＮＡ、その機能的同等の配列または相補体に由来するものであってよい。該プローブは、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３領域のすべてまたは一部にわたって、および、該領域に対する特異的ハイブリダイゼーションを可能とするいずれの適当な長さのものであってもよい。もし標的配列がプローブのそれと同一の配列を含有するならば、該プローブは短くてよく、例えば、約８−３０塩基対の範囲であってよい。というのは、該ハイブリダイッドは、高度にストリンジェントな条件下であっても、比較的安定だからである。プローブに関してある程度のミスマッチが予測されるならば、即ち、プローブが変異体領域にハイブリダイズすると疑われるならば、必要な特異性を持って、標的配列にハイブリダイズするより長いプローブを使用することができる。
プローブは、標識またはレポータ分子に付着された単離ポリヌクレオチドを含み、これを用いて、標準的方法により配列同様性を有する他のポリヌクレオチド配列を単離することができる。プローブを調製し、標識する技術については、例えば（Sambrookら、1989またはAusubelら、1992）参照。相同なポリヌクレオチドを用いることによって他の同様なポリヌクレオチドを選択することができる。別法として、これらのまたは同様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し、あるいは遺伝暗号における縮重の使用によって選択することができる。例えば、サイレント変化によって（それにより種々の制限部位を生じる）、種々のコドン置換を導入して特定の系についての発現を最適化することができる。突然変異を導入してポリペプチドの特性を修飾し、おそらくはポリペプチドの分解または代謝回転速度を変化させることができる。
本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含むプローブは、天然に生じるまたは組換え一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチドに由来するものであってよく、あるいは化学的に合成することができる。プローブは、ニックトランスレーション、クレノウフィル−イン反応または当該分野で公知の他の方法によって標識することもできる。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３をコードするポリヌクレオチド配列からの少なくとも約８個のヌクレオチド、通常は少なくとも約１５個のヌクレオチド、約９ｋｂ未満、通常は約１．０ｋｂ未満を有するポリヌクレオチド配列の一部がプローブとして好ましい。従って、この定義は、８ヌクレオチドないし９０００ヌクレオチドのサイズのプローブを含む。かくして、この定義は８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドのプローブあるいはこれらの範囲の値内のいずれかの数のヌクレオチドを有するプローブ（例えば、９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１等のヌクレオチド）、あるいは５００未満のヌクレオチドを有するプローブを含む。また、該プローブを用いて、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３をコードするｍＲＮＡが細胞または組織に存在するかを測定することができる。本発明は、配列番号：１または配列番号：６に由来する少なくとも８個のヌクレオチドを有する全ての新規のプローブ、その相補体または機能的同等核酸配列を含む。本発明は、先行技術に存在するプローブを含まない。即ち、本発明は配列番号：１または配列番号：６に由来する少なくとも８個のヌクレオチドを有する全てのプローブを含む。ただし、それらは先行技術に存在するプローブを含まないものとする。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子のすべてまたは一部を増幅するのに用いることができるプライマーに対して同様の考慮およびヌクレオチド長が適用することができる。かくして、プライマーについての定義は、８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドのプライマーまたはこれらの範囲の値内のいずれかの数のヌクレオチドを有するプライマー（例えば、９、１０、１１、１６、２３、３０、３８、５０、７２、１２１等のヌクレオチド）、または５００未満のヌクレオチドもしくは５００および９０００の間のいずれかの数のヌクレオチドを有するプライマーを含む。該プライマーを用いて細胞または組織にＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３をコードするｍＲＮＡが存在するか否かを決定することができる。本発明はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子を増幅するためのＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子座に由来する少なくとも８個のヌクレオチドを有する全ての新規なプライマー、その相補体または機能的同等核酸配列を含む。本発明は、先行技術に存在するプライマーを含まない。すなわち、本発明は少なくとも８個のヌクレオチドを有する全ての新規なプライマーを含む。ただし、それは、先行技術に存在するプライマーを含まないものとする。
「蛋白質の修飾または断片」は、一次構造配列に対して実質的に相同であるが、イン・ビボまたはイン・ビトロの化学的および生化学的修飾を含むか、あるいは通常のアミノ酸を取りこむ、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたはその断片につき本発明によって提供される。かかる修飾は当業者に容易に認識されるように、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種での標識、および種々の酵素修飾を含む。ポリペプチドを標識する、種々の方法およびそのような目的に有用な種々の置換基または標識は当該分野でよく知られており、32Ｐのごとき放射性同位体、標識された抗リガンド（例えば抗体）に結合するリガンド、発蛍光体、ケミルミネセンス剤、酵素、および標識されたリガンドに対する特異的結合ペアーメンバーとして働くことができる抗リガンドを含む。標識の選択は必要な感度、プライマーとのコンジュゲーションの容易性、安定性の要件および利用可能な装置に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野でよく知られている。Sambrookら、1989またはAusubelら、1992参照。
実質的に全長のポリペプチド以外に、本発明はポリペプチドの生物学的に活性な断片を提供する。重要な生物学的活性はリガンドー結合、免疫学的活性およびＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの他の生物学的活性特徴を含む。免疫学的活性は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質のエピトープに対するコンペティターまたは代替抗原いずれかとして働く、標的免疫系における免疫原性機能、ならびに結合用の免疫学的エピトープの保有を含む。本明細書中で用いるごとく「エピトープ」とはポリペプチドの抗原決定基を言う。エピトープは当該エピトープに対してユニークな空間的立体配座の３個のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは少なくとも５個のそのようなアミノ酸よりなり、より通常には少なくとも８−１０個のそのようなアミノ酸よりなる。そのようなアミノ酸の空間的立体配座を決定する方法は当該分野で知られている。
免疫学的目的では、タンデム反復ポリペプチドセグメントを免疫原として用いることができ、それにより高度に抗原性の蛋白質を生じる。あるいは、かかるポリペプチドは特異的結合用のかなり効果的なコンペティターとして働く。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体の生産は後記する。
本発明は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドおよび断片を含む、融合ポリペプチドを提供する。相同ポリペプチドは、２以上のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチド配列の間のあるいはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３および関連蛋白質の配列の間の融合であってよい。同様に、誘導体蛋白質の特性または活性の組み合わせを呈するであろう異種融合を構築することができる。例えば、リガンド−結合性また他のドメインは異なる新しい融合ポリペプチドまたは断片の間で「交換する」することができる。かかる相同または異種融合ポリペプチドは、例えば、改変された強度または結合の特異性を呈することができる。融合ペートナーは免疫グロブリン、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロデナーゼ、および酵母アルファ接合因子を含む。例えば、Godowskiら、1988参照。
融合蛋白質は、典型的には、後記するごとくいずれかの組換え核酸方法によって作成されるか、あるいは化学的に合成することができる。ポリペプチドの合成の技術は、例えば、Merrifield、1963に記載されている。
「蛋白質精製」とはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３をコードする組換え核酸で形質転換した細胞からのもののごとく、他の生物学的材料からのＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの単離のための種々の方法を言い、当該分野でよく知られている。たとえば、かかるポリペプチドは例えば本発明によって提供される抗体を使用して、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。蛋白質精製の種々の方法は当該分野でよく知られており、Deutscher、1990およびScopes、1982に記載されているものを含む。
「単離された」、「実質的に純粋な」および「実質的に均一な」なる用語は、その天然状態でそれに伴う成分から分離されている蛋白質またはポリペプチドを記載するために相互交換して用いることができる。試料の少なくとも約６０ないし７５％が単一のポリペプチド配列を呈する場合にモノマー蛋白質は実質的に純粋である。実質的に純粋な蛋白質は、典型的には、約６０ないし９０％Ｗ／Ｗの蛋白質試料、より通常には約９５％を含み、好ましくは、約９９％純度を超えるであろう。蛋白質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当該分野でよく知られた多数の手段、引き続いてのゲルを染色して単一ポリペプチドバンドを可視化することによって蛋白質の純度または均一性を示すことができる。ある目的では、より高い分解度は、精製で利用されるＨＰＬＣまたは当該分野でよく知られた他の手段によって供することができる。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質は、それが天然状態でそれに伴う汚染物から分離された場合に、天然に会合した成分を実質的に含まない。かくして、化学的に合成されたまたは、それが天然で由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然に会合した成分を実質的に含まないであろう。また蛋白質は、当該分野でよく知られた蛋白質精製技術を用い、単離によって天然に会合した成分を実質的に含まないようにすることもできる。
単離されたおよび操作された遺伝子配列の発現産物として生産されたポリペプチドは、もし相同細胞タイプで発現されたとしても、本明細書中で用いるごとく「単離されたポリペプチド」である。合成により作成された形態または異種細胞によって発現された分子は元来単離された分子である。
「組換え核酸」は天然に生じる、または配列の２つの分離されたセグメントの人工的組み合わせによって作成された核酸である。この人工的組み合わせは、しばしば、化学的合成手段によって、あるいは核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、たとえば遺伝子工学技術によって達成される。それは、典型的には配列認識部位を導入または除去しつつ、通常は同一または保存されたアミノ酸をコードする冗長なコドンで置き換えてなされる。あるいは、それは所望の機能の核酸セグメントを連結して機能の所望の組み合わせを生じさせて行われる。
「調節配列」とは遺伝子座の１００ｋｂのコーディング領域内に通常ある配列を言うが、それらはコーディング領域からより離れていてもよく、これは（遺伝子の転写、およびメッセンジャーＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性等を含めた）遺伝子の発現に影響する。
「実質的相同性または同様性」。核酸またはその断片は、もし他の核酸（またはその相補的ストランド）と（適当なヌクレオチド挿入または欠失をもって）最適に整列させた場合に、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５−９８％のヌクレオチド塩基におけるヌクレオチド配列同一性があれば、もう１つのものに対して「実質的に相同」（「または実質的に同様」）である。
２つの異なる核酸の間の相同性を測定するには、ＢＬＡＳＴＮプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」を用いてパーセント相同性が測定されるべきである。このプログラムはインターネット（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html）でのNational Center for Biotechnology Information （ＮＣＢＩ）から公衆が利用可能である。（Altschulら、1997）。使用されるべきパラメーターは、括弧中で示された欠陥パラメーターで（後記されるごとく計算された）最高の計算されたパーセント相同性を生じる以下の全ての組み合わせである：
Program−blastn
Matrix−0 BLOSUM62
マッチ−０または１（１）を概観
ミスマッチ−０、−１、−２または−３（−２）のペナルティー
オープンギャップペナルティー−０、１、２、３、４または５(５)
伸長ギャップペナルティー−０または１（１）
Ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ−０または５０（５０）
予想−１０
種々の他の結果と共に、このプログラムは完全なストランドを横切ってのまたはマッチさせるべき二つの核酸の領域を横切ってのパーセント同一性示す。該プログラムは結果の一部として比較すべき２つのストランドの整列および同一性を示す。もしストランドが、等しい長さであれば、同一性は核酸の完全な長さを横切って計算されるであろう。もしストランドが同等の長さでないならば、より短い核酸の長さが使用されるべきである。もし核酸がその配列の一部を横切ってかなり類似するがその配列の残りを横切って異なれば、ＢＬＡＳＴＮプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」は同様の部分のみを横切る性質を示し、これらの部分は個々に報告される。ここに相同性を決定する目的では、パーセント相同性とは比較すべき２つの配列のより短いものをいう。もしいずれかの１つの領域が異なるパーセント同一性を持つ異なる整列で示されれば、最大相同性を生じる整列を用いるべきである。配列番号：２０および２１のこの例におけるごとく平均を行うべきである。
Figure 0005328603
プログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」は選択されるパラメータに応じてこれらの２つの核酸の異なる整列を示す。例として、４組のパラメータを配列番号：２０および２１の比較につき選択し、（全てのケースでｇａｐ ｘ ｄｒｏｐｏｆｆは５０であった）、結果は表１に示す。表１で示されたごとく選択されたパラメータのいずれの組も、これらの配列を比較するための最良のパラメータの組では必ずしもないことに注意すべきである。パーセント相同性は、同一性を示す各領域につき、領域内のより短いストランドの塩基の分率にその領域についてのパーセント同一性を乗じ、これらのすべてを加えることによって計算される。例えば、表１に示されたパラメータの第１の組を用い、配列番号：２０は短い配列（６３塩基）であり、同一性の２つの領域が示され、最初のものは配列番号：２１に対して９２％同一性の配列番号：２０の塩基４−２９（２６塩基）を含み、第２のものは配列番号：２１に対して１００％同一性の配列番号：２０の塩基３９−５９（２１塩基）を含む。塩基１−３、３０−３８および６０−６３（１６塩基）は配列番号：２１に対しいずれかの同一性を有するものとしては示されない。パーセント同一性は以下のごとく計算される：（２６／６３）（９２）＋（２１／６３）（１００）＋（１６／６３）（０）＝７１．３％相同性。示された４組のパラメータのおのおのを用いて計算された相同性のパーセンテージは表１にリストされる。パラメータのいくつかの他の組み合わせが可能であるが、それらは簡潔さのためにリストされない。パラメータの各組は異なる計算されたパーセント相同性をもたらすことがわかる。最高のパーセント相同性を生じる結果を用いるべきであるので、これらの４組のパラメータにのみに基づいて、配列番号：２０および２１は８７．１％相同性を有するということができるであろう。再度、他のパラメータの使用は配列番号：２０および２１についてより最い相同性さえ示すが、簡潔さのために全ての可能な結果が示されるのではないことに注意すべきである。
あるいは、選択されたハイブリダイゼーション条件下で、核酸またはその断片がもう１つの核酸（またはその相補的ストランド）、ストランド、またはその相補体にハイブリダイズする場合に、実質的相同性または（同様性）が存在する。特異性の全くの欠如よりも実質的により選択的であるハイブリダイゼーションが起こる場合に、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％相同性、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性がある場合に起こる。Kanehisa、1984参照。記載された相同性比較の長さは、より長いストレッチにわたってもよく、ある具体例では、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドのストレッチにわたるであろう。
Figure 0005328603
核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に認識されるごとく、塩基組成、相補的ストランドの長さ、およびハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度または有機溶媒のごとき条件によって影響されるであろう。ストリンジェントな温度条件は、一般的には、３０℃を超える温度、典型的には３７℃を超える、好ましくは４５℃を超える温度を含む。ストリンジェントな条件は、通常は、１０００ｍＭ未満、典型的には５０ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満であろう。しかしながら、パラメータの組み合わせは、いずれの単一のパラメータの尺度よりもかなり重要である。ストリンジェンシー条件は核酸の長さに依存し、核酸の塩基組成は当該分野でよく知られた技術によって測定することができる。例えば、WetmurおよびDavidson、1968参照。
プローブ配列はある条件下でデュプレックスＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、トリプレックスまたは他の高次のＤＮＡ複合体を形成することもできる。かかるプローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条件は当該分野でよく知られている。
「実質的相同性」または「実質的同一性」なる用語は、ポリペプチドに言及する場合、問題とするポリペプチドまたは蛋白質が天然に生じる蛋白質またはその一部と少なくとも約３０％同一性、通常は少なくとも７０％同一性、より通常には少なくとも約８０％同一性、好ましくは少なくとも約９０％同一性、より好ましくは少なくとも約９５％同一性を呈することを示す。
ポリペプチドについては相同性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705参照。蛋白質解析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾に帰属される相同性の尺度を用いて同様の配列にマッチされる。保存的置換は、典型的には以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。
「実質的に同様な機能」とは、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３核酸あるいは野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドを参照した、修飾された核酸または修飾された蛋白質の機能を言う。修飾されたポリペプチドは野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドに実質的に相同であって、実質的に同一の機能を有するであろう。修飾されたポリペプチドは改変されたアミノ酸配列を有することができ、および／または修飾されたアミノ酸を含有することができる。機能の同様性に加えて、修飾されたポリペプチドはより長い半減期のごとき他の有用な特性を有することができる。修飾されたポリペプチドの機能（活性）の同様性は、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの活性と実質的に同様であり得る。あるいは、修飾されたポリペプチドの機能（活性）の同様性は野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの活性よりも高くてもよい。修飾されたポリペプチドは通常の技術を用いて合成されるか、あるいは修飾された核酸によってコードされ、通常の技術を用いて生産される。修飾された核酸は通常の技術によって調製される。野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子機能に対して、実質的に同様の機能を持つ核酸は前記した修飾された蛋白質を生じる。
ポリペプチド「断片」、「部分」または「セグメント」は、少なくとも約５ないし７個の連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約７ないし９個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約９ないし１３個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０ないし３０以上の連続したアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチである。
本発明のポリペプチドは、もし可溶性であれば、固相支持体、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材料（例えば、セファロースビーズ）、磁性ビーズ、ガラスウール、プラスチック、金属、ポリマーゲル、細胞または他の基材にカップリングさせることができる。かかる支持体は例えば、ビーズ、ウエル、ディップスティック、または膜の形態を取ることができる。
「標的領域」は増幅されおよび／または検出される核酸の領域をいう。「標的配列」なる用語は所望の条件下でプローブまたはプライマーがそれとで安定なハイブリッドを形成する配列を言う。
本発明の実施は、特記しない限り、化学の通常の技術、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学を使用する。例えば、Maniatisら、1982；Sambrookら、1989；Ausubelら、1992、Glover、1985；Anand、1992；GuthrieおよびFink、1991参照。ヒト染色体１のマッピングを含めた、ヒト遺伝子マッピングのための技術および材料についての一般的記載は、例えば、WhiteおよびLalouel、1988に提供される。
組換えまたは化学的に合成された核酸：ベクター、形質転換、宿主細胞の調製
本発明の大量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中での複製によって生産することができる。所望の断片につきコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片は、組換えポリヌクレオチド構築体、通常は、原核細胞または真核細胞に導入し、そこで複製できるＤＮＡ構築体に組み込まれる。通常、ポリヌクレオチド構築体は、酵母または細菌のごとき単細胞宿主中での複製に適しているが、培養された哺乳動物もしくは植物または他の真核生物細胞系への（ゲノム内に組み込まれまたは組み込まれることのない）導入を意図することができる。本発明の方法によって生産された核酸の精製は、例えば、Sambrookら、1989またはAusubelら、1992に記載されている。
本発明のポリヌクレオチドは化学的合成、例えば、BeaucageおよびCarruthers（1981）によって記載されたホスホルアミダイト方法またはMatteucciおよびCaruthers（1981）に準じたトリエステル方法によっても生産することができ、市販の自動オリゴヌクレオチド合成器で行うことができる。二本鎖断片は、相補ストランドを合成し、該ストランドを適当な条件下で一緒にアニールすることによって、あるいは適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補ストランドを付加することによって、化学的合成の一本鎖産物から得ることができる。
原核生物または真核生物宿主への導入のために調製されたポリヌクレオチド構築体は、所望のポリペプチドをコードする意図されたポリヌクレオチド断片を含む宿主によって認識される複製系を含むことができ、好ましくは、ポリペプチドコーディングセグメントに作動可能に連結した転写および翻訳開始調節配列を含むであろう。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律的に複製する配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサーおよびリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列および、ｍＲＮＡ安定化配列のごとき必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。かかるベクターは、当該分野でよく知られ、例えば、Sambrookら、1989またはAusubelら、1992に記載されている標準的な組換え技術によって調製することができる。
適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は宿主中で機能的であるように選択され、適当には、天然ではＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子に関連するものを含むことができる。細胞系および発現ベクターの作動可能な組み合わせの例は、Sambrookら、1989またはAusubelら、1992に記載されている；また例えばMetzgerら、1988参照。多くの有用なベクターが当該分野で知られており、Stratagene、New England Biolabs、Promega、Biotechその他のような販売業者から得ることができる。ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プロモーターのごときプロモーターを原核細胞宿主で使用することができる。有用な酵母プロモーターはメタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはエノラーゼもしくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのごとき他の解糖酵素、マルトースおよびガラクトース資化の原因となる酵素についてのプロモーター領域を含む。酵母発現で使用するのに適したベクターおよびプロモーターはさらにHitzemanら、ＥＰ７３６７５Ａに記載されている。適当な非天然哺乳動物プロモーターはＳＶ４０からの初期および後記プロモーター（Fiersら、1978）またはネズミモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスまたはポリオーマーに由来する初期および後記プロモーターを含むであろう。昆虫プロモーターは、バキュロウイルスに由来するものであってよい。加えて、構築体は、遺伝子の複数コピーが作成できるように、増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に接合することができる。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列については、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、New York(1983)参照。また、例えば、米国特許第５６９１１９８号；第５７３５５００号；第５７４７４６９号および第５４３６９１４６号参照。
かかる発現ベクターは、自律的に複製できるが、それらは当該分野でよく知られた方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入されることによっても複製することができる。
発現およびクローニングベクターは選択マーカー、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子を含有するであろう。この遺伝子の存在は該インサートを発現する宿主細胞のみの増殖を保証する。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート等に対する耐性を付与する、ｂ）栄養要求性欠乏を補足する、またはｃ）複雑な倍地から得ることができない非常に重要な栄養素を供給する蛋白質をコードする。例えば、Ｂａｃｉｌｌｉ用のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子。適当な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主用の適当なマーカーは当該分野でよく知られている。
注目する核酸を含有するベクターはイン・ビトロで転写でき、よく知られた方法、例えば、注入によって、得られたＲＮＡを宿主細胞に導入することができ、（Kuboら、1988参照）あるいは当該分野でよく知られた方法によってベクターを宿主細胞に直接導入することができ、これはエレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＢＥＡＥ−デキストリンまたは他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝撃；リポフェクション；注入（ここに、ベクターはレトロウイルスゲノムのごとき感染性剤である）；および他の方法を含めた、細胞宿主のタイプに依存して変化する。例えば、一般的にはSambrookら、1989およびAusubelら、1992参照。とりわけ、前記したものを含めた当該分野で公知のいずれかの方法による宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は本明細書中では「形質転換」と言う。前記したごとく、核酸が導入された細胞は、かかる細胞の子孫を含めることを意味する。
大量の本発明の核酸およびポリヌクレオチドは、適合する原核生物または真核生物宿主細胞中において、ベクターまたは他の発現ビークル中にてＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３核酸またはその一部を発現させることによって調製することができる。最も通常に使用される原核生物宿主はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの株であるがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのごとき他の原核生物も用いることもできる。
酵母、繊維状の菌類、植物、昆虫、または両生類もしくは鳥類種のもののような哺乳動物または他の真核生物宿主細胞もまた本発明の蛋白質の生産で有用であろう。培養中の哺乳動物細胞の増殖は自体公知である。JakobyおよびPastan（編）（1979）参照。通常に使用される哺乳動物宿主細胞系の例はＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＷＩ３８．ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞系であるが、より高い発現、所望のグリコシル化パターンまたは他の特徴を供するには、他の細胞系が適するのは当業者に認識されるであろう。通常に使用される昆虫細胞系の例はＳＦ９である。
クローンはベクター構築の様式に応じてマーカーを用いることによって選択される。該マーカーは同一または異なるＤＮＡ分子、このましくは同一ＤＮＡ分子上にあってよい。原核生物宿主においては、形質転換体は、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する耐性によって選択することができる。温度感受性に基づく特定の産物の生産も適当なマーカーとして供することができる。
本発明はポリヌクレオチドで形質転換した原核生物または真核生物細胞は、本発明の核酸およびポリヌクレオチドの生産のみならず、例えば、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの特徴の研究で有用である。
本明細書中で開示されたＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて、他の種における相同ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子配列および蛋白質を同定する。これらの遺伝子配列および蛋白質は、それらが単離された種について、診断／予後後、治療および薬物スクリーニング方法で用いられる。
使用方法：薬物スクリーニング
本発明は種々の薬物スクリーニング技術のうちのいずれかにおいてＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたはその結合断片を用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。
かかるテストで使用されるＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片は、溶液中で遊離している、固体支持体に付着されている、または細胞表面に保持されているのいずれかであってよい。薬物スクリーニングの１つの方法は、好ましくは競合結合アッセイにおいてポリペプチドまたは断片を発現する組換えポリヌクレオチドで安定に形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。生存形態または固定された形態いずれかであるかかる細胞は標準的な結合アッセイで使用することができる。例えば、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片およびテストすべき剤の間の複合体の形成につき測定し、あるいはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片および公知のリガンドの間の複合体の形成がテストすべき剤によって干渉される程度を調べることができる。
かくして、本発明は、かかる剤をＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたはその断片と接触させ、（ｉ）該剤とＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片との間の複合体の存在につき、または（ii）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片とリガンドとの間の複合体の存在につき、当該分野でよく知られた方法によってアッセイすることを特徴とする薬物につきスクリーニングする方法を提供する。かかる競合結合アッセイにおいては、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片は典型的には標識される。遊離ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたは断片は、蛋白質：蛋白質複合体に存在するものから分離され、遊離（即ち、非複合体化）標識の量はテストされるべき剤のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３への結合あるいはＫＣＮＱ２（またはＫＣＮＱ３）：リガンド結合とのその干渉の尺度である。遊離したものよりもむしろ結合したＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の量を測定することもできる。また、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３よりもむしろリガンドを標識して、テストすべき薬物の存在下および不存在下でＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に結合するリガンドの量を測定することができる。
薬物スクリーニングのためのもう１つの技術は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドに対する適当な結合親和性を有する化合物に対する高スループットスクリーニングを提供し、これはGeysen（公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４）に詳細に記載されている。簡単に述べれば、非常に多数の異なる小ぺプチドテスト化合物がプラスチックピンまたはある他の表面のごとき固体基材上で合成される。ペプチドテスト化合物をＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３と反応させ、洗浄する。次いで、結合したＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドを当該分野でよく知られた方法によって検出する。
精製されたＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３を前記した薬物スクリーニング技術で使用されるプレート上に直接コートすることができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非中和抗体を用いて抗体を捕獲して固相上にＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドを固定化することができる。
また、本発明では、競合薬物スクリーニングアッセイの使用が考えられる。そこでは、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドに特異的に結合することができる中和抗体はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドまたはその断片への結合につきテスト化合物と競合する。このようにして、抗体を用いて、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの１以上の抗原決定基を保有するいずれのペプチドの存在も検出することができる。
本発明は形質転換細胞、トランスフェクトされた卵母細胞またはトランスジェニック動物においてＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質を用いることによって化合物をスクリーニングするのに特に有用である。薬物を培養中の細胞に添加し、あるいは、突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３を含有するトランスジェニック動物に投与し、カリウムチャンネルの電流に対する効果を野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３を含有する細胞または動物の電流と比較する。電流をより正常なレベルまで変化させる薬物候補はＢＦＮＣ、ローランド癲癇およびＪＭＥを予防または治療するのに有用である。
前記スクリーニング方法は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３のみ使用するアッセイに限定されるものではないが、ＫＣＮＱ２−またはＫＣＮＱ３−蛋白質複合体を研究するのにも適用することができる。この複合体の活性に対する薬物の効果を分析する。
これらの方法によると、以下のアッセイは薬物候補につきスクリーニングするのに使用できるアッセイの例である。
突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３（それ自体または融合蛋白質の一部）を、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３が結合する野生型蛋白質（それ自体または融合蛋白質の一部）と混合する。この混合は、薬物の存在下および薬物の不存在下双方において行われ、突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３と野生型蛋白質との結合の量を測定する。もし、決合の量が該薬物の不存在下におけるよりも該薬物の存在下における方が多ければ、該薬物は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３における突然変異に由来するＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを治療するための薬物候補である。
野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３（それ自体または融合蛋白質）を、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３が結合する野生型蛋白質（それ自体または融合蛋白質の一部）と混合する。この混合は、薬物の存在下および薬物の不存在下双方で行い、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３と野生型蛋白質との結合の量を測定する。もし、結合の量が該薬物の不存在下におけるよりも該薬物の存在下におけるほうが多いならば、該薬物は、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に由来するＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを治療するための薬物候補である。
野生型蛋白質として、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３（それ自体または融合蛋白質の一部）に結合する突然変異体蛋白質を野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３（それ自体または融合蛋白質）と混合する。この混合は薬物の存在下または不存在下で行い、突然変異体蛋白質と野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３との結合の量を測定する。もし結合の量が該薬物の不存在下におけるよりも該薬物の存在下におけるほうが多いならば、該薬物は該蛋白質をコードする遺伝子中の突然変異に由来するＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを治療するための薬物候補である。
また、本発明のポリペプチドは、組み合わせライブラリー技術の結果として、開発された化合物をスクリーニングするのに使用することもできる。組み合わせライブラリー技術は、ポリペプチドの活性を変調する能力につき、潜在的な莫大な数の異なる物質をテストする効果的な方法を提供する。かかるライブラリーおよびその使用は当該分野で公知である。ペプチドライブラリーの使用が好ましい。例えば、ＷＯ９７／０２０４８参照。
略言すれば、ポリペプチドの活性を変調する物質につきスクリーニングする方法は、適当な反応媒体中で１以上のテスト物質をポリペプチドと接触させ、処理されたポリペプチドの活性をテストし、その活性を、テスト物質または複数の物質で処理されていない匹敵する反応媒体中でのポリペプチドの活性と比較することを含むことができる。処理および未処理ポリペプチドの間の活性の相違は関連するテスト物質または複数の物質の変調効果を示す。
活性の変調につきスクリーニングするのに先立って、あるいはスクリーニングするに際し、テスト物質を例えば、酵母２−ハイブリッド系においてポリペプチドと相互作用する能力につきスクリーニングすることができる。（例えばBartelら、1993；FieldsおよびSong、1989；ChevrayおよびNathans、1992；Leeら、1995）。この系は、ポリペプチドの活性を変調する現実の能力につき、物質をテストするに先立って、粗いスクリーニングとして用いることができる。別法として、該スクリーニングを用いて、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３特異的結合パートナーへの結合につきテスト物質をスクリーニングし、あるいはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドのミメティックスを見つけ出すことができる。
ポリペプチド活性を変調しまたはそれに影響する物質の同定に続き、該物質をさらに調べることができる。さらに、それを製造しおよび／または調製、すなわち、製造もしくは処方、あるいは医薬品、医薬組成物または薬物のごとき組成物で用いることができる。これらは個体に投与することができる。
かくして、本発明は、種々の態様において、本明細書中に記載されたことに従い、ポリペプチド活性のモジュレータとしての核酸分子を用いて同定された物質のみならず、医薬組成物、医薬品、かかる物質を含む薬物または他の組成物、かかる物質を含むかかる組成物の投与方法、例えばＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの（予後的処置を含むことができる）治療のためのかかる組成物を患者に投与する方法、例えば、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの治療のための、投与用組成物の製造におけるかかる物質の使用、およびかかる物質を医薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体、および所望により他の成分を含む医薬組成物の製法まで拡大する。
ポリペプチド機能のモジュレータとして同定された物質は、天然ではペプチドまたは非ペプチドでありうる。非ぺプチド「小分子」は、しばしば多くのイン・ビボ医薬使用で好ましい。従って、物質のミメティックまたはミミック（特にもしペプチドであれば）を医薬用途で設計することができる。
公知の医薬上活性な化合物に対するミメティックスの設計は、「リード」化合物に基づく医薬品の開発に対する公知のアプローチである。これは、活性化合物が合成するのに困難であるかまたは費用がかかる場合、あるいは投与の特定の方法に適しない場合、例えば、純粋なペプチドは胃腸管中でプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるので、それらが経口組成物用には不適当な活性剤である場合望ましいであろう。ミメティック設計、合成およびテストは、一般的には、標的特性につき使用に多数の分子をランダムにスクリーニングするのを回避するのに使用される。
与えられた標的特性を有する化合物からのミメティックの設計において、通常採用されるいくつかの工程がある。まず、標的特性を測定するにおいて非常に重要なおよび／または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これは例えば各残基を置換することによってペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによってなすことができる。ペプチドのアラニンスキャニンを通常は用いてかかるペプチドモチーフを精錬する。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られている。
一旦ファルマコフォアが見出されると、ある範囲の源からのデータ、たとえば、分光学技術、Ｘ−線回析データおよびＮＭＲを用い、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷に従ってその構造を作成する。コンピュータ解析、同様性マッピング（これは原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷および／または容量を作成する）および他の技術はこの作成プロセスで用いることができる。
このアプローチの変形において、リガンドおよびその結合パートナーの３次元構造を作成する。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが結合に際して立体配座を変化させる場合に特に有用であり、該モデルをミメティックの設計においてこれを利用することを可能とする。
次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基がその上にグラフトすることができる鋳型分子を選択する。該鋳型分子およびその上にグラフトした化学基は、便宜には、リード化合物の生物学的活性を保持しつつ、ミメティックが合成するのが容易であり、薬理学的に許容されるようであり、イン・ビボで分解しないように選択することができる。あるいは、ミメティックがペプチドをベースにする場合、更なる安定性は、ペプチドを環化し、その剛性を増大させることによって達成することができる。このアプローチによって見出されたミメティックまたは複数のミメティックは、ついで、それらが標的特性を有するか否か、あるいはそれらがそれをどの程度呈するかを見るためにスクリーニングすることができる。ついで、さらに最適化または修飾を行って、イン・ビボまたは臨床テストのために１以上の最終ミメティックスに到達することができる。
使用の方法：核酸診断および診断キット
ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥが個体の病気素因となるＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子の存在を検出するために、血液のごとき生物学的試料を調製し、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の罹患性対立遺伝子の存在または不存在につき分析する。ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの存在につき検出するために、あるいは予後インディケータとしては、生物学的試料を調製し、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の突然変異体対立遺伝子の存在または不存在につき分析する。これらのテストの結果および解釈された情報をテストされた個体へ知らせるためにヘルスケアー供給者に戻される。そのような診断は診断研究所によって行うことができ、あるいは、診断キットを製造し、ヘルスケアー供給者または自己診断のために個人的に個人に販売される。
最初に、該スクリーニング方法は関連するＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３配列の増幅を含む。本発明のもう１つの好ましい具体例において、該スクリーニング方法は非ＰＣＲベースの戦略を含む。かかるスクリーニング方法は当該分野でよく知られた２−工程標識増幅方法を含む。ＰＣＲおよび非ＰＣＲベースのスクリーニング戦略は共に高レベルの感度で持って標的配列を検出することができる。
今日使用される最もポピュラーな方法は標的増幅である。ここに、標的核酸配列は、ポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼ−駆動増幅を用いる１つの特に好ましい方法はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）である。ポリメラーゼ鎖反応および他のポリメラーゼ−駆動増幅アッセイは、ポリメラーゼ−駆動増幅サイクルの使用を介してコピー数の１００万倍増加を超えて達成することができる。一旦増幅されれば、得られた核酸は配列決定し、またはＤＮＡプローブ用の基質として使用することができる。
標的配列の存在を検出するのにプローブを用いる場合、血液または血清のごとき分析すべき生物学的試料を処理して、所望ならば、核酸を抽出することができる。試料核酸は種々の方法で調製して標的配列の検出、例えば、変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングを容易とすることができる。分析物核酸の標的化領域は、通常は、少なくとも部分的に１本鎖化されて、プローブの標的配列とでハイブリッドを形成しなければならない。もし配列が天然での１本鎖であれば、変性は必要ないであろう。しかしながら、もし配列が２本鎖であれば、該配列は恐らくは変性される必要があろう。変性は当該分野で公知の種々の技術によって行うことができる。
分析物中の推定標的化配列と共にプローブ中の標的配列の安定なハイブリッド形成を促進する条件下で、分析物核酸およびプローブをインキュベートする。分析物に結合するのに使用されるプローブの領域は、ＫＣＮＱ２についてのヒト染色体２０の標的化領域に対し、またはＫＣＮＱ３についてのヒト染色体８の標的化領域に対して、完全に相補的とすることができる。従って、高ストリンジェンシー条件が偽陽性を防ぐには望ましい。しかしながら、もしプローブがゲノム中でユニークである染色体の領域に対して相補的でありさえすれば、高ストリンジェンシーの条件が用いられる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、塩基組成、プローブ長およびホルムアミドの濃度を含めた、ハイブリダイゼーションの間および洗浄間の多数の因子によって決定される。これらの因子は、例えば、Maniatisら、1982およびSambrookら、1989に概説されている。ある状況下では、トリプレックス、クワドラプレックス等のごとき高次ハイブリッドの形成が標的配列を検出する手段を提供するのに望まれるであろう。
得られたハイブリッドの検出はもしあれば、標識プローブの使用によって通常は達成される。別法として、プローブを標識しなくてもよいが、直接的または間接的に標識されたリガンドとの特異的結合によって検出することができる。適当な標識、およびプローブおよびリガンドを標識する方法は、当該分野で知られており、たとえば、公知の方法（たとえば、ニックトランスベーション、ランダムプライニングまたはキナージング）によって取りこむことができる放射性標識、ビオチン、蛍光基、ケミルミネセンス基（たとえば、ジオキセタン、特にトリガーされたジオキセタン）、酵素、抗体、金ナノ粒子等を含む。この基本的スキームの変形は当該分野で知られており、外因性物質から検出されるべきハイブリッドの分離を容易としおよび／または標識部位からのシグナルを増幅する変形を含む。多数のこれらの変形が例えば、MatthewsおよびKricka、1988；Landegrenら、1988；Mifflin、1989；米国特許第４８６８１０５号；およびＥＰＯ公開番号２２５８０７にレビューされている。
前記したごとく、非ＰＣＲベースのスクリーニングアッセイが本発明で考えられる。この手法は核酸プローブ（または正常なホスホジエステルを置き換えるメチルホスホネート骨格のごときアナログ）を低レベルＤＮＡ標識にハイブリダイズさせる。このプローブは該プローブに共有結合した酵素を有すことができ、従って該共有結合はハイブリダイゼーションの特異性に干渉しない。ついで、この酵素−プローブ−コンジュゲート−標的核酸複合体を遊離プローブ酵素コンジュゲートから単離することができ、酵素検出のために基質が添加される。酵素活性は発色またはルミネセンス出力の変化として観察され、１０3−１０6の感度の増加となる。オリゴデオキシヌクレオチド−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートの調製およびハイブリダイゼーションプローブとしてのそれらの使用に関する例としては、Jablonskiら、1986参照。
２工程標識増幅方法は当該分野で知られている。これらのアッセイは、（ジゴキシゲニン、ビオチン等のごとき）小リガンドがＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に特異的に結合することができる核酸プローブに付着するという原理に基づく。また、対立遺伝子特異的プローブがこの例の範囲内で考えられ、例示的対立遺伝子特異的プローブはこの開示の病気素因突然変異を含むプローブを包含する。
１つの例において、核酸プローブに付着した小リガンドは抗体−酵素コンジュゲートによって特異的に認識される。この例の１つの具体例において、ジゴキシゲニンは核酸プローブに付着される。ハイブリダイゼーションはケミルミネセンス基質にスイッチを入れる抗体−アルカリ性ホスファターゼコンンジュゲートによって検出される。この具体例による核酸プローブを標識する方法については、Martinら、1990参照。第２の例において、小リガンドは、第１のリガンドに対して特異的に複合体化される第２のリガンド−酵素コンジュゲートによって認識される。この例のよく知られた具体例は、ビオチン−アビジンタイプの相互作用である。核酸プローブを標識する方法およびビオチン−アビジンベースのアッセイにおけるそれらの使用については、Rigbyら、1977およびNguyenら、1992参照。
また、本発明の核酸プローブアッセイがＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３を検出することができる核酸プローブのカクテルを使用するであろうことは本発明の範囲内である。かくして、細胞試料中でのＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３の存在を検出する１つの例において、遺伝子に相補的な１を超えるプローブを使用し、特に異なる数のプローブは、別法として、２、３または５の異なる核酸プローブ配列である。もう１つの例において、患者においてＫＣＮＱまたはＫＣＮＱ３遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するには、これらの遺伝子に相補的な１を超えるプローブを使用し、ここに該カクテルはＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３において変化を持つ患者の集団において同定された対立遺伝子−特異的突然変異に結合することができるプローブを含む。この具体例において、いずれかの数のプローブを用いることができ、これは好ましくは個人に対してＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの病気素因として同定される主要遺伝子突然変異に対応するプローブを含む。
使用の方法：ペプチド診断および診断キット
ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの存在は、野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドの改変に基づいて検出することもできる。かかる改変は通常の技術に従い配列分析によって測定することができる。より好ましくは、（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗体を用いてＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ペプチドの相違またはその不存在を検出する。抗体を生起させそれを精製する技術は当該分野でよく知られており、いずれかのかかる技術を選択して、本発明で主張する調製を達成することができる。本発明の好ましい具体例において、抗体は、溶液からＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質を免疫沈降させ、ならびにポリアクリルアミドゲルのウエスタンまたはイムノブロット上のこれらの蛋白質と反応する。もう１つの好ましい具体例において、抗体は、免疫組織化技術を用いて、パラフィンまたは凍結された組織セクション中のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質を検出するであろう。
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３またはそれらの突然変異を検出する方法に関する好ましい具体例は酵素連結免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを用いる）を含む。例示的サンドイッチアッセイは、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第４３７６１１０号および第４４８６５３０号においてDavidらによって記載されている。
使用の方法：合理的薬物デザイン
合理的薬物デザインの目標は、注目する生物学的に活性なポリペプチドの構造的アナログまたはそれらが相互反応する小分子（たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター）を生産して、例えば、ポリペプチドのより活性または安定な形態である、または例えばイン・ビボでポリペプチドの機能を増強させまたはそれに干渉する薬物を作成することである。例えば、Hodgson、1991参照。１つのアプローチにおいて、Ｘ線結晶解析によって、コンピュータモデリングによって、または最も典型的にはアプローチの組み合わせによって、注目する蛋白質（例えば、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチド）の３次元構造をまず決定する。それほど頻繁ではないが、ポリペプチドの構造に関して有用な情報は、相同蛋白質の構造に基づくモデリングによって獲得することができる。合理的薬物デザインの例はＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発である（Ericksonら、1990）。加えて、ペプチド（例えば、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチド）は、アラニンスキャンによって分析される（Wells、1991）。この技術においては、アミノ酸残基がＡｌａによって置き換えられ、ペプチドの活性に対するその効果が測定される。ペプチドのアミノ酸残基の各々をこのように分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。
また、機能的アッセイによって選択された標的−特異的抗体を単離し、ついでその結晶構造を解析することもできる。原理的には、このアプローチは、引き続いての薬物デザインがそれをベースとすることができるファルマコアを生じる。機能的な薬理学上活性な抗体に対する抗−イデオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成させることによって、蛋白質の結晶解析をまったく迂回することができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は元の受容体のアナログであると予測されるであろう。ついで、該抗−ｉｄを用いてペプチドの化学的にまたは生物学的に生産されたバンクのバンクからペプチドを同定し単離し得る。ついで、選択されたペプチドはファルマコアとして作用するであろう。
かくして、例えば、改良されたＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチド活性または安定性を有するまたは、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチド活性の阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等として作用する薬物を設計することができる。クローン化ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３配列の利用可能性によって、十分な量のＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３ポリペプチドを利用可能として、Ｘ線結晶解析のごとき解析研究を行うことができる。加えて、本明細書中で提供するＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３蛋白質配列の知識は、Ｘ線結晶解析の代わりにまたはそれに加えて、コンピュータモデリング技術を使用するものをガイドする。
使用の方法：遺伝子治療
本発明によると、各々、突然変異体ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子を担う細胞に対して野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３機能を供給する方法も提供される。かかる機能の提供は受容体細胞の正常な機能を可能とするはずである。野生型遺伝子または該遺伝子の一部を、該遺伝子が染色体外にとどまるようにベクター中にて細胞に導入することができる。かかる状況において、遺伝子は染色体外位置から細胞によって発現されるであろう。より好ましいものは、野生型遺伝子またはその一部が、それが細胞中に存在する内因性突然変異体遺伝子と組み換えられるように、突然変異体細胞に導入される状況である。かかる組換えは、遺伝子突然変異の修正の結果となる二重組換え事象を要する。組換えおよび染色体外維持のための遺伝子の導入用ベクターは当該分野で知られており、いずれの適当なベクターも使用することができる。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿およびウイルス導入のごときＤＮＡを細胞に導入する方法は当該分野で公知であり、選択方法は実行者の技量の範囲内である。
一般的には前記したごとく、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子または断片は適応可能であれば、遺伝子治療方法で使用して細胞中のかかる遺伝子の発現産物の量を増大させることができる。また、突然変異体遺伝子が「正常」レベルで発現されるが遺伝子産物が十分には機能的ではない個人において、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の発現レベルを増大させるのが有用であろう。
遺伝子治療は、例えば、Friedman（1991）またはCulver（1996）によって記載された一般的に認められた方法によって行われる。患者からの細胞をまず前記した診断方法によって分析して細胞中のＫＣＮＱ２およびまたはＫＣＮＱ３ポリペプチドの生産を確実なものとする。発現制御エレメントに連結したＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子のコピーを含有し、細胞の内部で複製することができるウイルスまたはプラスミドベクター（さらなる詳細は後記参照）を調製する。該ベクターは細胞の内部で複製することができる。あるいは、該ベクターは複製欠陥であってもよく、遺伝子治療で使用されるヘルパー細胞中で複製される。米国特許第５２５２４７９号およびＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０７２８２および米国特許第５６９１１９８号；第５７４７４６９号；第５４３６１４６号および第５７５３５００号に開示されているごとき適当なベクターが公知である。ついで、ベクターを患者に注入する。もしトランスフェクトされた遺伝子が各標的細胞のゲノムに永久的に組み込まれなければ、当該治療は周期的に反復される必要があろう。
当該分野で公知の遺伝子導入システムは本発明の遺伝子治療の実施で有用であろう。これらはウイルスおよび非ウイルス導入方法を含む。パポバウイルス（たとえばSV40、Madzakら、1992）、アデノウイルス（Berkner、1992；Berknerら、1988；GorzigliaおよびKapikian、1992；Quantinら、1992；Rosenfeldら、1992；WilkinsonおよびAkrigg、1992；Stratford‐Perricaudetら、1990；Schneiderら、1998）、ワクシニアウイルス（Moss、1992、Moss、1996）、アデノ関連ウイルス（Muzyczka、1992；Ohiら、1990；RussellおよびHirata、1998）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Margolskee、1992；Johnsonら、1992；Finkら、1992；BreakefieldおよびGeller、1987；Freeseら、1990；Finkら、1996）、レンチウイルス（Naldiniら、1996）、シンドビスおよびセンリキフォレストウイルス（Berglundら、1993）、および鳥類（BandyopadhyayおよびTemin、1984；Petropoulosら、1992）、ネズミ（Miller、1992；Millerら、1985；Sorgeら、1984；MannおよびBaltimore、1985；Millerら、1988）およびヒト起源（Shimadaら、1991；Helsethら、1990；Pageら、1990；BuchschacherおよびPanganibanら、1992）のレトロウイルスを含めた、遺伝子導入ベクターとしてまたは遺伝子導入ベクターを修復するベースとして使用されてきた。ほとんどのヒト遺伝子治療プロトコルは廃疾ネズミレトロウイルスをベースとしてきたが、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスも使用されている。
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子導入方法は、リン酸カルシウム共沈殿（Grahamおよびvan der Eb、1973；Pellicerら、1980）；機械的技術、例えば、マイクロインジェクション（Andersonら、1980；Gordonら、1980；Brinsterら、1981；CostantiniおよびLacy、1981）；リポソームを介する膜融合−媒介導入（Felgnerら、1987；WangおよびHuang、1989；Kanedaら、1989；Stewartら、1992；Nabelら、1990；Limら、1991）；および直接的ＤＮＡ摂取および受容体−媒介ＤＮＡ導入（Wolffら、1990；Wuら、1991；Zenkeら、1990；Wuら、1989；Wolffら、1991；Wagnerら、1990；Wagnerら、1991；Cottenら、1990；Curielら、1992；Curielら、1991）のごとき化学的技術を含む。ウイルス−媒介遺伝子導入はリポソーム送達を用いる直接的イン・ビトロ遺伝子導入と組み合わせることができ、ウイルスベクターを周囲の非分裂細胞へではなく腫瘍細胞へ向けるのを可能とする。別法として、レトロウイルスベクター生産細胞系を腫瘍に注入することができる（Culverら、1992）。生産細胞の注入はベクター粒子の連続的源を提供するであろう。この技術は扱うことができない脳腫瘍を持つヒトでの使用が認可されている。
生物学的および物理学的遺伝子導入方法を組合わせるアプローチにおいて、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルスヘキソン蛋白質に特異的なポリリシン−コンジュゲーテッド抗体と組み合わせ、得られた複合体はアデノウイルスベクターに結合される。ついで、三分子複合体を用いて細胞を感染させる。カップリングされたＤＮＡが損傷する前に、アデノウイルスベクターは十分な結合、内部化およびエンドソームの分解を可能とする。アデノウイルスベースのベクターの送達用の他の技術については、Schneiderら（1998）および米国特許第５６９１１９８号；第５７４７４６９号；第５４３６１４６号および第５７５３５００号参照。
リポソーム／ＤＮＡ複合体は直接的イン・ビボ遺伝子導入を媒介することができるのが示されてきた。標準的なリポソーム調製物においては遺伝子導入プロセスは、非特異的であるが、局所化されたイン・ビボ摂取および発現が、例えば、直接的イン・サイチュ投与に続いて腫瘍寄託で報告されている（Nabel、1992）。
遺伝子治療の意味において発現ベクターは、そこにクローン化されたポリヌクレオチドを発現するのに十分な配列を含有する構築体を意味する。ウイルス発現ベクターにおいて、該構築体は該構築体のパッキングを支持するのに十分なウイルス配列を含む。もしポリヌクレオチドがＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３をコードするならば、発現はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３を生じさせるであろう。もしポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムをコードするならば、発現はアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムを生じさせるであろう。かくして、この意味において、発現は生産された蛋白質が合成されることを必要としない。発現ベクターにクローン化されたポリヌクレオチドに加えて、該ベクターは真核生物細胞で機能的なプロモーターも含有する。クローン化ポリヌクレオチド配列はこのプロモーターの制御下にある。適当な真核生物プロモーターは前記したものを含む。また、発現ベクターは選択マーカーおよび本明細書中に記載された他の配列のごとき配列も含むことができる。
脳組織にＤＮＡを直接的に標的化する遺伝子導入技術が好ましい。受容体−媒介遺伝子導入は、例えば、（通常は共有結合により閉じたスーパーコイルドプラスミドの形態である）ＤＮＡのポリリシンを介する蛋白質リガンドへのコンジュゲーションによって達成される。リガンドは、標的細胞の細胞表面／組織タイプ上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択される。もし、受容体結合およびＤＮＡ−蛋白質複合体の内部化が起こる場合に所望のものが標的組織に向けられれば、これらのリガンド−ＤＮＡコンジュゲートは直接的に血液に注入することができる。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するにはアデノウイルスとの共感染を含めてエンドソーム機能を破壊することができる。
治療は以下のとおりである：ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３罹患性対立遺伝子を担う患者を、それらの脳前駆体細胞のいくらかまたはすべてが、各々、機能的正常ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子の少なくとも１つの更なるコピーに到達するように遺伝子送達ビイクルで処理する。この工程において処理された個体は、罹患性対立遺伝子の効果が正常対立遺伝子の存在によって逆行される程度まで、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇および／またはＪＭＥの危険性が低下している。
使用の方法：ペプチド治療
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３活性を有するペプチドは、各々、突然変異体またはミシングＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子を担う細胞に供給することができる。蛋白質は、例えば、公知の発現ベクターを用い、細菌中でのｃＤＮＡ配列の発現によって生産することができる。別法として、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ポリペプチドはＫＣＮＱ２−またはＫＣＮＱ３−生産哺乳動物細胞から抽出することができる。加えて、合成化学の技術を使用してＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質を合成することができる。かかる技術のいずれも、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３蛋白質を含む本発明の調製物を提供することができる。該調製物は、他のヒト蛋白質が実質的にない。これは微生物中においてまたはイン・ビトロにおいてかなり容易に達成される。
活性なＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３分子はマイクロインジェクションによって、あるいはリポソームの使用によって細胞に導入することができる。別法として、いくつかの活性な分子は細胞によって能動的にあるいは拡散によって摂取することができる。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３活性を持つ分子の供給は、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇および／またはＪＭＥの部分的逆行に至るはずである。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３活性を持つ他の分子（例えば、ペプチド、薬物または有機化合物）を用いて、かかる逆行を行うこともできる。実質的に同様の機能を有する修飾されたポリペプチドをペプチド治療で用いることもできる。
使用の方法：形質転換された宿主
治療剤をテストするための動物は全動物の突然変異誘発後にまたは生殖系細胞もしくは接合体の処理の後に選択することができる。かかる処理は、通常は、第２の動物種からの突然変異体ＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３対立遺伝子の挿入、ならびに破壊された相同遺伝子の挿入を含む。別法として、動物の内因性ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子は、通常の技術を用いる挿入もしくは欠失突然変異または他の遺伝子変化によって破壊することができる（Capecchi、1989；ValanciusおよびSmithies、1991：Hastyら、1991；Shinkaiら、1992；Mombaertsら、1992；Philpottら、1992；Snouwaertら、1992；Donehowerら、1992）。テスト物質を動物に投与した後、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの存在を評価しなければならない。もし、テスト物質がＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの出現を予防しまたは抑制するならば、テスト物質はＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの治療用の候補治療剤であろう。これらの動物モデルは潜在的治療産物のための極端に重要なテストビイクルを提供する。
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３遺伝子突然変異とＢＦＮＣ、ローランド癲癇およびＪＭＥとの間の関連の同定は、個体の初期プレ症状スクリーニングが、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを発生する危険のあるものを同定することを可能とする。かかる個体を同定するには、ＫＣＮＱ２および／またはＫＣＮＱ３対立遺伝子を、直接的にまたは対立遺伝子をクローン化した後に突然変異につきスクリーニングする。限定されるものではないが以下の方法：蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接的ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖立体配座解析（ＳＳＣＰ）、連鎖分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を含めたいずれかの適当な技術を用い、正常対立遺伝子からの核酸配列差異の存在につき対立遺伝子をテストする。また、最近開発されたＤＮＡマイクロチップ技術も有用である。例えば、（１）クローン化対立遺伝子および正常ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子または適当な断片双方のヌクレオチド配列（コーディング配列またはゲノム配列）を決定し、ついで比較し、あるいは（２）ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子または遺伝子断片の転写体を、テストすべき個体からの一本鎖全ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、得られたヘテロデュプレックスをＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａ（ＲＮａｓｅ Ａ）で処理し、変性ゲル上で泳動させていずれのミスマッチの位置も検出する。これらの方法のうち２つは以下の手法に準じて行うことができる。
テストすべき個体中のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の対立遺伝子は通常の技術を用いてクローン化される。たとえば、血液試料は個体から得られる。この試料中の細胞から単離されたゲノムＤＮＡはほぼ２０ｋｂの平均断片サイズまで部分的に消化される。１８−２１ｋｂの範囲の断片を単離する。得られた断片を適当なベクターに連結する。ついで、クローンの配列を決定し、正常ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子と比較する。
あるいは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）をＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の５−領域またはエキソン用のプライマー対で行う。また、ＰＣＲは正常ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子のいずれかの配列に基づいたプライマー対で行うこともできる。例えば、イントロンの１つについてのプライマー対を調製し、利用することができる。最後に、ＲＴ−ＰＣＲをｍＲＮＡで行うこともできる。次いで、いずれかの差異を同定するための通常の技術を用いる一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）によって増幅された産物を分析し、ついで、これらを配列決定し、正常遺伝子配列と比較する。
例えば、対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーションによって、適当なプローブ対を用い、個体のＤＮＡを増幅し、増幅された産物を分析することによって、共通のＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子変異体につき個体を迅速にスクリーニングすることができる。
第２の方法は、正常ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子と欠陥遺伝子との間の差異の検出を助けるためにＲＮａｓｅ Ａを使用する。この比較は、プローブとしてＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の小（〜５００ｂｐ）制限断片を用いる工程で行われる。まず、遺伝子配列をほぼ５００ｂｐの断片に切断する制限酵素でＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子を消化する。これらの断片を電気泳動ゲル上で分離し、該ゲルから精製し、両方の向きにおいて、ＳＰ６ベクター（例えば、ｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５）で個々にクローン化する。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子断片のインサートを含有するＳＰ６−ベースのプラスミドを、［α−32Ｐ］ＧＴＰの存在下で、当該分野でよく知られたＳＰ６転写系を用いてイン・ビトロで転写し、該遺伝子の両鎖の放射性標識ＲＮＡ転写体を生じさせる。
個々には、これらのＲＮＡ転写体を用いて、通常の技術を用い対立遺伝子ＤＮＡを持つヘテロデュプレックスを形成させる。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３断片と個体からのＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３対立遺伝子サブクローンとの間の配列の差のため、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックスで起こるミスマッチの結果、ＲＮａｓｅ Ａ処理した場合にＲＮＡストランドにおいて切断が起こる。かかるミスマッチは個体の対立遺伝子における点突然変異または小さな欠失の結果であり得る。ＲＮＡストランドの切断は２以上の小さなＲＮＡ断片を生じ、これは変性ゲル上でＲＮＡプローブそれ自体よりも速く泳動する。
見出されるいずれの差異も、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子の分子変異体およびその結果としてのＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの存在を有するものとして個体を同定するであろう。最もひどい形態は、遺伝子が異常蛋白質をコードするようにするフレームシフト突然変異または大きな欠失、あるいは蛋白質を発現をかなり変化させるものであろう。よりひどくない破壊的突然変異は、小さなインフレーム欠失および非保存的塩基対置換を含み、これは、システイン残基へのまたはシステイン残基からの変化、塩基性から酸性アミノ酸への変化、またはその逆、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への変化またはその逆、あるいは２次または３次の蛋白質構造に影響するであろう他の突然変異のような、生産された蛋白質に対して有意な効果を有するであろう。サイレント突然変異または保存的アミノ酸置換の結果となるものは、一般的に、蛋白質機能を破壊するとは予測されない。
遺伝子テストは実行者が誕生時または誕生時前においてさえ、ＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥの危険のある個体を同定するのを可能とするであろう。これらの癲癇の前徴候診断はこれらの障害の予防を可能とするであろう。最後に、本発明はＢＦＮＣ、ローランド癲癇およびＪＭＥの原因および治療の我々の理解を変化させる。例えば、カリウムチャンネルオープニング剤はＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３突然変異を持つ患者において発作の危険性を減少させるであろう。
医薬組成物および投与経路
本発明のＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３ポリペプチド、抗体、ペプチドおよび核酸は医薬組成物に処方することができ、これは通常の医薬調合技術に従って調製される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，第１８版（1990、Mack Publishing Company、Easton、Pensilvenia州）参照。該組成物は活性剤または活性剤の医薬上許容される塩を含有することができる。これらの組成物は活性物質の１つに加えて、医薬上許容される賦形剤担体、緩衝剤、安定化剤、または当該分野でよく知られた他の物質を含有することができる。かかる物質は非毒性であるべきで、有効成分の効率に干渉すべきではない。投与（例えば、静脈内投与経口投与、鞘内投与、神経弓上投与または非経口投与）で望まれる調製物の形態に依存して、該担体は種々の形態を取ることができる。
経口投与では、化合物はカプセル剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ、メルト、粉末、懸濁物またはエマルジョンのごとき固体もしくは液体調製物に処方することができる。経口投与形態において組成物を調製するには、（例えば、懸濁物、エリキシル剤および溶液のごとき）経口固体調製物の場合には、水、グリコール、油、アルコール、フレーブ剤、防腐剤、着色剤、懸濁化剤；（たとえば粉末、カプセル剤、および錠剤のごとき）経口固体調製物の場合には、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、バインダー、崩壊剤のごとき通常の医薬媒体のいずれかを使用することができる。錠剤およびカプセル剤は、最も有利な経口投与ユニットを表し、この場合には固体医薬単体が明らかに使用される。所望ならば、錠剤は標準的な技術によって糖で被覆し、または腸溶被覆することができる。活性剤は、同時に脳血液関門を横切って通過するのを可能としつつ、胃腸管を通ってそれが安定に通過するようにカプセル化することができる。例えば、ＷＯ９６／１１６９８参照。
非経口投与では、化合物を医薬上許容される担体に溶解させ、溶液または懸濁物いずれかとして投与する。適当な担体の例は、水、生理食塩水、デキストローズ溶液、フラクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油である。担体は他の成分、たとえば、防腐剤、懸濁化剤、安定化剤、緩衝剤等を含有することもできる。化合物を鞘内投与すべき場合には、それは脳脊髄液に溶解させることもできる。
活性剤は、好ましくは、治療上有効量で投与される。現実の投与量および投与の速度および期間は、治療されるべき疾患の性質および重症度に依存するであろう。治療の方法、例えば投与量の決定、タイミング等は一般的な実行者またはスペシャリストの責任範囲内にあり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の疾患、送達の部位、投与の部位および実行者に知られている他の因子を考慮する。技術およびプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに見出すことができる。
別法として、標的化療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのごとき標的化系の使用によって、活性剤をより特異的にあるタイプの細胞に送達することができる。例えば、もし該剤が許容されないように毒性であれば、あるいはもしそれがあまりにも高い用量を要するならば、あるいはもしそれが標的細胞に侵入することができないならば、標的化は種々の理由で望ましいであろう。
これらの剤を直接的に投与する代わりに、それらを標的細胞中にて例えば、前記したごときウイルスベクター中においてまたは、患者中のインプランテーションに設計された米国特許第５５５００５０号および公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４５２、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９５９、ＷＯ９７／１２６３５に記載されているごとき細胞ベースの送達系にて生産することができる。ベクターを治療すべき特異的細胞に標的化することができるか、あるいはそれは標的細胞に特異的な組織である調節エレメントを含有することができる。細胞ベースの送達系は、所望の標的部位において患者の身体に移植するように設計され、活性剤についてのコーディング配列を含有する。あるいは、該剤は処理すべき細胞中で生産された、あるいは該細胞に標的化された活性化剤によって、活性化形態に変換される前駆体にて投与することができる。たとえば、ＥＰ４２５７３１ＡおよびＷＯ９０／０７９３６参照。
本発明を以下の実施例でさらに詳細に記載するが、これは例示として供するものであって、断じて本発明を限定する意図のものではない。当該分野でよく知られている標準的な技術または、後記にて記載する技術を用いる。
実施例１
サザンブロット分析
５μｇのゲノミックＤＮＡをＴａｑ１で切断し、ナイロン膜に移した。フィルターを、ランダム・プライミング（random priming，Stratagene社製）によって標識したＤ２０Ｓ２４プラスミド・プローブと、ＰＥＧ ｈｙｂ（７％のＰＥＧ、１０％のＳＤＳ、５０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび２００μｇ／ｍｌの全ヒトＤＮＡ）中、６５℃にて一晩ハイブリダイズさせた。フィルターを２×ＳＳＣ、室温にて０.１％のＳＤＳで２回、つづいて０.５×ＳＳＣ、６５℃にて０.１％のＳＤＳで１回洗浄した。
実施例２
蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション
形質転換リンパ球からの染色体は、３０分間のエチジウムブロマイド処理につづくコルセミド中の３時間の処理を用いて調製した。ついで、細胞をペレット化し、低浸透圧溶液（０.７５ＭのＫＣｌ）中に２０分間再懸濁させ、つづいて４ないし５滴の新たな固定液（３：１のメタノール：酢酸）を滴下した。再度、細胞をペレット化し、ついで注意深くボルテックス攪拌させて固定液中に再懸濁させた。固定液中で３回洗浄した後に、中期細胞（metaphases）を４℃にて保存した。４００ｎｇのプローブをビオチンで標識し、標準的なハイブリダイゼーション手法を用いて中期スプレッド細胞（metaphase spreads）のスライドにハイブリダイズさせた。ついで、プローブをアビジン−ＦＩＴＣ（Vector社製）で蛍光標識し、ビオチン−標識抗−アビジン、つづいてアビジン−ＦＩＴＣを用いてシグナルを強めた。ついで、染色体をＤＡＰＩを用いて対抗染色（counterstain）し、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩおよび三重バンドパス・フィルターのセットを備えたZeiss Axioplan蛍光顕微鏡を用いて視覚化した。Applied Imaging社（Pittburg, PA）製ソフトウェア、プロベビジョン（Probevision）を用いてコンピュータによってイメージをキャプチャーし、Kodak XL 7700カラーイメージプリンター上に写真を印刷した。
実施例３
ＫＣＮＱ２の位置決定
大きな血縁における連鎖解析により、ＢＦＮＣの原因となる遺伝子が、マーカーＤ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ１９に近い染色体２０ｑ１３.３（Leppertら、1989）にマッピングされることが示された。最初の報告の後に、２のセンターが、ＥＢＮ１（１型良性新生児癲癇）遺伝子座と呼ばれる第２０染色体上の同じ２の遺伝マーカーに対するＢＦＮＣの連鎖を確認した（Rayanら、1991；Malafosseら、1992）。より遠位のマーカーＤ２０Ｓ２４は、第２０染色体連鎖家族においてＢＦＮＣ表現型と完全な共分離を示した。ＢＦＮＣ遺伝子座に対する遠位のフランキング・マーカーを発見することは成功しなかった。恐らくは、それがテロメアに近接しているためである。このテロメア領域は、物理的遠位と比較した場合にマーカー間の高い組換え頻度によって特徴付けられる（Steinleinら、1992）。事実、Steinleinらは、３つのマーカーＤ２０Ｓ１９、Ｄ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ２４が同一の４５０ＭｂのＭｌｕＩ制限フラグメント上に含まれることを示している（Steinleinら、1992）。
第２の染色体遺伝子座、ＥＢＮ２もＢＦＮＣに対して同定されている。Lewisら（1993）は、ＢＦＮＣに影響された単一のヒスパニック系家族において、染色体８ｑ２４上のマーカーに対する連鎖を示している。この第２の遺伝子座に関する事実は、カフカス人血縁においても報告された（Steinleinら、1995）。本実験におけるすべての家族は、３.０よりも大きなＬＯＤ得点で染色体２０ｑマーカーに対する連鎖を示すか、またはＢＦＮＣと一致する臨床的症状発現を有する発端者を有していた（Leppertら、1993）。ＢＦＮＣの原因となる遺伝子を発見するために、我々は単一家族における準顕微的欠失を有するＢＦＮＣ領域を狭め、この欠失中に候補ｃＤＮＡを同定し、ついで他のＢＦＮＣ家族における突然変異を探索した。
小さな欠失に関する事実は、３つの対立遺伝子、ＲＥＬＰマーカー、Ｄ２０Ｓ２４での遺伝子型決定知見から最初に生じた。１の家族、血縁１５４７の分析により、無効対立遺伝子がＢＦＮＣを有する個人およびＶＮＴＲマーカーＤ２０Ｓ２０およびＤ２０Ｓ１９で浸透されていないことが以前に示されている２の個人において広範に発生していることが明らかになった（図１）。この家族にＢＦＮＣ表現型と共分離する欠失が存在することは、プローブとしてＤ２０Ｓ２４プラスミドおよびこのマーカーを含む２のゲノミックＰ１クローンを用いた血縁１５４７個人のセルラインにおける蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって確認した。
欠失の存在を確認するために、２の重複するゲノミックＰ１クローン、Ｐ１−ＫＯ９−６ｂおよびＰ１−ＫＯ９−７（各々ほぼ８０ｋｂのサイズであって、各々Ｄ２０Ｓ２４マーカーを含む）を得、これらを血縁１５４７のＢＦＮＣに影響された個人のセルラインにハイブリダイズさせた。中期スプレッド細胞の染色体がＰ１−ＫＯ９−７およびＰ１−ＫＯ９−６ｂとハイブリダイズする場合には、双方の第２０染色体相同物が２の姉妹染色分体にシグナルを与える。しかしながら、１２ｋｂのプローブＤ２０Ｓ２４のみがハイブリダイズした場合には、１の染色体相同物からのシグナルのみが検査した中期スプレッド細胞の７５％において認められた。残りの少ない方の細胞は１２ｋｂのＤ２０Ｓ２４プローブに対するハイブリダイゼーションを全く示さなかった（図２）。Ｄ２０Ｓ２４マーカーを含むプラスミドは、Ｊ. Weissenbachからの寄贈物であった。
影響された個人における１の染色体において１２ｋｂのＤ２０Ｓ２４プローブが欠失していた一方で、８０ｋｂのサイズで、共にほぼ１３０ｋｂに広がる重複するＰ１クローンが陽性のＦＩＳＨシグナルを示し、これは欠失が１３０ｋｂよりも小さいことを示している（図２）。
実施例４
ＫＣＮＱ２クローンの単離および特徴付け
実施例３におけるものと同一のプローブを用いて、胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって欠失の領域中のｃＤＮＡを同定した。単離したｃＤＮＡのうちの３は、ＫＣＮＱ１、長時間ＱＴ症候群（Long QT syndrome）およびジャーヴィル・ランゲ・ニールセン心臓音響症候群（Jervell and Lange-Nielsen cardiocauditory syndrome）の原因となる第１１染色体のカリウムチャンネル遺伝子に対して有意なホモロジーを示した（Wangら、1996；Altschulら、1990；Neyroudら、1997）。
胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社製）（１０6クローン）を、Ｐ１−ＫＯ９−６ｂおよびＰ１−ＫＯ９−７からのインサートならびにプラスミドＤ２０Ｓ２４で釣上げた。ハイブリダイゼーションは５×ＳＣＣ、１０×デンハーツ液、０.１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６.７）、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、０.１％のＳＤＳおよび５０％のホルムアミド中で行った。ブロットは２×ＳＳＣ、０.１×ＳＤＳ中、室温にて２回、つづいて０.５×ＳＳＣ、０.１％のＳＤＳ中、４２℃にて１回洗浄した。
Ｄ２０Ｓ２４を用いて単離した単一のｃＤＮＡ、ｃＩＰＫは、ＫＣＮＱ１のアミノ酸５１１−５６２と７５％のホモロジーを示し；プローブＰ１−ＫＯ９−６ｂを用いた胎児脳ｃＤＮＡライブラリーの２回目の釣上げにより、２のさらなるｃＤＮＡ、ｃ６ｂ−６およびｃ６ｂ−１２を単離し、これらは、各々ＫＣＮＱ１のアミノ酸３９８−４０６および３５４−３７８と有意なホモロジーを示した（Altschulら、1990；Wangら、1996；Neyroudら、1997）。
ＯＭＩＭ遺伝子座名の後にＫＶＥＢＮ１（現在はＫＣＮＱ２）と命名されたこのＢＦＮＣ遺伝子をコードするさらなる配列は、胎児および成人の脳組織および側頭皮質ｃＤＮＡライブラリーから単離した他のｃＤＮＡクローンからのアダプター−連結二本鎖ｃＤＮＡを用いたＲＡＣＥ実験から得た。
完全長の遺伝子を同定するために、５’および３’ＲＡＣＥを、ｃ６ｂ−６およびｃＩＰＫ内のプライマーを用い、ｃＩＰＫを挟む配列を用いた側頭皮質ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社製）をスクリーニングして、アダプター−連結胎児および成人脳ｃＤＮＡ（Clonetech社製）に対して行った。非プロセシングｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーおよびＲＡＣＥ実験から繰返して単離した。脳から単離した最長の転写物は１４５５ヌクレオチド長であって、５’ＲＡＣＥを用いて得られ、Ｓ１ドメイン（アミノ酸１００）から３’保存Ｃ−末端ドメイン（アミノ酸５８５）まで伸長していた。
ＫＣＮＱ２遺伝子の８７２アミノ酸をコードする複合クローンを単離した（図３）。ＫＣＮＱ２についてのｃＤＮＡ配列を配列番号：１に示し、ＫＣＮＱ２についてのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。推定イニシエーターであるメチオニンは、コザックのコンセンサス配列（Kozak，1987）と同様の領域内に存在していた。ＫＣＮＱ２は、Ｋ+イオンチャネル遺伝子の顕著な特徴である高度に保存された６個の貫膜モチーフならびにポア領域をコードしていた。Ｓ２、Ｓ３およびＳ４貫膜領域も、Shaker、Shab、ShawおよびShalを含むＫ+チャンネル・サブファミリーのすべてのメンバーに見出される電荷アミノ酸を含んでいた。ＫＣＮＱ２配列を用いたGenbankの検索により、ＨＮＳＰＣ（受託番号Ｄ８２３４６）、ヒト神経芽腫セルラインから単離された３９３アミノ酸の推定カリウムチャンネルのｃＤＮＡ（Yokoyamaら、1996）と同一のヌクレオチド配列が示された。しかしながら、停止コドンを含むＨＮＳＰＣの最後の２１アミノ酸は、ＫＣＮＱ２ではイントロン性である配列によってコードされていた。ヒト発現配列タグのデータベース（dbest）の検索により、ＫＣＮＱ２の一部分をコードする７の異なるクローンが示された。Weiらは、シイ・エレガンス（C.elegans）からの遺伝子、ｎＫＱＴ１を同定し、それがＫＣＮＱ２の相同物のようであることを発表している（Weiら、1996）。このグループは、ｎＫＱＴ１のヒトＥＳＴ相同物であるｈＫＱＴ２も記載しており、これはＫＣＮＱ２の部分クローンである（Weiら、1996）。６の貫膜ドメインおよびポアに加えて、貫膜ドメインＳ１の５’側の小領域もＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ１およびｎＫＱＴ１の間で保存されていた。他のＫ+チャンネル・サブファミリーとは異なり、Ｃ−末端ドメインは、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ｎＫＱＴ１およびＫＣＮＱ１について図３に示す高度に保存された残基を含むようである。ＫＣＮＱ２についてのポリＡテイルは現在まで同定されていない。
実施例５
ノザンブロット分析
ＫＣＮＱ２のｃＤＮＡは脳から作製したノザンブロット上のほぼ１.５、３.８および９.５ｋｂのサイズの転写物にハイブリサイズした。胎児および成人の脳の多重組織ノザン（Multiple Tissue Notherns，Clontech社製）を、ＫＣＮＱ２の貫膜ドメインＳ１ないしＳ６を含有するＲＡＣＥ生成物で釣上げた。１.５および９.５ｋｂの転写物は、成人および胎児の脳の双方で発現しているようであった。３.８ｋｂの転写物は、成人の脳の選択した領域、詳細には側頭葉および被殻において発現していた。
実施例６
ＫＣＮＱ２の突然変異分析
ＫＣＮＱ２の突然変異分析は、我々の１２の各ＢＦＮＣ家族からの１の影響された個人に対して行った。Ｓ１ないしＳ６のコード領域およびＫＣＮＱ２の３’末端の保存領域を、イントロン内のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅させ、４℃にて流す２０％のＴＢＥゲルを用いたＳＳＣＰ（Novex社製）によって分析した。エキソン−イントロン境界は、ゲノミックＰ１クローンに対するエキソン−エキソンＰＣＲによって得た生成物を配列決定することによってか、あるいは非プロセシング化転写物を含むＲＡＣＥ生成物から直接同定した。ＳＳＣＰ上で見られた変異型を示すＰＣＲ産物をクローン化し配列決定するか、あるいはＭ１３リバース・プライマーおよびＭ１３ユニバーサル−テイル・プライマーを用いて再増幅させ、色素−プライマー化学を用いてＡＢＩ３７３または３７７上で直接配列決定した。
血縁１５４７における実質的欠失に加えて、５の他のＢＦＮＣ家族においても突然変異が同定された。突然変異分析は、まずＳＳＣＰ変異型について発端者をスクリーニングし、ついで各個人のＤＮＡを配列決定して分子変異型の塩基を決定することによって行った。同定された突然変異には２のミスセンス突然変異、２のフレームシフト突然変異および１のスプライシング部位突然変異が含まれていた（表２）。後の分析では、ＫＣＮＱ２中に突然変異を有する４のさらなるＢＦＮＣ家族が見出された。これらには、２のナンセンス突然変異（家族Ｋ１５２５およびＫ４４４３）、正常な停止コドンを越えるリードスルーを起こすフレームシフトを生じる挿入（Ｋ３９６３）、およびミスセンス突然変異（Ｋ４５１６）が含まれていた。これらの後者の４の突然変異を表２に掲載する。
スプライシング部位変異型は、アミノ酸残基５４４をコードする２のエキソン間に生じるイントロン中に発生していた。第１のエキソンはコドン５４４の開始にＴＧを含み、続くエキソンはコドン５４４の最後のＴを含んでいた。（下部の事例の文字で示す）イントロンの３’末端に存在し、コドン５４４およびコドン５４５−５４６をコードする（上部の事例の文字で示す）エキソン領域に続く配列は：5'−tgcagTGTCATG−3'（配列番号：５）である。配列番号：５のポジション５の“ｇ”は、血縁Ｋ３９３３においては“ａ”に突然変異していた。
同定された最初の６家族において見られた突然変異は、すべて、我々の７０の無関係で、影響されていない個人のパネルのＳＳＣＰ分析においては見られなかった。さらに、突然変異が同定されたすべてのＢＮＦＣ家族においては、突然変異は疾患状況と完全に分離することが示された。血縁３９３３におけるスプライシング部位突然変異の場合においては、発端者のみをサンプリングした。この分離の例を、血縁１５０４において同定された２塩基対挿入について図４に示すが；該血縁のすべての１１の影響されたメンバーはＳＳＣＰ変異型を有し、すべての７の影響されていない個人は野生型ＳＳＣＰバンドを有していた。
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ＫＣＮＱ２突然変異を有することがより最近見出された４の家族（Ｋ１５２５、Ｋ３９６３、Ｋ４４４３およびＫ４５１６）のうちの３（Ｋ１５２５、Ｋ４４４３およびＫ４５１６）が直接配列決定を介して見出され、他の影響されたメンバーが実験に利用可能であった場合の家族においては突然変異が共分離していた。Ｋ３９６３における突然変異はＳＳＣＰスクリーニングを介して見出され、この突然変異は７０の正常、すなわち非ＢＦＮＣ個人のパネルにおいては検出されなかった。この突然変異は、家族Ｋ３９６３における影響された個人と共分離することが見出された。野生型遺伝子には、配列番号：１の塩基２７２７−２７３６の２セットのＧＧＧＣＣが含まれていた。Ｋ３９６３において見出された配列は、この領域へのＧＧＧＣＣの挿入の結果として、３セットのＧＧＧＣＣが存在した。これにより、最初の８７０アミノ酸の野生型につづくさらなる６０アミノ酸の新たな配列（野生型のアミノ酸残基８７１および８７２は該６０のさらなるアミノ酸残基の最初の２残基によって置換されている）をコードする遺伝子となった。５塩基の挿入を含む遺伝子を配列番号：９５に示し、この突然変異遺伝子によってコードされるタンパク質を配列番号：９６に示す。
家族Ｋ４４４３は６のＢＦＮＣに影響された個人を有し、これらの個人のうちの２は加えて小児期の後期に発作を有し、これは中側頭葉スパイク（centrotemporal spike）を有する良性癲癇（ＢＥＲＳ）、またはローランド癲癇として分類される。この家族における２の影響された個人のＤＮＡを調べた。ＢＦＮＣのみを発現する影響された個人のうちの１ならびに、新生児発作後の小児期後期に発症する、ＢＮＦＣおよびＢＥＲＳまたはローランド癲癇の双方を有する１の個人において、Ｑ３２３終止突然変異が見出された。この知見は、ローランド癲癇の原因となっている第２０染色体上のＫＣＮＱ２遺伝子を直接的に意味している。ローランド癲癇またはＢＥＲＳは通常の小児癲癇であり、全就学年齢癲癇の２５％を占め得る。これは、低い浸透度を有する常染色体優性として遺伝する遺伝疾患である。幾つかの遺伝子がローランド表現型を引起こし得るという可能性はあるが、この知見は、少なくとも幾つかのローランド癲癇が、潜在的に重要な知見であるＫＣＮＱ２中の欠陥によって発症されるであろうことを強く示唆している。
ＫＣＮＱ２遺伝子中に、２の中間多型が同定された。１の多型はＳ６貫膜ドメインのコドン３０４（ＴＴＣからＴＴＴ）に存在し、各々異型接合である７１のコントロールのうちの１０において見られた（７.０％の対立遺伝子頻度）。第２の多型は３'領域中のコドン５７３（ＧＣＣからＧＣＴ）に存在し、異型接合としての８７のコントロール個人のうちの１において認められた（０.５７％の対立遺伝子頻度）。
ＫＣＮＱ２の保存された３'領域中のスプライシング部位突然変異および２のフレームシフト突然変異（１はポア領域に存在し、１は高度に保存された３'領域の前に存在する）が変質タンパク質生成物に通じることが予想される。２８３ｉｎｓＧＴポア突然変異の場合においては、予想停止コドンは３６アミノ酸下流に見出され、５２２ｄｅｌ１３ ３'突然変異の場合においては、予想停止コドンは２アミノ酸下流に見出された。また、２塩基対の挿入突然変異、２８３ｉｎｓＧＴも、完全に変質したＳ６貫膜ドメインに通じるであろう。血縁１５４７欠失の終止点は決定されていないが、ＲＦＬＰマーカー遺伝子座、Ｄ２０Ｓ２４を含む１２ｋｂプラスミドがＫＣＮＱ２遺伝子の高度に保存された３'領域からの８０コドン（ＫＣＮＱ２の残基５０９から５８８）の配列を含むことが知られており、これは、血縁１５４７の影響された個人においては該遺伝子の少なくともこの部分が欠失していることを示している。家族Ｋ３９０４およびＫ１７０５における２のミスセンス突然変異は、鍵となる機能ドメイン、ポアおよびＳ６ドメイン中のアミノ酸残基を変化させる。
現在までに、１０のユニークな突然変異がＫＣＮＱ２中に同定されている。血縁３３６９のアミノ酸５２２における１３塩基対欠失によって定義される突然変異は、典型的なＢＦＮＣ家族と比較した場合に、この家族内の報告されている臨床的な発症年齢により大きな変動が存在する点において興味深い。血縁３３６９においては、３の個人が生後の最初の２週間以内の発作の発症を有する一方、３の個人が３、４および５月齢の発作の最初の発症を有していた。
ＢＦＮＣ血縁１７０５中の突然変異は、Ｓ６貫膜セグメント中のアラニンからスレオニンへの置換である。このアラニン残基は、現在までに同定されているカリウムチャンネルのShaker、Shab、ShawおよびShalサブファミリーのすべてのメンバーにおいて保存されている（Lopezら、1994；Nakamuraら、1997；Tytgat、1994）。ＫＣＮＱ２イオンチャンネル遺伝子が最も密接に関係するＫＣＮＱ１遺伝子も、このポジションにアラニンを含んでいた。６の無関係ＬＱＴ１家族においては、疾病を引起こす突然変異はこの同一ポジションで起こっており、アラニンがバリンに変化していた（Wangら、1996；Russellら、1996）。このＳ６貫膜ドメインはShakerサブタイプにおけるＫ+イオン透過性に関与することが示されており（Lopezら、1994）、ＫＣＮＱ２においても同様な機能を供し得る。１３ｂｐの欠失、スプライシング部位突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異および挿入がすべて分離ＢＦＮＣ家族に癲癇性表現型を起こすため、Ｃ−末端領域は遺伝子機能について重要であるようである（表２および図３を参照されたし）。興味深いことには、この同一の領域は、ＬＱＴのジャーヴィル・ランゲ・ニールセン劣性形態および関連する難聴を有する個人においてＫＣＮＱ１中に欠失−挿入突然変異を有することが知られている（Neyroudら、1997）。Ｃ−末端領域中の疾病を引起こす突然変異は、より短いＨＮＳＰＣクローンよりもＫＣＮＱ２遺伝子によってコードされる機能性タンパク質をさらに主張している。
同一の構造クラスに属するＫ+イオンチャンネルのポア領域は、突然変異分析によって広範に特徴付けられている。血縁１５０４において認められた２塩基対挿入は、普遍的に保存されているＧＹＧモチーフの直後に生じていた。ここにおける挿入は、機能に非常に重要であると考えられるポアの長さ（Nakamuraら、1997；Tytgat、1994）を変化させるばかりでなく、ポアの特徴配列も変質させ、切頭タンパク質を生成する。
ＢＦＮＣの第２０染色体形態に連鎖している家族の幼児においては、ＥＥＧ記録は脳全体にわたる活性の初期抑制につづくスパイクおよび遅い波の全身化された放電を示した（Ronenら、1993；Plouin、1994；HauserおよびKurland、1975）。したがって、ＫＣＮＱ２遺伝子が成人の複数の脳領域において発現されているということが見出されたことは驚くべきことではない。皮質領域、ならびに視床および尾状核のごとき皮質下領域には、複数のサイズのＫＣＮＱ２転写物が含まれていた（データは示さず）。この発現パターンは、新生児においても同一である可能性がある。
ＫＣＮＱ１およびシイ・エレガンスのｎＫＱＴ１遺伝子に対するＫＣＮＱ２の接近したホモロジー（アミノ酸の６０％同一性および７０％類似性）、ならびにShaker、Shab、ShawおよびShalサブファミリーに対するこれらのチャンネルの低いホモロジーは、それらが、ＫＱＴ−様と呼ばれるＫ+イオンチャンネルのユニークなファミリー（Weiら、1996）に属することを意味している。脳において発現されていることがここに知られた新たなＫ+イオンチャンネルは、この遺伝子ファミリーのさらなる発見されていないメンバーが他の形態の強直性−ミオクローヌス痙攣を伴う突発性の全身性化癲癇の原因となり得るのかという疑問を生じさせる。進展の早期に見られる同様の突発性発作疾患は、良性家族性新生児痙攣（ＢＦＩＣ）である。ＢＦＩＣにおいては、発作は４〜８月齢に始り、数年後に緩解する。ＢＦＩＣは５のイタリア人家族において染色体１９ｑにマッピングされている（Guipponiら、1997）。Ｋ+イオンチャンネルのＫＱＴ−様ファミリーの未だ同定されていないメンバーにおける突然変異によってか、またはminＫ−様タンパク質によっても、ＢＦＩＣが引起こされると仮定することは妥当である。
実施例７
体細胞ハイブリッド・パネル遺伝子型決定
非常に相同性の高い貫膜タンパク質ドメイン中のＫＣＮＱ２とＫＣＮＱ３との間のイントロン−エキソン境界の推定保存を利用して、利用可能なＥＳＴ配列からイントロンを横切るプライマー対（プライマーＡ：5’−TTCCTGATTGTCCTGGGGTGCT−3’（配列番号：８）、プライマーＢ：5'−TTCATCTTTGGAGCCGAGTTTGC−3’（配列番号：９））を設計した。増幅させたフラグメントはヒト（１.８ｋｂ）中ならびにげっ歯類（８００ｂｐ）ゲノミックＤＮＡ中のイントロンを含む。このプライマーを用いて、コリエル（Coriell）パネルを増幅させた。反応は、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2緩衝液中の５０ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer社製）、１０ｐｍｏｌの各プライマー、３ｎｍｏlの各デオキシリボヌクレオチドを用いて２５μＬ容積で行った。サイクル条件は９４℃にて４分間、ついで：９４℃にて３０秒間の変性、５８℃にて３０秒間のアニーリングおよび７２℃にて１.５分間の伸長の３０サイクルにつづく７２℃にて１０分間の最終伸長であった。ＰＣＲ産物は１.５％アガロースゲル中で電気泳動した。
実施例８
第８染色体放射ハイブリッドパネル
ＨＳＡ８放射ハイブリッドパネル（Lewisら、1995）を、特異的ヒト・イントロン性プライマー（プライマーＤ：5’−TCCATGTGGTACTCCATGTCTGAA−3’（配列番号：１０）、プライマーＥ：5’−GCACGTCACATTGGGGATGTCAT−3’（配列番号：１１））を用いて遺伝子型決定した。ＰＣＲ産物の長さは１９０ｂｐであった。反応は、１.５ｍＭのＭｇＣｌ2緩衝液中の１００ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび１単位のＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社製）、１０ｐｍｏｌの各プライマー、３ｎｍｏｌの各デオキシリボヌクレオチドを用いて２５μＬ容積で行った。サイクル条件は、９４℃にて４分間、ついで：９４℃にて３０秒間の変性、６２℃にて３０秒間のアニーリングおよび７２℃にて３０秒間の伸長の３０サイクルにつづく７２℃にて１０分間の最終伸長であった。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル中で電気泳動した。遺伝子型決定データは、ＲＨＭＡＰ Ｖ２.０１プログラム（Boehnkeら、1991）によって解析した。
実施例９
完全長ｃＤＮＡ
完全長ＫＣＮＱ３ ｃＤＮＡを同定するために、利用可能なＥＳＴ配列からのプライマーを用いてアダプター−連結胎児および成人脳ｃＤＮＡ（Clontech社製）上で５'および３'ＲＡＣＥを行った。ＲＡＣＥ実験に用いたプライマーを表３に掲載する。ＰＣＲ産物をサブクローン化（T／A cloningR Kit，Invitrogen社製）し、双方の鎖をＡＢＩ３７７機器上で配列決定した。
実施例１０
ゲノム系統化／イントロン−エキソン境界
ＢＡＣゲノミックライブラリーを（コリエル・パネルについて記載したごとく）ＰＣＲによってスクリーニングし、３の重複するゲノミック・クローンを単離した。ゲノミック・ヒトＤＮＡおよび／またはＫＣＮＱ３遺伝子を含むＢＡＣゲノミック・クローンに対するエキソン−エキソンＰＣＲによって得た生成物をクローニング（T／A cloningR Kit，Invitrogen社製）し、配列決定（ＡＢＩ３７７）することによって、イントロン／エキソン境界を同定した。
Figure 0005328603
実施例１１
ＳＳＣＰ分析ならびに突然変異および多型対立遺伝子の特徴付け
ＫＣＮＱ３のコード領域の６０％を、利用可能な場合にはイントロン内のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅させ、Novex ThermoflowTMプロトコール（Novex社製，San Diego，CA）に記載されているごとく４℃にて流す２０％ＴＢＥゲルを用いるＳＳＣＰ（Novex社製）によって分析した。ＳＳＣＰ多型を示しているＰＣＲ産物をクローン化（T／A cloningR Kit，Invitrogen社製）し、９のクローンを色素−プライマー化学を用いるＡＢＩ３７３または３７７上で配列決定し、SequencherTM３.０プログラムを用いて解析した。
実施例１２
ＫＣＮＱ３遺伝子の特徴付け
ＫＱＴ−様ファミリーは、電圧ゲートカリウムチャンネルの最近特徴付けされたファミリーである（Weiら、1996）。現在まで、第２０染色体ＢＦＮＣ疾患において突然変異した遺伝子である（本開示で記載する）ＫＣＮＱ２と、ならびに長時間ＱＴ症候群およびジャーヴィル・ランゲ・ニールセン心臓音響症候群の原因となる第１１染色体遺伝子（Neyroudら、1997）であるＫＣＮＱ１とのみがこのファミリーに属することが知られている。おそらくは他のタイプのＩＧＥに含まれるそのファミリーの新たなメンバーを同定するために、ｔＢＬＡＳＴｘ（Altschulら、1990）検索を、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースに対してＫＣＮＱ２完全長ｃＤＮＡを用いて開始した。ＫＣＮＱ２と有意なホモロジーを示した５のヒトＥＳＴクローン（クローンＩＤ：１−３６２０７９、２−２２２３２４、３−３６３２１５、４−３８８２２、５−４５６３６；Hillierら、未公開データ）を同定した。興味深いことには、これらのクローンは２の異なるｃＤＮＡライブラリー：網膜（１−３）および幼児脳（４−５）（Soaresら、1994）から得られ、２の非重複コンティグ（１−３）および（４−５）に系統化することができた。ここに、２のコンティグが同一の遺伝子、ＫＣＮＱ３に属することが示された。
新たな遺伝子の特徴付けにおける最初の工程は、ＥＳＴのゲノム位置決定であった。市販の体細胞ハイブリッドパネル（コリエル・パネル（Drwingaら、1993））を用いて、ＫＣＮＱ３がＨＳＡ８上にマッピングされた。割当てを明確にするために、第８染色体遺伝子座の直線順序およびマーカー間距離を決定するために以前に構築された９７の放射ハイブリッドのパネル（Lewisら、1995）を遺伝子型決定した。特異的なヒトイントロン性プライマーを用い、遺伝子座の存在または不存在についてＰＣＲによって各ＲＨを評点付けした。そのデータを、他の第８染色体マーカーにつき収集した結果ついて、ＲＨＭＡＰ Ｖ２.０１を用いて解析した。ＲＨパネル中のＫＣＮＱ３についての保持頻度は１１.７％であった。ＫＣＮＱ３遺伝子座の緊密な連鎖は、染色体バンド８ｑ２４に以前にマッピングされたマーカーで認められた。最も緊密な連鎖はマーカーＤ８Ｓ５５８で示された（ＬＯＤ１３.８７、０.０４７ Ｒ5000のθ）。得られたＲＨ地図を図５に示す。ＫＣＮＱ３遺伝子座のポジションは、以前に第８染色体ＢＦＮＣファミリーに連鎖されたマーカー（Lewisら、1993）によって画定される間隔に位置決定され、これによって、ＫＣＮＱ３は第８染色体ＢＦＮＣ遺伝子座の非常に強力な位置候補となった。第２のカフカス人家族も、同一のマーカーに対する示唆に富む連鎖を示した（Steinleinら、1995）。
部分的ｃＤＮＡ配列は、一連のｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）実験によって得た。５’および３’ＲＡＣＥは、以前に同定された２のＥＳＴコンティグ由来のプライマーを用いて成人および胎児の脳マラソン−レディー（Marathon−Ready）ｃＤＮＡ（Clonetech社製）を増幅させることによって行った。プライマー対を表３に示す。これを用いて、ＫＣＮＱ３のマウス・ゲノミック相同物を精製した。イントロン／エキソン連結部を含むマウス配列を決定した後に、マウス配列に基づくプライマーを用いてＫＣＮＱ３についてのヒトｃＤＮＡの残部をクローン化した。ヒト遺伝子の５'末端を増幅させるために用いたプライマーは、CGCGGATCATGGCATTGGAGTTC（配列番号：９３）およびAAGCCCCAGAGACTTCTCAGCTC（配列番号：９４）であった。完全なＫＣＮＱ３のｃＤＮＡ配列（配列番号：６）は、６の推定貫膜ドメイン、ポア領域、停止コドン、およびポリＡ+テイルを含む３'非翻訳領域を有する８７２アミノ酸のタンパク質をコードする（配列番号：７）。このタンパク質は、アミノ酸１０１から停止コドンまでの領域でＫＣＮＱ２と（ＢＬＡＳＴを用いて算出して）５８％の類似性および４６％の同一性を示し、また、ＫＣＮＱ１（Yangら、1997）ならびにシイ・エレガンス相同物ｎＫＱＴ１（Weiら、1996）とも高度に保存されていた。配列の比較を図３に示す。２のＥＳＴコンティグは、各々、ＫＣＮＱ３のアミノ酸８６−２６５および４７７−５７５と同一であった（図３を参照されたし）。
ＫＣＮＱ３が第８染色体ＢＦＮＣ表現型の原因となる遺伝子であるか否かを試験するために、表現型がよく特徴付けされた３世代のメキシコ人−アメリカ人ＢＦＮＣ家族の１の影響された個人において突然変異を探索した（Ryanら、1991）（図６を参照されたし）。そのファミリーは、（Ｄ８Ｓ２８４に近位の）マーカーＤ８Ｓ１９８および（Ｄ８Ｓ２５６に遠位の）Ｄ８Ｓ２７４によって広がる間隔内の染色体８ｑ２４（Ｚ＝４.４３）上の多点連鎖解析によってマッピングされている（図５を参照されたし）（Lewisら、1993；Dibら、1996）。この染色体領域がＫＣＮＱ３遺伝子座を含むことをここに示す。現在まで、イントロン性プライマーを用いて、６の貫膜ドメインならびにポア領域を含むＫＣＮＱ３のコード領域の６０％が冷ＳＳＣＰ法によってスクリーニングされている。１のＳＳＣＰ変異型は、貫膜ドメインＳ５およびポアの半分を含む１８７ｂｐのＰＣＲフラグメント中に同定された。このフラグメントを調製するために用いたプライマーは：（配列番号：６のヌクレオチド８０１−８２３に相当する）Ｒｅｔ.６ａ 5'−CATCACGGCCTGGTACATCGGTT−3'（配列番号：１８）およびＨｅｂｎ２.３ｂ 5'−AATCTCACAGAATTGGCCTCCAAG−3’（配列番号：１９）であった。Ｒｅｔ.６ａプライマーはコンティグ領域から得られ、Ｈｅｂｎ２.３ｂプライマーはイントロン性領域から得た。このＳＳＣＰ変異型はＢＦＮＣ表現型と完全に共分離するものであって、それは疾患−マーカー・ハプロタイプを運搬している単一の非−浸透個人においても存在する（図６）。さらに、このＳＳＣＰ変異型は、コントロール群として用いた無関係の個人である７２のカフカス人および６０のメキシコ人−アメリカ人のパネル（２６４の染色体）から欠けていた。この変異型のヌクレオチド変化を特徴付けするために、１の影響された個人のＰＣＲ産物をクローン化し、９のクローンを双方の鎖に対して配列決定した。４のクローンが野生型対立遺伝子を含んでおり、５のクローンが突然変異対立遺伝子を含んでいた。突然変異は、高度に保存されたポア領域のポジション３１０における単一のミスセンス突然変異（Ｇｌｙ（ＧＧＣ）からＶａｌ（ＧＴＣ））であった（当該突然変異は配列番号：６の塩基９４７で発生している）。加えて、サイレント多型（０.４％の頻度）が、Ｌ２７８の貫膜領域Ｓ５において１のメキシコ人−アメリカ人コントロールにおいて見出された（ＣＴＴ→ＣＴＣ）（多型は配列番号：６の塩基８５２に存在する）。ＫＣＮＱ３中には４の他の多型も見られた。これらは、Ｎ２２０（ＡＡＣまたはＡＡＴ）、Ｇｌｙ２４４（ＧＧＴまたはＧＧＣ）、Ｌ３５７（ＣＴＧまたはＣＴＣ）およびＩ８６０（ＡＴＴまたはＡＴＣ）に存在した。これらの多型は、各々、配列番号：６の塩基番号６７８、７５０、１０８９および２５９８に存在した。
加えて、若年性ミオクローヌス癲癇を有する数人の個人発端者を、ＳＳＣＰを用いてスクリーニングした。ＪＭＥは遺伝性小児発作疾患である。ＫＣＮＱ３は、試験した１の個人で突然変異していた。突然変異はコドン４１２を分裂させるイントロン中に存在する択一的にスプライシングされたエキソンで見出された。この択一的にスプライシングされたエキソンは、ＲＡＣＥ実験後に成人脳で見出された。このエキソンは配列番号：９２である。該エキソンはClontech社から得た成人脳ｃＤＮＡクローンにおいて見られた。このエキソンは、３の倍数ではない１３０ヌクレオチド長である。したがって、このエキソンの存在は余分のアミノ酸配列を付加するのみならず、遺伝子の正常なコード領域内の停止コドンとなるフレームシフト（１の余分の塩基）も生じる。ＪＭＥ発端者において見出された突然変異は、択一的にスプライシングされたエキソン中の１塩基対欠失（配列番号：９２の塩基１１８のＧの欠損）であり、これは、択一的エキソンから野生型のアミノ酸残基４１２および４１３の間にさらなる４３アミノ酸残基を有するＫＣＮＱ３を生じるフレームに戻るフレームシフトを生じ、したがってＪＭＥ発端者の脳細胞中のタンパク質を変質させる。この欠失を有する患者は、癲癇を有する母親を有するが、この特定の突然変異は父親からのものであって、母親からのものではない。ＪＭＥは一般的な、遺伝性の小児癲癇であって、恐らくはＫＣＮＱ３のみならず他の遺伝子中の欠陥によっても引起こされる。
この知見は、３のＫＱＴ−様ファミリーのヒトメンバー数（そのうちの２は脳で、１は心臓で発現している）に導いた。３のすべてのＫ+チャンネル遺伝子における欠陥は、興奮の変化した調節に関連するヒト疾患を引起こした。すべてのこれらの知見を考え合わせると、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３、ならびに同一ファミリーの発見されていない遺伝子または同一経路に属する遺伝子がＩＧＥに含まれているという強い証拠が存在した。これらのＫＱＴ−様Ｋ+チャンネル遺伝子ならびに異なるファミリーに属する他のＫ+チャンネル遺伝子を、通常のタイプのＩＧＥを有する個人における突然変異についてスクリーニングすれば、疾病を引起こす遺伝子を同定するための強力な別法となるであろう。これは、ＩＧＥ疾病血縁において記載されている（Leppertら、1993）困難かつ論争されている仮の連鎖を得るのに特に適法である。
実施例１３
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に対するポリクローナル抗体の生成
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３コード配列のセグメントを、イー・コリ（E.coli)中で融合タンパク質として発現させた。過剰発現させたタンパク質をゲル溶出によって精製し、これを用いて、HarlowおよびLane、1988によって記載されている手法と同様の手法を用いてウサギおよびマウスを免疫化した。この手法は、種々の他のタンパク質に対するＡｂを生成することが示されている（例えば、Kraemerら、1993を参照されたし）。
要約すると、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３コード配列のストレッチをプラスミドＰＥＴ５Ａ（Novagen，Inc.社製，Madison，WI）中に融合タンパク質としてクローン化した。ＩＰＴＧで誘導した後に、予想分子量を有する融合タンパク質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確かめた。融合タンパク質を電気溶出によってゲルから精製した。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３融合産物としてのタンパク質の同定は、Ｎ−末端のタンパク質配列決定によって確かめた。ついで、精製したタンパク質をウサギにおける免疫原として用いた。ウサギは、フロイント完全アジュバント中の１００μｇのタンパク質で免疫化し、３週間隔で２回追加免疫（１回目のフロイント不完全アジュバント中の１００μｇの免疫原につづくＰＢＳ中の１００μｇの免疫原）した。抗体を含む血清をそれから２週間後に採取した。
この手法を繰返して、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３遺伝子産物の突然変異形態に対する抗体を生起させた。野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に対する抗体と共にこれらの抗体を用いて、種々の組織および生物流体中の突然変異形態の存在および相対レベルを検出した。
実施例１４
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に対して特異的なモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体は以下のプロトコールに従って生成した。よく知られているごとくグルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてスカシガイ・ヘモシアニンにコンジュゲートさせた無傷ＫＣＮＱ２、無傷ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ２ペプチドまたはＫＣＮＱ３ペプチド（野生型または突然変異）を含む免疫原でマウスを免疫化した。
免疫原はアジュバントと混合した。各マウスには、１０ないし１００μｇの免疫原を投与し、４回目の注射の後にマウスから血液試料を採取して、血清が免疫原に対する抗体を含んでいるかを判定した。血清価はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって決定した。免疫原に対する抗体が存在することを示す血清を有するマウスを、ハイブリドーマ作成用に選抜した。
免疫マウスから脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製した（HarlowおおびLane、1988を参照されたし）。細胞融合は、実質的に、KohlerおよびMilstein、1975によって記載されているごとく行った。要約すると、P３.６５.３ミエローマ細胞（American Type Culture Collection，Rockville，MD）を、HarlowおよびLane、1988によって記載されているごとくポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細胞と融合させた。細胞は、２×１０5細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレートに平板した。個々のウェルを増殖性について調べ、増殖性であるウェルの上清を、野生型または突然変異ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３標的タンパク質を用いたＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって、ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３特異的抗体の存在について試験した。陽性ウェル中の細胞を広げ、サブクローン化して、モノクローナル性を確立し、確認した。
望ましい特異性を有するクローンを広げ、マウス中または中空ファイバー系中の腹水として増殖させて、特徴付けおよびアッセイを進めるのに十分な量の抗体を生成させた。
実施例１５
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３についてのサンドイッチ・アッセイ
モノクローナル抗体は、プレート、チューブ、ビーズまたは粒子のごとき固体表面に結合させた。好ましくは、該抗体は９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル表面に結合させる。ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ペプチド／タンパク質（野生型または突然変異）を含有する１００μＬの試料（例えば、血清、尿、組織サイトゾル）を固相抗体に添加した。その試料を室温にて２時間インキュベートした。ついで、試料流体をデカンテーションし、固相を緩衝液で洗浄して結合しなかった物質を除去した。（ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ペプチド／タンパク質上の異なる決定基に対する）１００μＬの第２モノクローナル抗体を固相に添加した。この抗体を検出分子（例えば、125Ｉ、酵素、発蛍光団または発色団）で標識し、第２抗体を有する固相を室温にて２時間インキュベートした。第２抗体をデカンテーションし、固相を緩衝液で洗浄して結合しなかった物質を除去した。
試料中に存在するＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ペプチド／タンパク質の量に比例する、結合した標識の量を定量化した。野生型ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３に対して特異的であるモノクローナル抗体ならびにＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３中に同定された各突然変異に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて、別のアッセイを行った。
実施例１６
ＫＣＮＱ２またはＫＣＮＱ３ Ｋ+チャンネルに作用する薬剤をスクリーニングするためのアッセイ
ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が各々カリウムチャンネルを形成するという知見を用いれば、ここに、これらのチャンネルの一方または双方に作用を有するであろう薬剤をスクリーニングするためのアッセイを考案することが可能である。遺伝子を卵母細胞または哺乳動物細胞にトランスフェクトし、前記のごとく発現させた。トランスフェクションに用いた遺伝子がＢＦＮＣ、ローランド癲癇またはＪＭＥを引起こす突然変異を含む場合には、野生型遺伝子のみを用いたトランスフェクションと比較して、誘導電流における変化が見られた。薬剤候補をトランスフェクト細胞の浴溶液（bathing solution）に添加して、誘導電流に対する該薬剤候補の効果を試験した。野生型ＫＣＮＱ２または野生型ＫＣＮＱ３で同時トランスフェクトした細胞で見られる電流に近いように、誘導電流を変化させる薬剤候補は、ＢＮＦＣ、ローランド癲癇、またはＪＭＥを治療するのに有用である。
実施例１７
突然変異につきＫＣＮＱ２の各エキソンをスクリーニングするためのプライマー対
ゲノミックＫＣＮＱ２をイントロン／エキソン境界で配列決定し、各エキソンを増幅させるのに有用なプライマー対を開発した。これらのプライマー対を表４に示す。エキソン１３および１７については、エキソン内のプライマーも利用した。幾つかのエキソン／イントロン配列を図７Ａ−Ｏに示す。
実施例１８
ＫＣＮＱ３のイントロン配列およびＫＣＮＱ３のエキソンを増幅させるためのプライマー対
ＫＣＮＱ３に対する完全ｃＤＮＡを得て配列決定したが、完全なゲノミックＤＮＡはいまだ配列決定されていない。しかしながら、イントロンＤＮＡの多くが配列決定されており、この配列情報を利用して各エキソンを増幅させるのに有用であるプライマー対が開発されている。イントロン／エキソン配列を図８Ａ−Ｏに示す。当業者であれば図８Ａ−Ｏに示すイントロン配列を用いて他のプライマーも容易に開発できるが、各エキソンを増幅させるための幾つかの有用なプライマー対を表６に示す。
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本発明の好ましい具体例の詳細に参照することによって本発明を本特許出願に開示してきたが、当業者であれば本発明の趣旨および添付する請求の範囲の範囲内で修飾を容易に思い付くであろうため、該開示が限定する意味におけるものではなく説明を意図するものであることは理解されなければならない。
参考文献のリスト
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米国特許第5,550,050号
米国特許第5,691,198号
米国特許第5,735,500号
米国特許第5,747,469号

Claims (7)

  1. プローブをＤＮＡまたはＲＮＡのヒト患者試料にハイブリダイズさせることを含む、家族性新生児痙攣（ＢＦＮＣ）に関連するまたは対象をＢＦＮＣの危険性にさらす突然変異の検出方法であって、ここに、
    ａ．プローブは、突然変異体ＫＣＮＱ３核酸の全てまたは一部にハイブリダイズする核酸であり；
    ｂ．プローブは、該突然変異を含む核酸の全てまたは一部への該プローブのハイブリダイゼーションを可能にするが、野生型ヒトＫＣＮＱ３への該プローブのハイブリダイゼーションを妨げるストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ここに、ハイブリダイゼーションシグナルの存在が該突然変異の存在を示す；および
    ｃ．突然変異は、配列番号：１８および配列番号：１９を用いて調製された増幅産物のヌクレオチド１４７のＴである
    ことを特徴とする該方法。
  2. ＢＦＮＣに関連するまたはヒト対象をＢＦＮＣの危険性にさらす突然変異の検出方法であって、ここに、
    ａ．該方法は、該突然変異の存在を同定する手段により行われ；
    ｂ．該手段は、該突然変異につき検定するために一本鎖立体配座多形技術を用いることを含み；および
    ｃ．該突然変異は、配列番号：１８および配列番号：１９を用いて調製された増幅産物のヌクレオチド１４７のＴの存在である
    ことを特徴とする該方法。
  3. 該一本鎖立体配座多形技術が、増幅された核酸を用い、ここに、該増幅された核酸が配列番号：１８および配列番号：１９のプライマーを用いて調製された請求項２記載の方法。
  4. ＢＦＮＣに関連するまたは対象をＢＦＮＣの危険性にさらす突然変異の検出方法であって、ここに、
    ａ．該方法は、該突然変異の存在を同定する手段により行われ；
    ｂ．該手段は、ヒトＫＣＮＱ３の全てまたは一部を配列決定することを含み；および
    ｃ．該突然変異は、配列番号：１８および配列番号：１９を用いて調製された増幅産物のヌクレオチド１４７のＴの存在である
    ことを特徴とする該方法。
  5. ＢＦＮＣに関連するまたは対象をＢＦＮＣの危険性にさらす突然変異の検出方法であって、ここに、
    ａ．該方法は、該突然変異の存在を同定する手段により行われ；
    ｂ．該手段は、ヒトＫＣＮＱ３に対するＲＮＡｓｅ保護アッセイを行うことを含み；および
    ｃ．該突然変異は、配列番号：１８および配列番号：１９を用いて調製された増幅産物のヌクレオチド１４７のＴの存在である
    ことを特徴とする該方法。
  6. ヒトＫＣＮＱ３遺伝子の核酸配列における突然変異または欠失の存在を検出する方法であって、
    ａ．ヒトＫＣＮＱ３遺伝子を含むテスト試料を分析し；
    ｂ．配列番号：６を含むＫＣＮＱ３遺伝子を含む対照試料を分析し；
    ｃ．テスト試料の分析結果と対照試料の分析結果とを比較し、ここに、テスト試料と対照試料との差の存在の検出は、テスト試料中のＫＣＮＱ３遺伝子の核酸配列における突然変異または欠失の存在を示し；
    ｄ．突然変異は、ＢＦＮＣに関連するまたは対象をＢＦＮＣの危険性にさらし；および
    ｅ．突然変異は、配列番号：１８および配列番号：１９を用いて調製された増幅産物のヌクレオチド１４７のＴの存在である
    ことを特徴とする該方法。
  7. ヒトＫＣＮＱ３ポリペプチドをコードする核酸配列における突然変異または欠失の存在を検出する方法であって、
    ａ．ヒトＫＣＮＱ３ポリペプチドをコードする核酸を含むテスト試料を分析し；
    ｂ．配列番号：７を含むＫＣＮＱ３ポリペプチドをコードする核酸を含む対照試料を分析し；
    ｃ．テスト試料の分析結果と対照試料の分析結果とを比較し、ここに、テスト試料と対照試料との差の存在の検出は、テスト試料中のＫＣＮＱ３ポリペプチドをコードする核酸における突然変異または欠失の存在を示し、
    ｄ．突然変異は、ＢＦＮＣに関連するまたは対象をＢＦＮＣの危険性にさらし；および
    ｅ．突然変異は、配列番号：７のアミノ酸残基３１０のバリンである
    ことを特徴とする該方法。
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