JP5308787B2 - 機能性rna−蛋白質複合体の分子デザイン - Google Patents
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Description
Ikawa et al.Proc Natl Acad Sci U S A.;101(38):13750−5, 2004 Atsumi et al. EMBO Journal, 20, 5453, 2001 Saito et al. Journal of Biotechnology,132,1,1−7 2007
本発明において、RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列とは、RNA−蛋白質複合体における、RNAと蛋白質との相互作用部位の、RNA側の塩基配列をいう。また、本発明において、RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とは、RNA−蛋白質複合体における、RNAと蛋白質との相互作用部位の、蛋白質側のアミノ酸配列をいう。
本発明者らは天然のRNA−蛋白質間相互作用に着目し、これらを活用することによって、蛋白質を基盤上に並べる従来の手法では困難とされる、蛋白質およびRNA双方の機能及び構造を損なわずに3次元的にそれらの距離や配向を制御する方法を構築し、本発明を完成するに至った。
[typeE RNA及びその変異体の作製]
Type E RNA(配列番号3)は、T7プロモーターを含むセンス側のプライマーとそれとハイブリダイズするアンチセンス側のプライマーの2本(配列番号4、5)を、グラディエントマスターサイクラー(エッペンドルフ社製)を用いて、ハイブリダイズ、伸張させた。100μL反応液には、各100μM DNAプライマー 2μL、2.5mM dNTPを8μL、Ex taq 10×バッファー 10μL、Ex taq DNAポリメラーゼ(TAKARA製)0.5μLが混合してあり、94℃ 1分、63℃ 30秒、72℃ 1分を10サイクルで行った。反応後、フェノール処理、ジエチルエーテル処理、エタノール沈殿を行い、20μLの超純水に溶解し、転写の鋳型として用いた。後述するEMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)に用いる際に32Pで放射性標識する場合には、反応は、40mM Tris・Cl(pH7.5),5mM DTT,1mM スペルミジン,5mM MgCl2,1.25mM ATP,1.25mM CTP,1.25mM UTP,0.25mM GTP,[32P−α]GTP (PerkinElmer製),20U RNase inhibitor(TOYOBO製),T7 RNA polymerase条件下、37℃、3時間から一晩で行った。FRET測定に用いる際に放射性標識しない場合には、同じ鋳型DNAを用いて、MEGAshortscript(商標)(Ambion製)を用いて、転写反応を行った。MEGAshortscriptを用いた転写反応は以下の通りである。超純水に溶解した鋳型DNA 8μL、T7 10×Reaction Buffer 2μL、T7 ATP Solution(75mM) 2μL(CTP、GTP、UTPに関しても同様)、T7 Enzyme Mix 2μLを混合した全20μLを37℃で2時間から一晩反応させた。
初めにλN遺伝子とHIV Rev遺伝子を、制限酵素XbaIおよびBamHIで切断したpET−3aベクター(Novagen製)にRapid DNA Ligation Kit(ロシュ・ダイアグノスティックス製)を用いて連結した。このプラスミドをそれぞれKpnIおよびBamHI、XbaIおよびKpnIで切断し、同じ制限酵素で切断したYFP遺伝子とCFP遺伝子をそれぞれ連結することによりpλN−YFP及びpCFP−Revを得た。ここで、CFPもしくはYFP遺伝子は、pECFPもしくはpEYFPプラスミド(いずれもClontech製)からPCRで増幅した。また、pN−YFPおよびpCFP−RevプラスミドはC末端にヒスチジンタグ(His×6)が挿入されている。なお、CFPとRevならびにNとYFPを融合する際、両蛋白質の間にリンカー部位グリシン、トレオニンが導入されている。これは、発現ベクターに制限酵素部位を導入するためであり、リンカー部位の塩基配列は制限酵素KpnIの切断部位を含んでいるからである。続いて、リンカーのアミノ酸配列をアラニン4残基に変更した方法について述べる。まず、適切な塩基配列を持つプライマー(配列番号28、29、31、32)を用いてPCRを行い、改変したリンカーを連結させたλN遺伝子およびRev遺伝子を増幅した。PCR後、λN遺伝子はXbaIとKpnIを用いて、Rev遺伝子はKpnIとBamHIを用いて切断し、それぞれを同じ制限酵素で切断したpN−YFPまたはpCFP−Revに連結して発現ベクターを得た(配列番号27、30)。
反応は最終濃度が20nM RNA、20mM Tris・Cl、80mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.001U/mL tRNA、10% Glycerol、0〜2000nM蛋白質となるよう、以下の条件で行った。まず32Pで標識した100nM RNA 4μLを90℃ 5分で変性した後、5×binding buffer(100mM Tris−Cl(pH7.5)、400mM KCl、7.5mM MgCl2、0.005U/μL tRNA、50%グリセロール)4μL、超純水を加えた後、蛋白質と混合し、全量を20μLとした。混合後、反応溶液を氷上で15分間放置した。色素(0.25% BPB、0.25% XC、30% グリセロール)を1μL加え、4℃の冷蔵庫の中で、10% 非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を3〜4時間行った。試料の拡散を防ぐために、初めの15分は、400Vで泳動し、その後300Vに切り替えた。ゲルの放射線量の強さをBio−Imaging Analyzer(BAS2500;富士写真フィルム製)で解析した。結果、typeE RNAにおいて設計通り基盤RNA上に融合蛋白質が2つ結合していることを示唆する結果が得られた(図5(A)(B)(C)、及び図6)。
[typeE RNA及びDM RNAでのFRET測定]
反応は最終濃度が100nM RNA、20mM Tris・Cl、80mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001U/mL tRNA、500nM蛋白質となるよう、以下の条件で行った。RNA以外の試料は、氷上放置し冷やして用いた。1μM RNA 21μLを90℃ 5分で変性させ、超純水63μLと、5×binding buffer(100mM Tris−Cl(pH7.5)、400mM KCl、7.5mM MgCl2、0.005U/μL tRNA)を42μL加え、よく混合した後、卓上遠心機でスピンダウンした。続いて2.5μM 各蛋白質を42μL混合し全量を210μLとして卓上遠心機でスピンダウンした後、遮光したサンプルケースに入れ、室温で30分放置した。
λN−YFP、CFP−Rev両融合蛋白質の代わりに、λNペプチド及びRevペプチドを用いて結合のFRET競合実験を行った。手順は上記と同様である。結果、100nM typeE RNAに対し、5μMまたは10μMのペプチドにより、FRET強度の減少が確認された(図9、10)。このことは、配列特異的に基盤RNA上に2つの融合蛋白質が結合しているという結果であり、上記の実験結果を裏付けるものである。
[typeB RNAの設計]
単純にRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を繋いだだけのtypeE RNAだけでなく、以前我々の研究室で取得したDSLリボザイムのRNA骨格に用いたセルフフォールディングするtypeB RNA(Structure,Vol.10,527−534,2002)を基盤RNAとするRNA−蛋白質複合体も設計した。設計はtypeE RNAのときと同様にDiscovery Studio1.7(Accelrys社製)を使用して以下のように行った。まず、typeB RNAの設計のときと同様に、上部の構造安定化モジュールとして、テトラヒメナ・グループIイントロンのGAAAテトラループ−11ntレセプター相互作用構造をPDBから取得し(ID:1GID)、下部の構造安定化モジュールとして、テトラヒメナ・グループIイントロンのP4−J6/7部分のベーストリプル構造をPDBから取得した(ID:1GRZ)。
TypeB RNA(配列番号15)に関しては、TypeB RNA fw(配列番号16)プライマーとTypeB RNA revプライマー(配列番号17)の2本を、PCRサーマルサイクラーを用いて、ハイブリダイズ、伸張させた。反応には、各100μM DNAプライマー 2μL、2.5mM dNTPを8μL、Ex taq 10×バッファー 10μL、DNAポリメラーゼ(Ex taq、TAKARA製)0.5μLを使用した。以上の条件で、94℃ 1分、60℃ 30秒、72℃ 1分を15サイクルの反応を行った。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、制限酵素EcoRIとHindIIIで切断させ、再びフェノール処理、エタノール沈殿を行い、LMPアガロース電気泳動を行い、目的のバンドを切り出し精製した。Rapid DNA Ligation Kit(ロシュ・ダイアグノスティックス製)を用いて、制限酵素EcoRIとHindIIIで切断させたpUC118ベクターにクローニングした。Type B RNAの変異体であるTypeB RNA−1(配列番号18)、TypeB RNA+1(配列番号21)、mut 11ntR TypeB RNA(配列番号24)に関しては、pTypeB RNAプラスミドを鋳型とし、5’末端にBsaIに認識、切断される制限酵素部位を導入したプライマー(配列番号19、20、22、23、25、26)を用いてPCRを行った。PCR反応バッファー(50μL)の組成は、各10μM DNAプライマー2.5μL、2mMdNTPを8μL、25mM MgCl2 5μL、LA PCR BufferII 10×バッファー 5μL、鋳型DNA 10ng、DNAポリメラーゼ(LA taq、TAKARA)0.5μLであった。この時、LA taqを用いたのは、AUリッチな配列を含むため、二次構造形成による伸張反応の阻害を防ぐためである。以上の条件で、94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 4分を25サイクルの反応を行った。反応後、フェノール処理、エタノール沈殿を行い、LMPアガロース電気泳動を行い、目的のバンドを切り出し精製した。その後BsaIで処理し、Rapid DNA Ligation Kit(ロシュ・ダイアグノスティックス製)により自己環化させ、プラスミドを再構築した。
デザインしたTypeB RNAとこれらの変異体を用い、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってTypeB RNAが期待される構造を取りうるかどうか検討した。非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行うと、非変性ゲル中でのRNAの移動度はそのRNAの大きさや形で決まるため、長さが同じ程度のRNA分子を泳動した場合、よりコンパクトな立体構造を取る分子ほど泳動度が大きくなる。そのため、RNA立体構造のコンパクトさを相対的に比較するために有効な手段である。また、GAAAテトラループ−11ntレセプターはマグネシウムイオン濃度依存的に相互作用が強くなることが知られていることから、マグネシウムイオン濃度を0mM、10mM、25mMと変化させて非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。以下具体的な手順を示す。超純水5μLに32Pで標識したRNA1μL(20000cpm)を加え、80℃,5min加熱して変性させた。室温まで冷却させた後、10×緩衝液(500mM Tris−OAc(pH7.5),任意濃度の10倍のMg(OAc)2)を0.5μL加え、30℃,30minかけてRNAをフォールディングさせた。1μLの色素マーカー(18%グリセリン,0.5% XC)を加え、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルは5%ポリアクリルアミド(39:1)を用いて作製し、50mM Tris−OAc(pH7.5),任意濃度のMg(OAc)2を含むバッファーを使用して200V 3分でサンプルをゲル中に素早く泳動させ、発熱を防ぐために75Vで4〜7時間泳動した。Mg(OAc)2を含まない場合にはゲル、緩衝液の両方に最終濃度が0.1mMになるようにEDTAを添加した。また、長時間の泳動により上下の泳動層のバッファー組成に違いが出るのを防ぐために、ペリスタポンプを用いてバッファーを循環させた。ゲルの放射線量の強さをBio−Imaging Analyzer(BAS2500;富士写真フィルム製)で解析した。
typeE RNAのときと全く同様の手順で行った。結果、typeB RNAにおいても設計通り基盤RNA上に融合蛋白質が2つ結合していることを示唆する結果が得られた(図15(a)(b)、図16)。
typeE RNAのときと全く同様の手順で行った。結果、typeB RNAにおいても475nmの蛍光強度が減少し、527nmの蛍光強度が増加するというFRET特有の現象が見られた(図17、図18)。以上のことから、基盤RNAとして単純にRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を並べただけの構造のみならず、設計したセルフフォールディングするRNAの目的の位置にRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を入れ、蛋白質を結合させる事にも成功した。
実施例1と同様にして、図3(A)に示すtype−E RNA(配列番号3 ggccugggcg cagcccugaa gaagggcuga cgguacaggc uuu)、及び図3(D)に示すdouble mutant RNA(DM RNA) (配列番号12)を作製した。また、同様にして、図19(a)に示す、type−E−2 RNA(配列番号33 ggccugggcg caccugaa gaagguga cgguacaggc uuu)、図19(b)に示す、type−E−3 RNA(配列番号34 ggccugggcg cacugaa gaaguga cgguacaggc uuu)、図19(c)に示す、type−E−4 RNA(配列番号35 ggccugggcg caugaa gaauga cgguacaggc uuu)を作製した。
実施例1と同様にして、図2(A)(B)に示す二つの融合蛋白質を作製した。得られた蛋白質(A)λ−YFPの配列を、配列番号36に、得られた蛋白質(B)CFP−REVの配列を配列番号37に示す。
実施例1と同様の方法で、type−E RNA、type−E−2 RNA、type−E−3 RNA、type−E−4 RNAのそれぞれと、融合蛋白質との複合体のモデリングを行った。この結果を、図20、21、22に、それぞれ示す。モデリングの結果、type−E RNAに二つの融合蛋白質を結合させたときの両融合蛋白質間の発色団間の距離は、約5.7nmであった。なお、発色団間の距離とは、CFP蛋白質の66番目のアミノ酸残基であるチロシンと、YFP蛋白質の66番目のアミノ酸残基であるトリプトファンとの距離をいう。図20に示すモデリングの結果、type−E−2 RNAに二つの融合蛋白質を結合させたときの発色団間の距離は、約4.6nmであった。図21に示すモデリングの結果、type−E−3 RNAに二つの融合蛋白質を結合させたときの発色団間の距離は、約3.1nmであった。図22に示すモデリングの結果、type−E−4 RNAに二つの融合蛋白質を結合させたときの発色団間の距離は、約1.9mmであった。なお、図22において、実際には、λ−YFPは、RNAに結合していないことが、ゲルシフトアッセイによる実験(図示せず)により確認された。
上記5種類のRNAと、二つの融合蛋白質との複合体、及びRNAを加えない融合蛋白質のみの系のFERT測定を、実施例4と同様の方法により行った。具体的には、反応は最終濃度が100nM RNA、20mM Tris・Cl、80mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001U/mL tRNA、500nM蛋白質となるよう、以下の条件で行った。RNA以外の試料は、氷上放置し冷やして用いた。1μM RNA 21μLを90℃ 5分で変性させ、超純水63μLと、5×binding buffer(100mM Tris−Cl(pH7.5)、400mM KCl、7.5mM MgCl2、0.005U/μL tRNA)を42μL加え、よく混合した後、卓上遠心機でスピンダウンした。続いて2.5μM 各蛋白質を42μL混合し全量を210μLとして卓上遠心機でスピンダウンした後、遮光したサンプルケースに入れ、室温で30分放置した。反応後、試料をゲルローディング用チップ(200μL)で100μL採取し、0.5mm×0.5mmの石英セルに空気に注意しながら静かに入れ、蛍光分光器FP−6500(日本分光)を用いて、次のような条件で蛍光測定を行った。測定条件は、測定モードEmission、励起バンド幅 5nm、蛍光バンド幅 5nm、レスポンス0.2sec、感度 Medium、測定範囲400−600nm、データ取込間隔 0.1nm、励起波長 433.0nm、走査速度 200nm/min、繰返し回数 1回。温度調節器は感度が下がるため、用いなかった。石英セルの洗浄は、アスピレーターを使って超純水で三回行った。測定は少なくとも2回以上行った。FRETの評価は、スペクトルデータの定性的結果を得るため、CFPの放出波長のマイナーピークである504nmで規定化を行い、その相対的比較を行った。また、527nmの蛍光強度と475nmの蛍光強度の比をFRET valueの指標として用い、解析を行った。
このように、二つの融合蛋白質とこれが特異的に結合する配列を有するRNAとのRNA−蛋白質複合体と、FRET測定を用いることにより、RNA上に目的の複数の蛋白質を、距離と配向性を制御して自在に配置させる技術が可能になる。
2 基盤RNA
23 RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列
24 RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列
3 融合蛋白質
31 RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列
32 リンカー
4 融合蛋白質
41 RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列
42 リンカー
Claims (6)
- RNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を2以上有する基盤RNAと、
蛋白質と、前記塩基配列に非共有結合的にかつ特異的に結合するRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列とを含む2以上の融合蛋白質と
を含んでなるRNA−蛋白質複合体であって、
前記基盤RNAが、人工のRNA配列に、前記基盤RNAとは異なるRNA由来の配列であり、天然に存在するRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列を導入してなるセルフフォールディングするRNAである、RNA−蛋白質複合体。 - 前記蛋白質が蛍光蛋白質、発光蛋白質、アポトーシス誘導蛋白質、酵素、抗体から選択される機能性蛋白質である、請求項1に記載のRNA−蛋白質複合体。
- 前記融合蛋白質が、前記蛋白質と、前記アミノ酸配列との間にさらにリンカーを含んでなる請求項1または2に記載のRNA−蛋白質複合体。
- 前記天然のRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、バクテリオファージλ由来のboxB配列であり、前記天然のRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、バクテリオファージλ由来のNペプチド配列である請求項1〜3のいずれかに記載のRNA−蛋白質複合体。
- 前記天然のRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来の塩基配列が、HIV由来のRRE配列であり、前記天然のRNA−蛋白質複合体相互作用モチーフ由来のアミノ酸配列が、HIVRev蛋白質由来の配列である請求項1〜3のいずれかに記載のRNA−蛋白質複合体。
- 前記セルフフォールディングするRNAが、typeB RNAを含む、請求項1に記載のRNA−蛋白質複合体。
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