JP5275678B2 - Intestinal motility enhancing and pancreatic lipase inhibitory components of tea flowers and their uses - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、茶花抽出物および該抽出物に含まれる新規サポニン化合物またはその塩に関する。
より詳細には、本発明は、ツバキ科植物であるチャの花部である茶花の水または含水低級アルコール抽出物および/またはこの抽出物に含まれる新規サポニン化合物またはその塩の用途に関する。
The present invention relates to a tea flower extract and a novel saponin compound or a salt thereof contained in the extract.
In more detail, this invention relates to the use of the water or water-containing lower alcohol extract of the tea flower which is the flower part of the tea which is a camellia plant, and / or the novel saponin compound or its salt contained in this extract.
さらに詳細には、本発明は、上記の抽出物または該抽出物に含まれ、膵リパーゼ活性阻害作用を有する新規サポニン化合物の少なくとも一つを含有する遊離脂肪酸産生抑制用医薬組成物および該組成物が添加されてなる健康食品に関する。 More specifically, the present invention relates to the above-mentioned extract or a pharmaceutical composition for suppressing free fatty acid production, which contains at least one of the novel saponin compounds having pancreatic lipase activity inhibitory activity, and the composition. Relates to a health food to which is added.
ツバキ科 (Theaceae)植物ツバキ属 (Camellia)に属するチャ (Camellia sinensis、別名Thea sinensis)は、本来、熱帯および亜熱帯性の多年性植物であるが、インド、スリランカ、インドネシア、中国および日本などアジアにおいて広く自生または栽培されている常緑樹である。
特に、緑茶原料としては中国の福建省において大量栽培が行なわれている。
Theaceae plant (Camellia sinensis, also known as Thea sinensis) is originally a tropical and subtropical perennial plant, but in Asia such as India, Sri Lanka, Indonesia, China and Japan. It is an evergreen tree that is widely grown or grown.
In particular, as a green tea raw material, mass cultivation is carried out in Fujian Province, China.
従来、チャの幼葉を摘んで不発酵、半発酵または発酵加工して、緑茶、ウーロン茶または紅茶などに製茶し、嗜好飲料として古くから広く日常的に愛飲されている。
また、チャの興奮作用および利尿作用は古くから知られ、中国においては、明時代の「本草綱目」に、そして我が国においては、江戸時代の「本朝食鑑」に記載されているほどである。
Conventionally, young tea leaves are picked, non-fermented, semi-fermented, or fermented to produce green tea, oolong tea, black tea, etc., and have been widely enjoyed daily as a favorite beverage.
In addition, the excitement and diuretic action of tea has been known for a long time, and in China, it has been described in the “Honchotsume” of the Ming era, and in Japan the “Book of Breakfast” in the Edo period.
さらに近年、チャに関しては、主として、その葉部の成分として含まれるカテキンなどのようなポリフェノール類が、活性酸素の消去など対して有効であることが報告され、一段と注目されている。また、チャ葉には抗炎症、抗菌作用を有するサポニン化合物が含まれることも報告されている（例えば、非特許文献１および特許文献１など）。さらにチャの木の花芽が、抗菌作用を有する新規サポニンを含有することも報告されている（例えば、非特許文献２）。 Furthermore, in recent years, regarding tea, it has been reported that polyphenols such as catechins contained as a component of the leaf are effective for the elimination of active oxygen, and are attracting more attention. It has also been reported that tea leaves contain saponin compounds having anti-inflammatory and antibacterial actions (for example, Non-Patent Document 1 and Patent Document 1). Furthermore, it has been reported that the flower buds of tea trees contain a novel saponin having an antibacterial action (for example, Non-Patent Document 2).
また、最近、本発明者により茶花が、中性脂肪吸収抑制、糖吸収抑制および胃粘膜保護作用または抗高脂血症作用を有する新規サポニン化合物を含むことが見出されたことも報告されている（例えば、特許文献２、非特許文献３）。
しかしながら、茶花含有成分が腸運動亢進作用と膵リパーゼ活性阻害作用を有することに関しては、何等報告されていない。
Recently, it has also been reported by the present inventors that tea flowers have been found to contain a novel saponin compound having neutral fat absorption inhibition, sugar absorption inhibition and gastric mucosal protective action or antihyperlipidemic action. (For example, Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).
However, there is no report regarding the tea flower-containing component having an intestinal motility enhancing action and a pancreatic lipase activity inhibiting action.
本発明は、茶花の新規用途の開発を課題とする。 An object of the present invention is to develop a new use of tea flowers.
本発明者は、福建省産茶花の成分およびその薬理作用を明らかにすべく研究に着手し、茶花の水または含水低級アルコール抽出物および各精製段階における茶花抽出物の薬理作用を指標としてその含有成分を鋭意研究し、新規サポニン化合物を見出し、それらの化学構造を決定すると共に、当該化合物の薬理作用についても知見を得、茶花の新規用途を確立し、上記の課題を解決する。 The present inventor has started research to clarify the components and the pharmacological action of tea flowers produced in Fujian Province, and contains the water or water-containing lower alcohol extract of tea flowers and the pharmacological action of the tea flower extract at each purification stage as an index. Researching the ingredients, finding new saponin compounds, determining their chemical structures, obtaining knowledge about the pharmacological action of the compounds, establishing new uses for tea flowers, and solving the above problems.
すなわち、本発明によれば、次の一般式(１)：
で表されるサポニン化合物またはその塩が提供される。
That is, according to the present invention, the following general formula (1):
The saponin compound represented by these, or its salt is provided.
また、茶花抽出物および該抽出物に含まれる本発明によるサポニン化合物は、いずれも腸運動亢進作用および膵リパーゼ活性阻害作用を有する。 In addition, both the tea flower extract and the saponin compound according to the present invention contained in the extract have an intestinal motility enhancing action and a pancreatic lipase activity inhibiting action.
したがって、茶花抽出物および該抽出物に含まれる本発明によるサポニン化合物は、その腸運動亢進作用による腸閉塞症の予防・改善と排泄の促進による便秘の予防・改善、ならびに膵リパーゼ活性阻害作用により遊離脂肪酸の産生や腸での中性脂質の吸収を抑制でき、抗肥満、抗高脂血症および脂肪肝改善を意図する医薬用組成物および該組成物が添加されてなる健康食品が提供される。 Therefore, the tea flower extract and the saponin compound according to the present invention contained in the extract are released by preventing or improving intestinal obstruction by promoting intestinal motility and preventing or improving constipation by promoting excretion, and by inhibiting pancreatic lipase activity. Provided are a pharmaceutical composition capable of suppressing the production of fatty acids and absorption of neutral lipids in the intestine and intended to improve anti-obesity, anti-hyperlipidemia and fatty liver, and a health food to which the composition is added .
さらに、本発明によれば、茶花抽出物、または該抽出物に含まれる本発明によるサポニン化合物は、上記の作用に基づき、痔、肌荒れ、吹き出物、肥満、動脈硬化、高血圧、憩室症、胃潰瘍などに対しても有効に利用できる。
また、本発明によれば、茶花抽出物、または該抽出物に含まれる本発明によるサポニン化合物またはその塩は、従来、食用としても用いられている茶の花部から得られるので、安全に使用できる。
Furthermore, according to the present invention, the tea flower extract, or the saponin compound according to the present invention contained in the extract, is based on the above-mentioned action, such as wrinkles, rough skin, pimples, obesity, arteriosclerosis, hypertension, diverticulosis, gastric ulcer, etc. Can be used effectively.
Further, according to the present invention, the tea flower extract, or the saponin compound or the salt thereof according to the present invention contained in the extract can be used safely because it is obtained from the flower part of tea that has been conventionally used for food. it can.
本発明は、茶花の水または含水低級アルコール抽出物および/または該抽出物を必要に応じてさらに精製した茶花抽出物に含まれる、上記の一般式(１)で表されるサポニン化合物またはその塩およびそれらの使用に関している。 The present invention relates to a saponin compound represented by the above general formula (1) or a salt thereof, which is contained in a tea flower water or water-containing lower alcohol extract and / or a tea flower extract obtained by further purifying the extract as necessary. And their use.
本発明において、用いられる茶花とは、ツバキ科 (Theaceae)植物ツバキ属 (Camellia)に属するチャ (Camellia sinensis、別名Thea sinensis)の花部、すなわち、雌しべ、雄しべ、花弁、萼、苞葉、花軸、花柄等を含むいわゆる花、花芽および蕾などを意味する。
本発明において、茶花は、採取したものをそのまま、または乾燥して、あるいは当業者に公知の前記のいずれかの方法で製茶して用いることができる。
In the present invention, the tea flower used is a flower part of the tea (Camellia sinensis, also known as Thea sinensis) belonging to the family Camellia (Theaceae), that is, pistil, stamen, petal, camellia, leaf, flower It means so-called flowers, stems, flower buds, buds, etc.
In the present invention, the tea flower can be used as it is or after it has been collected, or can be made by any of the methods described above known to those skilled in the art.
なお、通常、上記のチャは、主として２変種、すなわち、いわゆる緑茶製造に適する中国種var. sinensisおよび紅茶製造に適するアッサム種var. assamica (Mast.) Kitamに、またはこれらの雑種に分類されるが、本発明における茶花の原料としては、上記のいずれかに限定されるものではないが、中国福建省産の茶花に含まれる成分が高含量であることから好適に用いられる。 Usually, the above tea is mainly classified into two varieties, namely, the Chinese variety var. Sinensis suitable for green tea production and the Assam variety var. Assamica (Mast.) Kitam suitable for black tea production, or these hybrids. However, the raw material of the tea flower in the present invention is not limited to any of the above, but it is preferably used because it contains a high content of components contained in the tea flower produced in Fujian Province, China.
本発明の抽出物の調製に用いられる溶媒に関して、水以外の低級アルコールとしては、炭素数１〜４のモノアルコールまたはジアルコール類が挙げられる。
具体的には、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノールもしくはt-ブタノールまたはこれらの混液あるいはこれらの任意の割合における含水アルコール等が挙げられる。さらに、エタンジオール、プロパンジオールおよびブタンジオールおよびこれらの位置異性体またはこれらの混液あるいはこれらの任意の割合における含水ジアルコール等が挙げられる。
Regarding the solvent used for the preparation of the extract of the present invention, examples of the lower alcohol other than water include C1-C4 monoalcohols or dialcohols.
Specific examples include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, a mixed solution thereof, or a hydrous alcohol in any ratio thereof. Furthermore, ethanediol, propanediol, butanediol, and their positional isomers or mixtures thereof, or hydrous alcohols in any proportions thereof.
しかしながら、抽出後の濃縮などの容易性の観点から、好ましくは、水またはメタノールもしくはエタノールが用いられる。さらに好ましくは、水または約８０％エタノールが用いられるが、本発明においては、含水エタノールのエタノール量が特に８０％に限定されるものではない。
これらの抽出用溶媒は、抽出材料に対して１〜５０倍 (容量)程度、好ましくは２〜１０倍 (容量)程度用いられる。
However, from the viewpoint of ease of concentration after extraction, water, methanol or ethanol is preferably used. More preferably, water or about 80% ethanol is used, but in the present invention, the amount of ethanol in water-containing ethanol is not particularly limited to 80%.
These extraction solvents are used in an amount of about 1 to 50 times (volume), preferably about 2 to 10 times (volume) with respect to the extraction material.
なお、抽出は、熱時または室温で行うことができ、抽出温度は、室温と溶媒の沸点の間で任意に設定できる。熱時抽出の場合、例えば、50℃〜抽出溶媒の沸点の温度で、振盪(または撹拌)下もしくは非振盪下または還流下に、茶花の花部を上記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、30分間〜5時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、1時間〜20日間程度行うのが適当である。また、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分〜数時間加熱還流するのが好ましい。 The extraction can be performed while heating or at room temperature, and the extraction temperature can be arbitrarily set between room temperature and the boiling point of the solvent. In the case of hot extraction, for example, it is carried out by immersing the flower part of tea flowers in the extraction solvent at a temperature between 50 ° C. and the boiling point of the extraction solvent under shaking (or stirring) or non-shaking or refluxing. Is appropriate. When the extraction material is immersed under shaking, it is appropriate to perform for about 30 minutes to 5 hours, and when it is immersed under non-shaking, it is appropriate for about 1 hour to 20 days. Moreover, when extracting under reflux of an extraction solvent, it is preferable to heat to reflux for 30 minutes to several hours.
また、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、上記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について1回だけ行ってもよいが、複数回、例えば、2〜5回程度繰り返すのが抽出効率の点から好ましい。 It is also possible to extract by dipping at a temperature lower than 50 ° C. In this case, it is preferable to immerse for a longer time than the above time. The extraction operation may be performed only once for the same material, but it is preferable from the viewpoint of extraction efficiency to repeat a plurality of times, for example, about 2 to 5 times.
固形物を、抽出後にろ別して得られる抽出液は、常法により濃縮して抽出エキスとしてもよい。濃縮は、減圧下に行うのが好ましい。濃縮は抽出液が乾固するまで行ってもよい。
抽出物は、そのまま本発明の組成物を調製するのに用いてもよいが、粉末状または凍結乾燥品等として用いてもよい。これらの固形物とする方法は、当該分野で公知の方法を採用することができる。
The extract obtained by filtering the solid after extraction may be concentrated by an ordinary method to obtain an extract. Concentration is preferably performed under reduced pressure. Concentration may be performed until the extract is dry.
The extract may be used as it is to prepare the composition of the present invention, but may also be used as a powder or lyophilized product. A method known in the art can be adopted as the method for forming these solids.
したがって、本発明における抽出物とは、抽出液、抽出エキス、濃縮乾固物または凍結乾燥物のいずれも意味するが、本発明による抽出物は、精製せずにそのまま用いることもでき、本発明の一部を構成している。 Therefore, the extract in the present invention means any of an extract, an extract, a concentrated dried product or a lyophilized product, but the extract according to the present invention can be used as it is without being purified. Part of.
しかしながら、本発明では、抽出液を濃縮した抽出物を、溶媒による分配抽出、すなわち、水と非水和性有機溶媒とを用いる分配抽出に単回または複数回付し、有機溶媒可溶画分と水溶性画分として分離することができる。 However, in the present invention, the extract obtained by concentrating the extract is subjected to partition extraction with a solvent, that is, partition extraction using water and a non-hydratable organic solvent one or more times, and an organic solvent-soluble fraction is obtained. And water-soluble fraction.
非水和性有機溶媒としては、酢酸エチル、n-ブタノール、ヘキサン、クロロホルムなどが挙げられるが、中でも酢酸エチルが好ましい。
すなわち、茶花の水または含水低級アルコール抽出物を濃縮して得られた抽出物を、必要に応じて酢酸エチルと水を用いて分配し、酢酸エチル可溶画分と水溶性画分として得ることができる。
Examples of the non-hydratable organic solvent include ethyl acetate, n-butanol, hexane, chloroform, and the like. Among them, ethyl acetate is preferable.
That is, the extract obtained by concentrating the tea flower water or water-containing lower alcohol extract is distributed using ethyl acetate and water as necessary to obtain an ethyl acetate-soluble fraction and a water-soluble fraction. Can do.
また、上記で得られる水溶性画分を、さらに水と非水和性有機溶媒を用いる分配抽出に付し、有機溶媒可溶画分と水溶性画分として分離することができる。
この場合の非水和性有機溶媒としては、n-ブタノール、ヘキサン、クロロホルムなどが挙げられるが、中でもn-ブタノールが好ましい。
すなわち、上記の酢酸エチルと水との分配後の水溶性画分をそのままｎ-ブタノールとの分配に付すか、または該水溶性画分を濃縮して得られる残渣をさらに水とｎ-ブタノールとの分配に付し、n-ブタノール画分と水溶性画分を得ることができる。
In addition, the water-soluble fraction obtained above can be further subjected to partition extraction using water and a non-hydratable organic solvent to separate the organic solvent-soluble fraction and the water-soluble fraction.
In this case, examples of the non-hydratable organic solvent include n-butanol, hexane, chloroform, and the like. Among them, n-butanol is preferable.
That is, the water-soluble fraction after partitioning between ethyl acetate and water is directly subjected to partitioning with n-butanol, or the residue obtained by concentrating the water-soluble fraction is further mixed with water and n-butanol. N-butanol fraction and water-soluble fraction can be obtained.
分配抽出は、当該分野で通常行われる撹拌もしくは振盪分配法または液滴向流分配法などの常法に従って行うことができる。例えば、室温下、振盪下または非振盪下に、抽出エキスなどに対して、非水和性有機溶媒と水とを１〜１０倍 (容量)程度 (１:１０〜１０:１)加えて行うのが適当である。 The partition extraction can be performed according to a conventional method such as a stirring or shaking distribution method or a droplet counter-current distribution method usually performed in the art. For example, it is performed by adding about 1 to 10 times (volume) (1:10 to 10: 1) of a non-hydratable organic solvent and water to an extract or the like at room temperature, with shaking or without shaking. Is appropriate.
なお、上記のアルコール抽出物および各分配抽出物は、上記のいずれの段階においても、濃縮する前後に精製処理に付すことができる。
精製処理には、上記の溶媒による分配抽出以外に、当業者に公知のクロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法等を単独で、または組み合わせて採用することができる。例えば、クロマトグラフ法としては、順相もしくは逆相担体またはイオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは遠心液体クロマトグラフィー等のいずれか、またはそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宜選択することができる。
The alcohol extract and each partition extract can be subjected to a purification treatment before and after concentration in any of the above steps.
For the purification treatment, a chromatographic method, an ion exchange chromatographic method and the like known to those skilled in the art can be employed alone or in combination in addition to the above-described partition extraction with a solvent. For example, as a chromatographic method, a column chromatography, a thin layer chromatography, a high performance liquid chromatography, a centrifugal liquid chromatography or the like using a normal phase or reverse phase carrier or an ion exchange resin, or a combination thereof is performed. Is mentioned. In this case, purification conditions such as a carrier and an elution solvent can be appropriately selected according to various chromatographies.
本発明者は、茶花抽出物を、上記の精製方法を組み合わせて精製すると同時に精製物の作用について検討した。 The present inventor examined the action of the purified product at the same time as purifying the tea flower extract by combining the above purification methods.
そこで、本発明者は、上記の酢酸エチル画分およびn-ブタノール画分について、逆相カラムを用いたクロマトグラフィーおよびHPLCによる精製を繰り返し、含有成分の単離を行った。 Therefore, the present inventor repeatedly performed chromatography and HPLC purification using a reverse phase column on the above ethyl acetate fraction and n-butanol fraction to isolate the contained components.
その結果、本発明者は、既知物質として酢酸エチル画分から、２種のフラボノイド配糖体ケンペロール3-O-β-D-ガラクトピラノシドおよびケンペロール3-O-β-D-グルコピラノシド；２種のカテキン(-)-エピカテキン3-O-ガレートおよび(-)-エピガロカテキン3-O-ガレート；(+)-ガロカテキン；芳香族化合物として桂皮酸、プロトカテチュ酸メチルエステル、ベンジルアルコール、(S)-1-フェニルエチルβ-D-グルコピラノシド；およびその他の化合物としてカフェインを得た。
また、ｎ-ブタノール画分からは、1種の既知フラボノイド配糖体ケンペロール3-O-β-D-グルコピラノシル(1→3)-α-L-ラムノピラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノシド；３種のカテキン、(-)-エピカテキン、(-)-エピカテキン3-O-ガレートおよび(-)-エピガロカテキン3-O-ガレート；２種の芳香族化合物ベンジルβ-D-グルコピラノシドおよび(S)-1-フェニルエチルβ-D-グルコピラノシド；ならびにカフェインを既知物質として得ると共に、さらに以下の新規化合物を見出した。
As a result, the present inventor has obtained two kinds of flavonoid glycoside kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside and kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside as known substances from the ethyl acetate fraction; Catechins (-)-epicatechin 3-O-gallate and (-)-epigallocatechin 3-O-gallate; (+)-gallocatechin; cinnamic acid, protocatechuic acid methyl ester, benzyl alcohol, (S Caffeine was obtained as) -1-phenylethyl β-D-glucopyranoside; and other compounds.
From the n-butanol fraction, one known flavonoid glycoside kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl (1 → 3) -α-L-rhamnopyranosyl (1 → 6) -β-D-glucopyranoside; 3 catechins, (−)-epicatechin, (−)-epicatechin 3-O-gallate and (−)-epigallocatechin 3-O-gallate; two aromatic compounds benzyl β-D-glucopyranoside and (S) -1-Phenylethyl β-D-glucopyranoside; and caffeine were obtained as known substances, and the following novel compounds were found.
すなわち、本発明によれば、次の一般式(１)：
で表されるサポニン化合物またはその塩が提供される。
That is, according to the present invention, the following general formula (1):
The saponin compound represented by these, or its salt is provided.
ことに、上記の式(１)の化合物において、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2がアセチル基であり、Ｒ3がチグロイル基であり、式(２)：
また、本発明によれば、式(１)の化合物において、Ｒ1がヒドロキシ基であり、Ｒ2およびＲ3がチグロイル基であり、式(３)：
また、本発明によれば、式(１)の化合物において、Ｒ1がヒドロキシ基であり、Ｒ2がアセチル基であり、Ｒ3がチグロイル基であり、式(４)：
さらに、本発明によれば、式(５)：
上記のチャカサポニンＩ、ＩＩおよびＩＩＩならびにチャカフラボノシドＡの塩としては、常法によって形成される当該化合物が有しているカルボキシ基またはフェノール性水酸基とナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属との塩が挙げられる。
さらに、上記の化合物が有するエステル結合のいずれかが常法によって部分加水分解された化合物も本発明の一部を構成する。
As the salt of the above-mentioned chacasaponins I, II and III and chacaflavonoside A, a salt of a carboxy group or a phenolic hydroxyl group of the compound formed by a conventional method and an alkali metal such as sodium or potassium Is mentioned.
Furthermore, a compound obtained by partially hydrolyzing any of the ester bonds of the above compound also constitutes a part of the present invention.
福建省産茶花抽出物の調製および該抽出物含有成分単離精製
例えば、福建省産チャ(Camellia sinensis L.)の乾燥花(1.5 kg)を、メタノールを用いて茶花抽出物を調製し、該茶花抽出物を精製した例を表１および以下に示す。
Preparation of Fujian-produced tea flower extract and isolation and purification of the extract-containing components For example, dry flowers (1.5 kg) of Fujian-produced tea (Camellia sinensis L.) were prepared using methanol and a tea flower extract was prepared. The example which refine | purified the tea flower extract is shown in Table 1 and the following.
（１）茶花のエタノール抽出物の調製
福建省産チャ(Camellia sinensis L.)の乾燥花(1.5 kg)をMeOHで熱時抽出後、溶媒を減圧留去し、MeOH抽出エキス(467.2 g、収率31.1％)を得た。得られたMeOH抽出エキスのうち450 gをEtOAcとH2Oで分配抽出、次いでH2O移行部をn-BuOHで分配抽出し、EtOAc移行部(46.6 g、3.2％)、n-BuOH移行部(238.0 g、16.4％)、H2O移行部(174.9 g、12.1％)を得た。活性が認められた EtOAc移行部およびｎ-BuOH移行部について含有成分の探索を行った。
(1) Preparation of tea flower ethanol extract After extracting hot flower (1.5 kg) of Fujian tea (Camellia sinensis L.) with MeOH while hot, the solvent was distilled off under reduced pressure, and MeOH extract extract (467.2 g, collected). Rate 31.1%). Of the obtained MeOH extract, 450 g was partitioned and extracted with EtOAc and H 2 O, and then the H 2 O transition part was partitioned and extracted with n-BuOH. The EtOAc transition part (46.6 g, 3.2%) and the n-BuOH transition Part (238.0 g, 16.4%), H 2 O migration part (174.9 g, 12.1%). The components contained were searched for the EtOAc transition part and the n-BuOH transition part where the activity was recognized.
（２）ＥｔＯＡｃ移行部の精製
EtOAc移行部を順相シリカゲル、逆相ODSカラムクロマトグラフィーおよび逆相HPLC で繰り返し分離精製し、2種のフラボノイド配糖体ケンペロール3-O-β-D-ガラクトピラノシド(0.0027％)、ケンペロール3-O-β-D-グルコピラノシド(0.0022％)、2種のカテキン(-)-エピカテキン3-O-ガレート(0.044％)、(-)-エピガロカテキン3-O-ガレート(0.087％)、(+)-ガロカテキン(0.0011％)および芳香族化合物として桂皮酸(0.00082％)、プロトカテチュ酸メチルエステル(0.00092％)、ベンジルアルコール(0.0012％) 、(S)-1-フェニルエチルβ-D-グルコピラノシド(0.013％)およびその他の化合物としてカフェイン(0.037％)を単離した。
(2) Purification of EtOAc transfer section
The EtOAc transition part was repeatedly separated and purified by normal phase silica gel, reverse phase ODS column chromatography and reverse phase HPLC, and two flavonoid glycoside kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (0.0027%), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (0.0022%), two catechins (-)-epicatechin 3-O-gallate (0.044%), (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (0.087%) , (+)-Gallocatechin (0.0011%) and cinnamic acid (0.00082%), protocatechuic acid methyl ester (0.00092%), benzyl alcohol (0.0012%), (S) -1-phenylethyl β-D- Glucopyranoside (0.013%) and caffeine (0.037%) as other compounds were isolated.
（３）ｎ-ＢｕＯＨ移行部の精製
BuOH移行部を順相シリカゲル、逆相ODSカラムクロマトグラフィーおよび順相、逆相HPLCで繰り返し分離精製し、3種の新規オレアナン(oleanane)型トリテルペン配糖体チャカサポニンＩ(0.49％)、チャカサポニンＩＩ(0.67％)、チャカサポニンＩＩＩ(0.013％)、1種の新規フラボノイド配糖体チャカフラボノシドＡ(0.0078％)、1種の既知フラボノイド配糖体ケンペロール3-O-β-D-グルコピラノシル(1→3)-α-L-ラムノピラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノシド(0.36％)、3 種のカテキン(-)-エピカテキン(0.000077％)、(-)-エピカテキン3-O-ガレート(0.067％)、(-)-エピガロカテキン3-O-ガレート(0.21％)、２種の既知芳香族化合物ベンジルβ-D-グルコピラノシド(0.00012％)および(S)-1-フェニルエチルβ-D-グルコピラノシド(0.094％)ならびにカフェイン(0.067％)を単離した。
(3) Purification of n-BuOH transition part
The BuOH transition part was repeatedly separated and purified by normal phase silica gel, reverse phase ODS column chromatography, normal phase and reverse phase HPLC, and three new oleanane triterpene glycosides, chakasaponin I (0.49%) and chakasaponin II (0.67%), Chacasaponin III (0.013%), one novel flavonoid glycoside chacaflavonoside A (0.0078%), one known flavonoid glycoside kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl ( 1 → 3) -α-L-rhamnopyranosyl (1 → 6) -β-D-glucopyranoside (0.36%), 3 catechins (-)-epicatechin (0.000077%), (-)-epicatechin 3-O -Gallate (0.067%), (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (0.21%), two known aromatic compounds benzyl β-D-glucopyranoside (0.00012%) and (S) -1-phenylethyl β-D-glucopyranoside (0.094%) as well as caffeine (0.067%) were isolated.
上記の既知化合物については、文献値との1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルデータの比較により同定した。
但し、これらの単離成分の収率は、福建省産茶花からの単離収率である。
The above known compounds were identified by comparing 1 H-NMR and 13 C-NMR spectral data with literature values.
However, the yield of these isolated components is the isolated yield from tea flowers produced in Fujian Province.
（４）チャカサポニンＩの構造解析
チャカサポニンＩは、負の旋光性 ([α]D 26 −9.0°、MeOH)を示す無色微細結晶(m.p.214−216℃)として得られた。IRスペクトルから水酸基(3468 cm-1)、カルボニル基 (1719 cm-1)、オレフィン(1664 cm-1)、およびエーテル(1078 cm-1)の存在が示唆された。
さらに陽イオンおよび陰イオンFAB-MSにおいて、擬似分子イオンピークがm/z 1239 (M+ Na)+および1215 (M − H)-に観測され、高分解能FAB-MSから分子式C59H92O26を有する化合物であることが判明した。
(4) Structural Analysis of Chacasaponin I Chacasaponin I was obtained as colorless fine crystals (mp214-216 ° C.) exhibiting negative optical rotation ([α] D 26 -9.0 °, MeOH). IR spectrum suggested the presence of hydroxyl group (3468 cm -1 ), carbonyl group (1719 cm -1 ), olefin (1664 cm -1 ), and ether (1078 cm -1 ).
Furthermore, quasi-molecular ion peaks were observed at m / z 1239 (M + Na) + and 1215 (M − H) − in cation and anion FAB-MS, and molecular formula C 59 H 92 O 26 was observed from high resolution FAB-MS. It was found to be a compound having
また、チャカサポニンＩの1H-および13C-NMR(ピリジン-d5)スペクトルデータ(表２および３)、種々の二次元NMRデータを詳細に解析した。アセチル基およびチグロイル基の結合位置については、HMBCスペクトルにおいて、21 位水素とチグロイルカルボニル炭素(δC；168.0) および22 位水素とアセチルカルボニル炭素(δC：171.0)との間にロング-レンジ相関が観測されたことから決定した。 Further, 1 H- and 13 C-NMR (pyridine-d 5 ) spectral data (Tables 2 and 3) and various two-dimensional NMR data of chakasaponin I were analyzed in detail. Regarding the bonding position of the acetyl group and the tigloyl group, in the HMBC spectrum, a long-range between the 21st hydrogen and the tigloylcarbonyl carbon (δ C ; 168.0) and the 22nd hydrogen and the acetylcarbonyl carbon (δ C : 171.0) Determined from the observed correlation.
チャカサポニンＩを、KOHの10％水溶液−50％水性1,4-ジオキサン(1：1)で加水分解することにより既知化合物デスアシル-アッサムサポニンEと酢酸、チグリン酸が得られた。酢酸およびチグリン酸については、それぞれp-ニトロベンジルエステル体とした後、HPLCで標品と同定した。 Chakasaponin I was hydrolyzed with 10% aqueous solution of KOH-50% aqueous 1,4-dioxane (1: 1) to obtain known compounds desacyl-assam saponin E, acetic acid and tiglic acid. Acetic acid and tiglic acid were each identified as a preparation by HPLC after making p-nitrobenzyl ester.
上記の構造決定の手法の略図を以下に示す。
（５）チャカサポニンＩＩおよびＩＩＩの構造解析
チャカサポニンＩＩおよびＩＩＩについて同様の方法により構造解析を行った。
チャカサポニンＩＩは、塩基性条件下で加水分解することによりデスアシル-フローラティーサポニンBとチグリン酸が得られ、チャカサポニンＩＩＩからデスアシル-フローラティーサポニンB、チグリン酸および酢酸が得られた。
(5) Structural analysis of chacasaponins II and III Structural analysis was performed on chacasaponins II and III by the same method.
Chacasaponin II was hydrolyzed under basic conditions to yield desacyl-floraty saponin B and tiglic acid, and chaacaponin III was desacyl-floraty saponin B, tiglic acid and acetic acid.
また、脱アシル体、デスアシル-フローラティーサポニンBを酸性条件下で加水分解することにより、既知化合物R1-バリゲノール(barrigenol)とD-グルクロン酸、D-ガラクトース、L-アラビノース、D-キシロースが得られた。 In addition, by hydrolyzing the desacyl derivative, desacyl-floraty saponin B under acidic conditions, the known compounds R 1 -barrigenol and D-glucuronic acid, D-galactose, L-arabinose, D-xylose Obtained.
構成糖については、L-システイン メチルエステル塩酸塩(CMEH)、次いでN、O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)との反応により各構成糖をトリメチルシリル化した後、それぞれの標品とGCによるリテンションタイムを比較することにより同定した。
以上の結果から、チャカサポニンＩＩおよびＩＩＩの化学構造を前記式(３)および式(４)に示すように決定した。
Constituent sugars were trimethylsilylated by reaction with L-cysteine methyl ester hydrochloride (CMEH) and then with N, O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA), and then each sample and GC It was identified by comparing the retention times.
From the above results, the chemical structures of chacasaponins II and III were determined as shown in the above formulas (3) and (4).
上記の構造決定の手法の略図を以下に示す。
本発明者は、茶花抽出物および該抽出物に含まれる上記のチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩが、いずれも腸運動亢進作用および膵リパーゼ活性阻害作用を有することを見出した。
また、本発明者は、上記の腸運動亢進作用に基づいて、本願発明による茶花抽出物およびチャカサポニンＩ〜ＩＩＩが、腸閉塞症の予防・改善と排泄の促進による便秘の予防・改善を意図する医薬用組成物および該組成物を含む健康食品に用いられ得ることを見出した。
The present inventor has found that the tea flower extract and the above-mentioned chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III contained in the extract all have an intestinal motility enhancing action and a pancreatic lipase activity inhibiting action.
Further, the present inventor intends to prevent or improve constipation by preventing or improving intestinal obstruction and promoting excretion of the tea flower extract and chacasaponins I to III according to the present invention based on the above-described action for enhancing intestinal motility. It has been found that the composition can be used for a pharmaceutical composition and a health food containing the composition.
さらに、本発明者は、上記の膵リパーゼ活性阻害作用に基づいて、本願発明による茶花抽出物およびチャカサポニンＩ〜ＩＩＩが、遊離脂肪酸産生抑制、抗肥満、抗高脂血症、または脂肪肝改善効果を意図する医薬組成物および該組成物を含む健康食品に用いられ得ることを見出し、本発明を完成した。 Furthermore, the present inventor, based on the above-mentioned pancreatic lipase activity inhibitory activity, the tea flower extract and chacasaponins I to III according to the present invention are capable of suppressing free fatty acid production, antiobesity, antihyperlipidemia, or fatty liver improvement. The present invention was completed by finding out that it can be used for a pharmaceutical composition intended for an effect and a health food containing the composition.
したがって、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれる式(２)〜(４)で表されるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む医薬組成物が提供される。 Therefore, according to the present invention, the tea flower extract or at least one of chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III represented by the formulas (2) to (4) contained in the extract is contained as an active ingredient. A pharmaceutical composition is provided.
すなわち、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む腸運動亢進作用、ひいては腸閉塞の予防・改善用組成物が提供される。 That is, according to the present invention, the tea flower extract or the action of promoting intestinal motility containing at least one of chakasaponin I, chakasaponin II and chakasaponin III contained in the extract as an active ingredient, and thus prevention / amelioration of intestinal obstruction A composition is provided.
また、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む上記の腸運動亢進作用に基づく排泄促進による便秘の予防・改善用組成物が提供される。 Further, according to the present invention, constipation due to promotion of excretion based on the above-mentioned action for enhancing intestinal motility, which comprises at least one of tea flower extract or chakasaponin I, chakasaponin II and chakasaponin III contained in the extract as an active ingredient Is provided.
さらに、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む膵リパーゼ活性阻害作用に基づく遊離脂肪酸産生抑制、ひいては抗肥満用組成物が提供される。 Furthermore, according to the present invention, free fatty acid production suppression based on pancreatic lipase activity inhibitory action comprising at least one of tea flower extract or chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III contained in the extract as an active ingredient, As a result, an anti-obesity composition is provided.
また、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む抗高脂血症用組成物が提供される。
また、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む脂肪肝改善用組成物が提供される。
In addition, according to the present invention, there is provided a composition for antihyperlipidemia comprising at least one of tea flower extract or chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III contained in the extract as an active ingredient. .
In addition, according to the present invention, there is provided a composition for improving fatty liver comprising tea extract or at least one of chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III contained in the extract as an active ingredient.
したがって、本発明によれば、茶花抽出物または該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの少なくとも一つを有効成分として含む、食生活の欧米化による高カロリー食の摂食に基づく現代病として代表的な肥満、高脂血症および脂肪肝などの生活習慣病の予防または治療を意図する医薬組成物、ならびに腸運動亢進作用による腸閉塞および便秘の予防または治療を意図する医薬組成物が提供される。
その上、本発明によれば、該組成物を含む健康食品が提供される。
Therefore, according to the present invention, the intake of a high-calorie diet due to westernization of the diet, comprising at least one of tea flower extract or chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III contained in the extract as an active ingredient. A pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of lifestyle-related diseases such as obesity, hyperlipidemia and fatty liver, which are representative of modern diet-based diseases, and the prevention or treatment of intestinal obstruction and constipation due to the action of promoting intestinal motility A pharmaceutical composition is provided.
Moreover, according to the present invention, a health food containing the composition is provided.
本発明の茶花抽出物、すなわち水もしくは含水アルコール抽出物、該抽出物の酢酸エチル可溶画分および/もしくはｎ-ブタノール可溶画分またはこれらの濃縮乾固物あるいは該抽出物に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩは、そのままの状態、または適当な媒体で希釈して、あるいは医薬品の製造分野において公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液剤等、種々の医薬品の形態に製剤化して使用することができる。 Tea flower extract of the present invention, that is, water or water-containing alcohol extract, ethyl acetate soluble fraction and / or n-butanol soluble fraction of the extract or concentrated dry-dried product thereof or chaka contained in the extract Saponin I, Chakasaponin II and Chakasaponin III can be used in various forms such as powders, granules, tablets, capsules or liquids as they are, or diluted with an appropriate medium, or by methods known in the field of pharmaceutical production. It can be used in the form of a pharmaceutical product.
これらの医薬品形態においては、適当な媒体を添加してもよい。そのような媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤 (例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガントまたはポリビニルピロリドン)、充填剤 (例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン)、滑沢剤 (例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはポリエチレングリコール)、崩壊剤 (例えば馬鈴薯澱粉)または湿潤剤 (例えばラウリル硫酸ナトリウム)等が挙げられる。 In these pharmaceutical forms, an appropriate medium may be added. Such vehicles include pharmaceutically acceptable excipients such as binders (e.g. syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinylpyrrolidone), fillers (e.g. lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, Sorbitol or glycine), lubricants (eg magnesium stearate, talc or polyethylene glycol), disintegrants (eg potato starch) or wetting agents (eg sodium lauryl sulfate).
錠剤は、通常の方法でコーティングしてもよい。液体製剤は、例えば水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、使用前に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。 Tablets may be coated by conventional methods. Liquid formulations may be in the form of, for example, aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups or elixirs, and may be provided as a dry product that is regenerated with water or other suitable excipients prior to use. Good.
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁化剤 (例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂)、乳化剤 (例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアラビアゴム)、(食用脂を含んでいてもよい)非水性賦形剤 (例えばアーモンド油、分画ココヤシ油またはグリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのような油性エステル)、保存剤 (例えばｐ-ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、またはソルビン酸)、および所望により着色剤または香料等を含んでいてもよい。 Such liquid preparations are prepared using conventional additives such as suspending agents (e.g. sorbitol, syrup, methylcellulose, glucose syrup, gelatin water edible fat), emulsifiers (e.g. lecithin, sorbitan monooleate or gum arabic), (edible fats). Non-aqueous excipients (e.g. almond oil, fractionated coconut oil or oily esters such as glycerin, propylene glycol or ethyl alcohol), preservatives (e.g. methyl or propyl p-hydroxybenzoate, or Sorbic acid) and, if desired, colorants or fragrances.
また、本発明による組成物を有効成分として食品に添加したものを健康食品として利用することができる。 Moreover, what added the composition by this invention to food as an active ingredient can be utilized as health food.
健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で保健、健康維持・増進等を目的とした食品を意味し、例えば、固形、半固形または液体の製品、具体的には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤または液剤等のほか、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ等の形態が挙げられる。
これらの食品の製造工程において、あるいは最終製品に、上記の抽出物を添加して、健康食品とすることができる。
Health food means food with a more positive meaning than normal food for the purpose of health, health maintenance and promotion, for example, solid, semi-solid or liquid products, specifically powders, granules In addition to pills, tablets, capsules or liquids, confectionery such as cookies, rice crackers, jelly, yokan, yogurt and manju, soft drinks, teas, nutritional drinks, soups and the like can be mentioned.
In the production process of these foods or to the final product, the above-mentioned extract can be added to make a health food.
茶花抽出物および該抽出物が含む本発明による化合物の使用量は、年齢、症状等によって異なるが、例えば該抽出物の濃縮乾固物を予防・治療に用いる場合には、成人１回につき50ｍｇ〜10ｇ程度、好ましくは100ｍｇ〜3ｇ程度使用できる。また、健康食品として使用する場合には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対し上記乾固物を、100ｍｇ〜10ｇ程度の範囲で用いることができる。 The amount of the tea flower extract and the compound according to the present invention contained in the extract varies depending on the age, symptoms, etc. For example, when the concentrated dried product of the extract is used for prevention / treatment, 50 mg per adult is used. About 10 g, preferably about 100 mg to 3 g can be used. Moreover, when using as a health food, the said dry-solid thing can be used in the quantity which does not have a bad influence on the taste and external appearance of a foodstuff, for example, the said dried solid substance with respect to 1 kg of target foodstuffs.
以下、本発明の茶花抽出物、式(２)〜(４)で表されるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの精製法ならびにそれらの作用に関する実施例を具体的に説明するが、以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明をなんら制限するものではない。 Hereinafter, the tea flower extract of the present invention, chakasaponin I represented by formulas (2) to (4), chakasaponin II and chakasaponin III will be described in detail and examples relating to the action thereof. The following examples are for explaining the present invention and are not intended to limit the present invention.
なお、実施例では、特に記載がない限り、以下の各種溶媒、クロマトグラフィー用担体およびHPLC用カラムならびに各種分析器機を用いた：
メタノール(MeOH)：ナカライテスク社製、特級
エタノール(EtOH)：ナカライテスク社製、特級
クロロホルム：ナカライテスク社製、特級
酢酸エチル(AcOEt)：ナカライテスク社製、特級
In the examples, unless otherwise specified, the following various solvents, chromatographic carriers, HPLC columns, and various analyzers were used:
Methanol (MeOH): Nacalai Tesque, special grade Ethanol (EtOH): Nacalai Tesque, special grade Chloroform: Nacalai Tesque, special grade Ethyl acetate (AcOEt): Nacalai Tesque, special grade
ｎ-ブタノール(BuOH)：ナカライテスク社製、特級
アラビアゴム：和光純薬工業株式会社製
カルボキシメチルセルロース ナトリウム塩(CMC-Na)：和光純薬工業株式会社製
炭素末（活性炭；粉末状）：和光純薬工業株式会社製
豚膵リパーゼ：シグマ・アルドリッチ社製
ｄｄｙ系雄性マウス：紀和実験動物研究所（和歌山）
n-butanol (BuOH): manufactured by Nacalai Tesque, special grade Arabic gum: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Carboxymethylcellulose sodium salt (CMC-Na): manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. carbon powder (activated carbon; powder): Japanese Porcine pancreatic lipase from Kojun Pharmaceutical Co., Ltd .: Sigma Aldrich ddy male mouse: Kiwa Laboratory Animal Research Institute (Wakayama)
カラムクロマトグラフィー用シリカゲル (SiO2)：富士シリシア化学社製、ＢＷ-200、150〜350メッシュ
カラムクロマトグラフィー用逆相シリカゲル：富士シリシア化学社製、Chromatorex ODS DM1020T、100〜200メッシュ
HPLC用ODSカラム：YMC社製、YMC-Pack ODS-A (250×20mm)
Silica gel for column chromatography (SiO 2 ): Fuji Silysia Chemical, BW-200, 150 to 350 mesh Reversed phase silica gel for column chromatography: Fuji Silysia Chemical, Chromatorex ODS DM1020T, 100 to 200 mesh
ODS column for HPLC: YMC, YMC-Pack ODS-A (250 × 20mm)
ＮＭＲ：日本電子データム株式会社製（JEOL）、EX-270（270 MHz）、JNM-LA500（500 MHz）、ECA-600K（600 MHz）
ＩＲ：島津製作所社製、ＦＴＩＲ-8100
ＨＰＬＣ：島津製作所社製、検出器；示差屈折率検出器RID-6A
ＵＶ検出器SPD-10A
送液ユニット；LC-6AD
ＧＣ：島津製作所GC-14A
ＭＳ：日本電子データム社製（JEOL）、FABMS、HRFABMAS；JMS-SX 102A
EIMS、HREIMS；JMS-GCMATE
NMR: JEOL Datum Co., Ltd. (JEOL), EX-270 (270 MHz), JNM-LA500 (500 MHz), ECA-600K (600 MHz)
IR: FTIR-8100, manufactured by Shimadzu Corporation
HPLC: Shimadzu Corporation detector, differential refractive index detector RID-6A
UV detector SPD-10A
Liquid feeding unit; LC-6AD
GC: Shimadzu GC-14A
MS: JEOL (JEOL), FABMS, HRFABMAS; JMS-SX 102A
EIMS, HREIMS; JMS-GCMATE
また、核磁気共鳴 (NMR)スペクトルにおいて、化学シフトδは百万分の一 (ppm)で表示し、略語はそれぞれ次の意味を有する：s：シングレット； d：ダブレット；dd：ダブルダブレット；t：トリプレット； q：クァルテット；dq：ダブルクァルテット；Ac；アセチル基；Tig：チグロイル基。 In nuclear magnetic resonance (NMR) spectra, chemical shift δ is expressed in parts per million (ppm), and abbreviations have the following meanings: s: singlet; d: doublet; dd: double doublet; : Triplet; q: quartet; dq: double quartet; Ac; acetyl group; Tig: tigloyl group.
実施例１
福建省産チャ (Camellia sinensis）の乾燥花部（茶花，1.5 kg) をMeOHで熱時抽出した。抽出液を濾過し、残渣にMeOHを加え、同様の抽出操作を計3回行った。MeOH抽出液を合わせて減圧下溶媒留去し、MeOH抽出エキス(467.2 kg、収率31.1％)を得た。得られたMeOH抽出エキスのうち450 gをAcOEtとH2Oで分配抽出後、H2O移行部をn-BuOHで分配抽出し、各移行部を減圧下溶媒留去して、AcOEt移行部エキス(46.6 g、3.2％)、n-BuOH移行部エキス(238.0 g、16.4％)
、H2O移行部エキス(174.9 g、12.1％)を得た。
Example 1
A dried flower part (tea flower, 1.5 kg) of a tea from Fujian Province (Camellia sinensis) was extracted hot with MeOH. The extract was filtered, MeOH was added to the residue, and the same extraction operation was performed three times. The MeOH extracts were combined and evaporated under reduced pressure to give a MeOH extract (467.2 kg, yield 31.1%). 450 g of the obtained MeOH extract was distributed and extracted with AcOEt and H 2 O, then the H 2 O transition part was partitioned and extracted with n-BuOH, and each transition part was evaporated under reduced pressure to give an AcOEt transition part. Extract (46.6 g, 3.2%), n-BuOH transition part extract (238.0 g, 16.4%)
, H 2 O transition part extract (174.9 g, 12.1%) was obtained.
（１） ＡｃＯＥｔ移行画分の精製
得られたAcOEt移行部エキス (40 g) を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー [2.0
kg、溶出剤：ヘキサン：酢酸エチル ＝ (10：1 → 5：1 → 1：1) → 酢酸エチル → CHCl3：MeOH ＝ (5：1 → 1：1) → MeOH] で分画し、Fr. 1 (7.1 g)、Fr. 2 (3.8 g)、Fr.
3 (3.1 g)、Fr. 4 (8.0 g)、Fr. 5 (8.1 g)、Fr. 6 (4.4 g) を得た。
(1) Purification of AcOEt transfer fraction The obtained AcOEt transfer portion extract (40 g) was subjected to normal phase silica gel column chromatography [2.0
kg, eluent: hexane: ethyl acetate = (10: 1 → 5: 1 → 1: 1) → ethyl acetate → CHCl 3: MeOH = (5 : 1 → 1: 1) → MeOH] fractionated, Fr 1 (7.1 g), Fr. 2 (3.8 g), Fr.
3 (3.1 g), Fr. 4 (8.0 g), Fr. 5 (8.1 g), and Fr. 6 (4.4 g) were obtained.
Fr. 3 (3.1 g)を逆相ODS カラムクロマトグラフィー [300 g、溶出剤：MeOH：H2O = (30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH → CHCl3] にて分画し、Fr. 3-1 (36.7 mg)、Fr. 3-2 (159.0 mg)、Fr. 3-3 (254.8 mg)、Fr. 3-4 (55.3 mg)、Fr. 3-5 (1.4 g)、Fr. 3-5 (818.3 mg) を得た。 Fr. 3 (3.1 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [300 g, eluent: MeOH: H 2 O = (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH → CHCl 3 ] Fr. 3-1 (36.7 mg), Fr. 3-2 (159.0 mg), Fr. 3-3 (254.8 mg), Fr. 3-4 (55.3 mg), Fr. 3- 5 (1.4 g), Fr. 3-5 (818.3 mg) were obtained.
Fr. 3-1 (36.7 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分] を用いて分離精製し、ベンジルアルコール(6.5 mg、0.0053％)を単離した。Fr. 3-2 (160 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分] を用いて分離精製し、プロトカテチュ酸 メチルエステル(11.3 mg、0.00092％)、ベンジルアルコール(8.6 mg、0.0012％)を単離した。Fr. 3-3 (250 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分] を用いて分離精製し桂皮酸(9.8 mg、0.00082％)を単離した。 Fr. 3-1 (36.7 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and benzyl alcohol (6.5 mg, 0.0053%) was isolated. Fr. 3-2 (160 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and protocatechuic acid methyl ester (11.3 mg, 0.00092%) and benzyl alcohol (8.6 mg, 0.0012%) were isolated. Fr. 3-3 (250 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and cinnamic acid (9.8 mg, 0.00082%) was isolated.
Fr. 4 (8.0 g)を逆相ODS カラムクロマトグラフィー[480 g、MeOH：H2O = (10：90) →(30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH → CH Cl3]にて分画し、Fr. 4-1 (654.6 mg)、Fr. 4-2 (212.5 mg)、Fr. 4-3 (2.4 g)、Fr. 4-4 (669.9 mg)、Fr. 4-5 (139.4 mg)、Fr. 4-6 (1.0 g)、Fr. 4-7 (668.9 mg) を得た。 Fr. 4 (8.0 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [480 g, MeOH: H 2 O = (10:90) → (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH → fractionated by CH Cl 3], Fr. 4-1 (654.6 mg), Fr. 4-2 (212.5 mg), Fr. 4-3 (2.4 g), Fr. 4-4 (669.9 mg), Fr. 4-5 (139.4 mg), Fr. 4-6 (1.0 g), and Fr. 4-7 (668.9 mg) were obtained.
Fr. 4-1 (654.6 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (10：90)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(+)-ガロカテキン(14.2 mg、0.0011％)を単離した。 Fr. 4-1 (654.6 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (10:90), flow rate : 9.0 mL / min], and (+)-gallocatechin (14.2 mg, 0.0011%) was isolated.
Fr. 4-2 (212.5 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(-)-エピガロカテキン 3-O-ガレート(199.6 mg、0.016％)を単離した。 Fr. 4-2 (212.5 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (199.6 mg, 0.016%) was isolated.
Fr. 4-3 (700 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(-)-エピガロカテキン 3-O-ガレート(29.3 mg、0.076％)、(-)-エピカテキン3-O-ガレート(160.4mg、0.44％)を単離した。 Fr. 4-3 (700 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (29.3 mg, 0.076%), (-)-epicatechin 3-O-gallate (160.4 mg, 0.44%) ) Was isolated.
Fr. 5 (8.1 g) を逆相ODS カラムクロマトグラフィー[120 g、溶出剤： MeOH：H2O = (10：90) → (30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH → CHCl 3] にて分画し、Fr.5-1 (93.9 mg)、Fr. 5-2 (200.0 mg)、Fr. 5-3 (1.9 g)、Fr. 5-4 (1.3 g)、Fr. 5-5 (339.5 mg)、Fr. 5-6 (863.1 mg)、Fr. 5-7 (406.7 mg)、Fr. 5-8 (1.3 g)、Fr. 5-9 (806.0 mg) を得た。 Fr. 5 (8.1 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [120 g, eluent: MeOH: H 2 O = (10:90) → (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH → fractionated by CHCl 3], Fr.5-1 (93.9 mg ), Fr. 5-2 (200.0 mg), Fr. 5-3 (1.9 g), Fr. 5-4 (1.3 g ), Fr. 5-5 (339.5 mg), Fr. 5-6 (863.1 mg), Fr. 5-7 (406.7 mg), Fr. 5-8 (1.3 g), Fr. 5-9 (806.0 mg) )
Fr. 5-3 (200 mg) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (30：70)、流速：8.0 mL/分] を用いて分離精製し、カフェイン(49.1 mg、0.037％)、(S)-1-フェニルエチル β-D-グルコピラノシド(17.2 mg、0.013％)を単離した。 Fr. 5-3 (200 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 8.0 mL / min], and caffeine (49.1 mg, 0.037%) and (S) -1-phenylethyl β-D-glucopyranoside (17.2 mg, 0.013%) were isolated.
Fr. 5-5 (339.5 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (45：55)、流速：8.0 mL/分]を用いて分離精製し、ケンペロール3-O-β-D-ガラクトピラノシド(34.3 mg、0.0027％)、ケンペロール3-O-β-D-グルコピラノシド(28.0 mg、0.0022％)を単離した。 Fr. 5-5 (339.5 mg) on reverse phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (45:55), flow rate : 8.0 mL / min], and purified by kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (34.3 mg, 0.0027%), kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (28.0 mg, 0.0022%) ) Was isolated.
Fr. 6 (4.4 g)を逆相ODS カラムクロマトグラフィー[120 g、溶出剤：MeOH：H2O = (10：90) → (30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH → CHCl 3]にて分画し、Fr.6-1 (223.6 mg)、Fr. 6-2 (114.5 mg)、Fr. 6-3 (131.5 mg)、Fr. 6-4 (941.5 mg)、Fr. 6-5 (540.4 mg)、Fr. 6-6 (768.5 mg)、Fr. 6-7 (343.6 mg)、Fr. 6-8 (120.5 mg)を得た。Fr.
6-4 (941.5 mg) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(-)-エピガロカテキン 3-O-ガレート(94.1 mg、0.045％)を単離した。
Fr. 6 (4.4 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [120 g, eluent: MeOH: H 2 O = (10:90) → (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH → fractionated by CHCl 3], Fr.6-1 (223.6 mg ), Fr. 6-2 (114.5 mg), Fr. 6-3 (131.5 mg), Fr. 6-4 (941.5 mg ), Fr. 6-5 (540.4 mg), Fr. 6-6 (768.5 mg), Fr. 6-7 (343.6 mg), and Fr. 6-8 (120.5 mg). Fr.
6-4 (941.5 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate: 9.0 (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (94.1 mg, 0.045%) was isolated.
（２）ｎ−ＢｕＯＨ移行画分の精製
得られたn-BuOH移行部エキス(170 g)を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー[シリカゲル3.0 kg、溶出剤；CHCl3 → CHCl3：MeOH：H2O＝10：3：1 (下層) → 7：3：1 (下層) → 6：4：1 → MeOH]で分画し、Fr. 1 (1.9 g)、Fr. 2 (25.5 g)、Fr. 3 (10.3 g)、Fr. 4 (115.0 g)、Fr. 5 (7.5 g) を得た。
(2) Purification of n-BuOH transfer fraction The obtained n-BuOH transfer extract (170 g) was subjected to normal phase silica gel column chromatography [silica gel 3.0 kg, eluent; CHCl 3 → CHCl 3 : MeOH: H 2 O = 10: 3: 1 (lower layer) → 7: 3: 1 (lower layer) → 6: 4: 1 → MeOH], Fr. 1 (1.9 g), Fr. 2 (25.5 g), Fr. 3 (10.3 g), Fr. 4 (115.0 g), and Fr. 5 (7.5 g) were obtained.
Fr. 2 (10.0 g)を逆相ODSカラムクロマトグラフィー[300 g、溶出剤；MeOH：H2O = (30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH → CHCl3] にて分画し、Fr. 2-1 (4.5 g)、Fr.
2-2 (868.8 mg)、Fr. 2-3 (309.6 mg)、Fr. 2-4 (2.0 g)、Fr. 2-5 (822.4 mg) を得た。
Fr. 2 (10.0 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [300 g, eluent; MeOH: H 2 O = (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH → CHCl 3 ] Fr. 2-1 (4.5 g), Fr.
2-2 (868.8 mg), Fr. 2-3 (309.6 mg), Fr. 2-4 (2.0 g), and Fr. 2-5 (822.4 mg) were obtained.
Fr. 2-1 (300 mg) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分] を用いて分離精製し、カフェイン(81.1 mg、0.30％)、(S)-1-フェニルエチルβ-D-グルコピラノシド(12.4 mg、0.047％)を単離した。 Fr. 2-1 (300 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and caffeine (81.1 mg, 0.30%) and (S) -1-phenylethyl β-D-glucopyranoside (12.4 mg, 0.047%) were isolated.
Fr. 3 (10.3 g) を逆相ODS カラムクロマトグラフィー [300 g、MeOH：H2O = (10：90)→ (30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH → CHCl3] にて分画し、Fr. 3-1 (1.7 g)、Fr. 3-2 (4.8 g)、Fr. 3-3 (1.9 g)、Fr. 3-4 (1.8 g)、Fr. 3-5 (2.8 g) を得た。 Fr. 3 (10.3 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [300 g, MeOH: H 2 O = (10:90) → (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH → fractionated at CHCl 3], Fr. 3-1 ( 1.7 g), Fr. 3-2 (4.8 g), Fr. 3-3 (1.9 g), Fr. 3-4 (1.8 g), Fr 3-5 (2.8 g) was obtained.
Fr. 3-2 (300 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、カフェイン(1.1 mg、0.30％)、ベンジルβ-D-グルコピラノシド(1.2 mg、0.00012％)、(-)-エピカテキン(0.8 mg、0.000077％)および(S)-1-フェニルエチルβ-D-グルコピラノシド(33.0 mg、0.094％)を単離した。 Fr. 3-2 (300 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min] and purified by caffeine (1.1 mg, 0.30%), benzyl β-D-glucopyranoside (1.2 mg, 0.00012%), (−)-epicatechin (0.8 mg, 0.000077%) And (S) -1-phenylethyl β-D-glucopyranoside (33.0 mg, 0.094%) were isolated.
Fr. 4 (115 g) を逆相ODS カラムクロマトグラフィー [530 g、MeOH：H2O = (10：90) → (30：70) → (50：50) → (70：30) → MeOH] にて分画し、Fr. 4-1 (6.6 g)、Fr. 4-2 (15.7 g)、Fr. 4-3 (9.2 g)、Fr. 4-4 (13.4 g)、Fr. 4-5 (6.7 g)、Fr. 4-6 (12.5 g)、Fr. 4-7 (24.1 g)、Fr. 4-8 (23.3 g)、Fr. 4-9 (4.7 g)を得た。 Fr. 4 (115 g) was subjected to reverse phase ODS column chromatography [530 g, MeOH: H 2 O = (10:90) → (30:70) → (50:50) → (70:30) → MeOH] Fr. 4-1 (6.6 g), Fr. 4-2 (15.7 g), Fr. 4-3 (9.2 g), Fr. 4-4 (13.4 g), Fr. 4- 5 (6.7 g), Fr. 4-6 (12.5 g), Fr. 4-7 (24.1 g), Fr. 4-8 (23.3 g), and Fr. 4-9 (4.7 g) were obtained.
Fr. 4-1 (654.6 mg) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (10：90)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(+)-ガロカテキン(14.2 mg、0.0011％)を単離した。 Fr. 4-1 (654.6 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (10:90), flow rate : 9.0 mL / min], and (+)-gallocatechin (14.2 mg, 0.0011%) was isolated.
Fr. 4-3 (500 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (20：80)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(-)-エピガロカテキン3-O-ガレート(118.7 mg、0.21％)を単離した。 Fr. 4-3 (500 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (20:80), flow rate : 9.0 mL / min], and (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (118.7 mg, 0.21%) was isolated.
Fr. 4-4 (500 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、(-)-エピガロカテキン3-O-ガレート(29.3 mg、0.076％)を単離した。 Fr. 4-4 (500 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and (-)-epigallocatechin 3-O-gallate (29.3 mg, 0.076%) was isolated.
Fr. 4-5 (200 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (50：50)、流速：9.0 mL/分] を用いて分離精製し、ケンペロール3-O-β-D-グルコピラノシル(1→3)-α-L-ラムノピラノシル(1→6)-β-D-グルコピラノシド(43.5 mg、0.14％)を単離した。 Fr. 4-5 (200 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (50:50), flow rate : 9.0 mL / min], and purified by kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl (1 → 3) -α-L-rhamnopyranosyl (1 → 6) -β-D-glucopyranoside (43.5 mg, 0.14 %) Was isolated.
Fr. 4-6 (12.5 g) を逆相ODS カラムクロマトグラフィー [370 g、MeOH：H2O = (50：50) → (60：40) → MeOH]にて分画し、Fr. 4-6-1 (200.2 mg)、Fr. 4-6-2 (3.8 g)、Fr. 4-6-3 (6.2 g)、Fr. 4-6-4 (1.2 g)、Fr. 4-6-5 (447.6 mg)を得た。 Fr. 4-6 (12.5 g) was fractionated by reversed-phase ODS column chromatography [370 g, MeOH: H 2 O = (50:50) → (60:40) → MeOH]. 6-1 (200.2 mg), Fr. 4-6-2 (3.8 g), Fr. 4-6-3 (6.2 g), Fr. 4-6-4 (1.2 g), Fr. 4-6- 5 (447.6 mg) was obtained.
Fr. 4-6-2 (1 g)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)
、溶出剤： MeOH：H2O = (55：45)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、新規フラボノイド チャカフラボノシドＡ (83.7 mg、0.0078％)を単離した。
Fr. 4-6-3 (1 g) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (70：30)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、Fr. 4-6-3-1(52.1 mg)、Fr. 4-6-3-2 (159.7 mg)、Fr. 4-6-3-3 (87.2 mg)、Fr. 4-6-3-4 (28.4 mg)を得た。
Fr. 4-6-2 (1 g) was reversed-phase HPLC [Detection: RI, Column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id)
, Eluent: MeOH: H 2 O = (55:45), flow rate: 9.0 mL / min], and the new flavonoid chacaflavonoside A (83.7 mg, 0.0078%) was isolated.
Fr. 4-6-3 (1 g) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (70:30) , Flow rate: 9.0 mL / min], Fr. 4-6-3-1 (52.1 mg), Fr. 4-6-3-2 (159.7 mg), Fr. 4-6-3 -3 (87.2 mg) and Fr. 4-6-3-4 (28.4 mg) were obtained.
Fr. 4-6-3-2 (159.7 mg) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (65：35)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、チャカサポニンＩＩＩ(21.8 mg、0.013％)を単離した。 Fr. 4-6-3-2 (159.7 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (65: 35), flow rate: 9.0 mL / min], and chacasaponin III (21.8 mg, 0.013%) was isolated.
Fr. 4-7 (1 g) を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤：MeOH：H2O = (30：70)、流速：9.0 mL/分]を用いて分離精製し、チャカサポニンＩ(212.3 mg、0.49％)を単離した。 Fr. 4-7 (1 g) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (30:70), flow rate : 9.0 mL / min], and chachasaponin I (212.3 mg, 0.49%) was isolated.
Fr. 4-8 (200 mg)を逆相HPLC [検出：RI、カラム：YMC-Pack ODS-A (250×20 mm i.d.)、溶出剤： MeOH：H2O = (70：30)、流速：9.0 mL/分] を用いて分離精製し、チャカサポニンＩＩ(61.3 mg、0.67％)を単離した。 Fr. 4-8 (200 mg) was reversed-phase HPLC [detection: RI, column: YMC-Pack ODS-A (250 × 20 mm id), eluent: MeOH: H 2 O = (70:30), flow rate : 9.0 mL / min], and chakasaponin II (61.3 mg, 0.67%) was isolated.
既知化合物については、文献値の1H-NMRおよび13C-NMRスペクトルデータの比較により同定した。 Known compounds were identified by comparison of literature values of 1 H-NMR and 13 C-NMR spectral data.
（３）チャカサポニンＩ、ＩＩ、ＩＩＩの脱アシル化
チャカサポニンＩ(19 mg)を10 ％ aq. KOH-50％ aq. 1,4-ジオキサン( 1：1、1 mL) 溶液中、37℃で1時間攪拌した。その反応液を陰イオン交換樹脂 Dowex HCR W2 (商標) (H+型) を用いて中和し、樹脂を濾別後、溶媒を減圧留去し粗生成物(18.5 mg)を得た。
(3) Deacylation of Chacasaponins I, II, III Chacasaponins I (19 mg) in 10% aq. KOH-50% aq. 1,4-dioxane (1: 1, 1 mL) in a solution at 37 ° C For 1 hour. The reaction solution was neutralized using an anion exchange resin Dowex HCR W2 (trademark) (H + type), the resin was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product (18.5 mg).
得られた粗生成物(17.5 mg)を順相SiO2カラムクロマトグラフィー [50 mg、溶出剤：CHCl3：MeOH：H2O (10：3：1 → 6：4：1、下層)]を用いて分離し、既知化合物デスアシル-アッサムサポニンE (14.2 mg)を得た。 The obtained crude product (17.5 mg) was subjected to normal phase SiO 2 column chromatography [50 mg, eluent: CHCl 3 : MeOH: H 2 O (10: 3: 1 → 6: 4: 1, lower layer)]. To obtain a known compound desacyl-assam saponin E (14.2 mg).
また粗生成物(1.0 mg)の(CH2)2Cl2 (2 mL)溶液にp-ニトロベンジル-N、N'-ジイソプロピルイソウレア(10 mg)を加え、80℃で1 時間攪拌し、HPLC用サンプルとした。以下に示す条件でHPLC分析を行い、標品(市販有機酸から調製したp-ニトロベンジルエステル)とのHPLCの保持時間を比較した。その結果、チャカサポニンＩのアシル基がアセチル基およびチグロイル基であることが判明した。 Also, p-nitrobenzyl-N, N′-diisopropylisourea (10 mg) was added to a solution of the crude product (1.0 mg) in (CH 2 ) 2 Cl 2 (2 mL), and the mixture was stirred at 80 ° C. for 1 hour. A sample for HPLC was used. HPLC analysis was performed under the conditions shown below, and the HPLC retention time was compared with a standard product (p-nitrobenzyl ester prepared from a commercially available organic acid). As a result, it was proved that the acyl group of chacasaponin I was an acetyl group and a tigloyl group.
チャカサポニンＩＩ(6.4 mg)およびチャカサポニンＩＩＩ(3.0 mg)についても上記と同様の操作を行った。その結果、チャカサポニンＩＩの脱アシル化によりデスアシル-フローラティーサポニンB (4.2 mg)が得られ、チャカサポニンＩＩのアシル基がチグロイル基であることが判明した。 The same operation as described above was performed for chacasaponin II (6.4 mg) and chacasaponin III (3.0 mg). As a result, it was found that desacyl-floraty saponin B (4.2 mg) was obtained by deacylation of chakasaponin II, and the acyl group of chakasaponin II was a tigloyl group.
また、チャカサポニンＩＩＩの脱アシル化によりデスアシル-フローラティーサポニンB (2.0 mg)が得られ、チャカサポニンＩＩＩのアシル基がアセチル基およびチグロイル基であることが判明した。 Further, desacyl-floraty saponin B (2.0 mg) was obtained by deacylation of chakasaponin III, and it was found that the acyl groups of chakasaponin III were an acetyl group and a tigloyl group.
HPLC条件： カラム：YMC-Pack ODS-A (250×4.6 mm i.d.)
溶出液検出器：旋光度(Shodex OR-2)
移動相：MeCN：H2O = (50：50)
流速：1.0 mL/分
カラム温度：室温
保持時間 (tR)：p-ニトロベンジル アセチレート：8.9 分、
p-ニトロベンジル チグレート：35.1 分
HPLC conditions: Column: YMC-Pack ODS-A (250 x 4.6 mm id)
Eluent detector: Optical rotation (Shodex OR-2)
Mobile phase: MeCN: H 2 O = (50:50)
Flow rate: 1.0 mL / min
Column temperature: room temperature
Retention time (t R ): p-nitrobenzyl acetylate: 8.9 minutes
p-Nitrobenzyl tiglate: 35.1 minutes
デスアシル-フローラティーサポニンB の酸加水分解
デスアシル-フローラティーサポニンB (2 mg) の5％ aq. H2SO4-1,4-ジオキサン(1：1、v/v、1 mL) 溶液を2 時間加熱還流した。その反応液を陰イオン交換樹脂IRA-400 (商標) (OH- 型)で中和し、樹脂を濾別後、減圧下溶媒を留去し粗生成物(2 mg)を得た。得られた粗生成物を Sep-Pak C18 カートリッジ(H2O → MeOH)で分離し、H2O 溶出部と MeOH 溶出部を得た。
Acid hydrolysis of desacyl-floraty saponin B 2% aq. H 2 SO 4 -1,4-dioxane (1: 1, v / v, 1 mL) solution of desacyl-floraty saponin B (2 mg) Heated to reflux for hours. The reaction solution was neutralized with an anion exchange resin IRA-400 (trademark) (OH - type), the resin was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain a crude product (2 mg). The obtained crude product was separated with a Sep-Pak C18 cartridge (H 2 O → MeOH) to obtain a H 2 O eluate and a MeOH eluate.
そのMeOH溶出部について、溶媒を減圧下留去し得た化合物は、1H-NMR、13C-NMR、MS スペクトルから、既知化合物 R1-バリゲノールであることが判明した。
一方、H2O 溶出部について、溶媒を減圧下留去し得た残留物のピリジン溶液(0.1 mL)にL-システイン メチルエステル 塩酸塩(CMEH、1.0 mg)を加え、60℃で1 時間攪拌した。続いて N,N-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA、0.1 mL)を反応液に加え、さらに、60℃で1 時間攪拌後、遠心分離し、GC用サンプルとして以下に示す条件でGC分析を行い標品と同定した。その結果、デスアシル-フローラティーサポニンBの構成糖は、D-グルクロン酸、D-ガラクトース、L-アラビノースおよびD-キシロースであることが判明した。
About the MeOH elution part, the compound which could distill off the solvent under reduced pressure was 1 H-NMR, 13 C-NMR, MS From the spectrum it was found to be the known compound R 1 -Varigenol.
On the other hand, for the H 2 O eluate, L-cysteine methyl ester hydrochloride (CMEH, 1.0 mg) was added to the residual pyridine solution (0.1 mL) obtained by evaporating the solvent under reduced pressure, and the mixture was stirred at 60 ° C for 1 hour. did. Subsequently, N, N-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA, 0.1 mL) was added to the reaction solution, and the mixture was further stirred at 60 ° C for 1 hour, centrifuged, and analyzed by GC under the conditions shown below as a GC sample. And identified as a standard. As a result, it was found that the constituent sugars of desacyl-floraty saponin B were D-glucuronic acid, D-galactose, L-arabinose and D-xylose.
ＧＣ条件： カラム： Supelco STB-1 (30 m×0.25 mm i.d.)
Injector temp：230 ℃
Detector temp：230 ℃
カラム temp：230 ℃
Carrier gas：N2
保持時間 (tR)： D-グルクロン酸：26.5 分、
D-ガラクトース：25.6 分、
L-アラビノース：15.1 分、
D-キシロース： 19.3 分
GC condition: Column: Supelco STB-1 (30 m × 0.25 mm id)
Injector temp: 230 ℃
Detector temp: 230 ° C
Column temp: 230 ° C
Carrier gas: N 2
Retention time (t R ): D-glucuronic acid: 26.5 minutes
D-galactose: 25.6 minutes,
L-arabinose: 15.1 minutes
D-xylose: 19.3 minutes
チャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩの1Ｈ−ＮＭＲ（600 MHz）データおよび13Ｃ−ＮＭＲ（150 MHz）データを以下の表にまとめて示す。 The 1 H-NMR (600 MHz) data and 13 C-NMR (150 MHz) data of Chacasaponin I, Chacasaponin II and Chacasaponin III are summarized in the following table.
本願発明により見出された新規サポニン化合物、チャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩ、チャカサポニンＩＩＩおよびチャカフラボノシドＡに関して、それぞれの化学構造式に1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフトの値を記入した構造式と、Ｃ−Ｈ相関を示した構造式をそれぞれの物理データと共に以下に示す。 With respect to the novel saponin compounds discovered by the present invention, chakasaponin I, chakasaponin II, chakasaponin III and chacaflavonoside A, the chemical shift values of 1 H-NMR and 13 C-NMR are shown in the respective chemical structural formulas. The entered structural formula and the structural formula showing the C—H correlation are shown below together with the respective physical data.
試験例１
小腸内輸送に対する茶花成分の作用
評価方法
以下の表に示す数の３０〜３５ｇのｄｄｙマウスを１週間予備飼育した後、約２４時間絶食して評価試験に用いた。
Test example 1
Method for Evaluating Action of Tea Flower Component on Intestinal Transport After the 30-35 g ddy mice of the number shown in the following table were preliminarily raised for 1 week, they were fasted for about 24 hours and used for the evaluation test.
評価試験には、茶花メタノール抽出物、ｎ−ブタノール可溶画分の濃縮物、チャカサポニンＩ〜ＩＩＩを用い、各群のマウスに対し、５％アラビアゴムで懸濁したサンプル懸濁液を経口投与（10 mL/kg）し、その６０分後に１.５％CMC-Naに懸濁させた５％炭素末を0.3 mL/マウスで経口投与した。投与１５分後に開腹し、噴門から盲腸まで摘出し、幽門部から炭素末到達先端までの距離を測定後、小腸全長に対する百分率を算出した。
その結果を、以下の表に示す。
For the evaluation test, tea flower methanol extract, n-butanol soluble fraction concentrate, chacasaponins I to III were used, and a sample suspension suspended in 5% gum arabic was orally administered to each group of mice. Administration (10 mL / kg), 60 minutes later, 5% carbon powder suspended in 1.5% CMC-Na was orally administered at 0.3 mL / mouse. 15 minutes after administration, the abdomen was opened, the cardia was removed from the cecum, the distance from the pylorus to the tip of the carbon end was measured, and then the percentage of the entire small intestine was calculated.
The results are shown in the following table.
上記の結果から、腸管輸送試験において、茶花メタノール抽出物および特にｎ−ブタノール画分の濃縮物は腸運動亢進作用を有することが判明した。さらに、上記のｎ−ブタノール画分に含まれるチャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩはいずれも、強力な腸運動亢進作用を有することが判明した。 From the above results, in the intestinal transport test, it was found that the tea flower methanol extract and particularly the concentrate of the n-butanol fraction have an intestinal motility enhancing action. Furthermore, it was found that all of chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III contained in the n-butanol fraction have a strong intestinal motility enhancing action.
試験例２
膵リパーゼ活性Iに対する茶花成分の阻害効果
評価方法
トリオレイン(80 mg)、フォスファチジルコリン(10 mg)およびタウロコール酸(5 mg)の0.1 mL NaClを含む0.1 mol/L Tris-HClバッファー(pH=7.0) 9 mLの懸濁液を10分間超音波処理した。この超音波処理した基質懸濁液(0.1 mL)を豚膵リパーゼ(250 μg/mL、2型、ブランクはTris-HClバッファー0.05 mLを用いる) 0.05 mL、種々の濃度のサンプル溶液(DMSO) 0.005 mLおよびTris-HClバッファー0.095 mLと共に、最終容量0.25 mLで、37℃で30分インキュベートした。
Test example 2
Method for evaluating the inhibitory effect of tea flower components on pancreatic lipase activity I 0.1 mol / L Tris-HCl buffer (pH) containing 0.1 mL NaCl of triolein (80 mg), phosphatidylcholine (10 mg) and taurocholic acid (5 mg) = 7.0) 9 mL of the suspension was sonicated for 10 minutes. This sonicated substrate suspension (0.1 mL) was added to porcine pancreatic lipase (250 μg / mL, type 2, 0.05 mL Tris-HCl buffer for blank), 0.05 mL sample solution (DMSO) of various concentrations, 0.005 Incubated with 37 mL of Tris-HCl buffer and 30 min at 37 ° C. in a final volume of 0.25 mL.
このインキュベートした混合物を、チューブ中のCHCl3と2％MeOH含有n-ヘプタンとの１：１（容量）混液に加えて、このチューブをシェーカーで水平方向に１分間振盪して抽出した。 The incubated mixture was added to a 1: 1 (volume) mixture of CHCl 3 and 2% MeOH in n-heptane in a tube and the tube was extracted by shaking for 1 minute in a horizontal direction on a shaker.
この混合物を2500 rpmで5分間遠心分離し、上部の水相を吸引除去した。次いで、下部の有機相に銅試薬(1.0 mL)を加えた。このチューブを1分間振盪し、この混合物を2500 rpmで5分間遠心分離して、抽出された遊離脂肪酸の銅塩を含む上部の有機相1 mLを、ヒドロキシアニソール0.5 g/mLを含み、バソクプロイン(bathocuproine)を1 g/Lの割合で含むCHCl3 1 mLで処理した。次いで、波長480 nmで試料の吸光度を測定した。
以下に、ティーサポニンE1、ティーサポニンE2、チャカサポニンI、IIおよびIIIの各種濃度における、豚膵リパーゼ活性に対する阻害効果の結果を示す。
The mixture was centrifuged at 2500 rpm for 5 minutes, and the upper aqueous phase was removed by suction. The copper reagent (1.0 mL) was then added to the lower organic phase. The tube was shaken for 1 minute, the mixture was centrifuged at 2500 rpm for 5 minutes, 1 mL of the top organic phase containing the extracted free fatty acid copper salt was added to hydroxyanisole 0.5 g / mL, and bathocuproine ( bathocuproine) was treated with 1 mL of CHCl 3 containing 1 g / L. Next, the absorbance of the sample was measured at a wavelength of 480 nm.
The results of the inhibitory effect on porcine pancreatic lipase activity at various concentrations of tea saponin E1, tea saponin E2, chaka saponins I, II and III are shown below.
上記の結果から、膵リパーゼ活性阻害試験において、チャカサポニンＩ、チャカサポニンＩＩおよびチャカサポニンＩＩＩはいずれも、対照薬として用いたチャ種子サポニン（ティーサポニンＥ１，Ｅ２）よりも強い膵リパーゼ活性阻害を有し、遊離脂肪酸産生抑制効果や中性脂質の吸収抑制効果を有することが判明した。 From the above results, in the pancreatic lipase activity inhibition test, chacasaponin I, chacasaponin II and chacasaponin III all inhibited pancreatic lipase activity inhibition stronger than the cha seed saponin (tea saponin E1, E2) used as a control drug. It has been found that it has a free fatty acid production inhibitory effect and a neutral lipid absorption inhibitory effect.
実施例２
当該分野で公知の方法に従って、茶花抽出物10重量部を乳糖25重量部と混合し、ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に抽出物が500 mg含有されるゼラチンカプセル剤を得た。
Example 2
According to a method known in the art, 10 parts by weight of tea flower extract was mixed with 25 parts by weight of lactose and filled into gelatin capsules to obtain gelatin capsules containing 500 mg of extract in one capsule.
実施例３
実施例１で得られた水性移行部を実施例２の茶花抽出物に替えて、実施例２と同様にして、ゼラチンカプセル剤を得た。
Example 3
A gelatin capsule was obtained in the same manner as in Example 2, except that the aqueous transition part obtained in Example 1 was replaced with the tea flower extract of Example 2.
実施例４
実施例１で得られたｎ−ＢｕＯＨ可溶画分の濃縮物を実施例２の茶花抽出物に替えて、実施例２と同様にして、ゼラチンカプセル剤を得た。
Example 4
A gelatin capsule was obtained in the same manner as in Example 2, except that the concentrate of the n-BuOH soluble fraction obtained in Example 1 was replaced with the tea flower extract of Example 2.
実施例５
米粉５０重量部、砂糖５重量部、全卵１０重量部、実施例１で得られた茶花抽出物１重量部を秤量した。
全卵に砂糖を混合した後、予め篩に通した米粉を加え、軽く混ぜ合わせて生地を作り、これを適当な形に成形し、オーブンで焼き上げて、せんべいを作った。
Example 5
50 parts by weight of rice flour, 5 parts by weight of sugar, 10 parts by weight of whole eggs, and 1 part by weight of tea flower extract obtained in Example 1 were weighed.
After mixing sugar with whole eggs, rice flour previously passed through a sieve was added and lightly mixed to make a dough, which was shaped into an appropriate shape and baked in an oven to make a rice cracker.
実施例６
実施例１で得られた水性移行部を実施例５の茶花抽出物に替えて、実施例５と同様にしてせんべいを作った。
Example 6
A rice cracker was made in the same manner as in Example 5 by replacing the aqueous transition part obtained in Example 1 with the tea flower extract of Example 5.
実施例７
実施例１で得られたｎ−ＢｕＯＨ可溶画分の濃縮物を実施例５の茶花抽出物に替えて、実施例５と同様にして、せんべいを作った。
Example 7
A rice cracker was prepared in the same manner as in Example 5, except that the concentrate of the n-BuOH soluble fraction obtained in Example 1 was replaced with the tea flower extract of Example 5.
実施例８
小麦粉１００重量部、塩４重量部、実施例１で得られた茶花抽出物５重量部および水４５重量部を秤量し、常法に従ってこれらをよく混合して、うどんを製造した。
Example 8
100 parts by weight of flour, 4 parts by weight of salt, 5 parts by weight of the tea flower extract obtained in Example 1 and 45 parts by weight of water were weighed and mixed well according to a conventional method to produce udon.
実施例９
実施例１で得られた水性移行部を実施例８の茶花抽出物に替えて、実施例８と同様にしてうどんを製造した。
Example 9
Udon was produced in the same manner as in Example 8, except that the aqueous transition part obtained in Example 1 was replaced with the tea flower extract of Example 8.
実施例１０
実施例１で得られたｎ−ＢｕＯＨ可溶画分の濃縮物を実施例８の茶花抽出物に替えて、実施例８と同様にして、うどんを製造した。
Example 10
Udon was produced in the same manner as in Example 8, except that the concentrate of the n-BuOH soluble fraction obtained in Example 1 was replaced with the tea flower extract of Example 8.
本発明による茶花抽出物、または該抽出物に含まれる本発明によるサポニン化合物またはその塩の少なくとも一つを有効成分とする組成物は、腸管運動亢進作用および膵リパーゼ活性阻害作用を有しており、腸閉塞症および便秘の予防・改善用組成物、ならびに遊離脂肪酸産生阻害剤、抗肥満および抗脂血症用組成物として安全に使用できる。 The tea flower extract according to the present invention, or the composition comprising at least one of the saponin compounds according to the present invention or a salt thereof contained in the extract as an active ingredient has an intestinal motility enhancing action and a pancreatic lipase activity inhibiting action. It can be safely used as a composition for preventing / ameliorating intestinal obstruction and constipation, and a free fatty acid production inhibitor, anti-obesity and anti-lipidemia composition.
Claims (8)
Ｒ 1 がヒドロキシ基であり、Ｒ 2 およびＲ 3 がチグロイル基であるか；または
Ｒ 1 がヒドロキシ基であり、Ｒ 2 がアセチル基であり、Ｒ 3 がチグロイル基である］
で表されるサポニン化合物またはその塩。 The following general formula (1):
R 1 is a hydroxy group and R 2 and R 3 are tigloyl groups; or
R 1 is a hydroxy group, R 2 is an acetyl group, and R 3 is a tigloyl group ]
Or a salt thereof.
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