JP5273461B2

JP5273461B2 - レトロウイルス感染抑制剤

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Publication number: JP5273461B2
Application number: JP2008544091A
Authority: JP
Inventors: 嘉直久保; 陽香神山
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2027-09-20
Also published as: US8415399B2; US20100056629A1; WO2008059662A1; JPWO2008059662A1; US20120065263A1

Description

本発明はレトロウイルス感染抑制剤に関する。より具体的には、本発明は、あるレチノイド類似体を有効成分として含有する、ヒト免疫不全ウイルス等のレトロウイルスの感染抑制剤に関する。

レトロウイルスは、レトロウイルス科に属するウイルスであって、遺伝子としてＲＮＡを持ち、自身の有する逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の働きによりＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する段階を自己複製の第１段階とするウイルスの総称である。レトロウイルス科は３つの亜科（オンコウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス）からなる。レトロウイルスは、鳥類や哺乳類の種々の動物を宿主として感染、増殖し、肉腫、白血病、癌等を引き起こすことが知られている。ヒトを宿主とするレトロウイルスとしては、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T-cell leukemia virus、ＨＴＬＶ）および
ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus, ＨＩＶ）等が報告されている。ＨＩＶは重篤な免疫不全症である後天性免疫不全症候群（aquired immunodeficiency syndrome, ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであることが分かっている。
ＡＩＤＳは、ＨＩＶ複製に必須な逆転写酵素および蛋白分解酵素を阻害する化合物の開発と、それら化合物の併用療法の確立によって、ある程度制圧できるようになった。しかし、耐性ウイルスの出現が大きな問題となっており、逆転写酵素および蛋白質分解酵素以外のＨＩＶ複製に必須な機構を阻害する化合物の開発が望まれている。
ＨＩＶはヘルパーＴ細胞やマクロファージ細胞膜に存在するＣＤ４分子を受容体として感染するが、その際、ＣＤ４分子と協同してウイルスのエントリーを促進する補助因子（コレセプター）が必要である。コレセプターとしては、現在のところ、ケモカイン（炎症性サイトカイン）受容体のＣＸＣＲ４とＣＣＲ５が同定されている（非特許文献１）。
上述のように、ＨＩＶは、標的細胞のＣＤ４およびＣＸＣＲ４等の一連のケモカインレセプターを認識した後、ウイルスエンベロープと細胞膜の融合によって細胞内に侵入する。そのため、膜の構成成分である脂質の変化が、ＨＩＶ感染に影響を与えると考えられる。レチノイドの類似体であるフェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ；４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｒｅｔｉｎｏｉｄ）は、膜の脂質成分においてセラミドのレベルを特異的に増加させることが知られており、ＨＩＶの細胞内侵入を抑制することが既に報告されている(非特許文献２、非特許文献３)。しかし、フェンレチニドは細胞毒性が強く、臨床に応用することが困難である。
Berger, E. A., Doms, R. W., Fenyo, E.- M., Korber, B. T. M., Littman, D. R., Moore, J. P., Sattentau, Q. J., Schuitemaker, H., Sodroski, J.,and Weiss, R. A. 1998. A new classification for HIV-1. Nature 391, 240. Finnegan, C. M., Rawat, S. S., Puri, A., Wang, J. M., Ruscetti, F. W., and Blumenthal, R. 2004. Ceramide, a target for antiretroviral therapy. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101, 15452-15457. Finnegan, C. M., and Blumenthal, R. 2006. Fenretinide inhibits HIV infection by promoting viral endocytosis. Antiviral Res. 69, 116-123. Shidoji, Y., and Ogawa, H. 2004. Natural occurrence of cancer-preventive geranylgeranoic acid in medicinal herbs. J.Lipid Res. 45, 1092-1103. Muto, Y., Moriwaki, H., and Saito, A. 1999. Prevention of second primary tumors by an acyclic retinoid in patients with hepatocellular carcinoma. N.Engl.J.Med. 340, 1046-1047.

本発明は、ＨＩＶ等のレトロウイルスの細胞内侵入を標的としたレトロウイルス感染抑制剤の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、フェンレチニドとは異なる非環式レチノイドにＨＩＶ感染抑制作用を見出した。さらにその細胞毒性がフェンレチニドと比較して顕著に低減されていることを確認して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する、レトロウイルス感染抑制剤。

［２］式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩、又は式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含有する、上記［１］記載の剤。
［３］レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、上記［１］又は［２］記載の剤。
［４］レトロウイルス感染抑制が、ＣＸＣＲ４の発現低下作用によるものである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
［５］式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する、ＨＩＶ感染症の治療剤。
［６］式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物の有効量を、その投与を必要とする対象に投与することを含む、レトロウイルス感染を抑制する方法。
［７］式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩、又は式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩の有効量を、その投与を必要とする対象に投与することを含む、上記［６］記載の方法。
［８］レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、上記［６］又は［７］記載の方法。
［９］レトロウイルス感染抑制が、ＣＸＣＲ４の発現低下作用によるものである、上記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩、及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの化合物の有効量を、その投与を必要とする対象に投与することを含む、ＨＩＶ感染症の治療方法。

本発明によって提供されるレトロウイルス感染抑制剤は、レトロウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の細胞内侵入を阻害し、従来のものに比べてその細胞毒性が低減されている。

フェンレチニドのＨＩＶ感染に及ぼす影響を示すグラフである。フェンレチニドの細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。ＧＧＡのＨＩＶ感染に及ぼす影響を示すグラフである。ＧＧＡの細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。ＮＩＫ−３３３のＨＩＶ感染に及ぼす影響を示すグラフである。ＮＩＫ−３３３の細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞におけるフェンレチニドとＧＧＡのＣＤ４発現に及ぼす影響を示すグラフである。ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞におけるＧＧＡのＣＤ４発現に及ぼす影響を示すグラフである。ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞におけるフェンレチニドとＧＧＡのＣＸＣＲ４発現に及ぼす影響を示すグラフである。ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞におけるＧＧＡのＣＸＣＲ４発現に及ぼす影響を示すグラフである。ＧＧＡのＨＩＶ感染及び細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。フェンレチニドのＨＩＶ感染及び細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。ＮＩＫ−３３３のＨＩＶ感染及び細胞増殖に及ぼす影響を示すグラフである。レチノイドのＶＳＶ感染に及ぼす影響を示すグラフである。Ａ：ＧＧＡ、Ｂ：フェンレチニド、Ｃ：ＮＩＫ−３３３レチノイドのＣＣＲ５指向性ＨＩＶ感染に及ぼす影響を示すグラフである。レチノイドのシンシチウム形成に及ぼす影響を示すグラフである。ＧＧＡのＣＤ４細胞表面発現及びＣＸＣＲ４細胞表面発現に及ぼす影響を示すグラフである。フェンレチニドのＣＤ４細胞表面発現及びＣＸＣＲ４細胞表面発現に及ぼす影響を示すグラフである。ＮＩＫ−３３３のＣＤ４細胞表面発現及びＣＸＣＲ４細胞表面発現に及ぼす影響を示すグラフである。

文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照することにより本明細書に組み入れられる。

本発明に有効成分として含められる、式（Ｉ）で表される化合物は、薬草中に含まれるゲラニルゲラノイル酸（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｏｉｃａｃｉｄ；ＧＧＡ）として知られ、膜脂質のセラミドレベルを増加させること、ならびに肝臓癌細胞のアポトーシスを引き起こすことから癌治療薬又は癌予防薬として期待できることが報告されている（非特許文献４）。本明細書では、式（Ｉ）で表される化合物をＧＧＡと略することもある。ＧＧＡは、公知化合物であり、以前に報告された方法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる。

式（ＩＩ）で表される化合物は、ＮＩＫ−３３３とも称される公知化合物であるが、抗癌作用及び発癌予防作用を有することが知られている（非特許文献５）。本明細書では、式（ＩＩ）で表される化合物をＮＩＫ−３３３と略することもある。

本発明の感染抑制剤に有効成分として含められる式（Ｉ）で表される化合物及び式（ＩＩ）で表される化合物は、そのレトロウイルス感染抑制作用を有している限り誘導体化されていてもよい。誘導体化することにより、その特異性や効果、薬物動態等の点でより効果的な化合物となりうる。誘導体化は、所望する改変に応じて当分野で通常実施されている種々の方法、反応により行うことができる。式（Ｉ）で表される化合物及び式（ＩＩ）で表される化合物、ならびにそれらの誘導体をあわせて本発明化合物とも称する。

本発明化合物は、無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸・スルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩または酸付加塩等として用いることができる。
本発明化合物は溶媒和物（例えば水和物等）であっても無溶媒和物であってもよく、いずれも本発明化合物に包含される。

本発明化合物はプロドラッグとして用いることもできる。ここでプロドラッグとは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明化合物、すなわち生体内で酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明化合物に変化する化合物である。例えば、本発明化合物の分子内に存在し得るカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、水酸基（ＯＨ）、アミノ基（ＮＨ_２、アミドも含む）、メルカプト基（ＳＨ）等の部位が修飾されたものをいう。

本発明の感染抑制剤が対象とするレトロウイルスとしては、ＲＮＡの転写により生命維持をしているウイルス類を包含するものであり、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ等）等が挙げられる。好ましくはＨＩＶ及びＨＴＬＶである。特に本発明の感染抑制剤はＨＩＶ感染症に対して有用である。ＨＩＶ感染症とはエイズ、症候性又は無症候性のＨＩＶ感染症（エイズ関連症候群：ＡＲＣを含む）を含めてＨＩＶに感染している病態をいう。

本発明においてレトロウイルス感染抑制剤、特にＨＩＶ感染抑制剤は、ＨＩＶ感染症をはじめとした各種レトロウイルス感染症の治療用の薬剤として用いることができる。「治療」とは症状の改善、緩和又は治癒を目的とする処置を含む。例えばＨＩＶ感染症の治療とは、ＨＩＶ感染による症状の改善、緩和又は治癒、エイズ発症の予防又は遅延を目的とした処置を含む。具体的には、ＣＤ４陽性リンパ球数の増加又は減少の抑制、ＮＫ細胞活性の増加又は低下の抑制、ＡＲＣの予防、改善、緩和又は治癒、エイズ発症の予防又は遅延、日和見感染症の予防、改善、緩和又は治癒、エイズの症状の改善、緩和又は治癒を目的とした処置を含む。ＡＲＣの症状には、リンパ節腫脹、食欲不振、下痢、体重減少、発熱、倦怠感、発疹、気管支喘息等が含まれる。

本発明の感染抑制剤はヒト、サル、ウシ及びネコを含む哺乳類、好ましくはヒトに投与することができる。
本発明の感染抑制剤は経口投与又は注射投与、直腸内投与、点鼻投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与等の非経口投与のいずれでも使用することができる。本発明化合物は、経口投与、直腸内投与、注射投与、点鼻投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与等の投与方法に適した固体又は液体の医薬的に許容される無毒性の担体と混合して慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。医薬製剤における本発明化合物の使用量は、経口投与する場合には、一日あたりの投与量は、本発明化合物の有効量として、通常、体重１ｋｇあたり０．００１ｇ〜０．１ｇ程度である。非経口投与の場合には、一日あたりの投与量は、本発明化合物の有効量として、通常、体重１ｋｇあたり０．０００１ｇ〜０．０１ｇ程度である。実際に投与される化合物の量は、化合物の選択、各種製剤形態、患者の年齢、体重、性別、疾患の程度、投与経路等によって決定され、適宜変更可能である。本発明のレトロウイルス感染抑制剤、特にＨＩＶ感染抑制剤は毒性が低く、副作用が少ない。

本発明の感染抑制剤の剤型としては、経口用剤（例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤等）、注射剤、坐薬、点鼻薬、経皮投与用製剤（例えば、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤等）、経粘膜投与用製剤、舌下剤、噴霧剤、吸入剤等が挙げられる。

医薬的に許容される担体としては、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール、マルトース、トレハロース、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等の賦形剤；メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、プルラン、ショ糖脂肪酸エステル等の結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等の増粘剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、軽質無水ケイ酸等の滑沢剤；ポリエチレングリコール、カカオ脂等の坐剤基剤；蒸留水、注射用蒸留水、滅菌精製水、生理食塩水、植物油（オリーブ油、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油）、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール等の無機又は有機溶剤等が挙げられる。さらに本発明の医薬製剤には、安息香酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム等の保存剤；モノステアリン酸グリセリン等の乳化剤；塩酸、クエン酸、酢酸、酒石酸、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム等の緩衝剤を含むｐＨ調整剤等の添加剤を添加してもよい。

また、本発明の感染抑制剤と他の薬剤とを組み合わせて用いることも可能である。すなわち、ＡＩＤＳに合併した日和見感染に対する治療薬、他の種類の抗ＨＩＶ剤、免疫機能を改善する薬剤等と併用し得る。具体的には、抗ウイルス剤、抗生物質、免疫増強剤等が挙げられる。
本発明の感染抑制剤と組み合わせて用いることができる抗ウイルス剤の好適な例としては、ＡＺＴ（逆転写酵素阻害剤）、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）等のヌクレオシド誘導体、インジナビル（ＩＤＶ）、サキナビル、リトナビル（ＲＴＶ）、ネルフィナビル等のプロテアーゼ阻害剤、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ等のインターフェロンが挙げられる。これらの抗ウイルス剤の１種又は２種以上と本発明のＨＩＶ感染抑制剤とを組み合わせて用いることができる。

本発明の感染抑制剤と組み合わせて用いることができる抗生物質としては、抗菌剤、抗真菌剤（カンジダ症、カリニ肺炎等に対する抗真菌剤を含む）等が挙げられる。好適な抗菌剤の例としては、ペニシリン系抗生物質、セフェム系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、ホスホマイシン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、ニューキノロン系抗菌剤等が挙げられる。好適な抗真菌剤の例としては、ポリエン系抗真菌薬、イミダゾール系抗真菌薬、トリアゾール系抗真菌薬、アリルアミン系抗真菌薬、フルシトシン（５−ＦＣ）系抗真菌薬等が挙げられる。これらの抗菌剤、抗真菌剤は２種以上を合剤として用いてもよい。

本発明の感染抑制剤と組み合わせて用いることができる免疫増強剤としては、Ｔリンパ球の刺激等による免疫増強作用を有すると考えられる薬剤が挙げられる。具体的には、ノイロトロピン、グリチルリチン、レンチナン、イソプリノシン等が挙げられる。

さらに、レトロウイルス感染、例えばＨＩＶ感染によりもたらされる疾患の諸症状に対する対症療法に用いられ得る種々の薬剤もまた、本発明の感染抑制剤と併用することができる。

本発明の感染抑制剤と併用する薬剤の投与は本発明の感染抑制剤と同時に投与することができるが、別々に投与してもよい。その投与量は各々期待される効果を達成するのに必要な量であり、各薬剤ごとに既に報告されているであろう情報に基づいて決定することができる。

さらに、本発明は、レトロウイルス感染を抑制する方法、特にＨＩＶ感染を抑制する方法を提供する。これらの方法によって、ＨＩＶ感染症をはじめとした各種レトロウイルス感染症の治療が可能となる。

以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。

実施例１：ＨＩＶ感染抑制作用及び細胞増殖抑制作用−１
方法
（１）試薬
フェンレチニド（BIOMOL Research Laboratories Inc.）、ＧＧＡ（県立長崎シーボルト大学の四童子博士より供与された）、ＮＩＫ−３３３（興和創薬）を、それぞれ５ｍＭ、５ｍＭ、５０ｍＭになるようにエタノールに溶解しストック溶液を調製した。ストック溶液は１回使用分ずつを小分けして使用時まで−２０℃で保存した。

（２）細胞
ＮＰ２細胞は、ヒトglioma由来細胞株であり、ＴＥ６７１細胞はヒトrhabdomyosarcoma由来細胞株であり、ＨｅＬａ細胞はヒト子宮癌由来細胞株である。ヒトＮＰ２細胞およびＨＩＶの感染受容体であるＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現するＮＰ２細胞（ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞）は、群馬大学の星野博士から供与された（Soda, Y., Shimizu, N., Jinno, A., Liu, H. Y., Kanbe, K., Kitamura, T., and Hoshino, H. 1999. Establishment of a new system for determination of coreceptor usages of HIV based on the human glioma NP-2 cell line. Biochem.Biophys.Res.Commun. 258, 313-321.）。ＣＤ４を発現するヒトＴＥ６７１細胞（ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞）およびＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞）は、ＣＤ４を持つマウス白血病ウイルスベクターをＴＥ６７１細胞（理化学研究所・天沼博士より供与された）あるいはＨｅＬａ細胞（国立感染症研究所・佐藤博士より供与された）に感染させることによって作製した。すなわち以下のようにして行った。マウス白血病ウイルスベクタープラスミドであるｐＭＸ−ｐｕｒｏ（東京大学・北村博士より分与された）にＣＤ４遺伝子を挿入し、そのプラスミドＤＮＡをＣＤ４−ｐｕｒｏと名付けた。得られたＣＤ４−ｐｕｒｏプラスミド、マウス白血病ウイルスのｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミドｐＧＰ（タカラから購入）及びｐＬＰ／ＶＳＶＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）の３種類のプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、その培養上澄をＴＥ６７１細胞及びＨｅＬａ細胞に接種した。ピュロマイシン選択により生き残った細胞をそれぞれＴＥ６７１／ＣＤ４細胞、ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞とした。ヒト２９３Ｔ細胞（Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., and Baltimore, D. 1993. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90, 8392-8396.)、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞、ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞及び２９３Ｔ細胞は、８％ウシ胎児血清および抗生物質を含むダルベッコ−改良イーグル培地（シグマまたは和光）において５％二酸化炭素存在下３７℃で培養した。

（３）プラスミドＤＮＡの調製：
ｅｎｖ遺伝子を除くＨＩＶベクター作製に必要なＨＩＶ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＬＰ１，ｐＬＰ２）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＣＸＣＲ４指向性のＨＩＶ−１（ＨＸＢ２）のｅｎｖ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡとＣＣＲ５指向性のＨＩＶ−１（ＪＲＦＬ）のｅｎｖ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡは、それぞれ名古屋国立医療センターの横幕博士より供与された（Yokomaku, Y., Miura, H., Tomiyama, H., Kawana-Tachikawa, A., Takiguchi, M., Kojima, A., Nagai, Y., Iwamoto, A., Matsuda, Z., and Ariyoshi, K. 2004. Impaired processing and presentation of cytotoxic-T-lymphocyte (CTL) epitopes are major escape mechanisms from CTL immune pressure in human immunodeficiency virus type 1 infection. J.Virol. 78, 1324-1332.）。マーカー遺伝子としてＬａｃＺを持つＨＩＶベクターゲノムを発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。これらのプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌（タカラ）に導入し、アンピシリン存在下で培養した。こうして増やした大腸菌からプラスミドＤＮＡを精製した（Ｖｉｏｇｅｎｅ）。

（４）ＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶベクター作製
１０ｃｍ培養ディッシュにおいて培養した２９３Ｔ細胞にｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ及びＨＸＢ２ｅｎｖプラスミドＤＮＡをそれぞれ３μｇずつｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法（ＭｉｒｕｓまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトランスフェクションした。２４時間後、新鮮な培地に交換した。更に２４時間培養し、その培養液を標的細胞（ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞、ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞）への接種に用いた。培養液中にＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶベクターが存在する。

（５）ＨＩＶベクターの感染価の測定
ＨＩＶベクター接種後２４時間培養し、新鮮な培地に交換した。さらに２４時間培養した。細胞をグルタールアルデヒドにより固定し、Ｘ−Ｇａｌにより一晩染色した。青く染まった細胞の数を数え、その値を感染価とした。

（６）細胞毒性試験
細胞数を数えることにより、細胞増殖に対する効果を観察した。

結果
（１）フェンレチニドによるＨＩＶ感染抑制と細胞増殖抑制
フェンレチニドがＨＩＶ感染を抑制することは既に報告されている（Finnegan, C. M., Rawat, S. S., Puri, A., Wang, J. M., Ruscetti, F. W., and Blumenthal, R. 2004. Ceramide, a target for antiretroviral therapy. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101, 15452-15457.；Finnegan, C. M., and Blumenthal, R. 2006. Fenretinide inhibits HIV infection by promoting viral endocytosis. Antiviral Res. 69, 116-123.）が、本実験系においても既報どおりフェンレチニドがＨＩＶベクター感染を抑制するかどうか確認した。
２％ウシ胎児血清および抗生物質を含むダルベッコ−改良イーグル培地（シグマまたは和光）に様々な濃度になるようにフェンレチニドを加え、標的細胞を２日間５％二酸化炭素存在下３７℃で培養した。その細胞にＨＩＶベクター（ＨＩＶベクターを含む培養上清、上述）を接種し感染価を測定した。
一方で、フェンレチニドの細胞増殖に及ぼす影響を定量的に解析するため、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４及びＨｅＬａ／ＣＤ４細胞の細胞数を測定した。各細胞は、それぞれの化合物で感染価の測定時と同様にして処理し、２日間培養した。
感染価測定の結果を図１に、細胞増殖測定の結果を図２に示す。測定結果は、フェンレチニドを含まない（０μＭ）時の値を１として相対値で示した。図１に示すように、フェンレチニドは濃度依存的にＨＩＶベクターの感染性を抑制したが、図２に示すように、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞およびＴＥ６７１／ＣＤ４細胞に対しては細胞毒性が見られた。これらの結果から算出された、各細胞におけるＨＩＶ感染を５０％に抑制する濃度と、細胞増殖を５０％抑制する濃度を表１に示す。

ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞では、フェンレチニドはＨＩＶ感染抑制効果の方が細胞増殖抑制効果よりも強かったが、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞では同程度、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞ではむしろ細胞増殖抑制効果の方が強かった。

（２）ＧＧＡによるＨＩＶ感染抑制と細胞増殖抑制
フェンレチニドと同様に標的細胞をＧＧＡにより処理し、ＨＩＶベクターを接種した。感染価測定の結果を図３に、細胞増殖測定の結果を図４に示す。測定結果は、ＧＧＡを含まない（０μＭ）時の値を１として相対値で示した。図３に示すように、ＧＧＡは濃度依存的にＨＩＶベクター感染を抑制することがわかった。ＨＩＶベクター感染を抑制する効果において、ＧＧＡはフェンレチニドよりも低かったが、調べたすべての細胞においてＧＧＡによる細胞毒性はフェンレチニドよりも低かった（図４）。
ＧＧＡについて、各細胞におけるＨＩＶ感染を５０％に抑制する濃度と、細胞増殖を５０％抑制する濃度を表１（上記）に示す。
表１に示すように、ＧＧＡはいずれの細胞においても、ＨＩＶ感染抑制効果と細胞増殖抑制効果は同程度であった。

（３）ＮＩＫ−３３３によるＨＩＶ感染抑制と細胞増殖抑制
フェンレチニド及びＧＧＡと同様にして標的細胞をＮＩＫ−３３３により処理し、ＨＩＶベクターを接種した。感染価測定の結果を図５に、細胞増殖測定の結果を図６に示す。測定結果は、ＮＩＫ−３３３を含まない（０μＭ）時の値を１として相対値で示した。さらに、ＮＩＫ−３３３について、各細胞におけるＨＩＶ感染を５０％に抑制する濃度と、細胞増殖を５０％抑制する濃度を表１（上記）に示す。
図５及び図６の結果より、ＮＩＫ−３３３も、ＨＩＶ感染抑制作用及び細胞増殖抑制の作用を持っていることが示された。さらに、表１に示すように、ＮＩＫ−３３３は、フェンレチニド及びＧＧＡと異なり、いずれの細胞においても、ＨＩＶ感染抑制効果の方が細胞増殖抑制効果よりも強かった。

実施例２：ＨＩＶ感染受容体発現に及ぼす影響
方法
２％ウシ胎児血清および抗生物質を含むダルベッコ−改良イーグル培地（シグマまたは和光）にフェンレチニドは２μＭとなるように、ＧＧＡは２０μＭとなるようにそれぞれ加え、この培地中で、標的細胞（ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞又はＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞）を２日間、５％二酸化炭素存在下３７℃で培養した。ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞及びＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞は実施例１で用いたものと同様のものである。フェンレチニド又はＧＧＡで処理した細胞をＦＩＴＣがコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体（シグマ）で染色した。対照として、抗体を用いないこと以外は同様の処理をした細胞（Ａｂ（−））、フェンレチニドやＧＧＡによる処理を行わないこと以外は同様の処理をした細胞（Ａｂ（＋））についても調べた。ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）により各細胞の蛍光強度を測定し、ＣＤ４の細胞表面発現量として評価した。同様に、フェンレチニド又はＧＧＡで処理した細胞をラット抗ＣＸＣＲ４抗体（Tanaka, R., Yoshida, A., Murakami, T., Baba, E., Lichtenfeld, J., Omori, T., Kimura, T., Tsurutani, N., Fujii, N., Wang, Z. -X., Peiper, S. C., Yamamoto, N., and Tanaka, Y. 2001. Unique monoclonal antibody recognizing the third extracellular loop of CXCR4 induces lymphocyte agglutination and enhances human immunodeficiency virus type 1-mediated syncytium formation and productive infection. J.Virol. 75, 11534-11543.）、続いてＦＩＴＣがコンジュゲートした抗ラットＩｇＧ抗体（シグマ）で染色し、ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）により各細胞の蛍光強度を測定し、ＣＸＣＲ４の細胞表面発現量として評価した。

結果
実施例１から明らかなようにある種のレチノイド類似体にＨＩＶ感染抑制作用が見られた。この感染抑制作用のメカニズムを知るため、ＨＩＶ受容体であるＣＤ４及びＣＸＣＲ４の細胞表面発現に及ぼすレチノイド類似体の影響を解析した。結果、ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞とＮＰ２細胞においてフェンレチニド及びＧＧＡはいずれもＣＤ４発現を増加させることがわかった（図７、図８）。一方、ＣＸＣＲ４発現は、フェンレチニド及びＧＧＡ処理により低下することがわかった（図９、図１０）。

結論
フェンレチニド、ＧＧＡ、ＮＩＫ−３３３ともＨＩＶ感染抑制効果（抗ＨＩＶ活性）、細胞増殖抑制効果（細胞毒性）を持っていた。フェンレチニドは、ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞では、抗ＨＩＶ活性の方が強かったが、その他の細胞では、細胞毒性の方が強いかもしくは同程度であった。ＧＧＡの抗ＨＩＶ活性と細胞毒性は、いずれの細胞においても、同程度であった。又、ＧＧＡの細胞毒性はフェンレチニドに比べて低かった。ＮＩＫ−３３３は、いずれの細胞においても、抗ＨＩＶ活性の方が細胞毒性に比べて強かった。これらの結果から、レチノイド類の中で、特にＮＩＫ−３３３が有効な抗ＨＩＶ活性を有していることが示された。

実施例３：ＨＩＶ感染抑制作用及び細胞増殖抑制作用−２
方法
実施例１と同様にして、レチノイドであるＧＧＡ、フェンレチニド、ＮＩＫ−３３３のＨＩＶ感染抑制作用と細胞増殖抑制作用を調べた。ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞及びＨｅＬａ／ＣＤ４細胞について調べた。ＧＧＡのＨＩＶ感染抑制作用と細胞増殖抑制作用を図１１に、フェンレチニドのＨＩＶ感染抑制作用と細胞増殖抑制作用を図１２に、ＮＩＫ−３３３のＨＩＶ感染抑制作用と細胞増殖抑制作用を図１３に、それぞれ示した。
いずれのレチノイドもＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞、ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞において、濃度依存的にＣＸＣＲ４指向性ＨＸＢ２ＨＩＶ−１ベクター感染を抑制した。これらのレチノイドは、細胞増殖も抑制した。例えば、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞を２０μＭのＧＧＡによって処理した時、ＨＩＶ−１ベクター感染は１０％にまで抑制されたが、細胞増殖は５５％しか抑制されなかった（図１１）。同様に、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞を５μＭのＮＩＫ−３３３によって処理した時、ＨＩＶ−１ベクター感染は２０％にまで低下したが、細胞増殖はほとんど影響を受けなかった（図１３）。この結果は、ＧＧＡとＮＩＫ−３３３が、細胞増殖抑制効果よりもＨＩＶ−１ベクター感染抑制効果の方が強いことを示している。一方、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞を２μＭのフェンレチニドによって処理した時、細胞増殖は１０％にまで低下したが、ＨＩＶ−１ベクター感染は４０％しか抑制されなかった。フェンレチニドは、ＨＩＶ−１ベクター感染抑制効果よりも、細胞増殖抑制効果の方が強いこと示している。すなわち、フェンレチニドはＨＩＶ−１感染を抑制することが既に報告されているが、フェンレチニドよりもＧＧＡおよびＮＩＫ−３３３の方が副作用の少ない効率的なＨＩＶ−１感染抑制剤であることがわかった。

実施例４：ＶＳＶ感染抑制作用
レチノイドによるＨＩＶベクター感染の抑制が、ＨＩＶ−１Ｅｎｖ蛋白質による感染特異的かどうかを知るため、水泡性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）−Ｇ蛋白質による感染におけるレチノイドの効果を観察した。ＶＳＶは、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヴェシキュロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）のウイルスであり、膜（エンベロープ）に包まれている。遺伝子は、１１，１６２塩基からなる一本鎖（−）ＲＮＡである。
ＨＩＶベクターの代わりにＶＳＶベクターを用いること以外は、実施例１と同様にして、各種の細胞におけるＶＳＶ感染抑制作用について調べた。
ＶＳＶベクター作製
２９３Ｔ細胞に以下の４種類のプラスミドＤＮＡ（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ）をそれぞれ３μｇずつｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法（ＭｉｒｕｓまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトランスフェクションした。２４時間後、新鮮な培地に交換した。更に２４時間培養し、その培養液を標的細胞への接種に用いた。培養液中にＶＳＶベクターが存在する。
結果、ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞においては、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質による感染もこれらレチノイドによって抑制されることがわかった（図１４、Ａ〜Ｃ）。ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞におけるＶＳＶ−Ｇ蛋白質による感染は、影響を受けなかった（図１４、Ａ及びＣ）。ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞におけるＶＳＶ−Ｇ蛋白質による感染も、あまり影響を受けなかった（図１４、Ａ〜Ｃ）。ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞を１０μＭのＮＩＫ−３３３によって処理した時、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質による感染が抑制されたが（図１４、Ｃ）、この結果は、細胞増殖も同様に抑制されたことによって生じたのかもしれない（図１３）。これらの結果は、ＮＰ２／ＣＤ４／Ｘ４細胞およびＨｅＬａ／ＣＤ４細胞において、用いたレチノイドはＨＩＶ−１Ｅｎｖ蛋白質による感染を抑制するが、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質による感染は抑制しないことを示している。

実施例５：ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ感染に及ぼすレチノイドの影響
実施例１〜３は、ＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ−１ベクター感染に対するレチノイドの影響を観察したものであったが、ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ−１ベクター感染にも同様な影響を示すかどうかを知るために、ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ−１であるＪＲＦＬ株のＥｎｖ蛋白質による感染に対する影響を観察した。
ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞にＣＣＲ５を導入し（ＴＥ６７１／ＣＤ４／Ｒ５細胞）、その細胞において実験を行った。使用する細胞をＣＣＲ５発現細胞と、ベクターをＣＣＲ５指向性ＨＩＶ−１としたこと以外は実施例１と同様にしてウイルス感染に及ぼす影響を調べた。
ＴＥ６７１／ＣＤ４／Ｒ５細胞は以下のようにして作製した。ネオマイシン耐性遺伝子とＣＤ４をコードするプラスミドＤＮＡをＴＥ６７１細胞にトランスフェクションし、ネオマイシンによって処理した。ネオマイシン耐性細胞の中で、ＣＤ４を発現している細胞クローンを選択した。この細胞をＴＥＣＤ４−１と命名した。ＴＥ６７１／ＣＤ４細胞の作製方法と同様にして、ＴＥＣＤ４−１細胞にＣＣＲ５をコードするマウス白血病ウイルスベクターを感染させ、ピュロマイシン処理によって生き残った細胞をＴＥ６７１／ＣＤ４／Ｒ５細胞とした。
ＣＣＲ５指向性ＨＩＶベクター作製
１０ｃｍ培養ディッシュにおいて培養した２９３Ｔ細胞にｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺ、ＪＲＦＬｅｎｖプラスミドＤＮＡをそれぞれ３μｇずつｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法（ＭｉｒｕｓまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトランスフェクションした。２４時間後、新鮮な培地に交換した。更に２４時間培養し、その培養液を標的細胞への接種に用いた。培養液中にＣＣＲ５指向性ＨＩＶベクターが存在する。
結果を図１５に示す。用いたレチノイドは、ＣＣＲ５を強発現させた細胞におけるＣＣＲ５指向性ＨＩＶ−１ベクター感染に影響しないことが示された（感染受容体を強発現させた細胞では、ＨＩＶ−１感染抑制物質の効果が低下する結果は、しばしば観察されている）。

実施例６：レチノイド類のＨＩＶ−１感染受容体に及ぼす影響
ＨＩＶ−１は、Ｅｎｖ蛋白質によるウイルス膜と宿主細胞膜の膜融合によって細胞内に侵入する。このＥｎｖ蛋白質の膜融合活性により、Ｅｎｖ蛋白質を発現する細胞は、宿主細胞と細胞融合を起こし、シンシチウムを形成する。そのため、Ｅｎｖ蛋白質のシンシチウム形成能は、ＨＩＶ−１の細胞内侵入を反映していると考えられ、シンシチウムを形成する割合を測定することによりＨＩＶ−１の細胞内侵入を定量することが可能である。
使用したプラスミドＤＮＡの作製
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＧＷ／ＬａｃＺプラスミドＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）からのＬａｃＺ配列を含むＤＮＡフラグメントをＨＩＶ−１ＬＴＲ配列（名古屋国立医療センターの横幕博士より供与された）と連結し、ｐＢＲ３２２プラスミド（タカラから購入）においてクローン化した。このプラスミドＤＮＡをＬＴＲ−ＬａｃＺと命名した。
シンシチウム形成の定量的測定方法
ＨｅＬａ／ＣＤ４細胞にＬＴＲ−ＬａｃＺプラスミドＤＮＡ３mｇをトランスフェクションし、ＬＴＲ−ＬａｃＺを持つ細胞を選択した（ＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬａｃＺ細胞と命名）。ＬＴＲはＨＩＶ−１のＴＡＴ蛋白質がないと転写を開始しないので、この細胞はＬａｃＺを発現しない。感染実験の場合と同様に、ＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬａｃＺ細胞をフェンレチニド、ＧＧＡ、ＮＩＫ−３３３により処理した。一方、２９３Ｔ細胞にＨＸＢ２ｅｎｖプラスミドＤＮＡ３mｇをトランスフェクションした。ＨＸＢ２ｅｎｖプラスミドＤＮＡはｅｎｖと同時にＴＡＴもコードしている。トランスフェクションして２４時間後、細胞数を合わせて、これらの細胞を混合した。２９３Ｔ細胞において発現するｅｎｖ蛋白質の働きにより、２９３Ｔ細胞とＨｅＬａ／ＣＤ４／ＬａｃＺ細胞は細胞融合を起こす。するとＴＡＴ蛋白質が初めてＬＴＲに作用し、転写が開始され、ＬａｃＺ遺伝子が発現する。そこでＬａｃＺ活性をHigh sensitive beta-galactosidase assay kit （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入）により定量し、その値をシンシチウム形成効率とした。
結果、これらのレチノイドは、ＨＩＶ−１Ｅｎｖ蛋白質による細胞融合を抑制することがわかった（図１６）。すなわち、用いたレチノイド類によるＨＩＶ−１ベクター感染抑制は、ＨＩＶ−１の細胞内侵入過程が阻害されることによって起こっていることを示唆している。

これらのレチノイド類によるＨＩＶ−１ベクター感染の抑制が、ＨＩＶ−１の感染受容体であるＣＤ４およびＣＸＣＲ４の発現に影響することによって起こったのかどうかを知るために、ＣＤ４とＣＸＣＲ４の発現をＦＡＣＳによって解析した。具体的な手順は実施例２と同様である。黒い領域が抗体が存在しない場合のデータを示し、白い領域が抗体が存在する場合の領域を示している。
結果、ＧＧＡ（図１７）、フェンレチニド（図１８）、ＮＩＫ−３３３（図１９）はＣＤ４の細胞表面発現を増加させ、ＣＸＣＲ４の細胞表面発現を低下させる傾向にあることがわかった。

本出願は、日本で出願された特願２００６−３１２０４０を基礎としておりそれの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、及び式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩からなる群より選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として含有する、レトロウイルス感染抑制剤であって、レトロウイルス感染抑制が、ＣＸＣＲ４の発現低下作用によるものであり、該レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、剤。
式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩、又は式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩を有効成分として含有する、請求項１記載の剤。