JP5269783B2 - 光学的内部移行により細胞内にsiRNAを導入する方法 - Google Patents
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Description
担体分子は、siRNA分子またはsiRNAおよび光感作薬の両方と会合、結合、またはコンジュゲートしていてよい。したがって、たとえばsiRNAは、電荷:電荷の相互作用によって担体に付着していてよい。上述のように、複数の担体を同時に用いてよく、担体は、複数のsiRNA分子または複数種のsiRNA分子と会合、結合またはコンジュゲートしていてよい。
(a)非リポソーム配合物中のリポポリアミン、
(b)GPCによって500〜20000のMn値を有するポリエチレンイミン(PEI)、
(c)以下の式のβシクロデキストリンアミンポリマー
(d)アミン基含有デンドリマー、および
(e)陽イオン性ペプチド。
連結基は、通常条件下で安定な結合からなる。
nが2〜5である場合、異なる断片
式(I)の好ましい実施形態では、nは3に等しく、断片
本発明に従って使用するリポポリアミンのさらなる例には、2,3−ジオレイル−オキシ−N[2−スペルミンカルボキシイル−アミド]エチル−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオル酢酸(DOSPA)、1,3−ジオレオイルオキシ−2−(6−カルボキシスペルミン)プロピルアミド(DOSPER)およびRPR−120535が含まれる(Ahmed他(2005)Pharmaceutical Research、22(6)、972〜980)。好ましいリポポリアミンの構造を図7に示す。
DOSPERでは、連結基は
したがって、上記構造は連結基のさらなる適切な例を表す。
親油性領域は、上記R3、R4、R5またはR6に定義したとおりであるか、または任意の飽和もしくは不飽和の炭化水素鎖、コレステロールもしくは他のステロイド、ラメラ相もしくは六方相を形成することができる天然脂質もしくは合成脂質であることができる。炭化水素鎖の長さは、10〜30個の炭素の長さ、たとえば12〜28、14〜26、16〜24、18〜22個の炭素の長さであり得る。
代替実施形態では、担体は、生理的pHで陽イオン性(かつ好ましくはプロトン化可能)であるポリアミン化合物、たとえばポリエチレンイミン(PEI)である。PEIは、多くの様々な構造変異体として存在するが、GPC(ゲルパーミエーションクロマトグラフィー)によって600以上のMn値(数平均分子量)を有する変異体が最も興味深い。たとえば、PEIは、500〜700、500〜750、750〜1000、100〜1250、1000〜1250、1250〜1500、1000〜20000、1100〜15000、1200〜12500、1250〜10000、1500〜7500、1750〜5000、2000〜4000または2500〜3500のMn値を有し得る。
分枝鎖状PEIとは、第三級アミン基、ならびに第一級および第二級アミン基を含むPEIを意味する。第一級および/または第二級アミン基に対する第三級アミン基の数は、ポリマー中の分枝の量または度合の指標である。一般に、分枝鎖状PEIは、0.5〜1.5:1.5〜2.5:0.5〜1.5の比、たとえば1:2:1で第一級、第二級および第三級アミン基を含むが(すなわち第二級および第三級アミン基の比は2:1)、第三級アミン基をより多くまたは少なく含む分枝構造を有する分枝鎖状PEIも存在し、本発明で使用することができる。別の比の例は、1:1〜3:1(第二級:第三級アミン基)、たとえば1.2:1〜2.8:1、1.4:1〜2.6:1、1.6:1〜2.4:1、1.8:1〜2.2:1である。
適切なPEIの例はSigmaから入手可能である(408719ポリエチレンイミン(平均MwはLSで約800Daまで、平均MnはGPCで約600まで、低分子量、非含水)。他の市販のPEI系試薬には、Poly Sciences,Inc PEI(分枝鎖状、Mw10,000)、US Biological Exgen500、Polyplus transfection jetPEI(商標)、Sigma ESCORT(商標)V形質移入試薬、およびMinis TransIT−TKO(登録商標)が含まれる。
ペプチドに関して本明細書中で言及する「陽イオン性」とは、生理的pH、すなわちpH7.2でペプチドの全体的な、すなわち実効電荷が+1以上であることを示す。アミノ酸は、ペプチドの配列構成中で存在する場合に、生理的pHでの優勢種が陽性に帯電している場合に+1とみなされる。ペプチド中のそのようなアミノ酸のそれぞれがさらなる正電荷に寄与して、ペプチドの最終電荷が計算される。ペプチドの実効電荷(それぞれのアミノ酸に起因する電荷を合計することによって計算する)が陽性である限りは、ペプチドは1つまたは複数の陰性に帯電したアミノ酸残基、および中性残基を含み得る。
理論に拘泥するものではないが、担体とsiRNA分子との会合は、陽性に帯電した担体と陰性に帯電したsiRNA分子との相互作用に基づいており、siRNA−担体の複合体の形成がもたらされると考えられている。siRNA−担体の複合体は細胞表面の陰イオン性プロテオグリカンと相互作用し、エンドサイトーシスによって取り込まれる。
あるいは、2つの構成要素の比は、N/P比、すなわち窒素残基対オリゴヌクレオチドリン酸の比として表現し得る。担体のすべての窒素原子が必ず陽イオンであるわけではないので、N/P比は電荷比と同じではない。N/P比は、それぞれの化合物の化学組成および存在するそれぞれの化合物の量に依存する。N/P比の適切な値には、1〜500、たとえば2〜450、3〜400、4〜350、5〜300、6〜250、7〜200、8〜150、9〜100、10〜80、15〜60、20〜50、30〜40、1〜25、1〜20、1〜15、1〜10、1〜5が含まれる。
本発明の方法で使用するsiRNA分子の適切な用量の決定は、当業者にはルーチン的な実施である。in vitroの用途ではsiRNA分子の例示的な用量は約1〜100nMのsiRNAであり、in vivoの用途ではヒトに注射する1回あたり約10-6〜1gのsiRNAである。たとえば、siRNA分子は、500nM未満、たとえば300nM未満、特に好ましくは100nMもしくは50nM未満、たとえば1〜100nM、または5〜50nMのレベルで投与してよく、示した濃度は、細胞と接触するレベルを反映している。
適切な濃度は、懸案のsiRNA分子の懸案の細胞内への取り込み効率、および細胞中で達成することを所望する最終濃度に応じて決定することができる。したがって、「形質移入時間」または「細胞取り込み時間」、すなわち分子が細胞と接触している時間は、数分間または数時間までであることができ、たとえば、10分間〜24時間、たとえば30分間〜10時間、またはたとえば30分間〜2時間もしくは6時間の形質移入時間を使用することができる。より長いインキュベーション時間、たとえば24〜96時間以上、たとえば5〜10日間も使用し得る。
本発明の方法は、たとえば遺伝子治療方法およびスクリーニングアッセイの作製における特定の遺伝子産物の発現の阻害を含めた様々な目的のために、in vitroまたはin vivoで、たとえばin situ治療またはex vivo治療のために使用し、次いで処理細胞を身体に投与し得る。
これらの方法は、細胞の発現プロフィールを変更させて、たとえば細胞経路を調査するため、もしくは特定の遺伝子の発現の影響を測定するために、あるいは治療目的に使用し得る。
以下、本発明を、以下の図面を参照しながら、以下の非限定的な実施例でさらに詳述する。
細胞系および培養条件。
HCT−116(結腸直腸腺癌)およびSW620(結腸直腸腺癌)を米国タイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection、米国バージニア州Manassas)から得た。OHS(骨肉腫(osteocarcinoma))およびRMS細胞系はノルウェーラジウム病院(Norwegian Radium Hospital)で確立されたものである。すべての細胞系は、抗生物質を含まないが10%のウシ胎児血清(FCS;PAA Laboratories、オーストリアLinz)および2mMのL−グルタミン(Bio Whittaker、ベルギーVerviers)を添加したRPMI−1640培地(Bio Whittaker、ベルギーVerviersまたはGibcoBRL、英国Paisley)を用いて培養した。5%のCO2を含む加湿雰囲気中、37℃で細胞を増殖およびインキュベートした。すべての細胞系を試験し、実験前にマイコプラズマ感染に関して陰性であることが見出された。
Lumisource(登録商標)(PCI Biotech AS、ノルウェーOslo)を光源として用いた。Lumisource(登録商標)とは、処理領域の均一な照射を提供し、主にピークが420nmの青色光を発光するように設計された4本の蛍光チューブのバンク(bank)である。光感作薬、ジスルホン化テトラフェニルポルフィン(TPPS2a)はPorphyrin Products(米国ユタ州Logan)から購入した。最初にTPPS2aを0.1MのNaOHに溶かし、その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.5で5mg/mlの濃度まで希釈し、0.002MのNaOHの最終濃度まで希釈した。光感作薬は光から保護し、使用時まで−20℃で保管した。
siRNA送達用の様々な形質移入試薬は、以下を用いて評価した:Life Technologies Inc.のリポフェクチン(商標)試薬(米国メリーランド州Gaithersburg)、Invitrogenのリポフェクタミン(商標)2000(米国カリフォルニア州Carlsbad)、Roche DiagnosticsのFuGene6(ドイツMannheim)、AmbionのsiPORT(商標)Lipid Transfection Agent(米国テキサス州Austin)、Polyplus transfectionのjetSI(商標)およびjetSI(商標)−ENDO(フランスIllkirch)。すべての形質移入試薬は、製造者の仕様書に従って取り扱った。すべての細胞系を「細胞系および培養条件」に記載のように培養し、6ウェルプレート中で24時間、50〜70%のコンフルエンスまで培養した後、24、48または96時間形質移入した。形質移入試薬を用いた組み換えsiRNAに加えて、未処理の対照として形質移入試薬を単独で細胞に適用した。
・ステップ1:それぞれのウェルについて、4.2(8.4)μlのjetSI/jetSI−ENDO溶液を100μlの培地に希釈する。激しく渦攪拌し(重要:混合にピペットを用いない)、10分間待つ(重要:30分間を超えない)。
・ステップ2:それぞれのウェルについて、1.4μg(100nM)のsiRNA二重鎖を100μlの培地中に希釈する。穏やかに渦攪拌する。
・100μlのjetSI培地溶液を100μlのsiRNA溶液に加え、溶液を直ちに混合する(重要:溶液を逆の順序で混合しない)
・直ちに溶液を10秒間渦攪拌混合する。
・30分間、室温でインキュベーションを行って複合体を形成させる(重要:1時間を超えない)。
・複合体の形成中、増殖培地をプレートから除去し、事前に37℃に温めた0.8mlの新鮮な血清含有培地(および使用する場合は光感作薬)を加える。
・200μlのjetSI/siRNA溶液をそれぞれのウェルに加え、プレートを穏やかに回すことによって混合物を均一にする。
・プレートを必要な細胞培養条件下で18時間インキュベートし、その後、プレートを新鮮な培地で3回洗浄し、2〜4mlの培地で再度インキュベートする。
数点の変更以外は、細胞を「PCIを用いないsiRNA形質移入」と同様に培養および形質移入した。光感作薬TPPS2a(0,5μg/ml)を形質移入時に培地に加えた。18時間のインキュベーション後、細胞を新鮮な培地で3回洗浄し、光処理の前に4時間インキュベートした。4時間後、細胞を、細胞系に応じて青色光(7mW/cm2)に様々な時間(60〜90秒間)露光させ、24、48および96時間再度インキュベートした後に回収した。PCI効果を測定するために、エフェクターsiRNA、組み換えsiRNAおよび形質移入試薬単独を、同じプレート中の異なるウェルに、光感作薬を用いてまたは用いずに適用し、同じ処理を与えた。細胞はこれらの実験中アルミニウム箔によって光から保護した。
GenElute哺乳動物全RNA Miniprepキット(Sigma−Aldrich、ドイツSteinheim)を用いて全細胞RNAを単離し、iScript cDNA合成キット(BioRad、カリフォルニア州Hercules)を逆転写に用いた。どちらのキットも、製造者のマニュアルに従って使用した。すべてのPCRを並行して実行し、SYBRGreen Iを用いることによってリアルタイム検出が得られた。それぞれのPCRについて、10μlのcDNA、30μlのiQ SYBRGreen Supermix(BioRad)、300nMのそれぞれのプライマーおよびヌクレアーゼを含まない水を加えて最終容積60μlとした。その後、それぞれ25μlの試料をPCRプレートに適用した。本方法では、並行が真の並行であり、すべての複製(replicate)について十分なPCRミックスが存在することを保証する。プライマーの設計は、Applied BiosystemsのPrimer Expressソフトウェア(Applied Biosystems、カリフォルニア州Foster City)を用いて達成した。使用したプライマー組(フォワードプライマー5’−AAGTTCAAGCTCAACAAGTCAGAAC−3’およびリバースプライマー5’−CATCTGTCCTTTTCCCCAAGA−3’)によって、S100A4配列のエクソン2および3中の79−塩基対のセグメントが増幅される。
記載(PCIを用いたおよび用いないsiRNA形質移入)のように細胞をsiRNA/jetSI−ENDOの複合体と共にインキュベートし、48時間後に、PCI処理を用いておよび用いずに、FITC(450〜490nmのBP励起フィルター、510nmのFTビームスプリッター、および515〜565nmのLP発光フィルター)、ならびにローダミン(546/12nmのBP励起フィルター、580nmのFTビームスプリッター、および590nmのLP発光フィルター)用のフィルターを備えたZeiss倒立顕微鏡、Axiovert200で分析した。画像(Pictures)は、Carl Zeiss AxioCam HR、バージョン5.05.10およびAxioVision3.1.2.1ソフトウェアを用いることによって構成した。画像(Images)はAdobe Photoshop7.0(Adobe、カリフォルニア州San Jose)およびZeiss LSM Image Browser(バージョン3)を用いて形成した。
タンパク質溶解物は、150mMのNaClならびに2g/mlのペプスタチン、アプロチニン(Sigma Chemical Company、モンタナ州St Louis)およびロイペプチン(Roche Diagnostics、ドイツMannheim)を含む0.1%のNP−40を含む50mMのトリス−HCl(pH7.5)中で調製した。それぞれの試料からの全タンパク質溶解物(30μg)を12%のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、製造者のマニュアルに従ってImmobilon−P膜(Millipore、マサチューセッツ州Bedford)上に移した。ローディング対照および移動対照として、膜を0.1%のアミドブラックで染色した。続いて、膜を、0.5MのNaClおよび10%の乾燥乳(ブロッキング溶液)を含む0.25%のTween20(TBST)を含む20mMのトリス−HCl(pH7.5)中でインキュベートした後、5%の乾燥乳を含むTBST中のウサギポリクローナル抗S100A4(1:300に希釈、DAKO、デンマークGlostrup)およびマウスモノクローナル抗α−チューブリン(1:250に希釈、Amersham Life Science、英国Buckinghamshire)と共にインキュベートした。洗浄後、二次抗体(1:5000に希釈、DAKO、デンマークGlostrup)に結合した西洋ワサビペルオキシダーゼおよび増強した化学発光系(Amersham Pharmacia Biotech、英国Buckinghamshire)を用いて免疫反応性タンパク質を可視化した。S100A4タンパク質レベルは対照試料の割合として報告し、α−チューブリンをローディング対照として用いた。
OHS細胞に、様々な形質移入系を用いてS100A4タンパク質の発現を標的とするように設計したsiRNAを形質移入した。それぞれの実験において、標準の形質移入プロトコルを製造者の指示に従って用いた。光感作薬を用いた場合は、それはTPPS2aであった(1mlの形質移入容積中に0.5μg、これとは別にjetSIは2mlの形質移入容積を用いた)。それぞれの実験における照射時間は60秒間であった。
siPORT脂質=1000μl中に1.4μgのsiRNAと組み合わせて2および4μlを試験した
FuGene6=1000μl中に1.4μgのsiRNAと組み合わせて4.2μlおよび8.4μlを試験した
リポフェクタミン2000=1000μl中に1.4μgのsiRNAと組み合わせて4.2および7μlを試験した
リポフェクチン=1000μl中に1.4μgのsiRNAと組み合わせて4.2および7μlを試験した
jetSI=2000μl中に2.8μgのsiRNAと組み合わせて8.4μl
jetSI−ENDO=2000μl中に1.4μgのsiRNAと組み合わせて4.2μl。
5’−UGAGCAAGUUCAAUAAAGA−3’
3’−ACUCGUUCAAGUUAUUUCU−5’
を有する特異的siRNAを、Elbashir他((2001)、Genes Dev.、15、188〜200)に従って設計した。選択した標的遺伝子に対して設計されたsiRNAに加えて、組み換えsiRNA(5’−CGCAUAAGUGAAAUAGAAU−3’、3’−GCGUAUUCACUUUAUCUUA−5’)を作製することによって対照siRNAを設計し、偽ハイブリダイゼーションを排除するためにBLAST検索を行った。二重鎖のGC含有率は30〜70%の範囲内に保ち、siRNA二重鎖の最適な安定性のために、すべてのsiRNA分子はその3’末端にdTdT突出を有するように合成した。siRNA分子はEurogentec(ベルギーSeraing)から注文した。
4つの異なる細胞系、HCT116、SW620、OHSおよびRMS細胞を、標準のjetSI−ENDOプロトコルを用いて、光感作薬(0.5μg/mlのTPPS2a)を存在させておよび存在させずに、S100A4の発現をサイレンシングするように設計された(実施例1参照)50nMのsiRNA(jetSI−ENDO=4.2μl、1.4μgのsiRNAと組み合わせた)を用いて形質移入した。細胞を照射に供し、照射の96時間後にウエスタンブロットを行うことによってS100A4タンパク質レベルを決定した(照射条件は、OHS=60秒間、SW620=80秒間、HCT116=90秒間、RMS=70秒間であった)。
S100A4タンパク質の発現をサイレンシングするように設計されたsiRNA分子を、4.2μlのjetSI−ENDOを用いて1〜5nMの濃度でOHS細胞内に形質移入し、上述のようにPCI処理に供した。
遺伝子サイレンシング効果は、細胞を曝露したsiRNAの濃度に伴って増加したが、4nMおよび5nMのsiRNAで見られたサイレンシング効果には僅かな差異しか存在しなかった。
図2Bは、細胞の照射と分析するための細胞溶解液の回収との間の時間を変更することによる、遺伝子サイレンシングに対する時間の効果を示す。照射後かつ回収前に細胞を長く放置すればするほど、遺伝子発現のより大きな阻害が観察されることがわかる。
OHS細胞に上述のように100nMのsiRNAまたは組換えsiRNAを形質移入し、タンパク質およびmRNAのレベルに対するPCI処理の効果を、照射の96時間後にウエスタンブロットおよびRT−PCRによって決定し、未処理の対照におけるタンパク質およびmRNAのレベルと比較した。
OHS細胞に、jetSI ENDO((jetSI−ENDO=8,4μl、1000μlの形質移入容積中で2,8μgのsiRNAと組み合わせた結果、200nMのsiRNA溶液である)を用いて、光感作薬を用いておよび用いずに、200nMのFITCで標識したsiRNAを形質移入した。その後、形質移入した細胞を照射に供した。
siRNA標的をS100A4のmRNA配列(Gene Bank受入番号NM_002961)に対して選択した。siRNAの481〜499をエフェクターとして用いた(配列は実施例1を参照)。
形質移入には、2つの溶液を作製した。溶液Aは、siRNAを100μlの無血清(OPTI−MEM I)培地に希釈した。溶液Bは、PEIを100μlの無血清培地に希釈した。穏やかに混合することによって溶液AおよびBを混合し、室温で30分間インキュベートした。その後、混合溶液を細胞に加えた(1mlの100nM siRNA)。
siRNA形質移入。すべての細胞系を「細胞系および培養条件」に記載のように培養し、形質移入前に25〜50%のコンフルエンスで6ウェルプレートにまいた(plated)。siRNAおよび担体を穏やかな混合によって複合体形成させ、細胞に加える前に30分間インキュベートした。細胞を、siRNA、担体、および光感作薬(TPPS2a=0,5μg/ml)を用いてまたは用いずに形質移入し、18時間インキュベートし、その後、新鮮な培地で3回洗浄し、光処理の前に4時間、再度インキュベートした。4時間後、細胞を青色光(7mW/cm2)に、実験に応じて様々な時間(0〜60秒間)露光させ、96時間再度インキュベートした後に回収した。遺伝子サイレンシングの際のPCIの効果を測定するために、特異的siRNA、組み換えsiRNA、および形質移入試薬単独を同じプレート中の異なるウェルに、光感作薬を用いてまたは用いずに適用し、全く同じ処理を与えた。細胞は実験中アルミニウム箔によって光から保護した。
S100A4 siRNAの活性に対するPCI効果を、様々な分枝状PEI製剤(formulation)を様々な濃度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/mlおよび100μg/ml、ウェル1つあたり1mlの培地を使用した)で用いて調査した。試験したPEI種(すべて分枝鎖状)は以下のとおりである:
PEI 分子量(Da)
1 800
2 1200
3 1300
4 1800
5 2000
6 25000
光用量は30秒間とし、血清含有培地中での複合体形成および形質移入をどちらも伴って、材料および方法に記載したプロトコルに従った。siRNAは100nMの濃度で用いた。図10から見ることができるように、PCIの使用は、様々なPEI担体を用いたS100A4 siRNAの遺伝子サイレンシング効果を有意に増強させることができる。この効果は、10μg/mlのPEI4(分子量1800)を除いてはPCIを用いない場合の効果が非常に低いが、より少量のPEI(1および10μg/ml)で特に顕著である。これら2つのPEIの濃度では、PCIにより、PEI1(分子量800)以外の試験したすべてのPEI種の遺伝子サイレンシング効果が顕著に増強された。
様々なPEI製剤(formulation)(分子量800〜25.000)単独(PCI処理を用いない)の毒性を最初に評価した。このアッセイでは、OHS細胞を96ウェルプレートにまき(plated)、血清含有培地中で一晩接着させた。その後、培地を廃棄し、細胞を培地および様々なPEI製剤(formulation)と共に、様々な濃度下で20時間インキュベートした。その後、PEI含有培地を廃棄し、MTS溶液(Promega、米国ウィスコンシン州Madison)をそれぞれのウェルに加え(1:6に希釈、100μl/ウェル)、プレートをさらに4時間、再度インキュベートした。490nmでの吸光度を測定した。
β−シクロデキストリンアミンに媒介されるsiRNA送達に対するPCIの効果を調査した。60秒間の光用量をこれらの実験で用い、材料および方法に記載のプロトコルに従った。n=6およびX=4である上述のβ−シクロデキストリンアミンを滅菌水で希釈し、無血清培地中で複合体形成および形質移入を行った。ウエスタンブロット(図12)から見ることができるように、50nM(0.7μg)のsiRNAと複合体形成した100μg/mlのβ−シクロデキストリンアミン(各ウェルに1mlを使用)が、PCIに誘発されるsiRNA送達に有効であり(レーン3)、一方で、これらの条件下では、PCIを用いない送達は無効であった(レーン6)。本研究で用いたβ−シクロデキストリンアミンは、siRNAとの結合に関与するアミン橋によって複合化したβ−シクロデキストリン分子からなり、Hwang S.J.他(2001、Bioconjugate Chem.、12、280〜290)に記載されている。
ポリアミドアミド(PAMAM)デンドリマーを、PCIに誘発されるsiRNA送達について評価した。PAMAMを滅菌水で希釈し、血清含有培地中で形質移入を行った。100μg/mlの様々な種類のPAMAMデンドリマー(世代2〜7)(各ウェルに1mlを使用)を100nM(1.4μg)のsiRNAと複合体形成させ、上述の手順に従って形質移入を実施した。30秒間の光用量をこれらの実験で用いた。ウエスタンブロット(図13A)からわかるように、siRNA/PAMAMが単独では遺伝子サイレンシングに無効であった条件下で(レーン4および5)、PCIはsiRNAの活性を強力に増強することができた(レーン1および2)。図13Bからわかるように、この効果はいくつかの他の種類のPAMAMデンドリマーでもみられ、これは、PCIがポリアミン系のデンドリマーによってsiRNA送達を全般的に増強することができることを示している。
G2 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=2); デンドリPAMAM(NH2)16
G3 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=3); デンドリPAMAM(NH2)32
G4 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=4); デンドリPAMAM(NH2)64
G5 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=5); デンドリPAMAM(NH2)128
G6 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=6); デンドリPAMAM(NH2)256
G7 = 分子式: [NH2(CH2)2NH2]:(G=7); デンドリPAMAM(NH2)512
ポリアルギニンを滅菌水で希釈し、無血清培地中で形質移入を行った。2種類のポリアルギニン担体(分子量15000〜70000および>70000)を試験した。0.35または0.7μg/mlのポリアルギニン(各ウェルに1mlを使用)を100nM(1.4μg)のsiRNAと複合体形成させ、上述のプロトコルに従って、30秒間の光用量を与えた後にS1004Aの発現をウエスタンブロットによって評価した。図15からわかるように、PCIで処理したおよび処理していない試料間で遺伝子サイレンシングの有効性に有意な差異が存在する。このように、PCIで処理したすべての試料(図15のR+試料)は有意な遺伝子サイレンシングを示す一方で、PCIで処理しない対応する試料(図15のR−試料)ではサイレンシング効果が観察されない。したがって、PCIは、試験した異なるポリアルギニン担体のどちらでも、また使用したどちらの濃度でも、遺伝子サイレンシングの誘発に有効であり、これは、PCIが陽イオン性ペプチド系の担体によってsiRNA送達を有意に増強することができることを示している。
Claims (36)
- siRNA分子を細胞のサイトゾル内に導入するin vitro若しくはex vivoの方法、又は、siRNA分子をヒトを除く動物の細胞のサイトゾル内に導入するin vivoの方法であって、
i)前記細胞をsiRNA分子、担体および光感作薬と接触させることと、
ii)細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することを含む方法であって、
前記担体が、
(a)5−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド(DOGS)、JetSI(商標)およびJetSI−ENDO(商標)から選択された非リポソーム剤形中のリポポリアミン、
(b)ポリエチレンイミン(PEI)、
(c)以下の式のβシクロデキストリンアミンポリマー
(d)PAMAMデンドリマー分子、および
(e)ポリ−ヒスチジン、ポリ−アルギニン、ヒスチジル化ポリ−リシンおよびポリ−オルニチン、または、LもしくはDリシン、LもしくはDアルギニン、LもしくはDヒスチジンおよび/またはオルニチン残基と1つ以上の他のアミノ酸とのコポリマーから選択された、陽イオン性ペプチド、
から選択された陽イオン性ポリアミンである方法。 - 前記担体がPEIであり、該PEIの分子量が30kDa未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記PEIの分子量が25kDa以下である、請求項2に記載の方法。
- 前記担体分子が分枝PEI分子である、請求項1又は3に記載の方法。
- PEIの分子量が50kDa未満である、請求項4に記載の方法。
- 前記担体がPEIであり、GPCによる該PEIのMn値が500〜20000である、請求項1に記載の方法。
- 前記担体がPEIであり、GPCによる該PEIのMn値が500〜1500である、請求項1に記載の方法。
- 前記PAMAMデンドリマー分子が世代2〜7のPAMAMデンドリマー分子である、請求項1に記載の方法。
- siRNA分子が長さ12〜28ヌクレオチドである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 光感作薬が、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、リソソーム向性(lysomotropic)弱塩基、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリン、5−アミノレブリン酸および/もしくはそのエステル、または前記光感作薬のいずれかの誘導体、または製薬上許容されるその塩から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 光感作薬が、TPPS 4 、TPPS 2a 、AlPcS 2a 、TPCS 2a 、5−アミノレブリン酸もしくは5−アミノレブリン酸のエステル、または製薬上許容されるその塩から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記siRNAを前記担体と接触させる追加のステップをさらに含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- siRNA分子および担体分子を、細胞と接触させる前に20〜40分間、互いに接触させる、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 10nM〜200nMのsiRNAを形質移入に用いる、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- ポリカチオン、ポリエチレンイミン、デンドリマー、陽イオン性脂質およびペプチドから選択された光感作薬担体がさらに存在する、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- siRNAを担体と混合して複合体を形成させ、次いでそれを細胞に光感作薬と同時にまたは逐次的に投与する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を光感作薬と接触させ、前記細胞を、導入する担体およびsiRNA分子と接触させ、前記細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することによって前記方法を行い、前記照射は、前記siRNA分子および前記担体の、前記光感作薬を含む細胞内区画内への細胞取り込みの前に行う、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記照射は、前記siRNA分子および前記担体の任意の細胞内区画内への取り込みの前に行う、請求項18に記載の方法。
- 請求項1から19のいずれか一項に記載の方法によりsiRNA分子を標的遺伝子を含む細胞内に導入することによって、前記標的遺伝子の発現を阻害するin vitroもしくはex vivoの方法、または、ヒトを除く動物の細胞において前記標的遺伝子の発現を阻害するin vivoの方法であって、前記siRNA分子が、前記標的遺伝子の発現を特異的に阻害する方法。
- 細胞のサイトゾル内に内部移行されているsiRNA分子を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる細胞または細胞集団。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の担体分子と、siRNA分子とを含み、請求項1、11または12のいずれか一項に記載の光感作薬も含む組成物。
- 前記光感作薬は前記siRNA分子および担体分子と別個に含まれている、請求項22に記載の組成物。
- 請求項21に記載の細胞または細胞集団を含む組成物。
- 治療で使用するための、請求項22から24のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1、11または12のいずれか一項に記載の、siRNA分子、担体分子および光感作薬を含むキット。
- 患者において1つ以上の標的遺伝子の発現を変更させることによって、患者の疾患、障害または感染症を治療または予防するための医薬品の調製における、請求項1から8のいずれか一項に記載の、siRNA分子および担体の使用であって、
前記治療または予防が、下記の方法によりsiRNA分子を前記患者の細胞または細胞のサイトゾル内に導入することを含む使用。
i)前記細胞をsiRNA分子、担体および光感作薬と接触させることと、
ii)この細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することを含む方法であって、
該光感作薬は、請求項1,11または12のいずれか一項に記載されている光感作薬である。 - 患者において1つ以上の標的遺伝子の発現を変更させることによって、患者の疾患、障害または感染症を治療または予防するための医薬品の調製における、請求項21に記載の細胞または細胞集団の使用。
- 前記医薬品が、異常な遺伝子発現によって代表される、または1つ以上の遺伝子の抑制から利益を受ける疾患または障害を治療するためのものである、請求項28に記載の使用。
- 前記医薬品が、癌、神経変性疾患またはウイルス感染症を治療するためのものである、請求項29に記載の使用。
- ヒトを除く患者において疾患、障害または感染症を治療または予防する方法であって、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法に従ってsiRNA分子および担体を1つ以上の細胞内にin vitro、in vivoまたはex vivoで導入すること、および必要な場合には前記細胞を前記患者に投与することを含む方法。
- ヒトを除く患者において疾患、障害または感染症を治療または予防する方法であって、請求項21に記載の細胞または細胞集団を前記患者に導入することを含む方法。
- 異常な遺伝子発現によって代表される、または1つ以上の遺伝子の抑制から利益を受ける疾患を治療するために使用する、請求項31または32に記載の方法。
- 前記疾患が、癌、神経変性疾患またはウイルス感染症である、請求項33に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の担体と、siRNA分子とを含み、請求項1、11または12のいずれか一項に記載の光感作薬を含み、該siRNA分子、該担体および該光感作薬が医療において同時、個別または逐次的な使用のためのものであることを特徴とする製品。
- 前記患者において1つ以上の標的遺伝子の発現を変更させることによって、疾患、障害または感染症を治療または予防するための医薬品の調製における、請求項1、11、または12のいずれか一項に記載の光感作薬の使用であって、
前記治療または予防が、下記の方法によりsiRNA分子を前記患者の細胞または細胞のサイトゾル内に導入することを含む使用。
i)前記細胞をsiRNA分子、担体および光感作薬と接触させることと、
ii)細胞に光感作薬を活性化させるのに有効な波長の光を照射することを含む方法であって、
該siRNAおよび担体は、請求項1〜8のいずれか一項に記載されているsiRNAである。
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