CN104878044B

CN104878044B - 一种脂类化合物siRNA转染试剂

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Publication number: CN104878044B
Application number: CN201510213174.0A
Authority: CN
Inventors: 崔坤元; 梁东; 夏国庆
Original assignee: CHANGZHOU BAIDAI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Changzhou Baidai Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104878044A

Abstract

本发明公开了一种脂类化合物siRNA转染试剂，属于小干扰核酸(siRNA,small interfering RNA)转染试剂的技术领域。本发明的脂类化合物siRNA转染试剂包括脂多胺、磷脂化合物和阳离子脂质化合物。与已有的siRNA转染试剂相比，本发明的siRNA转染试剂细胞毒性低，转染效率高，基因抑制效果更加明显，特别适合于细胞基因功能的研究和siRNA类药物的开发应用。

Description

一种脂类化合物siRNA转染试剂

技术领域

本发明涉及一种脂类化合物siRNA转染试剂，属于小干扰核酸(siRNA,smallinterfering RNA)转染试剂的技术领域。

背景技术

抑制细胞内特定基因表达是一种非常重要的研究基因功能和寻找新的核酸药物的方法。常用的抑制细胞内基因表达的方法是将一段人工合成的siRNA转染至细胞内，引发核酸干扰(RNAi)，即双链RAN(dsRAN)在细胞内特异性诱导同源互补mRNA降觧的现象，从而封闭细胞内与之同源的目标基因的表达。由于siRNA是一种带强负电荷的分子，不能自己进入细胞，因此需要特殊的载体帮助才能进入细胞。利用载体将 siRNA导入细胞内的方法叫转染，将siRNA导入细胞内的载体叫转染试剂。目前的转染试剂有许多材料，包括脂类物质、多肽、聚乙烯亚胺(PEI)，均可将siRNA传输至细胞内，但最常用的是脂类物质，且有多个以脂类物质为材料的siRNA转染试剂在科研用市场上销售。然而，这些转染试剂绝大多数是单纯用阳离子脂质化合物配制的，存在如下问题：(1)细胞转染效率低，普通细胞株转染阳性率一般在60％以内；(2) 基因抑制效果差，抑制效率一般在65％以内；(3)细胞毒性大，转染细胞死亡率一般在30％-50％以上。由于细胞转染死亡率较高，转染阳性率又很低，siRNA转染实验无法获得准确的结果，尤其是细胞对转染试剂的毒性引起一系列的反应，从而导致基因表达的变化，往往引起对基因功能研究的误判。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型脂类化合物siRNA转染试剂，以解决常规阳离子脂质化合物转染试剂的转染效率不高、毒性大的问题。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种脂类化合物siRNA转染试剂，其包含有如下化合物：脂多胺、磷脂和阳离子脂质。

对上述脂类化合物siRNA转染试剂的各组分用量进行优选后，其中的脂多胺、磷脂和阳离子脂质的重量比范围是(0.05～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.8)。

本发明术语“磷脂”意指由脂肪酸，磷酸和含氮碱基组成的各种化合物，包括但不限于磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰肌醇和心肌磷脂，可以选自如下的任何一种或多种：1,2-二月桂酰基-顺-甘油酯(DLG)；1,2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油酯(DMG)；1,2- 二棕榈酰基-顺-甘油酯(DPG)；1,2-二硬酯酰基-顺-甘油酯(DSG)；1,2-二月桂酰基- 顺-甘油-3-磷酯酸(钠盐；DLPA)；1,2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-磷酯酸(钠盐；DMPA)； 1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酯酸(钠盐；DPPA)；1,2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-磷酯酸(钠盐；DSPA)；1,2-二花生四烯酰基-顺-甘油-3-磷酯酸(DAPC)；1,2-二月桂酰基-顺-甘油 -3-磷酸胆碱(DLPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-O-乙基3-磷酸胆碱(氯离子或三氟甲磺酸根离子；DPePC)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)；1,2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2- 二月桂酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DLPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DMPE)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DPPE)；1,2-二硬酯酰基- 顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DSPE)；1,2-二月桂酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸(钠盐；DLPG)； 1,2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸(钠盐；DMPG)；1,2-二肉豆蔻酰基-顺-甘油-3- 磷酸-顺-1-甘油(铵盐；DMP-sn-1-G)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸(钠盐； DPPG)；1,2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸(钠盐；DSPG)；1,2-二硬酯酰基-顺-甘油 -3-磷酸-顺-1-甘油(钠盐；DSP-sn-1-G)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐；DPPS)；1-棕榈酰基-2-亚油酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱(PLinoPC)；1-棕榈酰基-2- 油酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸(钠盐； POPG)；1-棕榈酰基-2-油酰基-顺-甘油-3-甘油磷酸(铵盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-lyso- 顺-甘油-3-磷酸胆碱(P-lyso-PC)；1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)；1-硬酯酰基-2-lyso-顺-甘油-3- 磷酸胆碱(S-lyso-PC)；1,2-二二十六碳六烯酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(22:6PE)； 1,2-二花生四烯酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(20:4PE)；1,2-二亚麻酰基-顺-甘油-3- 乙醇氨磷酸酯(18:3PE)；1,2-二亚麻酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DlinPE)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DPPE)；1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯 (DPPE)；1,2-二硬酯酰基-顺-甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DSPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-顺- 甘油-3-乙醇氨磷酸酯(DMPE)。

上述的磷脂中，一些含有磷酯酸或者磷酸基团的，在市售产品中一般是其钠盐的形式，例如：1,2-二月桂酰基-顺-甘油-3-磷酯酸；在本发明中提供的转染试剂组合物中，既可以采用其钠盐形式，也可以采用其游离酸形式。

本发明中术语“阳离子脂质”意指任何一种带有阳离子的脂类化合物，大部分阳离子脂质的特点是带有游离的NH₂或NH基团。本发明中阳离子脂质化合物优选为 N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(N,N-di oleyl-N,N-dimethylammonium chloride， DODAC)；N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵 (N-(l-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride，DOTMA)；N,N-二甲基-(2,3-二油烯基氧基)丙胺(N,N-dimethyl-(2,3-dioleyloxy)propylamine，DODMA)； N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide， DDAB)；N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(N-(l-(2,3-di oleoyl oxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchloride，DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(3-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol， DC-Chol)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵 (N-(l,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethyl ammonium bromide， DMRIE)；1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基SPERMYL)PROPYLAMID (1,3-DI-OLEOYLOXY-2-(6-CARBOXY-SPERMYL)-PROPYLAMID，DOSPER)；1,2- 二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane， DLinDMA)；和1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷 (l,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、双十八烷基二甲基铵 (dioctadecyldimethylammonium，DODMA)、双硬脂基二甲基铵(Distearyldimethylammonium，DSDMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷 (1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N- 二甲基氨基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67)、N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-53)、1-(N4-精胺)-2,3- 二月桂基甘油氨基甲酸酯(GL-89)中的任何一个或者任何至少两个以上的混合物。

所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其中的脂多胺中不含有游离氨基。

优选地，如上所述的脂类化合物siRNA转染试剂中的脂多胺的结构中至少一个胺基上连接有1个或2个如式(I)所示的基团：

其中，R是含有3～18个碳原子的直链或者带有支链的烷基，n是0或者1。

优选地，如上所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其中的脂多胺是由胺基化合物上的胺基与环氧化合物上的环氧基充分反应而得。脂多胺的合成要求在中性pH下，不带电荷，也就是说脂多胺在培养液中是不带电的，不会与培养液中的成分结合。但吞噬进入细胞后，在细胞内体中的酸性pH下，带正电荷，能驱使细胞质内的H离子，进入细胞内体，使其膨胀，破裂，释放siRNA进入细胞质，使siRNA在细胞内发生功效。不带电荷，也就是说在血液中是不带电的，不会与血液中的成分结合，但吞噬进入细胞后，在细胞内体中的酸性pH下能驱使细胞质内的H离子，进入细胞内体，使其膨胀，破裂，释放siRNA进入细胞质，使siRNA在细胞内发生功效。

进一步优选地，所述的胺基化合物选自如下所示的结构：

S1：

Ns：

T4：

Ta：

T3：

B1：

Md：

B2：

T5：

优选地，如上所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其中的环氧化合物的结构如式(II)所示：

进一步优选地，如上所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其中的环氧化合物选自如下所示的结构：

C1：其中m＝12～14之间的任意整数；

C2：其中p＝8～10之间的任意整数；

C3：

C4：

C5：

C6：

在本发明最优选的实施例中，如上所述的脂类化合物siRNA转染试剂，其组成选自如下的组合之一：(1)S1C2、DPPC和DODAC；(2)B1C2、DOPE和DDAB；(3)B2C2、 DOPE和DDAB；(4)B2C3、DOPE和DDAB；(5)B2C4、DOPE和DDAB；(6)B2C5、DOPE 和DDAB；(7)B2C6、DOPE和DDAB。

在本发明的效果试验中发现，分别加入磷脂和脂多胺可以产生提高基因抑制表达的作用，且同时加入脂多胺和磷脂之后，可以产生协同作用，产生更好的抑制效果；而且具有很小的细胞毒性，细胞密度未发现明显的减小。因此，本发明还提供一种组合物的新用途，即：阳离子脂质与脂多胺或/和磷脂在制备siRNA转染试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明涉及的脂类化合物siRNA转染试剂具有如下优点和进步性：

(1)细胞转染阳性率：本发明制备的新型脂类化合物用于普通细胞株siRNA转染的阳性率在85～90％以上；

(2)基因抑制效率：普通细胞株siRNA转染后，靶基因mRNA抑制效率在90％以上；

(3)细胞死亡率：本发明制备的新型脂类化合物用于普通细胞株转染后细胞死亡率在10％以内。

附图说明

图1：采用B2C2转染试剂处理后的细胞显微图；

图2：采用转染试剂Lipofectamine处理后的细胞显微图。

具体实施方式

本发明实施例涉及的脂类化合物siRNA转染试剂，其由如下3种化合物组成：脂多胺、磷脂和阳离子脂质。下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在一些实施方式中，脂多胺中不含有游离氨基。在另一些实施方式中，脂多胺的至少一个胺基上连接有1个或2个如式(I)所示的基团，也可以是2个或者2个以上的胺基上分别连接有1个或2个如式(I)所示的基团：其中，R 是指含有3～18个碳原子的直链或者带有支链的烷基，n是0或者1；当n＝0时，上述的结构是：当n＝1时，上述的结构是：

上述的胺基，是指脂多胺中的NH或者NH₂基团。也就是说，在脂多胺的胺基上可以直接连接有一定长度的碳链，也可以是通过一个-C-O-之后再连接上碳链。保持碳链的一定长度可以有效地提高转染试剂的转染效果。

脂多胺分子由两种化合物反应而成，在一些实施方式中，由以下所示的含胺基的化合物通过其NH₂或NH与以下所列环氧化合物的环氧基反应而成，在一些典型的反应条件下，反应温度为92℃±1℃，反应时间为43小时，反应结果为生成的脂多胺分子中不含游离氨基，所有胺基上连接有1个或者2个如式(I)所示的基团。

在一些实施方式中，上述的胺基化合物可以选自如下所示的结构：

S1：

Ns：

T4：

Ta：

T3：

B1：

Md：

B2：

T5：

上述的环氧化合物的结构如下式(II)所示：

其中，R是指含有3～18个碳原子的直链或者带有支链的烷基，n是0或者1。

在一些实施方式中，上述的环氧化合物的结构如下所示：

C1：

其中m＝12～14之间的任意整数；

C2：

其中p＝8～10之间的任意整数；

C3：

C4：

C5：

C6：

以上所示的胺基化合物和环氧化合物可以任意搭配进行反应进而制备得到不同的脂多胺，在一些实施方式中，可以反应制得如下的特定结构的脂多胺分子：

B1C1：

B2Cx：

T3Cx：

TaCx：

上式中的Cx可以指任意的带有支链或者不带支链的烷基，x的取值可以在3～18之间的任意整数。

以上的化合物的编号标记是以一种胺基化合物的编号与环氧化合物的编号组成，代表的含义是由该两种编号的原料相反应而成；例如B1C1代表的是B1胺基化合物与C1环氧化合物相反应而得，依此类推，其它的一些典型的脂多胺化合物如下所示： S1C1、TaC1、T3C1、B1C1、S1C2、TaC2、T3C2、B1C2、S1C3、TaC3、T3C3、B1C3、 S1C4、TaC4、T3C4、B1C4、S1C5、TaC5、T3C5、B1C5、S1C6、TaC6、T3C6、B1C6、 NsC1、MdC1、T2C1、B2C1、NsC2、MdC2、T2C2、B2C2、NsC3、MdC3、T2C3、 B2C3、NsC4、MdC4、T2C4、B2C4、NsC5、MdC5、T2C5、B2C5、NsC6、MdC6、 T2C6、B2C6、T4C1、T5C1、T4C2、T5C2、T4C3、T5C3、T4C4、T5C4、T4C5、T5C5。

本发明的另一方面是在化合物的合成中，反应环氧化合物可以与多胺化合物上氨基数成比例的反应。因此，大环化合物中的氮将全被衍生化。另一种情况下，反应的环氧化合物可以少于化合物环上氨基数，这种情况下多胺化合物中只有部分氮被衍生化。而当反应的环氧化合物与多胺化合物的数量为1:1时，大环化合物的氨基只有一个氮会被衍生化。

在实施方式中，本发明所述的脂类化合物siRNA转染试剂由以上所示的任何一种脂多胺分子与任何一种磷脂化合物和任何一种阳离子脂质化合物混合组成。例如：新型脂类化合物核酸转染试剂由第一种化合物T4C5、阳离子脂质DOTMA和磷脂DMPC 组合的混合组成。脂类化合物siRNA转染试剂的细胞转染效果可按照上述方式组合后再进行细胞转染筛选。

实施例一：多胺酯类化合物的合成

多酯类化合物是通过将多氨化合物和环氧化合物在装有搅拌子的玻璃瓶内无溶剂下90℃反应得到。多胺化合物选自4到10个氨基官能团的化合物，环氧化合物包括不同链长、不同特征官能团和不同饱和度的脂肪族化合物。反应时间为90℃下24-72小时。可以通过添加到反应混合物中多胺化合物的量控制反应的程度。例如，如果多胺化合物含有4个氨基，加入4倍当量的环氧化合物，即可得到连有4个烷基链的化合物，这一结果已经从薄层色谱(TLC)上得到证实，在本发明实施例中的反应混合物中只存在一种全部取代的产物。

实施例二：转染试剂的制备

制备转染试剂：称量100mgS1C2，100mg阳离子脂质DOTAP，100mg磷脂DOPE，在玻璃容器内混合溶于三氯甲烷，在真空下除去三氯甲烷。然后加上300ml水，旋涡震荡溶于水中，经高压均质处理,均质条件是压力为1000帕，两次循环(ATS均质机)。

依照同法，选用相应的胺基化合物和环氧化合物时，也可以制备出其它的脂多胺化合物。以下实施例中，C1化合物中的m为12，C2化合物中的p为8。

实施例三：细胞转染

Lamin A/C siRNA：

正义链:GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU

反义链:AGCCCAGAUCGUCACCACCUU

A.细胞接种

转染前一天将对数生长期的HeLa细胞接种于96孔板，每孔加200μl DMEM培养基(Life Technologies)，不可加抗体，调整细胞接种密度使细胞在转染时密度在30～ 50％。

B.siRNA-转染试剂混合物准备

1. 6pmol siRNA用50μl无血清培养基稀释；

2. 2μl转染试剂(实施例一制备)用无血清培养基稀释至总体积为50μl。涡旋震荡10秒后，室温孵育5分钟；

3.将siRNA稀释液与转染试剂稀释液混合(总体积100μl)。涡旋震荡10秒后，室温孵育20分钟。

C.将混合物加到完全培养基内

1.将100μl混合物加入步骤A备好的培养孔内，轻轻敲打培养板，混匀。

2. 37℃，5％CO₂培养48h，检测基因表达效果。

注意：用于基因沉默的孵育时间的优化，取决于细胞类型，与分析方法。可通过实施时间进程实验来确定最佳孵育时间。

实施例四mRNA的分离及定量

转染后48小时，将细胞用100μl PBS洗一次，然后加入100μl(Turbocapture 试剂盒，Qiagen公司制)裂解缓冲液。溶解的细胞产物(80μl)转移到一个96孔的 mRNA的捕捉板，在室温下孵育1小时。用100μl洗涤缓冲液洗涤三次，然后80μl 的洗脱缓冲液加入到各孔中，在65℃下温育5分钟。洗脱溶液(含有mRNA的)被转移到一个新的96孔清洁洗板。

实时荧光定量PCR：

荧光定量PCR方法采用SYBR Green一步实时荧光定量PCR试剂盒(SensiMix 一步SYBR Green试剂盒，BIOLINE)。

3μl分离的mRNA用来进行实时荧光定量PCR

10μl master mix(含逆转录酶)

1μl的正向引物(6μM)

1μl的反向引物(6μM)

0.4μl 50X的SYBR Green

4.6μl水(无RNA酶的灭菌水)

共计20μl

反转录反应的条件是：温度在42℃，30分钟后。然后，95℃，15分钟灭活逆转录酶并用于激活热启动Taqg聚合酶；PCR循环的温度和时间是：95℃，15秒；秒， 60℃，20，30秒；，72℃，320秒，共40个循环。用ΔΔCT方法分析基因表达的变化。

实施例五细胞转染毒性的比较

转染前一天HeLa细胞接种于96孔板，每孔加200μl培养基，不可加抗体，调整细胞接种密度使细胞在转染时密度在30～50％。按照实施例二中的条件分别将目前市场最常用的Lipofectamine转染试剂和B2C2组合转染HeLa细胞。37℃，5％CO₂培养 24h后取出，在显微镜下，观察细胞生长的密度(如图1，B2C2)和图2(市场常用的转染试剂)。

实验结果：

1.采用HeLa细胞，分别使用本发明的转染试剂和Lipofectamine转染siRNA。新型转染试剂与Lipofectamine(ABI相比，其毒性只是Lipofectamine的三分之一)。如图1和图2所示。图1为以上实施例中B2C2的转染后的细胞显微镜图，图2是采用 Lipofectamine转染之后的细胞显微镜图，用Lipofectamine转染siRNA的细胞明显减少。

2.部分转染试剂显示出令人难以预料的基因抑制效果，具体实验结果见下表：

3.对照试验

分别采用“脂多胺+磷脂+阳离子脂质”转染试剂与“脂多胺+阳离子脂质”转染试剂和“磷脂+阳离子脂质”转染试剂转染siRNA抑制基因表达效果及细胞毒性对照(具体实验结果见下表)：

从上表中可以看出，分别加入磷脂和脂多胺可以产生提高基因抑制表达的作用，且同时加入胺多胺和磷脂之后，可以产生协同作用，产生更好的抑制效果；而且具有很小的细胞毒性，细胞密度未发现明显的减小。

Claims

1.一种脂类化合物siRNA转染试剂，其特征在于，该转染试剂的组成为：(1)S1C2、1,2-二棕榈酰基-顺-甘油-3-磷酸胆碱和N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵按重量比范围(0.05～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.8)组成，或(2)B2C6、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺和N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵按重量比范围(0.05～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.8)组成；所述的S1C2或B2C6是由胺基化合物上的胺基与环氧化合物上的环氧基充分反应而得，其中：

S1：

B2：

C2：其中p＝8～10之间的任意整数；

C6：。