JP2008505633A - 正荷電ペプチドと複合化したpna分子を細胞質および/または核への光化学的内在化(pci)により導入する方法。 - Google Patents
正荷電ペプチドと複合化したpna分子を細胞質および/または核への光化学的内在化(pci)により導入する方法。 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明は、細胞にPNA分子および光増感剤を接触させること、および該細胞
に該光増感剤を励起するのに有効な波長を有する光を照射することを含むものであって、PNA分子を細胞、好ましくは細胞の細胞質および/または核に導入するための方法に関する。さらに複合化したPNA分子を含む組成物、上記方法を用いた細胞、またはアンチセ
ンスまたはアンチジーン戦略など、遺伝子活動の評価または改変に向けた上記方法の使用、あるいはダウンレギュレーションされた遺伝子産物の効果を評価するためのハイスループットシステムなど、下流での応用に向けた上記方法の使用に関する。
【選択図】なし
Description
必要があるため、少数の細胞に対するときが最も好適であり、インビボで多数の細胞への適用には向いていない。細胞の損傷もまた問題となる。
などの界面活性剤による細胞膜透過法(Nortonら(1996), Nat. Biotech 14, 625-620)といった膜崩壊法(membrane disruptive methods)もまた試されてきた。これらの方法も
インビボでの使用には適さず、細胞に損傷を与えかねない。
A−DNAハイブリッドは、DNAからの寄与により分散した負の電荷を有する。凝縮した粒子はPNA−DNAハイブリッドとカチオン性脂質との相互作用により形成され、これらのリポプレックス(lipoplex)は培養された哺乳動物細胞にすみやかに取り込まれる(Borgattiら(2003), Oncol. Res. 13(5), 279-287;Borgattiら(2002), Biochem. Pharmacol. 64(4), 609-616;Nastruzziら(2000), J. Control Release 68(2), 237- 249)。PNAはまた、脂質への共有結合的な付着によっても細胞内に輸送されであろう(Muratovskaら(2001), Nucleic Acids Res. 29(9), 1852-1863;Ljungstromら(1999), Bioconjug. Chem. 10(6), 965-972 ;Filipovskaら (2004), FEBS Lett. 556 (1-3), 180-186)。
に入り込む能力を向上させるために試みられてきた。PNAを細胞内に輸送する目的のために、様々な種類の輸送ペプチドが設計されている。
る様式で、PNAのペプチドとの複合化はPNAの核への輸送を増進するが、NLS配列の
逆転(inversion)の後では核の局在化は見られないことを明らかにした。
(2002), J. MoI. Biol. 318, 237-243)。細胞膜輸送ペプチド(cellular membrane transporter peptide)はPNAを引き入れると考えられており、さらにNLSはPNAを核の方に連れて行くと思われる。これらの実験において、リジン−リジンのペプチド配列だけを有する細胞貫通ペプチドを含有する構成物が細胞質に残されていたことから、NLSは核への輸送にとって必須であることが明らかにされた。
物学的な効果のためには、大抵の場合、PNAが核へ移送されることが必要とされる。
放出されるときに、これらの分子が核へ移送されることを明らかにした。
であり、同時に投与された分子の細胞への内在化を達成するものである。この手法は、エンドソームなどの細胞のオルガネラに取り込まれた分子が、照射の後にはこれらのオルガネラから細胞質に放出されることを可能とする。
されている(参照により本明細書に取り込まれる)。そこで示されているように、内在化されるべき分子(本発明による利用においてはPNA−ペプチド複合体であろう)および光増感剤は、細胞と接触させられる。この光増感剤および内在化されるべき分子は、細胞内において細胞の膜で仕切られたサブコンパートメント(cellular membrane-bound subcompartment)に取り込まれる。この細胞を適切な波長の光で照射すると直ちに光増感剤は励起し、細胞内コンパートメントの膜を破壊させる有毒な化学種を直接的または間接的に生成する。これにより内在化された分子が細胞質内への放出が可能となる。
それが核に移送される上で、特定の細胞貫通配列も、NLS配列もPNAには必要とされな
いことは、特に驚くべきことである。PNAが少なくとも1つの正味の正電荷を有するペプチドと連結することが必要とされることのすべてである。
プチドの存在が、細胞内、エンドソーム性コンパートメント(endosomal compartments)のような細胞コンパートメントへのPNA分子の取り込みを促進しているようにみえる。加えて、PNA分子の細胞質への放出または内在化に続いて、正に荷電したペプチドはPNA分子の核へのターゲティングをも仲介する。その結果、PNA分子を所望の部位に差し向けるために最小限の修飾のみが要求され、PNA分子を長いアミノ酸配列または複数のアミノ酸配列と複合化させることは必要とされない。
これまた驚くべきことである。
のPNAは、遊離の線状形態であってもよく、二量体またはbis-PNAのように自己連結(self-ligated)した形態であってもよい。
具体的には、6〜20塩基長の分子を用いることができる。長さ12〜17単位のPNAオリゴ
マーを選択することもできる。配列の長さは、用いられる方法に要求される特異性を第一に決定される。25塩基よりも長いものが要求されるDNAの適用は、それよりずっと短いPNAプローブを用いてルーチンに実施することができる。長いPNAオリゴマーは、配列にもよるが、凝集しやすいため精製および同定確認が難しい。しかしながら配列が短いほど、より特異的になる。結果的にミスマッチの影響は短い配列についてよりも大きくなる。それでも20単位のPNAオリゴマーは、凝集の問題を生じることなく使用することができる。
PNA分子は、アンチセンスPNA分子であってもよく、または遺伝子(アンチジーン分子)と相補的なPNA分子であってもよく、特徴的な三重体構造を形成することができる。PNA分子はまた、プローブ、すなわち標的核酸配列と結合し、便宜的にはラベルを携えたものであってもよい。
た取り込みが達成される。
大きく減少させる、具体的には20、30、40または50%より大きく減少させることを達成できるようにである。タンパク質の減少レベルは、タンパク質の半減期に依存する。すなわち、既存のタンパク質は半減期に従って除去される。したがって、半減期を考慮するようにして、PNAがない場合における同じ時点での発現より10、20、30、40または50%よりも大きな減少が達成される。
り、より好ましくは、3(または4, 5もしくは6)から25、3(または4, 5もしくは6)から20、あるいは3(または4, 5もしくは6)から15のアミノ酸長である。さらに好ましい態様では、そのペプチドは10よりも小さい、たとえば3, 4, 5もしくは6アミノ酸長である。、
ペプチドは、いかなる好都合な方法(たとえば直接的な化学合成)により調製してもよく、また細胞内で適当な配列の核酸分子を発現させる組換え手法により調製してもよい。正に荷電した分子は、それが複合化するPNA分子を、細胞内、続いて細胞質内、好ましくは核内にも移送する能力を有する。
意味する。アミノ酸は、ペプチドの状況で存在するときに、もしも生理的なpHにおいて優勢な化学種のものが正に荷電しているならば、+1であると考えられる。ペプチド中のそのような各アミノ酸は、ペプチドの最終的な電荷を計算する上で、正の荷電にさらに寄与するものとなる。ペプチドは、その正味の電荷(各アミノ酸に帰属する電荷を合計することにより計算される)が正となる限りにおいて、中性の残基と同様に一以上の負に荷電したアミノ酸残基を有していてもよい。PNA分子は非荷電であり、そのもの自体は分子の全体的な荷電に寄与するものではない。しかしながら、重要なことであって、正に荷電したペプチドの存在を決定する上で評価がされるのは、ペプチド部分の電荷であることを理解すべきである。
(R)およびヒスチジン(H)であり、上記の尺度において+1であると考えられる。アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)は、たいていの生理的なpHにおいて負の電荷を帯びており、上記の尺度において−1であると考えられる。その他の天然アミノ酸は電荷を帯びていないと考えられる。正または負に荷電したアミノ酸は、ペプチドの全体的な電荷が+1以上である限り、いくつ存在していてもよい。
のような非タンパク質分子に結合するなどして、ハイブリッド分子の一部として存在していてもよい。またそのペプチドは、天然ではタンパク質性であるが実際上ペプチドから独立している(たとえば、非荷電であるか、または構造的には分離した配置にある)ような分離した構成部分に結合していてもよい。このような場合には、そのペプチドは露出した、好ましくは周辺の部分を構成し、その部分の電荷が対応するペプチドのものとして評価されるだろう。
示された。正味の電荷が+5のペプチド取り込みが最高であり、これはその電荷に寄与する配列には依存しないことが分かった。ペプチドの電荷は>1, 好ましくは+1〜+10、具体的
には+2〜+8、すなわち+3〜+6、例えば+4 または +5である。
SEQ ID NO:7 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL, SEQ ID NO:6 AKL および SEQ ID NO:5 GHHHHHGである。
るいはそれらは、例えば、(Btoc)手法によって単一の分子として化学的に合成してもよい。この方法において、PNAモノマーは、 ペプチド合成の標準的プロトコルを利用して20塩基ものの長さのオリゴマーに合成される。PNAモノマーは、N- 末端モノマーアミノ基のfluorenylmethozycarbonyl (Fmoc) 保護、ならびにA、CおよびG外環アミノ基を保護するためにbenzhydryloxycarbonyl (Bhoc)を使用する。
開裂させる。結合の代表的な収率は>95%である。合成は、樹脂からのオリゴマーのTFMSA
開裂によって完了する。オリゴマーは、逆相HPLCによって精製される (Viirreら (2003) , J. Org. Chem. 68(4), 1630-1632; Neunerら (2002), Bioconjug. Chem. 13 (3) , 676-678)。
分子が投与されるか、同時に導入される。
ムが挙げられる。これらの担体系は一般には複合化PNA分子および/または光増感剤の
薬剤動力学を改善し、ならびに細胞の取り込みを増加させることができるが、さらにPNA分子および/または光増感剤を細胞内コンパートメントへ差し向けるであろう。これは
、特に光化学的内在化を得るには有益であるが、PNA分子および/または光増感剤を特
定の細胞(例えば癌細胞)または組織に差し向ける能力は通常はない。.
しかしながら、首尾よく担体分子を特異的もしくは選択的にターゲティングさせるためには、PNA分子および/または光増感剤を、所望する細胞または組織内へのPNA分子
の細胞の取り込みを特別に推進する特定のターゲティング分子に結合させるか、複合化させてもよい。そのようなターゲティング分子は、またPNA分子を、光化学的内在化を得るのに特別に有益である細胞内コンパートメントに差し向けるであろう。
担体分子および/またはターゲティング分子は、PNA分子に、光増感剤に、または両
方に会合させるか、結合させるか、あるいは複合化させてもよく、同一または異なる担体またはターゲティング分子が使用されてもよい。上記のように1個より多い担体および/
またはターゲティング分子を同時に使用してもよい。
リジン) のようなポリカチオン、ポリエチレンイミンまたはデンドリマー(例、SuperFect(R)のようなカチオン性デンドリマー) ;DOTAPまたはリポフェクチン(Lipofectin)のよ
うなカチオン脂質、およびペプチドが挙げられる。
化合物および該分子は、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞内の膜隔絶コンパートメント内へエンドサイトーシス(endocytosis)されるか、他の方式で移送される。
もよい。これらは、細胞によって同一または異なる細胞内コンパートメント (例えば一緒に移送される) 内に取り込まれる。その後該PNA-ペプチドは、光増感化合物を活性化
させるのに好適な波長の光に該細胞が曝されると放出される。活性化された光増感化合物は、細胞内コンパートメント膜を破壊して、その後に該分子(このものは光増感化合物と同じコンパートメント内に存在していてもよい)の細胞質への放出をもたらすのである。したがってこれらの方法において、細胞を光に曝す最終段階は問題の分子が光増感剤と同じ細胞内コンパートメントから放出され、細胞質に存在するようになる。 .
ごく最近WO 02/44396 (参照により本明細書に取り込まれる)は、ある方法を記載しており、その方法においては段階の順序を変更することができ、その結果、内在化され細胞に送達されるべき分子が細胞と接触するようになる前に、光増感剤が細胞と接触し、照射によって活性化される。この適応化された方法では、内在化される分子が光増感剤と同じ細胞サブコンパートメントに存在させる必要はないという利点がある。かくして好ましい態様において、該光増感剤およびPNA分子は、一緒にまたは順番に細胞に適用される。細胞により同一細胞内コンパートメント内へ取り込まれ、次いで前記の照射が実行される。
みの前に実施される。
の場合の「内在化」には、分子が細胞内/膜隔壁コンパートメントから細胞の細胞質へ放
出される段階も含まれる。
により、細胞内の膜隔絶コンパートメント、例えば小胞体、ゴルジ体、リソゾーム、エンドソームなどの中に、または結合し、外側に存在する細胞膜に対して内部で見出されるという内在化の段階の一つをいう。
好都合な、または所望するいずれかの方法で実施してもよい。かくして、この接触段階が、インビトロで実施されるのであれば、その細胞は、例えば適切な細胞培養用培地のような水性培地で都合よく維持されるであろう。適切な時点で光増感剤および/またはPNA-ペプチド複合体が、適切な条件で、例えば適切な濃度および適切な期間にその培地に添加されるだけである。
異性の改善となるようである。 かくしていずれの方法でもトランスフェクション時間の
選択は、分子の充分な取り込みと、PCI治療の充分な特異性の確保との間で、適切な均衡
を打ちたてねばならない。
細胞は該PNA分子とは、より遅れた時点で、しかもより低濃度で接触することになるであろう。
れるかのいずれかである。 (ii)照射後、該PNA分子は、細胞内に取り込みをされるの
に充分な期間、細胞と接触する。
該剤が存在するコンパートメント)内に取り込まれるとすると、そのPNA分子は、照射
の前または後で取り込まれる。
ルフィリン(protoporphyrin)前駆体の5-アミノレブリン酸を用いる癌の光線力学治療について使用される典型的な光量は、高熱症を避けるために、200 mW/cm2未満のフルエンス(fluence)範囲で50〜150 J/cm2である。可視スペクトルの赤領域でより高い吸光係数を有する光増感剤が使用される場合には、通常、光量は低くなる。しかしながら非癌性の組織をより少ない蓄積量の光増感剤で治療する場合、必要とされる光の総量は癌の治療よりもはるかに高くなるかもしれない。 さらに細胞の生存力が維持されるべきであれば、毒
性種が過剰量、形成されることは避けるべきであり、このため関係するパラメーターが調整されるであろう。
えば、細胞の少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60、70、80または90%)が殺傷さ
れない。
傷されないように、光の用量が調節されることが重要である(もしこれらの分子が細胞毒
性作用を有するのであれば、それらの細胞は細胞内に導入される分子によってその後、殺傷されるのであるが。)
細胞毒性の作用は例えば遺伝子治療を用いることにより実現される。その治療では、本発明の方法によりアンチセンスPNA分子が腫瘍細胞の核内に内在化され、例えば遺伝子がダウンレギュレーションされる。
situ治療または処置細胞を後で身体に投与するエクスビボ(ex vivo)治療のいずれかで使用することができる; (i) mRNAまたはスプライシング中間体に結合させることに
よって特定遺伝子についての産物の発現を阻害すること; (ii)直接に特定遺伝子を干渉すること(例えば転写因子の結合の阻害)によるその遺伝子の転写を干渉すること ; (iii) in situハイブリダイゼーション用プローブ; (iv) スクリーニングアッセイ;および (v)
部位特異的突然変異または標的細胞内の欠陥遺伝子の修復。
ば該PNAは、DNAおよび/またはRNAに結合してもよい。
、その特定部位で修復または組換え(recombination)を促進する。PNAに結合させら
れるか、または単にPNAとともに一緒に投与されるドナーヌクレオチドは、所望のヌク
レオチド配列を含有する。それゆえPNAは、修復/組換えのプロモーターとして作用する
。
を細胞内に上記の方法によってPNA分子を導入すること(インビトロ、インビボまたはex vivoでもよい)この場合、該PNA分子は特異的にその標的遺伝子またはその複製も
しくは転写の産物(疾患、病態または障害の存在を表出している)に結合し、次いでそうした病気、病態または障害の存在、病期、または予後診断を決定するために結合したPNAのレベルを評価することを含む。
、適切な PNA分子を投与することによってダウンレギュレーションすることが可能で
ある。
よって本発明の別の態様から、 PNA分子および必要に応じて別個に本明細書で記載
された光増感剤を含む組成物が提供される。該PNA分子は、正に荷電したペプチドと複合化している。本発明の別の局面は、そうした組成物を治療に使用する方法を提供する。
に該PNA分子の取り込みの前に、その間に、またはその後に実施される。いずれかの細胞内コンパートメントへの該移送分子の取り込みの前に行なわれるのが好ましい。
胞内に上記の方法によって導入すること、ならびに必要であれば(すなわちトランスフェクションがインビトロ、インビボまたはex vivoで行なわれる場合に)さらに該細胞をその患者に投与することを含む。該PNA分子は正に荷電したペプチドに複合化されている。
れら)の細胞の細胞質または核に内在化される。
この場合、該PNA分子は正に荷電したペプチドに複合化されている。
本明細書で「製薬学的に許容される」とは、 レシピエントに生理学的に受け容れられ
るだけでなく、組成物の他の成分と適合性のある諸成分をいう。組成物および担体もしくは賦型剤の特性、材料、用量などは、選択および所望する投与経路、治療目的などに基づいて、通常のやり方で選択してもよい。同様に用量もまた、通常の方法で決められるが、分子の特性、治療目的、患者の年齢、投与様式などに基づくであろう。 光増感剤につい
ては、照射により膜を破壊する可能性、能力も考慮されねばならない。
らすために使用される。生じる細胞集団は、遺伝子サイレンシングの下流効果を同定するためのスクリーニングツールとして標準的技術とともに用いてもよい。例えば標的遺伝子のサイレンシングによって影響される遺伝子もまた同定することができる。そのように同定された遺伝子は、必要に応じてスクリーニングの次の過程、例えば特別のシグナル伝達事象に関与している分子を決定するための過程でPNAを用いて標的としてもよい。
投与するために本発明の方法を用いることによって、これらの問題は解決された。したがって、本発明のさらなる局面で、細胞(または細胞集団)の遺伝子発現パターンを改変して、スクリーニングツール(例えばハイスループット・スクリーニング)として使用する細胞 (または細胞集団)を調製するための方法が提供される。該方法は、ある遺伝子の発現を阻害するか、低下させることができるPNA分子および光増感剤と細胞(または細胞集団)とを接触させること、ならびに光増感剤を活性化させるのに有効な波長の光で細胞 (例えば細胞集団)を照射することを含み、ここで該PNA分子は、正に荷電したペプチドに複合化されている。本発明はさらにそうした細胞およびそうした細胞をスクリーニングする方法まで拡張され、 この場合そのような細胞の特異的な諸性質、具体的にはそのような細胞のmRNA発現レベルを、例えばマイクロアレイ上で調べられる。.
「改変された遺伝子発現パターン」により、該PNA分子が細胞核内に存在する結果、影響が及ぼされるのは、指定される遺伝子の転写または翻訳であることを意味する。
とは、例えば細胞 (または細胞集団)における機能上の変化、例えば細胞接着、タンパク
質分泌または形態的変化といった変化を探すことによってなし得る。代わりに遺伝子発現のプロファイルは、mRNAパターンおよび/またはタンパク質発現を、これ又知られて
いる標準的な技術を使用して分析することによって直接的に調べることができる。
は高く、そのものとして遺伝子発現に有する作用は、一回の投与後であっても長引いている。
[実施例]
実験プロトコル
細胞株および培養条件
ヒト細胞株HeLa(頸部腺癌)、WiDr(結腸癌)、および293(胚腎臓)は、American Type Culture Collection(Manassas、バージニア州、米国)より得た。ヒトOHS(骨肉腫)およびFEMXIII(メラノーマ)は、Norwegian Radium Hospital (Fodstad ら, (1986), Int. J. Cancer 38(1), 33-40; Fodstad ら., (1988), Cancer Res. 48(15), 4382-8)で確立された。DMEM培地(Bio Whittaker、ベルビエ、ベルギー)で培養した293細胞株を除き、すべての細胞株をRPMI-1640培地(Bio Whittaker、ベルビエ、ベルギー)で培養した。
よび2mMのL−グルタミン(Bio Whittaker、ベルビエ、ベルギー)を加えたことを除き、
抗生物質を加えることなく使用した。細胞株は、5%CO2を含む加湿環境にて、37℃で培養し、インキュベーションした。すべての細胞株について、マイコプラズマ感染に関して試験を行ったが、すべて陰性であることがわかった。
スクランブルPNAを含有するS100A4遺伝子に特異的なPNAは、Oswell DNA Service (サウサンプトン、英国)から得た。片方の末端もしくは両末端に修飾を施した(表1参照)。5'UTR(GeneBank accession number NM_002961, 2-15)に対する標的AUG開始領域(63-82)および2番目のエクソンのコード領域(98-118)は、先のPNA阻害に関する研究(Doyleら. , (2001), Biochem. 40, 53-64; Mologniら. , (1999), Biochem. Biophys. Res. Comm. 264, 537-543)及びリボザイムを用いるS100A4遺伝子抑制(Hovigら, (2001), Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Apr 11(2), 67-75)をもとに、選択された。
配列は、BLASTサーチでヒトゲノムデータベースに対して位置合わせを行い、他の遺伝子に著しい相同性を持つものは除外した。ストック溶液(1mM)は、PNAを10%のトリフルオロ酢酸に溶かすことで調製し、PNAを確実に完全に溶かすために、使用前に50℃に加熱した。使用に先立ち、PNAをさらに滅菌水で希釈して使用液(10 μM)とし、−20℃に保った。
Elbashirらにより提案された規則(Elbashirら, (2001), Genes Dev. 15, 188-200)に基づき、S100A4遺伝子のコード領域に対し、2つの標的を選択した。第一の標的はAA(N)19配列(GeneBank accession number NM_002961, 343-361)に対するもので、第二の標的はAA(N19)TT配列(264-282)とした。加えて、スクランブルコントロールsiRNAおよび蛍光標識したsiRNAを得た。siRNAはすべてEurogentec (スラン、ベルギー)よ
り購入した。標識は、両鎖で行い、FITCをアンチセンス鎖の5 '末端に、ローダミンをセ
ンス鎖の3 '末端に、行った。siRNA二重鎖の最適安定性を得るために、二重鎖のGC含
有量を40−70%の範囲に維持し、すべてのsiRNAはその3 '末端でdTdT突出を有するよ
うに合成された。この二つの標的配列も、BLASTサーチでヒトゲノムデータベースに対し
て位置合わせを行い、他の遺伝子に著しい相同性を持つものは除外した。乾燥したsiRNAオレゴヌクレオチドは、DEPC処理した水に再懸濁して100μMとし、−20℃で保管した。siRNAのアニーリングは、各RNAオリゴを別々にアリコットし、濃度50μMに希釈して行った。その後、100mMNaClの処理水において、最終濃度50 mM、pH7.5のトリス緩衝液、100mMNaCLとし、30μlの各RNAオリゴ溶液と15μlの5Xアニーリング緩衝液とを混合した。次に、その溶液を水浴中、95℃で2分間インキュベートし、続いて作業台上で、45分間徐冷した。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、良好なアニーリングであったことを確認した。
OHS細胞は、上述の方法で培養し、形質移入前に6ウェルプレートで24時間培養して30−60%に密集させた。形質移入は、製造業者の取扱説明書に従って、Life Technologies Inc. (Gaithersburg、メリーランド州、米国) のリポフェクチン試薬、Invitrogen (Catlsbad、カリフォルニア州、米国)のリポフェクチン試薬、Boehringer Mannheim(マンハイム、ドイツ)の(N−(1−(2、3−ジオレオキシルオキシ)プロピル)−N、N、N、−トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩(DOTAP)、Roche Diagnostics(マンハイム、ドイツ)のFuGene、Ambion(Austin、テキサス州、米国)のsiPORT Lipid Transfection Agent、およびSigma(St. Louis、ミズーリ州、米国)のポリ-L-リジン臭化水素酸塩(MW:15,000−30,000)を用いて、様々な濃度のsiRNAと共に、血清フリーのOPTI-MEM I培地(Invitrogen Corp、ペズーリ、英国)中で行った。
細胞を、300μlの培地中でPNA(1−10μM)と混合し、氷上で10分間インキュベートした。950μF/250 V(ECM399、BTX、A Division Of Genetronics、カリフォルニア州)に
設定して、0.4cmのキュベット中で、細胞の電気穿孔法を行った。電気穿孔法後、細胞を30分間氷の上でインキュベートし、T25フラスコ中で希釈した。その後、5%CO2と共に37℃で24時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査法により分析した。
増感剤であるジスルホン化テトラフェニルポルフィン(TPPS2a)は、Porphyrin Products (Logan,ユタ州、米国)より購入した。まず、TPPS2aを0.1M NaOHに溶解し、その後、pH7.5のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で濃度5mg/mlまで希釈し、最終濃度0.002M NaOHとした。光増感剤は、使用するまで、遮光し−20℃で保管した。照射において、TPPS2aで処理した細胞は、420nm付近に最高フルエンスを持つ4つの蛍光管(Osram 18W/67)列を収容できるLumiSource prototype(PCI Biotech AS、オスロ、ノルウェー)を使用して、青色光に露光された。
その後細胞を、種々のPNAと増感剤TPPS2a(1μg/ml)とともに18時間インキュベートした。取り込み後の細胞を新しい培地で3回洗浄し、増感剤フリーの培地で4時間インキュベートした。最後に、細胞を30秒間青色光に露光し、24、48、および96時間、再度インキュベートした。実験中は、細胞をアルミホイルで遮光した。
細胞は、FITC用(450−490nm BP510nm励起フィルター、510nm FTビームスリッター、および515−565nm LP発光フィルター)、ローダミン用(546/12nm BP励起フィルター、580nm FTビームスリッター、および590nm LP発光フィルター)、およびDAPI用(365/12nm BP励起フィルター、395nm FTビームフィルター、および397nm LP発光フィルター)のフィルターを備えたZeiss倒立顕微鏡、Axiovert 200で分析した。写真は、Carl Zeiss AxioCam HR、Version 5.05.10、およびAxioVision 3.1.2.1ソフトウェアを使用して作成した。
細胞小器官用の特異マーカーは、細胞内PNAの局在化を確認するために使用した。リソソームの局在化は、蛍光顕微鏡およびLysoTracker Red DND-99(Molecular Probes、Eugene、オレゴン州)を使用して決定した。核の局在化は、Hoechst H33342(Molecular Probes、Eugene、オレゴン州)を使用して決定した。
細胞は、FACS-Calibur(Becton Dickinson)フローサイトメーターで分析する前に、トリプシン処理、遠心分離、400μlの培地での再懸濁を行い、50μmメッシュのナイロンフ
ィルターでろ過した。各サンプルに対し、10.000 イベント(events)ずつ収集した。FITC標識PNAは、アルゴンレーザー(15mW、488nm)で励起後、510−530nmのフィルターを通して、測定した。死細胞は、前方散乱-側方散乱をゲートすることにより、単一生存細
胞から識別した。データは、CELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson)で解析した。
タンパク質可溶化液は、2g/mlのペプスタチン、アプロチニン(Sigma Chemical compa
ny、St Louis、ミズーリ州)、ロイペプチン(Roche Diagnostics、 マンハイム、ドイツ)とともに、150mM NaClおよび0.1%NP−40を含有するように、50mMのTris-HCl (pH 7.5)中で調製した。各サンプルの全タンパク質可溶化液(30μg)を、12% SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、製造業者の取扱説明書に従って、イモビロン-P膜(Millipore、Bedford、マサチューセッツ州)上に転写した。ローディングコントロール(loading control)および転写対照(transfer control)として、膜を0.1%のアミドブラックで染色した。その後、膜は、前に、10%粉ミルクとともに0.5M NaClおよび0.25% Tween 20(TBST)を含有する20mM Tris-HCl(pH 7.5)(ブロッキング溶液)中でインキュベートした。次いで5%の粉ミルクを含有するTBST中で、ウサギ多クローン性の抗S100A4(1:300希釈、DAKO、Glostrup、デンマーク)およびマウス単クローン性抗α−チューブリン(1:250希釈、Amersham Life Science、 バッキンガムシャー州、英国)を用いてインキュベートした。
MTSアッセイを使用した細胞生死判別測定
100μlの細胞を96ウェルプレートに仕込み、37℃で24時間静置して増殖させた。細胞を含有していないネガティブコントロールも含めた。各ウェルに100μl当たり20μlのMTS試薬(テトラゾリウム塩)を加え、暗所、37℃にて2〜4時間インキュベートした。その後、その吸光度を490nmで測定した。
細胞は、上記のように培養して処理した。光化学処置の後、細胞を様々なPNAで96時間インキュベートし、その後、RNA単離のため回収した。細胞の総RNAは、GenElute
Mammalian Total RNA Miniprep Kit(Sigma-Aldrich、シュタインハイム、ドイツ)で製造業者の取扱説明書に従って単離した。CDNA合成のために、50pmolのオリゴ-dT、3μgの総RNAおよびdH2Oを含めた12μlのプライマー混合物を、各サンプルに対して調製し
た。その混合物は、65℃で5分間変性させ、すぐに氷上で冷却し、18μlの反応混合物と混合して、最終濃度を1×第一標準緩衝液(インビトロゲン)、10mM DTT、0.3mM dNTP、6.5
ng/μl酵母tRNA、200U(6.6U/μl)スーパースクリプトII酵素とした。CDNA合成は
、42℃で50分間行い、その後72℃で15分間不活性化した。
各サンプルの融解曲線プロファイルは、標準サンプルに対して得られたものと比較した。
本明細書で使用するマイクロアレイは、Micro Grid II robotic printer(Bio Robotics、ケンブリッジ、英国)を使用し、社内で作製した。これらの15kヒトcDNAアレイは、アミノシラン被覆スライド(CMT GAPS、Corning Life Sciences、Corning、ニューヨーク州)上にプリントされた。このアレイの内容に関する詳細は、以下を参照のこと。
http: //www.med.uio.no/dnr/microarray/index.html.
PNA精製および標識
PCIおよび様々なPNAで処置した培養細胞から得られた総RNAは、上述のように単
離された。S100A4遺伝子サイレンシング(silencing)の結果として考えられ得るダウン
ストリーム効果を分析するため、活性PNA(PNA382または453)およびスクランブルPNAまたはコントロールPNA(PNA452(対照)または454(スクランブル))で処置した細胞のcDNAで、各アレイをハイブリダイズした。
またはCy5−dCTP(Amersham Pharmacia Biotech AB)で様々に標識された。反応混合物は、定着したオリゴ-dT20merプライマー(4μg)、40 U RNAsin (Promega、Madison、WI)、第一標準ストランド緩衝液、0.01 M のDTT、0.5mMのdATP, dCTP, dGTPおよび0.2mMのdTTPを含有していた。混合物は、65℃の水浴中で5分間インキュベートした。その後、チューブを42℃のヒートブロックに移し、400U Superscript II(Invitrogen、フローニゲン、オランダ)に加えて、4μl(4nmol)のいずれかの蛍光団を、それぞれのチューブに加えた。60分後、5 μl の0.5 M EDTA (pH 8.0)で、反応を不活性化した。残余RNAを加水分解するために10μlの1M NaClを加え、チューブを65℃で60分間インキュベートした。25μlの1M Tris-HCl(pH 7.5)を加えて、混合物を中和した。標識Cy3−cDNAおよびCy5−cDNAは0.5×TE−緩衝液で希釈し、取込まれていない色素を除去して、Microcon YM カラム(Ambion, Millipore Corporation、Bedford、マサチューセッツ州)によりサンプルを濃縮した。
スライドは、150kJで60秒間、紫外線で架橋した。使用直前にスライドをプレハイブリ
ダイゼーションして、スライド表面上にある反応性官能基を不活性化し、結合していないDNAを洗い流した。プレハイブリダイゼーション溶液で満たした小スライドホルダーを、30分間50℃で予熱した。ハイブリダイゼーション溶液は、1%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA)フラクションV(Sigma-Aldrich)、3.5×SSCおよび0.1% SDSを含有していた。
スライドは、インキュベーションの後、直ちに50℃で25分間、予熱溶液中でインキュベートした。スライドは清浄なスライドラックに移し、室温にて超純水中で撹拌しながら2回洗浄した。DNAを一本鎖形態に変性するため、該スライドを沸騰直後の湯中で2分間撹拌し、その後プロパン-2-オール中に素早く浸して30秒間撹拌した。スライドは、遠心分離により乾燥させた。
45μlのハイブリダイゼーション混合物は、15μlの各標識プローブ、16μgのポリA(Amersham Pharmacia Biotech AB)、4μgの酵母tRNA、1.25×Denhart溶液、5μgのBSA、3.5×SSC(pH 7.5)および0.3%のSDSからなっていた。最終混合物は、LifterSlip(Erie Scientific Company、Portsmouth、ニューハンプシャー州)下のマイクロアレイ・スライドに適用する前に、100℃で2分間加熱し、13Kで10分間、遠沈した。次いでスライドをArrayITハイブリダイザーション・チャンバー(Telechem、 Sunnyvale、カリフォルニア州)に収納し、水浴中65℃で一晩インキュベートした。スキャニングに先立ち、カバーグラスを0.5×SSCおよび0.1%SDSの溶液中で取り外した。その後、室温で5分間、スライドを同じ溶液中で二回洗浄し、続けて2回、0.06×SSC洗浄溶液中で5分間洗浄した。スライドは最終的に遠心分離により乾燥した。スキャニングは、ScanARRAY 4000(Packard Biosciences、Biochip Technologies LLC、 Meriden、CT)スキャナーで行い、GenePix Pro 4.0ソフトウェア(Axon Instruments Inc.、Union City、カリフォルニア州)を使用して、その画像からデータを得た。BASE(Lao Hら BioArray Software Environment: A Platform for Comprehensive Management and Analysis of Microarray Data Genome Biology 3(8): software0003.1-0003.6 (2002) .)を使用して、データを保存、解析、処理し、ならびに各スポットについてのバックグランドを補正した強度は、スポットにおけるピクセル平均値から局所バックグラウンド中のピクセル中央値を差し引くことにより計算した。
最初の一連の実験は、細胞取り込みの問題、すなわち様々な正味電荷を有する短ペプチドに結合したPNAが、種々のヒト癌細胞株の細胞膜に貫通するのか否かを取り扱うものである。細胞内にある化合物を検出するために、PNAをNまたはC末端のいずれかで、FITCを用いて標識した。表1にはその標的配列、化学修飾および荷電を含め、本研究で使用されたPNAが詳述されている。
ほぼ5倍増加することを観測した(図1、+5の正味電荷)。
PNA分子の存在位置の確認には、染色法を用いた。PNA分子に結合した標識の蛍光を使用して、細胞内のPNA分子の位置を確認した。Hoechst染色法およびLysoTracker染色法を使用して、それぞれ核およびリソソームコンパートメントを調べた。図2Aは、PCI
後にPNA分子が細胞内に分布したことを示している。図2BおよびCは、PCI後に、PNA分子が核に分布したことを示している(すなわちその分布はHoechst染色法と一致する)
。
依存するのかを調査するため、+5の正味電荷を有し、29アミノ酸鎖長のミトコンドリア移入シグナルにPNAを結合させた(PNA382)(図3B)。PNA381(図3A)に対する第二のコントロールとして、もとのNLSアミノ酸配列、PKKKRKV(配列ID:NO.3)を、代替のGHHHHHG (+5)配列(配列ID:No.5、PNA457)で置換した(図3C)。3つの異なるPNA構築物についての細胞取り込みの相対レベルは、顕微鏡検査で明らかにされた相対レベルと同様であった。すべての場合において、PCI後にPNAは核に局在化していた。このこ
とはHeLaおよびFEMXIII細胞において実施したときも同様であった。(図3DおよびE)。
異を検討するために、N末端(PNA453)およびC末端(PNA381)の両方にペプチドを結合させた。取り込みレベルに違いはないことが観測できた(図4)。種々の細胞株中で
、様々なPNAとその細胞取り込みについても試験した(HeLa、WiDr、293、OHS、FEMX5
、SW620、HCT116、SaO)が、目立った変化は見られなかった(図5)。
改変PNAの取り込み機構を評価するため、様々な温度のもとでのそれらの取り込みを検討した。その結果、37℃では取り込みが見られるが、4℃では内在化が見られないこと
がわかった(図6)。さらに、蛍光顕微鏡検査法のデータは、ちょうど核膜付近における
識別範囲に、粒状の蛍光スポットを示した。最後に、PNA構築物およびエンドソーム/リソソーム(LysoTracker Red DND)のマーカーの細胞内位置の間に、完全な一致が見ら
れた(データは示していない)。
重複した局在化により支持される。
顕微鏡検査法のデータから、中性/正の正味電荷を有するPNAがエンドソーム/リソソーム内に局在化していたことを示された。顕微鏡検査法のデータは、PCI処理後に、P
NA構築物がエンドソーム/リソソームから核へ転移していることを明示している。PNAの再局在化を確認するために、上記のHoechst核染色法も用いた(図2および図3参照)
。
核をベースとするPNAターゲティングには、大きな障壁を克服する必要がある:最も重要なものは、細胞膜、細胞内の膜および核膜である。エンドソーム/リソソームからのPNAの放出に関して、NLSペプチドの局在化能力およびNLSペプチドの配向が核局在化に重要であるか否かを調べることとした。これらの問題に取り組むために、NLSペプチドを
PNAにNおよびC両末端で結合した。顕微鏡検査法のデータは、NまたはC末端のいずれかでNLSペプチドに結合したPNAが、核に転移していることを示した(図4)。露光時間およびFITC/PNA構築物の濃度を増加することで、蛍光シグナルの増加が観測された。タイプの異なる蛍光プローブ間にあり得る食い違いを検証するため、PNAの蛍光体をFITCからローダミン(Rho)に交換した。しかしながらその場合には、局在化に明らかな変化
は見られなかった(図7)。PNAのNまたはC末端のいずれか一方のみにもFITCを結合し
てみたが、同じく位置または効率に変化はなかった(図4)。
のか、あるいは特異的なアミノ酸配列によるものなのかについても調べた。NLSペプチド
の核局在化能力をコントロールするために、同一の正味電荷(+5)と置換アミノ酸を持つ代替ペプチドを有するPNAを試験した(PNA457、図3C)。中性PNAの核内輸送(
PNA456および385、それぞれ図8CおよびB)について調査するとともに、ミトコンドリ
アおよびペルオキシソームへ向けてターゲティングさせる移入ペプチドシグナルに結合したPNA(PNA382、PNA384、それぞれFigure 3Bおよび8D)に関しても調べた。驚
くべきことにそれらのデータは、PCI処理後に、試験を行った中性および正に荷電したP
NAすべてが核に転移したことを示した。
阻害剤としてのPNAの機能を評価するために、S100A4遺伝子に沿う3つの異なる標的
部位に指向するPNAを合成した。5'-UTR (PNA381)の末端に対しターゲットしたキメラ14bpホモプリンPNA、ならびに開始コドン(PNA200)および第二エクソン内のコ
ード領域(PNA452)を標的とさせた2つの20bp混合塩基PNAを選択した。用量依存的な様式で、S100A4をダウンレギュレートできるか否かを調べることを目的とした。したがって96時間、OHS細胞を様々な濃度(100〜2000nM)のPNA200にさらして、生存率を確認し、ウェスタン・ブロッティングによりS100A4タンパク質の存在を確認した(図9AおよびF)。データは、PNA200を使用し、濃度100nMから始まるシグナル減少とともに、S100A4活性の用量依存的阻害を明示している。関係する典型的なコントロールを図9Dに示した。さらにこの結果は、S100A4発現の最大阻害が1000nMのPNA200で起こることを示している。細胞生存率(viability)の測定としてミトコンドリアの構造保全性を測定するMTSデータによれば(詳細は実験プロトコルを参照)、使用するPNA濃度が2000nM未満の時には毒性は観察されない(図10、5および6行)。それゆえ、その後の全実験ではPNA濃度1000nMを選択した。
異がないことが示された。結果を表3に示した。
S100A4発現を阻害するPNAの機能を、S100A4発現を阻害するsiRNAの機能とを比較した。siRNAのトランスフェクション効率および分布を解析するために、4つのsiR
NAのうち1つをローダミンおよびFITCで標識した。次に様々なトランスフェクション試
薬および濃度を試験した。顕微鏡検査法のデータからは、FuGene、Lipofectamin、siPORTまたはLipofectinのいずれを用いても取り込みは起こらないことが示された。しかしながら、DOTAPおよびポリ−L−リジンの両方では取り込みが見られ、また、ポリ-L-リジンが
最も効率的な試薬であった。それゆえポリ−L−リジンを以後のすべての実験に使用した
。
Aとともにインキュベートし、次いでS100A4タンパク質レベルの測定をウェスタン・ブロッティングによって行った。しかし、S100A4遺伝子の二つの領域を標的として20、50、100nM siRNAを用いた24、48、96時間後のS100A4発現において、いかなるダウンレギュレーションも観測されなかった(データは示さず)。
、転写過程を抑制することで作用するかも知れない。そのような複合体は立体障害を生じ、PNAポリメラーゼの安定な機能を阻害し、それゆえに抗原性作用剤として働く機能を有している可能性がある。翻訳レベルでは、PNAのアンチセンス効果は、RNAプロセッシング、細胞質への輸送、または翻訳のいずれかを立体的にブロックすることに基づいている。PNAがRNase Hを活性化できないことから、非標的mRNAが望まない分解を受ける可能性を排除することができる。
効率的な阻害剤であることを示したDoyleら(2001, 上記文献)と一致している。さらに
、無細胞抽出物中で行った翻訳実験により、PNAがRNAのAUG開始コドン付近を標的
としたときに、用量依存的様式で翻訳を阻害することが示された(Knudsen & Nielsen (1
996) , Nucleic Acids Res. 24, 494-500)。PNAがコード領域中の配列に対して標的
としたときには、効果は何も見られなかった。これらの結果は、S100A4のAUG開始部位に
対して標的としたPNA200ならびにS100A4の第2エクソンに対して標的としたPNA452
についての本実施例の結果を支持している(図9および11)。
。この場合でもタンパク質レベルでの違いは観察されなかった(図11A)
遺伝子サイレンシング(gene silencing)の根本的な機構を解明するため、リアルタイムRT−PCRにより、PNA/PCI処理前後における相対的なS100A4 mRNAレベルを測定
した。その目的は、我々のPNA分子がその作用を、転写レベルまたはタンパク質合成過程の他のあるレベルで遂行するかどうかを調査することにあった。増幅の図から見て取れるように処置後96時間で、PNA/PCI処理したサンプルから得られたCT値と処置しなか
ったコントロールから得られたCT値との間に明確な違いはなかった(図12)。スクランブルPNA201が、PNA200およびPNA381それぞれについての内部PNAコントロール
として使用された。
の三重鎖は、シトシンに富むホモピリミジンPNAとのみ形成されるようである。
)を設計したにもかかわらず、リアルタイムRT−PCRのデータは、それが翻訳レベルで機
能していることを示している。混合の塩基組成を有する他のPNAは、転写過程を阻止するために必要とされる三重鎖もしくは二重鎖侵入複合体を形成することができないという理論に従う。このことはリアルタイムRT−PCRの結果と一致し、混合塩基PNA(PNA200)は転写過程を阻害することができないという説を支持している。
遺伝子転写に対するS100A4阻害の想定される影響をCDNAマイクロアレイ実験におい
て調べるため、スクランブルPNAを除き全く同じ処理を同じ時間、施した細胞とPNA処理細胞とを比較した。その遺伝子上の二つの標的配列に向けられたPNA分子が試験された。すべての実験は二つ一組で行った。少数の遺伝子のみが、2倍を超える発現におい
て相対的な変化を一貫して示した。階層的クラスタ分析を使用することで、S100A4レベルで最大の低下をもたらすPNAで処理されたときに一貫してアップレギュレーションのパターンを示し、効率の悪いPNAで処理されたときにより小さなアップレギュレーションを示す一クラスタを確認した。このクラスタは、9つの命名された遺伝子(GAS2、UBE4B、FREQ、SHC1、PON3、CTSD、WNT3A、SCDおよびRAB6A)を含有していた。これらの遺伝子は
、ストレス応答、アポトーシスおよびカルシウム結合を含む過程に関与する遺伝子である。転写ダウンレギュレーションのレベルは、リアルタイムPCRを使用して検証した。観察された変化が、標的遺伝子に対するPNAの配列特異的作用の結果であることを示すため、リアルタイムPCRを上記過程の各段階について別々に行ったところ、この結論を支持する結果となった(データは示さず)。
証明として、cDNAマイクロアレイを使用し、全体的なmRNA発現レベル変化を調べた。遺伝子発現に及ぼすPNA添加および/または光化学処理の効果は現在知られていないため、スクランブルPNAで処理した細胞を参照チャンネルとして使用してマイクロアレイ実験を行った。これは処理法に潜在する紛らわしい影響を最小とするために行った。処理操作、暴露時間などにおける変動が少しでも起こり得るため、処理の過程での各段階でリアルタイムPCRを実施し、観察された発現変化がS100A4に特異的な効果であるよりも処理の結果であることを除外した。特に、PCIはアポトーシスを含む過程に関係した転写の変化を引き起こすことが可能であった(Ferreira S. D.ら, 2004, Lasers Med Sci 18(4) : 207-12)。それゆえ、PNA/PCI/LSは、そのような過程に関係する遺伝子の遺伝子サイレンシングをモニタリングするには、一般的な手段としてあまり適さないと考えられていた。しかしながらこの方法は、標的配列設計の容易さ、PNA安定性、大量の合成と投与において多くの興味深い特徴を備えており、この系は時機を得た投与により細胞株のインビトロ系統的サイレンシングに関しての良い選択肢となる。siRNA遺伝子サイレンシングもまた実施可能性の高い方法であることが示されているが、標的配列設計および安定性に関わる問題が多少伴う(Amarzguioui Mら, 2004: Biochem. Biophys. Res. Commun. 316(4) : 1050-8)。
味深く、このものは4個のEFの手を有するカルシウム結合タンパク質である(多クローン
性抗体はwww.abcam.com で得られる)。
チロシナーゼ(TYR)、チロシナーゼ関連タンパク質1(TRP-I)、および小眼球症転写
因子(MITF)を含め、メラニン生合成に関係する様々な遺伝子に対するPNAを設計した。その目的は、PNA/PCI法を使用することにより3つすべての遺伝子をサイレンスさせることにある。TYR、TRP-IおよびMITFは互いに関連しており、このことがモデル系として興味深いものにしている。これらの遺伝子は互いに関連しているため、MITFをノックダウンする場合、TYR/TRP-1タンパク質レベルでの想定可能な影響を調べることは、極めて興味深いものになるであろう。
細胞株および培地条件
FEMX V(メラノーマ)細胞は、Norwegian Radium Hospitalで確立された。細胞はRPMI
−1640培地(Bio Whittaker、ベルビエ、ベルギー)で培養された。培地は、10%ウシ胎
児血清(FCS:PAA Laboratories、リンツ、オーストリア)および2mMのL-グルタミン(Bio Whittaker、ベルビエ、ベルギー)を加えたことを除き、抗生物質を加えることなく使用した。細胞は、5%CO2を含む加湿環境にて、37℃で増殖、培養された。すべての細胞株について、マイコプラズマ感染に関して試験を行い、すべて陰性であることがわかった。
PNA設計
スクランブルPNAを含め、チロシナーゼ(TYR)遺伝子に特異的なPNAは、Oswell DNA Service (サウサンプトン、英国)から得た。修飾は両末端で(FAMおよびNLS配列
を用いて)行った。AUG開始コドンに対する標的は、先のPNA阻害研究に基づいて選択
した。配列は、BLASTサーチでヒトゲノムデータベースに対して位置合わせを行い、他の
遺伝子と著しい相同性を有するものを除外した。
CTTTAGTTATAGCTCTCCCC (TYRSCR−配列ID:No. 11)
AATGTTTGAAGAACTCAATA (TYR5UTR−配列ID:No. 12)
CAGCCAGGAGCATTCTTCCT (TYRATG−配列ID:No. 13)
各PNA分子は、N末端(5'末端)でFAM、C末端(3'末端)でNLSペプチドを用いて標識した。すなわち、FAM−L−L−PNA−L−L−PKKKRKVであり、Lはリンカー(2−アミノエトキシ−2−エトキシ酢酸(AEEA)である。
図13に示した結果は、TYRがPNA/PCI法によりサイレンスされ得ることを示しているが、さらなる最適化によって、より強力な遺伝子サイレンシング効果がもたらされると考えられる。特にレーン番号7は、開始コドン領域にターゲティングされた10mM PNAを用いたインキュベーション後においてTYRタンパク質のダウンレギュレーションを示してい
る。
結果は、平均蛍光強度(mean fluorescence intensity)対 種々のPNA分子の正味電
荷として表示されている。バーは、各6並行(parallels)を有する、3つの個別実験を示す。誤差バーは平均の標準偏差を示す。
Claims (39)
- 細胞にPNA分子および光増感剤を接触させること、および該細胞に該光増感剤を励起す
るのに有効な波長を有する光を照射することを含むものであって、該PNA分子は正に荷電
したペプチドと複合化していることを特徴とする、PNA分子を細胞の細胞質内に導入する
方法。 - 細胞にPNA分子および光増感剤を接触させること、および該細胞に該光増感剤を励起す
るのに有効な波長を有する光を照射することを含むものであって、該PNA分子は正に荷電
したペプチドと複合化していることを特徴とする、PNA分子を細胞の核内に導入する方法
。 - 前記PNA分子が25塩基長よりも短いことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法
。 - 前記PNA分子が、アンチセンス分子であり、遺伝子と相補的であり、またはプローブで
あることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 前記PNA分子の導入が、24時間、細胞とインキュベーションした後に、標的遺伝子の発
現を10%より大きく低減させる濃度で行われることを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 前記細胞が真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記光増感剤がTPPS4、TPPS2a、AlPcS2a、TPCS2a、5−アミノレブリン酸および5−ア
ミノレブリン酸エステルから選択されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 前記の正に荷電したペプチドが連続的なアミノ酸のポリマーであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記の正に荷電したペプチドが3〜30アミノ酸長であることを特徴とする、請求項1〜
8のいずれかに記載の方法。 - 前記の正に荷電したペプチドが共有結合により直接にPNA分子と複合化していることを
特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 - 前記の正に荷電したペプチドが+1〜+10、好ましくは+3〜+6の電荷を有することを特徴とする、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記の正に荷電したペプチドが、配列Xn-(Y)m-Xo(ここでXは中性残基であり、Yは正に荷電した残基であって、それが現れるそれぞれの位置で同一または相違していてもよく、n、mおよびoは≧1の整数である)を有することを特徴とする、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- Yが各位置で同一であり、K、RまたはHであることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記の正に荷電したペプチドが、
SEQ ID NO: 7 MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSL、
SEQ ID NO: 6 AKL、または
SEQ ID NO: 5 GHHHHHG
であることを特徴とする、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。 - 一種類より多い種類のPNA分子が同時に導入され、各種類が異なる配列を有することを
特徴とする、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。 - 前記光増感剤および前記PNA分子の一方または両方が、一種類以上の担体分子またはタ
ーゲティング分子と、結合、会合または複合化していることを特徴とする、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。 - 前記の担体分子またはターゲティング分子がポリカチオン、カチオン脂質、リポフェクチン(lipofectin)またはペプチドであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 前記光増感剤および前記PNA分子を一緒にまたは順番に細胞に適用することを特徴とす
る、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。 - 前記細胞を光増感剤と接触させ、導入させるPNA分子と該細胞とを接触させ、次にその
細胞を、該光増感剤を活性化させるのに有効な波長の光で照射するものであって、該光増感剤を含有する細胞内コンパートメントへの該PNA分子の細胞取り込みに先立って、好ま
しくは該分子のいずれの細胞内コンパートメントへの細胞取り込みに先立って、その照射が実施されることを特徴とする、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。 - 照射が60分までで実施されることを特徴とする、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- インビトロ(in vitro)またはエクスビボ(ex vivo)で実施されることを特徴とする
請求項1〜20のいずれかに記載の方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法に基づき、標的遺伝子を含有する細胞内にPNA
分子を導入することによって標的遺伝子の転写または発現を阻害するものであって、該PNA分子は該標的遺伝子またはその複製もしくは転写の産物に特異的に結合することを特徴
とする方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法により、PNA分子を標的遺伝子またはその複製
もしくは転写の産物を含有する細胞に導入すること(ここで該PNA分子は該標的遺伝子ま
たはその複製もしくは転写の産物に特異的に結合する)、および結合したPNAのレベルを
評価することにより当該標的遺伝子またはその複製もしくは転写の産物の存在またはレベルを決定することを含む、標的遺伝子またはその複製もしくは転写の産物のレベルを同定または評価する方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法によりPNA分子および所望の配列を含むオリゴ
ヌクレオチド分子を、標的遺伝子を含有する細胞に導入すること(該PNA分子は該標的遺
伝子に特異的に結合し、PNAクランプを形成する)を含むことを特徴とする、部位特異的
突然変異または標的遺伝子、好ましくは欠陥遺伝子の修復を細胞で実施する方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法により、PNA分子を細胞に導入すること(ここ
で該PNA分子は疾患、病態または障害の存在を表出している標的遺伝子またはその複製も
しくは転写の産物に特異的に結合する)、およびそれらの疾患、病態または障害の存在、
病期、または予後診断を決定するために結合したPNAのレベルを評価することを含むこと
を特徴とする、疾患、病態または障害を診断する方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法により、PNA分子を細胞に導入することを含む
ことを特徴とする、1以上の遺伝子のダウンレギュレーション、修復または突然変異によって利益を受ける疾患、好ましくは癌、嚢胞性線維症、心臓血管疾患、ウィルス感染、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチングトン病またはアルツハイマー疾患の治療方法。 - 請求項1〜21のいずれかに記載の方法により得られる、細胞質内または核内に内在化されたPNA分子を含有する(ここで該PNA分子は正に荷電したペプチドと複合化している)ことを特徴とする細胞または細胞集団。
- 正に荷電したペプチドと複合化している、好ましくは請求項3、4または8〜14のいずれかにおいて規定されたものであるPNA分子と、必要に応じて別個に光増感剤とを含有
することを特徴とする組成物。 - 請求項27に記載の細胞または細胞集団を含有することを特徴とする組成物。
- 治療用、好ましくは癌治療用もしくは遺伝子治療用であることを特徴とする、請求項28または29に記載の組成物。
- 患者において1以上の標的遺伝子の発現を変更することにより疾患、障害または感染を治療し、または予防するための医薬の製造における、請求項1〜4、または8〜14のいずれかにおいて規定されたPNA分子の使用。
- 患者において1以上の標的遺伝子の発現を変更することにより疾患、障害または感染を治療し、または予防するための組成物または医薬の製造における、請求項27に記載の細胞または細胞集団の使用。
- 前記薬剤が遺伝子治療用または癌治療用である、請求項31または32に記載の使用。
- 請求項1〜21のいずれかに記載の方法により、インビトロ、インビボまたはエクスビボでPNA分子を1以上の細胞内に導入すること、ならびに必要であれば該細胞をその患者
に投与することを含むことを特徴とする、患者の疾患、障害または感染を治療または予防する方法。 - 請求項27に記載の細胞または細胞集団を患者に投与するステップを含むことを特徴とする、患者の疾患、障害または感染を治療または予防する方法。
- 癌の治療のため、または遺伝子治療において用いられることを特徴とする、請求項34または35に記載の方法。
- スクリーニングツールとしてである、請求項27に記載の細胞または細胞集団の使用。
- 下記a)およびb)を含むことを特徴とする、改変された遺伝子発現のパターンを有する細胞のスクリーニング方法;
a)請求項27に記載された細胞の標的遺伝子または1以上のさらなる遺伝子の発現を解析すること(ここで前記PNAは特異的に該標的遺伝子またはその複製もしくは転写の産物
に結合し、上記1以上のさらなる遺伝子の発現を改変する);
b)上記の標的遺伝子および/または1以上のさらなる遺伝子の発現を、対照細胞、好ま
しくは野生型細胞のそれらの遺伝子発現に対して比較すること。 - 前記標的遺伝子の発現が、コントロール(野生型)のレベルの80%未満に低減していることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
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