JP5243814B2 - Bacteria genus-specific primer and bacterial detection method using the primer - Google Patents
Bacteria genus-specific primer and bacterial detection method using the primer Download PDFInfo
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Description
本発明は、アルカリゲネス属細菌、フラボバクテリウム属細菌、またはエンテロコッカス属細菌をそれぞれ検出するためのプライマーに関する。本発明はまた、これらのプライマーを用いて食品中の菌叢を評価する方法に関する。 The present invention relates to a primer for detecting each of Alkagenes, Flavobacterium, or Enterococcus. The present invention also relates to a method for evaluating the flora in foods using these primers.
従来、食品中に含まれる細菌の菌数および菌叢を調べる場合には、平板培養法によって菌数を計数し、平板上に得られたコロニーについて、形態観察、グラム染色、生化学的性状試験等を行うことによって菌叢を評価する方法が行われてきた（非特許文献１）。この方法では、菌数の計数に１日間以上、菌叢の評価に２日間以上を要し、また、菌叢の評価に熟練技術が必要とされる。従って、製造直後に出荷する食品に対してこの方法を適用する場合には、細菌汚染が発生した際に迅速な対応が取れないという欠点があった。 Conventionally, when examining the number of bacteria and the bacterial flora contained in foods, the number of bacteria is counted by plate culture method, and morphological observation, Gram staining, biochemical property test are performed on the colonies obtained on the plate. A method for evaluating the flora by performing etc. has been performed (Non-patent Document 1). In this method, it takes 1 day or more to count the number of bacteria, 2 days or more to evaluate the flora, and skill is required to evaluate the flora. Therefore, when this method is applied to foods that are shipped immediately after production, there is a drawback that a rapid response cannot be taken when bacterial contamination occurs.
近年、平板培養法に替わる細菌の迅速検出法として、遺伝子検出を原理とするPCR法が用いられるようになった。例えば、真正細菌の16S rRNAをコードするDNA(16S rDNA)とハイブリダイズできるプライマー（ユニバーサルプライマー）を用い、被験試料に含まれる細菌からDNA抽出操作により得られるDNAを対象にしてPCR法を行い、細菌全般を検出する方法が知られている（例：Eubacteria Detection Kir for conventional PCR、Minerva Biolabs BmbH：非特許文献２）。しかし、この方法は、細菌の定性検出を目的としているために細菌の定量はできず、また、菌叢を評価することも不可能である。 In recent years, the PCR method based on the principle of gene detection has come to be used as a rapid detection method of bacteria instead of the plate culture method. For example, using a primer (universal primer) that can hybridize with DNA encoding 16S rRNA of eubacteria (16S rDNA), PCR is performed on DNA obtained by DNA extraction from bacteria contained in the test sample, Methods for detecting bacteria in general are known (eg, Eubacteria Detection Kir for conventional PCR, Minerva Biolabs BmbH: Non-Patent Document 2). However, since this method is aimed at qualitative detection of bacteria, it is not possible to quantify bacteria, and it is impossible to evaluate the flora.
また、各種の食中毒細菌の16S rDNAとハイブリダイズできる特異的なプライマーを用いたPCR法を行うことによって各種の食中毒細菌を検出する方法も提案されている（例：O-157（ベロ毒素遺伝子）One Shot PCR Screening Kit、TaKaRa：非特許文献３）。しかし、これらの方法は、特定の株、種、グループ（いくつかの種の集合体）を検出する方法であり、特定の範囲の細菌群について包括的かつ迅速に検出することはできない。 In addition, a method for detecting various food poisoning bacteria by PCR using specific primers capable of hybridizing with 16S rDNA of various food poisoning bacteria has also been proposed (eg, O-157 (verotoxin gene). One Shot PCR Screening Kit, TaKaRa: Non-Patent Document 3). However, these methods are methods for detecting a specific strain, species and group (an assembly of several species), and cannot comprehensively and rapidly detect a specific range of bacterial groups.
一般的な食品には多種の汚染細菌群が見られることから、本発明は、食品を汚染する可能性のある種々の細菌群について、特定の種や株に限定されることなく、包括的に菌叢の評価を実施するための簡便かつ迅速な方法を提供することを目的とする。 Since a variety of contaminating bacterial groups are found in general foods, the present invention is not limited to specific species and strains, but covers various bacterial groups that may contaminate foods. An object is to provide a simple and quick method for carrying out the evaluation of the bacterial flora.
本発明者らは前記課題を解決するため研究を重ねた結果、食品を汚染する可能性のある一定の範囲の細菌群の16S rRNAをコードするDNAにおいて保存された領域を見出し、食品を汚染する可能性のある一定の範囲の細菌群を、特定の種や株に限定することなく検出できるプライマーを開発することに成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have found a conserved region in DNA encoding 16S rRNA of a certain range of bacterial groups that may contaminate food, and contaminate food. The inventors have succeeded in developing a primer capable of detecting a certain range of bacterial groups without being limited to a specific species or strain, and completed the present invention.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アルカリゲネス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の（ｃ）または（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、アルカリゲネス属細菌を検出するためのプライマーセット：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、アルカリゲネス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、アルカリゲネス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A forward primer consisting of the following (a) or (b) oligonucleotide and a reverse primer consisting of the following (c) or (d) oligonucleotide, targeting DNA encoding 16S rRNA of Alkagenes bacterium Primer set for detecting Alkagenes bacteria, including:
(A) an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) consisting of a base sequence in which one or two bases are deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 An oligonucleotide that hybridizes to the region to which the oligonucleotide (a) hybridizes in DNA encoding 16S rRNA of the genus Algigenes bacterium (c) an oligonucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (d) SEQ ID NO: (C) Oligonucleotide hybridizes to DNA encoding 16S rRNA of the genus Algigenes bacterium, which consists of a base sequence in which 1 or 2 bases are deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by 2. Oligonucleotide that hybridizes to the region to be treated.
（２）フラボバクテリウム属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の（ｃ）または（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、フラボバクテリウム属細菌を検出するためのプライマーセット：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、フラボバクテリウム属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、フラボバクテリウム属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(2) Targeting DNA encoding 16S rRNA of Flavobacterium genus bacteria, consisting of a forward primer comprising the following oligonucleotide (a) or (b) and the following oligonucleotide (c) or (d) Primer set for detecting Flavobacterium, including reverse primer:
(A) an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 (b) consisting of a base sequence in which one or two bases are deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 An oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (a) hybridizes in DNA encoding 16S rRNA of Flavobacterium genus (c) an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 (d) (C) oligo in (c) a DNA comprising a nucleotide sequence in which one or two bases are deleted, substituted, added or inserted in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and encoding 16S rRNA of Flavobacterium An oligonucleotide that hybridizes to a region where nucleotides hybridize.
（３）エンテロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、以下の（ａ）または（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと以下の（ｃ）または（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、エンテロコッカス属細菌を検出するためのプライマーセット：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、エンテロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号５で表される塩基配列において１もしくは２個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、エンテロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(3) A forward primer consisting of the following (a) or (b) oligonucleotide and a reverse primer consisting of the following (c) or (d) oligonucleotide, targeting DNA encoding 16S rRNA of Enterococcus genus bacteria Primer set for detecting Enterococcus bacteria, including:
(A) an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) consisting of a base sequence in which one or two bases are deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (C) an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (a) hybridizes in DNA encoding 16S rRNA of Enterococcus bacteria (c) an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 (d) SEQ ID NO: 5 consisting of a base sequence in which one or two bases are deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by 5 and the oligonucleotide (c) hybridizes in DNA encoding 16S rRNA of Enterococcus bacteria Oligonucleotide that hybridizes to the region to be treated.
（４）（１）〜（３）に記載のプライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いて増幅反応を行って増幅産物を検出することを含む、細菌の検出方法。 (4) A method for detecting a bacterium, comprising performing an amplification reaction using at least one primer set selected from the primer sets described in (1) to (3) to detect an amplification product.
（５）（４）に記載の方法を用いて細菌を検出し、定量することを含む、食品中の菌叢を評価する方法。 (5) A method for evaluating a bacterial flora in food, which comprises detecting and quantifying bacteria using the method according to (4).
（６）（１）〜（３）に記載のプライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、食品中の菌叢を評価するためのキット。 (6) A kit for evaluating the bacterial flora in food, comprising at least one primer set selected from the primer sets described in (1) to (3).
本発明により、食品を汚染する可能性のある種々の細菌群について、包括的に菌叢の評価を実施するための簡便かつ迅速な方法が提供される。 The present invention provides a simple and rapid method for comprehensively evaluating the flora of various bacterial groups that may contaminate food.
プライマーセット
一実施形態において本発明は、アルカリゲネス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、アルカリゲネス属細菌を検出するためのプライマーセットに関する。上記プライマーセットにおけるフォワードプライマーとして、（ａ）のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、配列番号１で表される塩基配列において１もしくは２個、好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、アルカリゲネス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。同様に上記プライマーセットにおけるリバースプライマーとして、（ｃ）のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、（ｄ）配列番号２で表される塩基配列において１もしくは２個、好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、アルカリゲネス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において上記プライマーセットをAlプライマーセットと称する。
In one embodiment of the primer set , the present invention targets (a) a forward primer consisting of an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (c) a SEQ ID NO: The present invention relates to a primer set for detecting a bacterium belonging to the genus Alkagenes, comprising a reverse primer composed of an oligonucleotide having a base sequence represented by 2. As the forward primer in the above primer set, the oligonucleotide (a) and an oligonucleotide that can function equally as a primer can also be used. Such an oligonucleotide has a base sequence in which one or two, preferably one base is deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, And an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (a) hybridizes. Similarly, as the reverse primer in the above primer set, the oligonucleotide (c) and an oligonucleotide that can function equally as a primer can also be used. Such an oligonucleotide comprises (d) a base sequence in which 1 or 2, preferably 1 base is deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, In the DNA encoding 16S rRNA, an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (c) hybridizes can be mentioned. In the present specification, the primer set is referred to as an Al primer set.
Alプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、アルカリゲネス属細菌を検出することができる。Alプライマーセットによって、アルカリゲネス属に属する種々の細菌種を、特定の種に限定されることなく検出できるが、アルカリゲネス属細菌以外の細菌はほとんど検出されない。すなわち、Alプライマーセットによってアルカリゲネス属細菌を特異的に検出できる。アルカリゲネス（Alcaligenes）属細菌としては、例えば、A. denitrificans、A. faecalis、A. xylosoxidansなどが挙げられる。 By carrying out an amplification reaction using the Al primer set, bacteria of the genus Alkagenes can be detected. With Al primer set, various bacterial species belonging to the genus Alkaligenes can be detected without being limited to specific species, but bacteria other than the genus Alkagenes are hardly detected. That is, Algigenes bacteria can be specifically detected by the Al primer set. Examples of bacteria belonging to the genus Alcaligenes include A. denitrificans, A. faecalis, A. xylosoxidans, and the like.
一実施形態において本発明は、フラボバクテリウム属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、フラボバクテリウム属細菌を検出するためのプライマーセットに関する。上記プライマーセットにおけるフォワードプライマーとして、（ａ）のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、配列番号３で表される塩基配列において１もしくは２個、好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、フラボバクテリウム属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。同様に上記プライマーセットにおけるリバースプライマーとして、（ｃ）のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、（ｄ）配列番号４で表される塩基配列において１もしくは２個、好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、フラボバクテリウム属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において上記プライマーセットをFlプライマーセットと称する。 In one embodiment, the present invention targets (a) a forward primer consisting of an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and (c) a SEQ ID NO: targeting DNA encoding Flavobacterium 16S rRNA And a primer set for detecting a bacterium belonging to the genus Flavobacterium, comprising a reverse primer comprising an oligonucleotide having a base sequence represented by 4. As the forward primer in the above primer set, the oligonucleotide (a) and an oligonucleotide that can function equally as a primer can also be used. Such an oligonucleotide comprises a nucleotide sequence in which one or two, preferably one base is deleted, substituted, added or inserted in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, Examples include an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (a) hybridizes in DNA encoding 16S rRNA. Similarly, as the reverse primer in the above primer set, the oligonucleotide (c) and an oligonucleotide that can function equally as a primer can also be used. Such oligonucleotide comprises (d) a base sequence in which one or two, preferably one base is deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and Flavobacterium Examples include an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (c) hybridizes in DNA encoding 16S rRNA of a genus bacterium. In the present specification, the primer set is referred to as an Fl primer set.
Flプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、フラボバクテリウム属細菌を検出することができる。Flプライマーセットによって、フラボバクテリウム属に属する種々の細菌種を、特定の種に限定されることなく検出できるが、フラボバクテリウム属細菌以外の細菌はほとんど検出されない。すなわち、Flプライマーセットによってフラボバクテリウム属細菌を特異的に検出できる。フラボバクテリウム（Flavobacterium）属細菌としては、例えば、F. johnsoniae、F. indologenes、F. odoratus、F. balustinumなどが挙げられる。 Flavobacterium bacteria can be detected by performing an amplification reaction using the Fl primer set. Although various bacterial species belonging to the genus Flavobacterium can be detected by the Fl primer set without being limited to a specific species, bacteria other than the genus Flavobacterium are hardly detected. That is, flavobacterium bacteria can be specifically detected by the Fl primer set. Examples of the genus Flavobacterium include F. johnsoniae, F. indologenes, F. odoratus, F. balustinum, and the like.
一実施形態において本発明は、エンテロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAを標的とし、（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとを含む、エンテロコッカス属細菌を検出するためのプライマーセットに関する。上記プライマーセットにおけるフォワードプライマーとして、（ａ）のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、配列番号１で表される塩基配列において１もしくは２個、好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、エンテロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ａ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。同様に上記プライマーセットにおけるリバースプライマーとして、（ｃ）のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドを用いることもできる。そのようなオリゴヌクレオチドとして、（ｄ）配列番号５で表される塩基配列において１もしくは２個、好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、エンテロコッカス属細菌の16S rRNAをコードするDNAにおいて（ｃ）のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において上記プライマーセットをEcプライマーセットと称する。 In one embodiment, the present invention targets DNA encoding 16S rRNA of Enterococcus bacteria, (a) a forward primer consisting of an oligonucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (c) SEQ ID NO: 5 The present invention relates to a primer set for detecting Enterococcus bacteria, including a reverse primer composed of an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented. As the forward primer in the above primer set, the oligonucleotide (a) and an oligonucleotide that can function equally as a primer can also be used. Such an oligonucleotide has a base sequence in which one or two, preferably one base is deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is a 16S rRNA of Enterococcus bacteria. And an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (a) hybridizes. Similarly, as the reverse primer in the above primer set, the oligonucleotide (c) and an oligonucleotide that can function equally as a primer can also be used. Such an oligonucleotide comprises (d) a base sequence in which one or two, preferably one base is deleted, substituted, added or inserted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and enterococcus bacteria In the DNA encoding 16S rRNA, an oligonucleotide that hybridizes to a region to which the oligonucleotide (c) hybridizes can be mentioned. In the present specification, the primer set is referred to as an Ec primer set.
Ecプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、エンテロコッカス属細菌を検出することができる。Ecプライマーセットによって、エンテロコッカス属に属する種々の細菌種を、特定の種に限定されることなく検出できるが、エンテロコッカス属細菌以外の細菌はほとんど検出されない。すなわち、Ecプライマーセットによってエンテロコッカス属細菌を特異的に検出できる。エンテロコッカス（Enterococcus）属細菌としては、例えば、E. faecalis、E. faecium、E. solitariusなどが挙げられる。 By performing an amplification reaction using the Ec primer set, Enterococcus bacteria can be detected. Although various bacterial species belonging to the genus Enterococcus can be detected by the Ec primer set without being limited to a specific species, bacteria other than the genus Enterococcus are hardly detected. That is, Enterococcus bacteria can be specifically detected by the Ec primer set. Examples of Enterococcus bacteria include E. faecalis, E. faecium, E. solitarius, and the like.
本明細書において、16S rRNAをコードするDNA（16S rDNA）を標的とするプライマーセットとは、検出対象である細菌（標的細菌と称する場合もある）の16S rRNAをコードするDNAにプライマーがハイブリダイズし、該DNAにおける特定の領域（標的配列）を増幅しうるプライマーセットをさす。細菌の16S rRNAをコードするDNAは、通常、細菌のゲノムDNAをさす。本発明のプライマーセットは、16S rRNAをコードするDNAにおいて、各細菌属またはその群に特異的な部分を標的配列とすることから、各細菌属またはその群を特異的に検出および定量することが可能である。なお、各細菌の16S rDNAの塩基配列は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）の遺伝子データベースGenBankから取得できる。 In this specification, a primer set that targets DNA encoding 16S rRNA (16S rDNA) is a primer that hybridizes to DNA encoding 16S rRNA of a bacterium to be detected (sometimes referred to as a target bacterium). A primer set that can amplify a specific region (target sequence) in the DNA. DNA encoding bacterial 16S rRNA usually refers to bacterial genomic DNA. Since the primer set of the present invention uses a portion specific to each bacterial genus or group thereof as a target sequence in DNA encoding 16S rRNA, each bacterial genus or group thereof can be specifically detected and quantified. Is possible. The base sequence of 16S rDNA of each bacterium can be obtained from the gene database GenBank of NCBI (National Center for Biotechnology Information).
特定のオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等に機能しうるオリゴヌクレオチドは、当該特定のオリゴヌクレオチドが標的とする16S rRNAをコードするDNAに同様にハイブリダイズし、かつ、該16S rRNAをコードするDNAにおいて当該特定のオリゴヌクレオチドが増幅する領域を増幅できるプライマーを意味する。ここで、ハイブリダイズは、特定のオリゴヌクレオチドが、その標的である16S rRNAをコードするDNAにハイブリダイズする条件において生じればよい。 An oligonucleotide that can function equally as a primer with a specific oligonucleotide is similarly hybridized to the DNA encoding the 16S rRNA targeted by the specific oligonucleotide, and the specific in the DNA encoding the 16S rRNA. The primer which can amplify the area | region which the oligonucleotide of amplifies is meant. Here, hybridization may occur under the condition that a specific oligonucleotide hybridizes to DNA encoding 16S rRNA as a target.
本発明のプライマーは、好ましくはストリンジェントな条件下で、その標的である16S rRNAをコードするDNAにハイブリダイズするものである。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、65℃、0.1×SSCおよび0.1% SDSで洗浄する条件である。 The primer of the present invention hybridizes to DNA encoding 16S rRNA, which is its target, preferably under stringent conditions. Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Stringent conditions are, for example, conditions of washing at 65 ° C., 0.1 × SSC and 0.1% SDS in the post-hybridization wash.
本明細書において、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、好ましくは一本鎖DNAをさす。また、プライマーには、オリゴヌクレオチドを構成するデオキシリボースや塩基について、その一部に他の分子が付加する、その一部が他の分子で置換されるなどにより修飾されているものも含まれる。例えば、プライマーとするオリゴヌクレオチドの5’末端に蛍光色素などの標識を付したものなどが含まれる。 In the present specification, the oligonucleotide as a primer preferably refers to a single-stranded DNA. Primers also include those in which deoxyribose and base constituting the oligonucleotide are modified by adding another molecule to a part of the oligonucleotide or substituting a part of the molecule with another molecule. For example, the 5 'end of the oligonucleotide used as a primer is labeled with a label such as a fluorescent dye.
本発明のプライマーセットが標的とするアルカリゲネス属細菌、フラボバクテリウム属細菌およびエンテロコッカス属細菌は、食品を汚染する可能性のある細菌として頻出するものである。従って、これらの細菌の食品中での存在、およびその割合を明らかにすることによって、汚染原因の推定、汚染原因の排除方法の最適化を図ることが可能となる。 Alkaligenes, Flavobacterium, and Enterococcus bacteria targeted by the primer set of the present invention frequently appear as bacteria that may contaminate food. Therefore, by clarifying the presence and ratio of these bacteria in food, it is possible to estimate the cause of contamination and optimize the method for eliminating the cause of contamination.
細菌の検出
本発明はまた、本発明の上記プライマーセットを用いて増幅反応を行って増幅産物を検出することにより該プライマーセットが対象とする細菌、すなわち標的細菌を検出する方法に関する。
Detection of Bacteria The present invention also relates to a method for detecting a target bacterium, that is, a target bacterium, by carrying out an amplification reaction using the primer set of the present invention and detecting an amplification product.
本発明の検出方法は、被検試料に含まれる標的細菌のゲノムDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いて増幅反応を行い、増幅産物を検出することにより、被検試料に含まれる標的細菌を検出するものである。細菌の検出には、細菌の有無の判定および細菌の定量が包含される。 The detection method of the present invention uses a target bacterium genomic DNA contained in a test sample as a template, performs an amplification reaction using the primer set of the present invention, and detects an amplification product, thereby detecting a target contained in the test sample. It detects bacteria. Detection of bacteria includes determination of the presence or absence of bacteria and quantification of bacteria.
被検試料としては、使用するプライマーの標的細菌を含みうる試料であれば特に制限されない。本発明の検出方法は、食品試料に含まれる細菌の検出に、特に好適に用いられる。食品には飲料も含まれ、本発明の検出方法は、例えば、野菜類、肉類、果実類、穀類、卵類、魚介類、香辛料類（ハーブ類、スパイス類）、イモ類、豆／種実類、キノコ類、藻類、乳類およびこれらの加工製品等を広く対象とすることができる。 The test sample is not particularly limited as long as it is a sample that can contain the target bacteria of the primer to be used. The detection method of the present invention is particularly preferably used for detection of bacteria contained in food samples. The food includes beverages, and the detection method of the present invention is, for example, vegetables, meat, fruits, cereals, eggs, seafood, spices (herbs, spices), potatoes, beans / nuts and seeds , Mushrooms, algae, milk, and processed products thereof can be widely targeted.
上記被検試料からDNAを抽出しそれを鋳型として増幅反応を行う。DNAの抽出は、従来のゲノムDNAの調製の場合と同様の手法により行うことができ、例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。 DNA is extracted from the test sample and an amplification reaction is carried out using it as a template. DNA extraction can be performed by the same method as in the case of conventional genomic DNA preparation. For example, a DNA extraction method using phenol / chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB or the like can be used.
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。例えば、PCR法、LAMP(Loop-mediated isothermal AMPlification)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法、RCA(Rolling Circle Amplification)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法等を挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。 The amplification method is not particularly limited, and a known method utilizing the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method can be mentioned. For example, PCR method, LAMP (Loop-mediated isothermal AMPlification) method, ICAN (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method, RCA (Rolling Circle Amplification) method, LCR (Ligase Chain Reaction) method, SDA (Strand Displacement) Amplification) method and the like. Amplification is performed until the amplification product is at a detectable level.
PCR法は、被検試料に含まれるDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼにより、プライマーセットに含まれる一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。PCR法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、増幅産物を指数関数的に増幅させることができる。PCRの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。 The PCR method synthesizes a base sequence between a pair of primers contained in a primer set by DNA polymerase using DNA contained in a test sample as a template. According to the PCR method, the amplification product can be amplified exponentially by repeating a cycle consisting of denaturation, annealing and synthesis. The optimum PCR conditions can be easily determined by those skilled in the art.
上記増幅反応後の増幅産物の検出には、このような産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。標識したdNTPを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。 Known means capable of specifically recognizing such a product can be used for detection of the amplification product after the amplification reaction. For example, a label such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be allowed to act on dNTP taken in during the amplification reaction, and this label can be detected. As a method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP, any method may be used as long as it is a method known in the art for detecting the above-mentioned labeled body. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured by, for example, a liquid scintillation counter or a γ-counter. In addition, when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
本発明の検出方法では、増幅反応として好ましくは定量的PCRを実施することにより、細菌の定量を行う。定量的PCRとしては、リアルタタイムPCRが好ましい。リアルタイムPCRは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れている。この方法には、通常、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムPCR専用の装置を用いる。まず、段階希釈した既知量のDNAを標準としてPCRを行い、これをもとに、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold cycle；Ct値）を横軸に、初発のDNA量を縦軸にプロットし、検量線を作成する。未知濃度の試料についても、同じ条件下で反応を行い、Ct値を求め、この値と検量線から、試料中の目的のDNA量を測定することができる。 In the detection method of the present invention, bacteria are quantified preferably by performing quantitative PCR as an amplification reaction. Real-time PCR is preferable as the quantitative PCR. Real-time PCR is a method for monitoring and analyzing the amount of PCR amplification in real time, and does not require electrophoresis and is excellent in rapidity and quantitativeness. In this method, a device dedicated to real-time PCR, in which a thermal cycler and a spectrofluorometer are integrated, is usually used. First, PCR is performed using a known amount of DNA diluted serially as a standard, and based on this, the horizontal axis indicates the number of cycles (threshold cycle; Ct value) at which the amount of amplification product is constant in the region where amplification occurs exponentially. Then, plot the initial DNA amount on the vertical axis to create a calibration curve. A sample having an unknown concentration can be reacted under the same conditions to obtain a Ct value, and the target DNA amount in the sample can be measured from this value and a calibration curve.
リアルタイムPCRは、当技術分野で通常用いられる方法により実施することができる。例えば、インターカレーター法、TaqManプローブ法およびサイクリングプローブ法などが挙げられる。 Real-time PCR can be performed by a method commonly used in the art. Examples include the intercalator method, TaqMan probe method, and cycling probe method.
インターカレーター法は、二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬（例えば、インターカレーター：SYBR（登録商標）Green I）をPCR反応系に加える方法である。インターカレーターによるリアルタイムPCRは、SYBR Green Iの存在下でPCRを行い、標的配列の増幅に伴って増加する蛍光強度を測定することにより、試料中の標的配列を検出・定量する技術である。当該技術は、増幅反応と蛍光強度の測定を同時に実施するものであり、増幅産物にSYBR Green Iがインターカレートすることによって生じる蛍光を定量的に検出する。蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、試料中の標的配列を有するDNAの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、蛍光強度の対数的増加が始まるサイクル数を調べることにより、試料中の標的配列を有するDNAを定量することができる。 The intercalator method is a method in which a reagent that emits fluorescence by binding to double-stranded DNA (for example, intercalator: SYBR (registered trademark) Green I) is added to a PCR reaction system. Real-time PCR using an intercalator is a technique for detecting and quantifying a target sequence in a sample by performing PCR in the presence of SYBR Green I and measuring the fluorescence intensity that increases with the amplification of the target sequence. In this technique, the amplification reaction and the fluorescence intensity are measured simultaneously, and the fluorescence generated by the intercalation of SYBR Green I into the amplification product is quantitatively detected. The fluorescence intensity exceeds the detection limit after a certain number of cycles and increases rapidly. As the amount of DNA having the target sequence in the sample increases, the fluorescence intensity increases rapidly with a smaller number of cycles. Therefore, DNA having a target sequence in a sample can be quantified by examining the number of cycles in which the logarithmic increase in fluorescence intensity starts.
TaqManプローブ法は、5'末端を蛍光物質（FAMなど）で、3'末端をクエンチャー物質（TAMRAなど）で修飾したオリゴヌクレオチド（TaqManプローブ）をPCR反応系に加える方法である。TaqManプローブは、アニーリングステップで鋳型DNAに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応ステップのときに、Taq DNAポリメラーゼのもつ5'→3'エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたTaqManプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光を発する。 The TaqMan probe method is a method in which an oligonucleotide (TaqMan probe) in which the 5 ′ end is modified with a fluorescent substance (such as FAM) and the 3 ′ end is modified with a quencher substance (such as TAMRA) is added to the PCR reaction system. The TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA in the annealing step, but since the quencher is present on the probe, the generation of fluorescence is suppressed even when irradiated with excitation light. During the extension reaction step, if the TaqMan probe hybridized to the template is degraded due to the 5 '→ 3' exonuclease activity of Taq DNA polymerase, the fluorescent dye is released from the probe and the quencher release is released. Emits fluorescence.
サイクリングプローブ法は、RNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができる。プローブは5'端が蛍光物質（リポーター）で、3'端が蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識される。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより強い蛍光を発することはないが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNaseHによりRNA部分が切断されると、強い蛍光を発する。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができる。 The cycling probe method is a highly sensitive detection method using a combination of RNA and DNA chimeric probes and RNase H, and can efficiently detect specific sequences of gene fragments during and after amplification. The probe is labeled with a fluorescent substance (reporter) at the 5 ′ end and a substance (quencher) that quenches fluorescence at the 3 ′ end. This probe does not emit strong fluorescence by quenching in an intact state, but emits strong fluorescence when the RNA portion is cleaved by RNaseH after hybridization with an amplification product whose sequence is complementary. By measuring the fluorescence intensity, the amount of amplification product can be monitored.
リアルタイムPCR用の装置は市販されており、本発明においては、そのような市販の装置（例えば、Applied Biosystems社製ABI PRISM 7700 Sequence Detector等）を用いることができる。 An apparatus for real-time PCR is commercially available, and such a commercially available apparatus (for example, ABI PRISM 7700 Sequence Detector manufactured by Applied Biosystems) can be used in the present invention.
本発明の検出方法は、本発明のプライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いて増幅反応を行って増幅産物を検出することを含むが、好ましくは少なくとも２つ、特に好ましくはすべてのプライマーセットについて増幅反応を行って増幅産物を検出することを含む。 The detection method of the present invention comprises carrying out an amplification reaction using at least one primer set selected from the primer set of the present invention to detect an amplification product, but preferably at least two, particularly preferably all Performing an amplification reaction on the primer set to detect the amplification product.
本発明の検出方法において、各細菌属を検出し、定量する、すなわち菌数を定量するためには、標的細菌の菌株を標準として用いてもよいし、本発明のプライマーセットによって増幅される16S rDNA領域を含むプラスミド等の標準DNAを標準として用いてもよい。 In the detection method of the present invention, in order to detect and quantify each bacterial genus, that is, to quantify the number of bacteria, a target bacterial strain may be used as a standard, or 16S amplified by the primer set of the present invention. A standard DNA such as a plasmid containing the rDNA region may be used as a standard.
標的細菌の菌株を標準として用いる場合（標準菌株を用いる場合）は、検査すべき被検試料に加えて、各標準菌株の2種以上の希釈系列についても定量的PCRを行って検量線を求め、得られた検量線から試料中の各細菌属の菌数を定量する。また、この標準菌株はPCRにおけるポジティブコントロールとしても利用することができる。 When using a target bacterial strain as a standard (when using a standard strain), in addition to the test sample to be examined, quantitative curves are also used for two or more dilution series of each standard strain to obtain a calibration curve Then, the number of bacteria of each bacterial genus in the sample is quantified from the obtained calibration curve. This standard strain can also be used as a positive control in PCR.
標準プラスミドなどの標準DNAを用いる場合は、標準菌株の代わりに、本発明の各プライマーセットにより増幅される標的細菌の16S rDNA領域を含むプラスミド等の標準DNAの2種以上の希釈系列を用いて検量線を求め、得られた検量線から、試料中の標的細菌の16S rDNAのコピー数を定量することにより、試料中の標的細菌の菌数を定量することができる。この場合、予め各標準菌株の菌数と標準DNAの量とを相関させておく必要があるが、プラスミド等の標準DNAは標準菌株と比較して取り扱いや保存等が容易である。このため、標準DNAを用いる定量方法は、食品または食品原料の保存、製造または流通の現場で実施する場合に特に好ましい。 When using standard DNA such as a standard plasmid, two or more dilution series of standard DNA such as a plasmid containing the 16S rDNA region of the target bacteria amplified by each primer set of the present invention is used instead of the standard strain. By obtaining a calibration curve and quantifying the number of 16S rDNA copies of the target bacteria in the sample from the obtained calibration curve, the number of target bacteria in the sample can be quantified. In this case, it is necessary to correlate the number of bacteria of each standard strain and the amount of standard DNA in advance, but standard DNA such as a plasmid is easier to handle and store than the standard strain. For this reason, the quantification method using standard DNA is particularly preferable when carried out at the site of storage, production or distribution of food or food ingredients.
食品中の菌叢の評価
本発明はまた、本発明のプライマーセットを用いて細菌を検出することにより、食品中の菌叢を評価する方法に関する。本明細書において食品中の菌叢の評価には、食品中に存在する標的細菌の状態に関する評価全般をさし、被検食品中に存在する細菌属の同定、各細菌属の定量、総生菌数の定量および細菌属の存在比の同定が包含される。食品の汚染評価においては、一般的に、細菌の菌数が1gあたり105を越える場合に、食品が汚染されていると判定される。本発明の細菌の検出方法により、各標的細菌の細菌数をオーダーレベルで測定でき、各細菌の数または総細菌数が1gあたり105を越えるかどうかを迅速かつ簡便に判定できるため、食品の汚染評価に好適である。
Evaluation of flora in food The present invention also relates to a method for evaluating the flora in food by detecting bacteria using the primer set of the present invention. In this specification, the evaluation of the bacterial flora in food refers to the overall evaluation of the state of target bacteria present in food, the identification of bacterial genus present in the test food, quantification of each bacterial genus, total life Quantification of the number of bacteria and identification of bacterial abundance ratios are included. In food contamination assessment, it is generally judged that food is contaminated when the bacterial count exceeds 10 5 per gram. The method for detecting bacteria of the present invention, each target bacteria bacterial counts can be measured at the order level, since whether the number or the total bacterial count of each bacteria exceeds 10 5 per 1g can be determined quickly and simply, food Suitable for contamination assessment.
本発明のプライマーセットが標的とするアルカリゲネス属細菌、フラボバクテリウム属細菌およびエンテロコッカス属細菌は、食品を汚染する可能性のある細菌として頻出するものであるため、これらの細菌の食品中での存在、ならびにその数および割合を明らかにすることによって、食品中の菌叢を適切に評価することができる。そして、上記標的細菌群のうち、どの細菌属が最も多く存在するか、あるいはどの細菌属が有害な量で存在するかを評価することにより、汚染原因の推定、汚染原因の排除方法の最適化を図ることが可能となる。食品については、被検試料についてすでに記載したとおりである。本発明の評価方法においては、１つのプライマーセットを用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。好ましくは少なくとも２つ、特に好ましくはすべてのプライマーセットについて細菌の検出を行って、食品中の菌叢を評価する。 Alkaligenes, Flavobacterium, and Enterococcus bacteria targeted by the primer set of the present invention frequently appear as bacteria that can contaminate foods. Therefore, the presence of these bacteria in foods And by revealing their numbers and proportions, the flora in food can be properly assessed. Then, by evaluating which bacterial genus is the most abundant in the above target bacterial group or which genus is present in a harmful amount, estimation of the cause of contamination and optimization of the method for eliminating the cause of contamination Can be achieved. For food, it is as described for the test sample. In the evaluation method of the present invention, one primer set may be used, or a plurality of types may be used in combination. Bacteria detection is preferably performed on at least two, particularly preferably all primer sets, to assess the flora in the food.
キット
本発明はまた、本発明のプライマーセットから選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、食品中の菌叢を評価するためのキットに関する。本発明のキットは、上記プライマーセットのうちの１つを含むものでもよいし、複数種のプライマーセットを含むものでもよい。本発明のキットは、前記プライマーセットのほか、必要に応じて遺伝子増幅及び増幅産物の確認に利用可能な分子量マーカー、酵素、dNTP、NTP、緩衝液、減菌水、標品（標準菌株、標準DNAなど）等を含んだものとして構成される。
Kit The present invention also relates to a kit for evaluating a bacterial flora in a food comprising at least one primer set selected from the primer set of the present invention. The kit of the present invention may include one of the above primer sets, or may include a plurality of types of primer sets. In addition to the primer set, the kit of the present invention includes a molecular weight marker, enzyme, dNTP, NTP, buffer solution, sterilized water, standard (standard strain, standard) that can be used for gene amplification and confirmation of amplification products as necessary. DNA etc.).
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１（標準菌株を用いた場合の検出）
＜DNAの調製＞
Alcaligenes faecalis subsp. faecalis NBRC 13111、Flavobacterium johnsoniae NBRC 14942、Enterococcus faecalis NBRC 100480をそれぞれTryptic Soy Broth (Difco)で30℃、一晩培養して、12,000rpm、5分間の遠心分離によって集菌したものをミリQ水に再懸濁し、菌濃度を103、104、105、106cfu/mLとした。各菌液からDNeasy Tissue Kit（QIAGEN）を用いて、DNA溶液を調製した。
Example 1 (Detection using a standard strain)
<Preparation of DNA>
Alcaligenes faecalis subsp.faecalis
＜PCR反応＞
定量的PCR反応は、得られたDNA溶液およびSYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa)を用いて行った。プライマーセットとして、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとのAlプライマーセット、配列番号３の塩基配列からなるプライマーと配列番号４の塩基配列からなるプライマーとのFlプライマーセット、配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号５の塩基配列からなるプライマーとのEcプライマーセットをそれぞれ用いた。
<PCR reaction>
The quantitative PCR reaction was performed using the obtained DNA solution and SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa). As a primer set, an Al primer set consisting of a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 An Fl primer set and an Ec primer set comprising a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 were used.
PCR反応液容量は20μLとし、SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa) 10μL、10μMフォワードプライマーおよび10μMリバースプライマー各0.4μL、ROX Reference Dye (TaKaRa) 0.4μL、DNA抽出液2μL、滅菌蒸留水6.8μLの組成でPCR反応を行った。PCR反応条件は、95℃ 10秒間の後、95℃ 5秒間の熱変性と60℃ 30秒間のアニーリング処理と伸長反応を1サイクルとして、40サイクル行った。PCR反応により生成した増幅産物量は、二本鎖DNAにSYBR Green Iが結合して発生する蛍光強度を検出することによって測定した。測定データは ABI PRISM7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems)で解析した。PCR反応後に増幅産物の融解曲線分析（95℃ 15秒間、60℃ 20秒間の後、20分間かけて95℃まで温度を上昇させ、95℃ 15秒間保持）を行い、増幅産物のTm値を確認することによって増幅産物が目的物であることを確認した。
PCR reaction volume is 20 μL, SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa) 10 μL, 10 μM forward primer and 10 μM reverse primer 0.4 μL each, ROX Reference Dye (TaKaRa) 0.4 μL,
その結果、菌株液中に103 cfu/mL以上程度の細菌が存在していればそのDNAを検出できることを確認した。また、103〜106cfu/mLの範囲で菌濃度とCt値に直線性があることを確認した（図１）。すなわち、本発明のプライマーセットを用いて、上記範囲で菌数を定量できることが示された。 As a result, it was confirmed that the DNA could be detected if bacteria of about 10 3 cfu / mL or more were present in the strain solution. Further, it was confirmed that the bacterial concentration and Ct value were linear in the range of 10 3 to 10 6 cfu / mL (FIG. 1). That is, it was shown that the number of bacteria can be quantified within the above range using the primer set of the present invention.
実施例２（本発明のプライマーの菌種特異性の確認）
実施例１と同様にして、図２に示す各菌株（標準菌株以外は食品から分離し、市販の同定キットによって属種を同定した）を培養して菌濃度を105 cfu/mL相当とした菌液からDNAを抽出し、定量的PCR反応を行った。結果を図２に示す。
Example 2 (Confirmation of bacterial species specificity of the primer of the present invention)
In the same manner as in Example 1, each strain shown in FIG. 2 (separated from food except for the standard strain, and the genus species was identified by a commercially available identification kit) was cultured to make the bacterial concentration equivalent to 10 5 cfu / mL. DNA was extracted from the bacterial solution and subjected to quantitative PCR reaction. The results are shown in FIG.
図２に示すように、Alプライマーセット（配列番号１および２）を用いた場合には、アルカリゲネス属細菌については増幅産物が検出され、それ以外の細菌については増幅産物は検出されなかった。Flプライマーセット（配列番号３および４）を用いた場合には、フラボバクテリウム属細菌については増幅産物が検出され、それ以外の細菌については増幅産物は検出されなかった。Ecプライマーセット（配列番号１および５）を用いた場合には、エンテロコッカス属細菌については増幅産物が検出され、それ以外の細菌については増幅産物は検出されなかった。
したがって、本発明の各プライマーセットは、標的細菌を特異的に検出可能であることが確認された。
As shown in FIG. 2, when the Al primer set (SEQ ID NOs: 1 and 2) was used, an amplification product was detected for Alkaligenes bacteria, and no amplification product was detected for the other bacteria. When the Fl primer set (SEQ ID NOs: 3 and 4) was used, amplification products were detected for Flavobacterium bacteria, and amplification products were not detected for the other bacteria. When the Ec primer set (SEQ ID NOs: 1 and 5) was used, amplification products were detected for Enterococcus bacteria, and amplification products were not detected for the other bacteria.
Therefore, it was confirmed that each primer set of the present invention can specifically detect the target bacteria.
実施例３（食品に接種した細菌の定量）
食品として、市販のキャベツを用い、細菌汚染が少ない部分を採取して、食品1gあたり103個、104個、105個、106個程度となるようにAlcaligenes faecalis subsp. faecalis NBRC 13111、Flavobacterium johnsoniae NBRC 14942、Enterococcus faecalis NBRC 100480をそれぞれ接種した。なお、菌株添加前のキャベツの生菌数は、＜100 cfu/gであった。菌を接種した食品に9倍量のリン酸緩衝液(pH7.2)を加えてストマッカー処理した。これらの処理液からDNAを抽出し、実施例１と同様にして定量的PCR反応を行った。また、食品毎に各プライマーセットを用いた場合の定量的PCR反応における各菌株の検量線を作成した。その結果、接種した菌量が104log cfu/g以上の食品検体において、食品中の各標的細菌を定量的に検出できることを確認した。作成した検量線を図３に示す。
Example 3 (Quantification of bacteria inoculated in food)
As food, using commercially available cabbage, collect partial bacterial contamination is small, 10 3 per food 1 g, 10 4, 10 5, Alcaligenes so that 10 6 or so faecalis subsp.
本発明により、食品中の細菌の定量および菌叢の評価を簡単かつ迅速に実施できるPCR用プライマー、および、当該プライマーを用いて食品中の特定細菌群を簡単かつ迅速に検出できる方法などが提供される。本発明の方法は、食品工業における簡単かつ迅速な細菌検出・定量に有用である。本発明により、食品の一般生菌数を迅速に推定することが可能となり、さらに、細菌汚染の可能性のある食品について、その菌叢を迅速に推定することによって、食品製造現場における汚染原因への迅速な対応が可能となる。 The present invention provides a primer for PCR that can easily and quickly perform the quantification of bacteria in foods and the evaluation of bacterial flora, and a method that can easily and quickly detect specific bacterial groups in foods using the primers. Is done. The method of the present invention is useful for simple and rapid bacterial detection and quantification in the food industry. By virtue of the present invention, it becomes possible to quickly estimate the general viable count of food, and further to the cause of contamination at the food production site by quickly estimating the bacterial flora of food that may be contaminated with bacteria. It is possible to respond quickly.
Claims (6)
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 Targeting DNA encoding 16S rRNA of alkali genus bacteria, and detecting a bacterium of the genus alkaline genus comprising a forward primer comprising the following oligonucleotide (a) and a reverse primer comprising the following oligonucleotide (c) : Primer set:
(A) an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
(C) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 Flavobacterium bacteria, which target DNA encoding 16S rRNA of Flavobacterium bacteria, comprising a forward primer comprising the following oligonucleotide (a) and a reverse primer comprising the following oligonucleotide (c) : Primer set for detecting:
(A) an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3
(C) An oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 .
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 In order to detect Enterococcus bacteria comprising a forward primer comprising the following oligonucleotide (a) and a reverse primer comprising the following oligonucleotide (c) , targeting DNA encoding 16S rRNA of Enterococcus bacteria: Primer set:
(A) an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
(C) an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 .
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