KR20200059766A - Development of a Singleplex Real-Time PCR Kit for Rapid Detection of Campylobacter coli ceuE target gene - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 캠필로박터 콜라이 특이적인 유전자에 대한 프라이머 세트에 관한 것으로, 이의 캠필로박터 콜라이 검출 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a set of primers for a specific gene for Campylobacter coli, and to its use for detection of Campylobacter coli.
식중독은 세계적으로 사람의 건강에 대한 주요 문제 중 하나로 손꼽히고 있으며 이에 따른 식품산업, 공공 건강 기관, 미생물 테러 등 중요 분야에서 식중독균의 빠른 검출에 대한 관심을 가지고 있다. 상기 식중독이란 발열, 구토질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는 질환으로 (Heymann DL. Control of Communicable Diseases Manual. pp 232-242. The American Public Health Association. Washington. 2004.), 세균이 원인인 세균성 식중독이 대부분이다. 주요 식중독균들로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 대장균 O157:H7(Escherichiacoli O157:H7), 살모넬라(Salmonella spp), 시겔라(Shigella spp), 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus), 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii), 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 엔테로로커스(Enterococcus spp) 등이 존재한다. 세균성 식중독은 그 발병 형태에 따라 감염형과 독소형으로 분류된다. 감염형 식중독은 오염된 식품의 섭취시 세균이 장관 내에서 증식하여 일으키는 식중독으로, 살모넬라 속 균주(Salmonella spp), 대장균O157(Escherichia coli O157:H7, E coli O157:H7) 또는 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 등이 주된 원인균이다. 독소형 식중독은 식품 중에서 세균이 증식하면서 독소를 생산하여식품 내에 존재하는 독소를 섭취함으로써 발생하는 식중독이다. 그러므로 이 경우 원인균이 식품 내에서 이미 사멸되었어도 독소가 잔존할 때에는 식중독이 발생할 수 있으며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 등이 주된 원인균이다. Food poisoning is regarded as one of the major problems for human health worldwide and is interested in the rapid detection of food poisoning bacteria in important fields such as the food industry, public health institutions, and microbial terrorism. The food poisoning is a disease accompanied by symptoms such as fever, vomiting, vomiting, diarrhea, and abdominal pain (Heymann DL. Control of Communicable Diseases Manual. Pp 232-242.The American Public Health Association.Washington. 2004.) The cause is bacterial food poisoning. The major food poisoning bacteria are Bacillus cereus , Listeria monocytogenes , Staphylococcus aureus , Clostridium perfringens , Campylobacter jejuni , Yepy Yersinia enterocolitica , Escherichia coli O157: H7 ( Escherichiacoli O157: H7), Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio vulnificus, Chronobacter sazakazaki (Cronobactus sazakazaki) , there are such as Campylobacter coli (Campylobacter coli), Enterobacter locus (Enterococcus spp). Bacterial food poisoning is classified into an infectious type and a toxin type according to the type of outbreak. Infection type of food poisoning is a cause to consume when bacteria in contaminated food proliferate in the intestinal tract of food poisoning, Salmonella spp (Salmonella spp), E. coli O157 (Escherichia coli O157: H7, E coli O157: H7) , or Vibrio para H. Molly Tee The main causative agent is Vibrio parahaemolyticus . Toxin-type food poisoning is food poisoning that occurs by ingesting toxins present in foods by producing toxins while bacteria grow in food. Therefore, in this case, food poisoning may occur when the toxin remains even though the causative bacteria have already been killed in the food, and Staphylococcus aureus or Clostridium perfringens are the main causative bacteria.
미국 질병통제 및 예방센터(CDC)의 통계에 의하면, 식품매개에 의하여 연간 500만 건의 질병이 발생하고 있으며, 이 중 약 4,000명이 사망하는 것으로 알려져 있고, 대부분은 살모넬라 속 균주에 의한 식중독이 약 100만 내지 400만 명에게 발생하며, 이중 약 01%에 해당하는 약 2,000 여명이 사망하는 것으로 보고되었다. 또한, 대장균 O157:H7 에 의한 식중독은 연간 약 1만 명이 발생하여 약 300명이 사망하였으며, 리스테리아 모노사이토게네스의 경우, 연간 약 1,500명이 발생하여 약 400명이 사망하는 것으로 알려져 있어, 이들의 주요 병원성 세균에 의한 축산식품의 오염이 심각한 것으로 나타났다. 우리나라의 식중독 발생현황을 살펴보면, 원인식품으로는 육류 및 식육가공품이 약 50% 이상을 차지하고 있으며, 원인병원체는 살모넬라균이 약 50%, 포도상구균이 약 20% 인 것으로 알려져 있다. 정확한 원인균의 동정을 위해서 오염된 가검물이나 식품을 배양하여 생화학적 테스트를 수행하는 것을 원칙으로 하는데, 이는 최소 3일에서 수 주일이 소요된다. 이와 같은 배지법이나 생화학적 테스트는 공인검사법으로 널리 사용되고 있기는 하지만 원인병원체를 파악하고 역학조사를 완료하기 전에 이미 식중독이 집단적으로 확산될 가능성이 매우 높다.According to statistics from the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 5 million illnesses occur annually due to foodborne mediation, of which 4,000 are known to die, and most of the food poisonings of the genus Salmonella are about 100 It occurs in 10,000 to 4 million people, of which about 2,000 have been reported to die, or about 01%. In addition, food poisoning caused by E. coli O157: H7 occurred in about 10,000 people per year, resulting in about 300 deaths. In Listeria monocytogenes, about 1,500 deaths per year were reported, resulting in about 400 deaths. The contamination of livestock food by bacteria was found to be serious. Looking at the current state of food poisoning in Korea, meat and meat processed products account for about 50% or more as the cause food, and the causative agent is known to be about 50% for Salmonella and about 20% for Staphylococcus aureus. In order to accurately identify the causative agent, it is a principle to perform a biochemical test by culturing contaminated specimens or foods, which take at least 3 days to weeks. Although such a medium method or a biochemical test is widely used as an accredited test method, it is very likely that food poisoning is already spread collectively before identifying the causative agent and completing an epidemiological investigation.
이와 같은 식중독균의 검출은 인간의 건강 관리 및 식품산업에서 매우 중시되고 있으며, 특히 식중독 검출에 대하여 빠른 검출과 식중독균의 검출에 대한 민감도가 중요한 요건으로 자리잡고 있다. 식중독균의 빠른 다중검출을 위해 핵산기반의 검출방법이 보고되었으며, 이 방법 중 식중독균 DNA의 특정 염기서열을 증폭시켜 검출시키는 PCR(중합연쇄반응)을 일반적으로 사용하고 있다. PCR을 사용하는 경우, 소량의 샘플로도 증폭과정을 거치기 때문에 높은 민감도를 가지며, 빠른 검출이 가능하다는 장점을 가지게 되나, PCR시 사용되는 프라이머의 수가 많아질수록 비특이적 결합으로 인한 문제점이 제기되어 식중독균 다중 검출에 사용되기에는 문제점을 가지고 있다. 또한 균주들 사이에서도 비슷한 속에 속하는 균주들의 경우 DNA의 유사성과 다양성으로 인해 위양성(false positive) 또는 위음성(false negative)의 결과를 나타낼 수 있다는 문제점을 가진다.The detection of such food poisoning bacteria is highly valued in the human health care and food industry, and in particular, fast detection and sensitivity to detection of food poisoning bacteria have become important requirements for food poisoning detection. Nucleic acid-based detection methods have been reported for rapid multiple detection of food poisoning bacteria, and among these methods, PCR (polymerization chain reaction) that amplifies and detects specific sequences of food poisoning bacteria DNA is generally used. When PCR is used, a small amount of sample undergoes an amplification process, so it has high sensitivity and has the advantage of being able to detect quickly. However, as the number of primers used during PCR increases, the problem caused by non-specific binding is raised and food poisoning bacteria It has a problem to be used for multiple detection. In addition, strains belonging to similar genera among strains have a problem in that they may exhibit false positive or false negative results due to the similarity and diversity of DNA.
따라서 최근에는 이러한 식중독을 일으킬 수 있는 병원성 미생물들을 조기에 검출하고 미량의 병원성 미생물도 검출할 수 있는 방법들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 대한민국 등록특허공보 1544050호는 박테리아 검출용 키트 및 방법에 관한 것으로 살모넬라를 항체를 이용하여 검출하는 방법을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제1999-65107호에는 중합효소연쇄반응을 이용하여 병원성 대장균 O157:H7이 가지고 있는 특이 유전자를 검출할 수 있는 다종 유전자 동시 검출방법이 개시한 바 있다. 그러나 이러한 종래기술에 따른 병원성 미생물 검출 방법들은 비교적 높은 농도의 미생물이 존재할 경우에만 검출이 가능하기 때문에 낮은 농도의 미생물이 존재 시에는 병원균의 존재를 검출하지 못하는 문제점이 있었다. 또한, 기존의 실시간 PCR 병원균 검출 키트의 경우 대체로 활성이 낮고 몇몇 표적 유전자들은 균주가 존재함에도 활성이 관찰되지 않았으며, 현재 시중에 가장 많이 사용되고 있는 Real-time PCR 장비인 ABI 7500과 Bio-Rad CFX Connect에서 동시에 호환이 되지 않는다는 문제점이 있어왔다. 아울러, 검출을 원하는 균주의 유무를 특이적으로 확인하기 어려우며 실제로 식품 샘플에 균주가 어느 정도 존재함에도 불구하고 민감도가 떨어져 검출되지 않는 경우가 있어왔다. Therefore, recently, studies on methods for early detection of pathogenic microorganisms capable of causing such food poisoning and detection of trace pathogenic microorganisms have been actively conducted, and Korean Patent Publication No. 1544050 discloses a kit and method for detecting bacteria. The present invention discloses a method for detecting Salmonella using an antibody, and Korean Patent Publication No. 1999-65107 discloses multiple genes capable of detecting specific genes possessed by pathogenic E. coli O157: H7 using polymerase chain reaction. A detection method has been disclosed. However, since the methods for detecting pathogenic microorganisms according to the related art can be detected only when relatively high concentrations of microorganisms are present, there is a problem in that the presence of pathogens cannot be detected when low concentrations of microorganisms are present. In addition, in the case of the existing real-time PCR pathogen detection kit, the activity is generally low, and some target genes have not been observed even with the presence of a strain.ABI 7500 and Bio-Rad CFX, which are currently the most used real-time PCR equipment, are used. There has been a problem that Connect is not compatible at the same time. In addition, it is difficult to specifically identify the presence or absence of a strain to be detected, and in fact, there has been a case in which the sensitivity is not detected even though the strain is present in a food sample to some extent.
이에 본 발명자들은 보다 더 정확하고 특이적인 실시간 PCR 키트의 필요성을 절감하여 식품에 위해한 병원성 미생물에만 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 고안하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용한 PCR 방법으로 매우 낮은 농도에서도 검출이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors devised a primer set capable of specifically detecting only pathogenic microorganisms harmful to food by reducing the need for a more accurate and specific real-time PCR kit, and even at a very low concentration by PCR method using the primer set. The present invention was completed by confirming that detection is possible.
본 발명의 목적은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a primer set for detecting a strain of Campylobacter coli.
또한, 본 발명의 목적은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 조성물을 제공하는 것이다.In addition, an object of the present invention is to provide a composition for detecting a Campylobacter coli strain.
또한, 본 발명의 목적은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 키트를 제공하는 것이다.In addition, an object of the present invention is to provide a kit for detecting a strain of Campylobacter coli.
아울러, 본 발명의 목적은 캠필로박터 콜라이 균주의 검출방법을 제공하는 것이다.In addition, an object of the present invention is to provide a method for detecting a Campylobacter coli strain.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a primer set for the detection of Campylobacter coli strains.
또한, 본 발명은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting Campylobacter coli strains.
또한, 본 발명은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting a strain of Campylobacter coli.
아울러, 본 발명은 캠필로박터 콜라이 균주의 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting a Campylobacter coli strain.
본 발명에 따르면, 본 발명의 캠필로박터 콜라이 균주에 특이적인 프라이머 세트는 해당 균주만을 특이적으로 검출할 수 있는 정확성, 아주 극소량의 DNA 농도만으로도 검출이 가능한 민감성, 종래의 검출 키트에 비해 현저히 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 활성도가 높으므로, 이를 캠필로박터 콜라이 균주 검출용도로 유용하게 활용할 수 있다.According to the present invention, the primer set specific to the Campylobacter coli strain of the present invention is capable of specifically detecting only the corresponding strain, sensitivity capable of being detected only with a very small amount of DNA concentration, and significantly faster and more accurate detection compared to the conventional detection kit Since the activity can be high, it can be usefully used for the detection of Campylobacter coli strains.
도 1은 본 발명의 프라이머의 캠필로박터 콜라이 특이적 검출을 확인한 도이다.
도 2는 캠필로박터 콜라이 검출에 대한 본 발명의 프라이머의 singleplex Real-time PCR 민감도를 확인한 도이다.
도 3은 종래에 캠필로박터 콜라이 검출에 사용된 실시간 PCR 키트 (A사 glyA)와 본 발명의 프라이머를 이용한 실시간 PCR 키트의 캠필로박터 콜라이 검출 활성을 비교한 도이다.
도 4는 캠필로박터 콜라이 균주의 ceuE에 대한 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 singleplex real-time PCR을 ABI 7500 기기를 이용하여 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 캠필로박터 콜라이 균주의 ceuE에 대한 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 singleplex real-time PCR을 Bio-rad CFX connect를 이용하여 수행한 결과를 나타낸 도이다.1 is a view confirming the specific detection of Campylobacter coli of the primer of the present invention.
2 is a view confirming the sensitivity of the singleplex Real-time PCR of the primer of the present invention for the detection of Campylobacter coli.
Figure 3 is a diagram comparing the activity of the real-time PCR kit used for the detection of Campylobacter coli (A glyA company) and the activity of the Campylobacter coli of the real-time PCR kit using the primers of the present invention.
4 is a view showing the results of performing a singleplex real-time PCR using the ABI 7500 instrument using the primer set of the present invention for ceuE of the Campylobacter coli strain.
5 is a view showing the results of performing a singleplex real-time PCR using the primer set of the present invention for ceuE of the Campylobacter coli strain using Bio-rad CFX connect.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings as an embodiment of the present invention. However, the following embodiments are presented as examples of the present invention, and when it is determined that a detailed description of a technique or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description may be omitted. , Thereby, the present invention is not limited. The present invention is capable of various modifications and applications within the scope of the claims and the equivalents interpreted therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, terms used in the present specification (terminology) are terms used to properly represent a preferred embodiment of the present invention, which may vary according to a user, an operator's intention, or customs in the field to which the present invention pertains. Therefore, definitions of these terms should be made based on the contents throughout the specification. Throughout the specification, when a part “includes” a certain component, it means that the component may further include other components, not to exclude other components, unless otherwise stated.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.Unless otherwise indicated, nucleic acids are recorded in a 5 '→ 3' orientation from left to right. Numerical ranges recited within the specification include numbers defining the ranges, and include each integer or any non-integer fraction within the defined ranges.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in practice to test the present invention, preferred materials and methods are described herein.
본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상 식품 또는 재료로부터 얻은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 시료를 의미한다. As used herein, the term "sample (sample)" refers to a fresh, frozen and / or preserved sample obtained from a subject food or material.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in a sense as commonly understood by those skilled in the art in the relevant field of the present invention. Also, a preferred method or sample is described herein, but similar or equivalent ones are included in the scope of the present invention. The contents of all publications described by reference herein are incorporated into the present invention.
일 측면에서, 본 발명은 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a primer set for the detection of Campylobacter coli strains.
일 구현예에서, 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.In one embodiment, the primer set for detecting Campylobacter coli strain may include a primer set consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer set consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, primer and sequence consisting of a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may consist of a primer set consisting of the nucleotide sequence of No. 2.
일 구현예에서, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 캠필로박터 콜라이 균주 특이 유전자 ceuE를 102bp로 증폭시킬 수 있다. In one embodiment, the primer set consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the base sequence of SEQ ID NO: 2 of the present invention can amplify the Campylobacter coli strain specific gene ceuE to 102bp.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머 세트는 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 일반 중합효소연쇄반응 또는 실시간 RT-PCR에 사용될 수 있다.In one embodiment, the primer set of the present invention can be used for a conventional polymerase chain reaction, preferably a general polymerase chain reaction or real-time RT-PCR.
일 구현예에서, 본 발명의 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.In one embodiment, oligonucleotides used as primers of the invention also include nucleotide analogs, such as phosphorothioates, alkylphosphorothioates or peptide nucleic acids. Or may include an intercalating agent.
일 구현예에서, 본 발명의 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 VIC, NED, FAM 또는 PET 이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 VIC, NED, FAM 또는 PET를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.In one embodiment, the primer of the present invention may further include a material that emits DNA intercalating fluorescence, phosphorescence, or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling material is VIC, NED, FAM or PET. When amplifying the target sequence, PCR is performed by labeling VIC, NED, FAM or PET at the 5'-end of the primer, and the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling material. In addition, the labeling using a radioactive material, when a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution when performing PCR, the amplification product is synthesized and radioactive is incorporated into the amplification product, so that the amplification product can be radioactively labeled. The oligonucleotide primer set used to amplify the target sequence is as described above.
본 발명에서 사용된 용어 "중합효소연쇄반응" 또는 "PCR"은 일반(비정량) PCR과 정량 PCR을 포괄하는 것으로서, 예를 들어, 일반 PCR, 일반 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR을 모두 포함하는 개념이나, 문맥에 따라 "일반 PCR 또는 일반 RT-PCR"을 가리키거나 "일반 PCR"을 가리키는 개념으로 사용될 수 있다.The term "polymerase chain reaction" or "PCR" used in the present invention encompasses general (non-quantitative) PCR and quantitative PCR, for example, general PCR, general RT-PCR, real-time PCR, real-time RT-PCR. It may be used as a concept that includes all of the concepts or refers to "general PCR or general RT-PCR" or "general PCR" depending on context.
본 발명에서 사용된 용어 "검출"은 검출 또는 측정된 대상의 존재 여부 및/또는 이의 농도를 정량하는 것을 의미한다.As used herein, the term "detection" means quantifying the presence and / or concentration of a detected or measured subject.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. In the present invention, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3 terminal hydroxyl group (free 3 hydroxyl group) can form a complementary template (template) and base pair (base pair) as a starting point for template strand copying A short nucleic acid sequence that functions. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures.
일 측면에서, 본 발명은 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 균주 검출용 프로브에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a probe for detecting a Campylobacter coli strain.
일 구현예에서, 상기 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 프로브는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다.In one embodiment, the probe for detecting the Campylobacter coli strain may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a composition for detecting a Campylobacter coli strain comprising a primer set for detecting a Campylobacter coli strain of the present invention.
일 구현예에서, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열의 5’말단은 형광물질을 및 3’말단은 소광 물질(quencher) 물질을 포함할 수 있다.In one embodiment, a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 may be further included, wherein the probe is a fluorescent substance at the 5 'end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and a quencher at the 3' end. It may contain substances.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 실시간 RT-PCR 분석용 조성물일 수 있다.In one embodiment, the composition of the present invention may be a composition for real-time RT-PCR analysis.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. In the present invention, the term, "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases to a few hundred bases, which can achieve specific binding with mRNA, and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA. Can be. The probe may be prepared in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primer or probe of the present invention can be chemically synthesized using a phosphoramidite solid support method, or other well-known method. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution with one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (eg methyl phosphonate, phossotriester, phosphoro Amidate, carbamate, etc.) or charged linkers (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.In the present invention, suitable conditions for hybridizing a probe with a cDNA molecule can be determined in a series of procedures by an optimization procedure. These procedures are carried out in a series of procedures by those skilled in the art to establish protocols for use in the laboratory. For example, conditions such as temperature, concentration of components, hybridization and washing time, buffer components, and their pH and ionic strength, depend on various factors such as the length and GC amount of the probe and the target nucleotide sequence. Detailed conditions for hybridization include Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); And M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999).
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 조성물을 포함하는 캠필로박터 콜라이 균주 검출용 키트에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a kit for detecting a strain of Campylobacter coli comprising the composition for detecting a strain of Campylobacter coli of the present invention.
일 구현예에서, 상기 키트는 상기 프라이머 세트와 PCR을 이용한 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분(반응완충액, Taq DNA 중합효소, 표지물질 등)을 포함할 수 있으며, PCR(Polymerase chain reaction) 또는 실시간 PCR(Real-Time PCR)에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the kit may include common components (reaction buffer, Taq DNA polymerase, labeling material, etc.) of the primer set and the microorganism detection kit using PCR, and PCR (Polymerase chain reaction) or real time Reagents necessary for PCR (Real-Time PCR) may be further included.
일 구현예에서, 상기 PCR에 필요한 시약은 예를 들면, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 적당량의 DNA 중합 효소(Taq polymerase), dNTP 혼합물, KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유한 PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다In one embodiment, the reagents required for the PCR include, for example, a forward primer and a reverse primer, an appropriate amount of DNA polymerase, dNTP mixture, PCR buffer containing KCl, Tris-HCl and MgCl 2 (buffer) ) And water, but is not limited thereto.
일 구현예에서, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In one embodiment, the kit can include a guide. The guide is a printout that explains how to use the kit, for example, how to prepare reverse transcription buffer and PCR buffer, and the reaction conditions presented. The guide includes brochures in the form of brochures or flyers, labels attached to the kit, and descriptions on the surface of the package containing the kit. In addition, the handbook includes information that is disclosed or provided through electronic media, such as the Internet.
일 측면에서, 본 발명은 대상 시료에 대해 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 상기 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 확인하거나 그 염기서열을 분석하여 캠필로박터 콜라이 균주의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 캠필로박터 콜라이 균주의 검출방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention performs a polymerase chain reaction using the primer set of the present invention for a target sample; And confirming the size of the product of the polymerase chain reaction or analyzing the base sequence thereof to confirm the existence of the Campylobacter coli strain.
일 구현예에서, 캠필로박터 콜라이 균주의 존재 여부는 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 상기 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.In one embodiment, the presence or absence of the Campylobacter coli strain can be performed by a method of confirming the size of the amplified DNA product by electrophoresis of the amplified DNA product by the polymerase chain reaction.
일 구현예에서, 상기 시료는 식품에서 분리한 미생물 또는 이로부터 추출한 핵산 시료일 수 있다.In one embodiment, the sample may be a microorganism isolated from food or a nucleic acid sample extracted therefrom.
일 구현예에서, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브를 추가로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있다.In one embodiment, a polymerase chain reaction may be performed by further using a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
일 구현예에서, 본 발명의 검출방법은 상기 병원성 미생물인 캠필로박터 콜라이가 발견되는 모든 물질을 대상으로 실시될 수 있으며, 바람직하게로는 식품 또는 사료에 대하여 실시할 수 있다. 일례로, 캠필로박터 콜라이에 오염이 되었으리라고 의심되는 시료를 채취하고, 이를 멸균수 또는 생리식염수에 현탁한 후 프로테나제 K(Proteinase K)를 처리한 후 펠렛을 회수한 후 열수추출하여, PCR 반응에 필요한 시료를 준비하고, PCR을 실시한다. PCR 결과는 통상적인 PCR 검출 수단, 예컨대 전기영동 등의 방법으로 실시된다. 상기 열수추출은 통상적인 DNA 분리방법으로, 예컨대 상기 펠렛을 멸균수로 부유하고 여기에 페놀/클로로포름 (1:1) 혼합액을 처리한 다음 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 에탄올을 가한 후 원심분리하여 DNA 펠렛을 수득하는 방법이다. 구체적인 반응조건 및 시간은 통상적인 바에 따른다.In one embodiment, the detection method of the present invention may be performed on all substances in which the pathogenic microorganism Campylobacter coli is found, and preferably may be performed on food or feed. For example, a sample suspected to be contaminated with Campylobacter coli is collected, suspended in sterile water or physiological saline, treated with Proteinase K, recovered pellets, and then extracted with hot water for PCR reaction. Prepare the necessary sample, and perform PCR. PCR results are performed by conventional PCR detection means, such as electrophoresis. The hot water extraction is a conventional DNA separation method, for example, the pellet is suspended with sterile water, and a mixture of phenol / chloroform (1: 1) is treated therewith to obtain a supernatant, and ethanol is added to the supernatant, followed by centrifugation. It is a method of obtaining a DNA pellet. The specific reaction conditions and time are as usual.
일 구현예에서, 상기 중합효소연쇄반응은 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏 또는 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법으로 수행될 수 있다.In one embodiment, the polymerase chain reaction is real-time RT-PCR (Real-time RT-PCR), reverse transcriptase chain reaction, competitive polymerase chain reaction (Competitive RT-PCR), nuclease protection analysis (RNase, S1 nuclease assay), in situ hybridization, nucleic acid microarray, Northern blot, or DNA chip.
일 구현예에서, 상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우에, 상기 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 확인하거나 그 염기서열을 분석하여 캠필로박터 콜라이 균주의 존재 여부를 확인하는 단계는 형광정도, 즉, 형광공명에너지이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 측정하는 방법으로 수행할 수 있으며, 추가로 증폭된 DNA 산물의 이중나선이 분리되는 온도(melting temperature)를 확인하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.In one embodiment, in the case where the polymerase chain reaction is a real-time polymerase chain reaction, checking the size of the polymerase chain reaction product or analyzing the base sequence thereof to determine whether a Campylobacter coli strain is present is fluorescent Degree, that is, it can be performed by a method of measuring fluorescence resonance energy transfer (fluorescence resonance energy transfer, FRET), further comprising the step of determining the temperature (melting temperature) of the double helix is separated from the amplified DNA product It can be done in a way.
일 구현예에서, 상기 중합효소연쇄반응이 컨벤셔널 중합효소연쇄반응인 경우에, 상기 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 확인하거나 그 염기서열을 분석하여 캠필로박터 콜라이 균주의 존재 여부를 확인하는 단계는 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 상기 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.In one embodiment, in the case where the polymerase chain reaction is a conventional polymerase chain reaction, checking the size of the polymerase chain reaction product or analyzing the base sequence thereof to determine whether a Campylobacter coli strain exists The amplified DNA product may be electrophoresed to determine the size of the amplified DNA product.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다. The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only intended to materialize the contents of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
실시예 1. 캠필로박터 콜라이(Example 1. Campylobacter coli ( Campylobacter coliCampylobacter coli ) 특이적 프라이머 제작) Production of specific primers
캠필로박터 콜라이에만 특이적으로 존재하는 유전자인 ceuE(Accession No. KF541298.1)에 대한 프라이머 세트 (표 1, 서열번호 1 및 2)를 제작하였으며, Taqman™ Real-time PCR 방법에서 함께 사용될 프로브 (표 1, 서열번호 3)를 제작하였다.A primer set (Table 1, SEQ ID NOs: 1 and 2) was prepared for ceuE (Accession No. KF541298.1), a gene specific only to Campylobacter coli, and a probe to be used together in Taqman ™ Real-time PCR method ( Table 1, SEQ ID NO: 3) was prepared.
실험예 1. 정확성 검증Experimental Example 1. Accuracy Verification
종래에 다른 균주까지 검출되었던 Singleplex Real-time PCR 키트에 상기 실시예 1에서 제작한 프라이머를 적용한 경우 정확히 캠필로박터 콜라이 균주만 특이적으로 검출하는지 확인하기 위하여, 캠필로박터 콜라이 균주 또는 하기 표 2의 균주들의 혼합물에서 conventional PCR을 이용하여 Crosscheck PCR 검증을 수행하였다. When applying the primer prepared in Example 1 to the Singleplex Real-time PCR kit that has been conventionally detected to other strains, in order to confirm that only the specific strain of Campylobacter coli is specifically detected, a mixture of Campylobacter coli strains or strains of Table 2 below Crosscheck PCR verification was performed using conventional PCR.
그 결과, 특이적으로 캠필로박터 콜라이 균주에서만 102bp의 밴드가 검출되었으며, 캠필로박터 콜라이 균주를 제외한 나머지 15종의 다른 균주들에서는 밴드가 검출되지 않아, 본 발명의 프라이머 세트는 캠필로박터 콜라이 균주만을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다 (도 1).As a result, specifically, a band of 102 bp was detected only in the Campylobacter coli strain, and the band was not detected in the other 15 strains other than the Campylobacter coli strain, so the primer set of the present invention specifically detected only the Campylobacter coli strain It was found that it was possible (Fig. 1).
실험예 2. 민감성 검증Experimental Example 2. Sensitivity Verification
민감도가 낮아 샘플에서 균주의 검출이 어려웠던 종래의 Real-time PCR 키트들을 고려하여 본 발명의 프라이머 세트의 민감도를 확인하였다. 구체적으로, 100 ng/㎕의 DNA 양을 기준으로 연속 희석(Serial dilution) 실험을 진행하여 DNA 주형이 몇 ng 농도까지 검출되는지 확인하였다.The sensitivity of the primer set of the present invention was confirmed by considering conventional Real-time PCR kits in which it was difficult to detect a strain in a sample due to low sensitivity. Specifically, a serial dilution experiment was performed based on the amount of DNA of 100 ng / µl to determine how many ng concentrations of the DNA template were detected.
그 결과, 본 발명의 프라이머 세트는 10 pg/㎕의 아주 극소량의 DNA만 존재해도 캠필로박터 콜라이 균주의 검출이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 2).As a result, it was confirmed that the primer set of the present invention can detect the Campylobacter coli strain even if only a very small amount of DNA of 10 pg / µl is present (FIG. 2).
실험예 3. 활성도 검증Experimental Example 3. Activity Verification
캠필로박터 콜라이 균주의 glyA 유전자를 표적으로 하는 Real-time PCR 키트 (A사)와 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 Real-time PCR 키트의 활성을 비교 분석하였다.The activity of the Real-time PCR kit (A company) targeting the glyA gene of the Campylobacter coli strain and the Real-time PCR kit using the primer set of the present invention was compared and analyzed.
그 결과, 종래의 Real-time PCR 키트를 이용한 경우보다 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 경우에 현저히 활성도가 높은 것으로 나타나 (도 3), 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 더 빠르고 정확하게 캠필로박터 콜라이를 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. As a result, it was found that the activity of the primer set of the present invention was significantly higher than that of the conventional real-time PCR kit (FIG. 3), and the primer set of the present invention was used to detect Campylobacter coli more quickly and accurately. Was confirmed.
실험예 4. 양성 대조군 DNA 검증Experimental Example 4. Positive control DNA verification
식품 샘플 내에 존재하는 병원성 균주를 검출하기 위해서는 DNA 정제과정이 필요하나, 이 과정에서 DNA의 오염에 의해 정확한 실험 결과가 나오지 않을 수 있으므로, 식품 샘플 내의 병원균을 검출하기 위한 DNA 정제 과정을 모니터링하기 위한 양성 대조군으로서 캠필로박터 콜라이를 이용할 수 있는지 확인하고자, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 현재 시중에 가장 많이 사용되고 있는 Real-time PCR 장비인 ABI 7500 또는 Bio-rad CFX connect로 real-time PCR을 수행하였다. In order to detect the pathogenic strain present in the food sample, a DNA purification process is required, but since an accurate experimental result may not be generated due to the contamination of the DNA in this process, the DNA purification process for detecting the pathogen in the food sample may be monitored. In order to confirm whether Campylobacter coli can be used as a positive control, real-time PCR was performed with
그 결과, 본 발명의 프라이머 세트는 ABI 7500 및 Bio-Rad CFX Connect 모두에서 캠필로박터 콜라이 균주를 정확히 검출할 수 있었다 (도 4 및 5). 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트가 현재 시중에 가장 많이 사용되고 있는 Real-time PCR 장비인 ABI 7500과 Bio-Rad CFX Connect에서 동시에 호환 가능하며, 이를 식품 샘플에서 균주를 검출하기 위한 실험의 양성 대조군으로 이용할 수 있음을 알 수 있었다.As a result, the primer set of the present invention was able to accurately detect Campylobacter coli strains in both
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Development of a Singleplex Real-Time PCR Kit for Rapid Detection of Campylobacter coli ceuE target gene <130> PN1810-399 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Campylobacter coli ceuE forward primer <400> 1 ctgaatttat actagaaaaa aatcctg 27 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Campylobacter coli ceuE reverse primer <400> 2 gttgctttat caagtatgcc t 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ceuE probe <400> 3 tgtgcgcgtt ctttattgcc caca 24 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION <120> Development of a Singleplex Real-Time PCR Kit for Rapid Detection of Campylobacter coli ceuE target gene <130> PN1810-399 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Campylobacter coli ceuE forward primer <400> 1 ctgaatttat actagaaaaa aatcctg 27 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Campylobacter coli ceuE reverse primer <400> 2 gttgctttat caagtatgcc t 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ceuE probe <400> 3 tgtgcgcgtt ctttattgcc caca 24
Claims (14)
상기 중합효소연쇄반응 산물의 크기를 확인하거나 그 염기서열을 분석하여 캠필로박터 콜라이 균주의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 캠필로박터 콜라이 균주의 검출방법.Performing a polymerase chain reaction on the target sample using the primer set of claim 1; And
A method of detecting a Campylobacter coli strain, comprising checking the size of the polymerase chain reaction product or analyzing its base sequence to determine whether a Campylobacter coli strain is present.
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| KR1020180144882A KR20200059766A (en) | 2018-11-21 | 2018-11-21 | Development of a Singleplex Real-Time PCR Kit for Rapid Detection of Campylobacter coli ceuE target gene |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220059989A (en) | 2020-11-02 | 2022-05-11 | 주식회사 세니젠 | Real-time PCR kit for specific detection of Campylobacter |
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2018
- 2018-11-21 KR KR1020180144882A patent/KR20200059766A/en not_active Application Discontinuation
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|---|---|---|---|---|
| KR20220059989A (en) | 2020-11-02 | 2022-05-11 | 주식회사 세니젠 | Real-time PCR kit for specific detection of Campylobacter |
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