JP5230224B2 - 新規冷凍耐性パン酵母 - Google Patents
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Description
冷凍耐性パン酵母とは、一般に冷凍による傷害を受けにくいパン酵母のことを言う。本発明における冷凍耐性とは、[1]ドライアイス・エタノールバスなどによる−80℃での急速冷凍−解凍後の菌体生存率(冷凍耐性度)が、液系評価法で対照となる非破壊株と比較して20%以上高い場合を冷凍耐性、同様に20%以上低い場合を冷凍感受性、或いは、[2]1週間冷凍−解凍後の生地のガス残存率(冷凍耐性度)が、生地系評価法で対照となる非高発現株と比較して20%以上高い場合を冷凍耐性、同様に20%以上低い場合を冷凍感受性とする。ここで液系評価法とは、スクリーニングした遺伝子破壊株について、YPD寒天培地上に生育したコロニー数をカウントすることにより冷凍後の生存率を測定する方法である。詳細には、YPD培地に適量の菌体を植菌して一晩前培養した後、培養液を新しいYPD培地に植菌し、一晩本培養した後、培養液をマイクロチューブ2本に分注し、1本は滅菌水で適宜希釈して、YPD寒天培地に塗布し、もう1本はドライアイス・エタノールバスで冷却後、冷凍庫で冷凍保存する。1日冷凍後、解凍した培養液サンプルを、滅菌水で適宜希釈して、YPD寒天培地に塗布し、冷凍前及び冷凍後のサンプルを塗布した寒天培地に生育したコロニーをカウントし、冷凍後の菌体生存率(冷凍後サンプルのコロニー数/冷凍前サンプルのコロニー数)を指標として冷凍耐性の評価を行う。上記のような液系生存率による評価法では、実用機能レベルの発酵力を持たない株でも冷凍耐性を評価できるので、遺伝子破壊株ライブラリーから実用パン酵母まで、様々な菌株の冷凍耐性評価に有効に用いることができる。
実用株(実用パン酵母)の形質転換を実施するに当たり、遺伝子導入の成否を判定するための選択マーカーが必要となる。実用パン酵母にウラシル要求性を賦与するには、菌体を5−FOA(5-フルオロオロチン酸)寒天培地に塗布し、30℃で培養し、生育したコロニーを選抜すればよい。
KTR1遺伝子及びMNT3遺伝子の少なくとも一つを高発現させるには、該遺伝子を含む多コピー型プラスミドで酵母を形質転換するか、該遺伝子を酵母で効率良く機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えDNAを用いて酵母を形質転換するか、あるいは酵母で効率良く機能する他のプロモーター配列を、染色体DNA上の該遺伝子のプロモーター配列と置換、或いは該遺伝子の上流側に挿入すればよい。また、KTR1及び/又はMNT3遺伝子をより活性の高いものと置換してもよい。
酵母では、各遺伝子の発現量は、様々なストレスを与えることにより変化することが知られている。例えば、浸透圧ストレス下では、細胞内の浸透圧を高めるために、グリセロール合成に関わる遺伝子の発現量が増加する。同様に、冷凍ストレス環境下では、冷凍ストレス緩和に関わる遺伝子の発現量が増加していると考えられる。従って、冷凍耐性遺伝子を高発現することにより、酵母の冷凍耐性を向上させることが可能であると推察される。ここで、本発明において遺伝子高発現とは、遺伝子発現量が元株の5倍以上、好ましくは10倍以上に増加した株を高発現株と定義する。遺伝子の発現量の比較は、転写されたmRNAの量又は翻訳されたタンパク質の量を比較することにより行うことができる。mRNAの検出を行うには、ノーザンブロット法、リアルタイムPCR等が用いられる。同様に、タンパク質の検出を行うには、ウェスタン解析を用いればよく、発現するタンパクに対する抗体を取得し、RIもしくは蛍光ラベルを比較できる系の使用が望ましい。
参考文献1:「酵母遺伝子実験マニュアル」 大矢禎一監訳 丸善
参考文献2:「バイオ実験イラストレイテッド 1 分子生物学実験の基礎」 中山広樹、西方敬人著 秀潤社
参考文献3:「バイオ実験イラストレイテッド 2 遺伝子解析の基礎」 中山広樹、西方敬人著 秀潤社
参考文献4:「バイオ実験イラストレイテッド 3 本当にふえるPCR」 中山広樹著 秀潤社
参考文献5:「バイオマニュアルシリーズ10 酵母による遺伝子実験法」 山本正幸編、羊土社
遺伝子破壊株ライブラリーを、YPD培地を用いてマイクロプレートで静置培養し、培養液をドライアイス・エタノールバスにより5分間冷却後、−80℃の冷凍庫で1日冷凍保存した。冷凍前後の培養液を適宜希釈して、それぞれYPD寒天培地にスポットし、増殖の様子を目視することにより、冷凍後の増殖が著しく低下した菌株を冷凍感受性株として一次スクリーニングした。一次スクリーニングした遺伝子破壊株については、改めて二次スクリーニングで冷凍後の生存率を測定した。YPD培地5mlに適量の菌体を植菌して30℃で一晩前培養した後、培養液50μlを新しいYPD培地5mlに植菌し、30℃で一晩本培養した。培養液を1mlずつ1.5mlマイクロチューブ2本に分注し、1本は滅菌水で適宜希釈して、YPD寒天培地に塗布した。もう1本は−80℃のドライアイス・エタノールバスで5分間冷却後、−80℃の冷凍庫で冷凍保存した。1日冷凍後、25℃で15分間静置して解凍した培養液サンプルを、滅菌水で適宜希釈して、YPD寒天培地に塗布した。冷凍前及び冷凍後のサンプルを塗布した寒天培地に生育したコロニーをカウントし、冷凍後の菌体生存率(冷凍後サンプルのコロニー数/冷凍前サンプルのコロニー数)を指標として冷凍耐性の評価を行った。図1に示すように、YOR099W、YIL014W、YBL090W、YKL126W、YDR119Wの何れか一つの遺伝子の破壊株は非破壊株と比べて冷凍後の生存率が20%以上低下していた。このことから、これら5つの遺伝子は、冷凍耐性に関連していることが示唆された。
高発現プロモーターを含むプラスミドのプロモーター部分、例えば市販のプラスミドpAUR123を制限酵素BamHIで切断して得られるADH1プロモーター及びADH1ターミネーターの配列部分(PADH1−TADH1)約1.0kbを、多コピー型のプラスミド、例えば市販のプラスミドpESC-URA(TOYOBO)を制限酵素PvuIIで切断して得られる配列約5.3kbと連結し、多コピー型高発現プラスミドpEUA約6.3kbを作製した(図2)。
配列番号5、6に示したプライマーを用いたPCRにより、配列番号2に示すサッカロミセス・セレビシエのMNT3遺伝子を取得し、MNT3遺伝子の5’末端に付加したKpnIと3’末端に付加したSalIの両制限酵素切断部位の間約1.9kbを、pEUAの同制限酵素KpnI、SalI切断部位に挿入する以外は実施例2と同様にして、MNT3遺伝子高発現プラスミドpEUAM1約8.2kbを作製した(図4)。
ウラシル要求性実用パン酵母は、以下のようにして作製した。二倍体実用パン酵母をYPD寒天培地に塗布し、紫外線を30秒間照射後、30℃で1日培養した。生育した菌体をレプリカ法により5−FOA寒天培地に移しとり、30℃で3〜4日培養し、生育したコロニーを選抜することにより取得した。ウラシル要求性が賦与(URA3欠損変異)されたことは、ウラシル要求性を相補、すなわちURA3を含有するプラスミドYCp50を用いて形質転換することにより、ウラシルを含有しないカザミノ酸培地で生育できるようになることで確認した。また、要求性の相補株では、野生型の二倍体実用パン酵母と同等の増殖性、発酵力を持つことも確認した。
実施例2で作製したプラスミドと実施例4で作製した宿主を用いて、酢酸リチウム法に準ずる方法によりKTR1高発現プラスミド(pEUAK1)で形質転換したGMKY79株と、非高発現プラスミド(pEUA)で形質転換したGMKY78株を作製した。
実施例3で作製したプラスミドと実施例4で作製した宿主を用いて、酢酸リチウム法に準ずる方法によりMNT3高発現プラスミド(pEUAM1)で形質転換したGMKY80株を作製した。プラスミドの導入の確認およびtotal RNAの抽出は、実施例5と同様にして行った。
実施例5で作製したKTR1遺伝子高発現実用パン酵母は、表1の培地を用いて坂口フラスコで培養した。得られたそれぞれの培養酵母を吸引ろ過して、水分含量約70%の固体状にした。これを表2の配合でパン生地に加えて混捏した。
実施例6で作製したMNT3遺伝子高発現実用パン酵母を用いた以外は、実施例7と同様にして固体状の培養酵母を得、冷凍耐性度を算出した。その結果は、表3及び図6に示す。
Claims (7)
- 配列番号1に示すサッカロミセス・セレビシエのKTR1遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び/又は、配列番号2に示すサッカロミセス・セレビシエのMNT3遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換させてなるパン酵母を用いて製造された冷凍パン生地。
- パン酵母が、サッカロミセス・セレビシエに属するGMKY79株(受託番号:NITE P−436)である請求項1に記載の冷凍パン生地。
- パン酵母が、サッカロミセス・セレビシエに属するGMKY80株(受託番号:NITE P−437)である請求項1に記載の冷凍パン生地。
- 請求項1〜3のいずれかに記載に記載の冷凍パン生地を焼成してなるパン。
- 配列番号1に示すサッカロミセス・セレビシエのKTR1遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び/又は、配列番号2に示すサッカロミセス・セレビシエのMNT3遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換させてなるパン酵母を含むパン生地を冷凍した後、焼成することを特徴とする製パン方法。
- 配列番号1に示すサッカロミセス・セレビシエのKTR1遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び/又は、配列番号2に示すサッカロミセス・セレビシエのMNT3遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換することを特徴とするパン酵母の冷凍耐性を向上させる方法。
- 配列番号1に示すサッカロミセス・セレビシエのKTR1遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び/又は、配列番号2に示すサッカロミセス・セレビシエのMNT3遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換させてなるパン酵母を用いてパン生地を作製することを特徴とするパン生地の冷凍耐性を向上させる方法。
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