JP5226353B2 - 形質転換酵母、それを用いた分析方法および分析キット - Google Patents
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Description
前記動物核内受容体が、RXRα核内受容体と二量体を形成する、RXRαヘテロ二量体型核内受容体であり、
前記動物核内受容体遺伝子として、RXRα核内受容体遺伝子およびRXRαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を発現可能に含み、
前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するRNA不安定化配列を含む。
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、本発明の形質転換酵母を使用することを特徴とする。
(a)培地と、
(b)本発明の形質転換酵母と、
(c)発色基質と
を備える。
前記動物核内受容体遺伝子として、RXRα核内受容体遺伝子およびRXRαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するRNA不安定化配列を含む。
したがって、本発明の形質転換酵母を用いれば、RXRαへテロ二量体型動物核内受容体リガンドを、簡単な操作により、低コスト、短時間かつ高感度で分析可能である。また、本発明の分析キットを用いれば、さらに簡便に、RXRαへテロ二量体型動物核内受容体リガンドの分析を実施可能である。
(2)TRβ:Thyroid Hormone Receptor beta
(3)RARα:Retinoic Acid Receptor alpha
(4)RARβ:Retinoic Acid Receptor beta
(5)RARγ:Retinoic Acid Receptor gamma
(6)PPARα:Peroxisome proliferator activated receptor alpha(PPAR−alpha)
(7)PPARδ:Peroxisome proliferator activated receptor delta(PPAR−delta、PPAR−beta、Nuclear hormone receptor 1、NUC1)
(8)PPARγ1:Peroxisome proliferator activated receptor gamma 1(PPAR−gamma1)
(9)PPARγ2:Peroxisome proliferator activated receptor gamma 2(PPAR−gamma2)
(10)LXRβ:Oxysterols receptor LXR−beta (Liver X receptor beta、Nuclear orphan receptor LXR−beta、Ubiquitously−expressed nuclear receptor、Nuclear receptor NER)
(11)LXRα:Oxysterols receptor LXR−alpha(Liver X receptor alpha、Nuclear orphan receptor LXR−alpha)
(12)VDR:Vitamin D3 receptor(VDR、1,25−dihydroxyvitamin D3 receptor)
(13)PXR−1:Orphan nuclear receptor PXR−1(Pregnane X receptor−1、Orphan nuclear receptor PAR−1、Steroid and xenobiotic receptor−1、SXR−1)
(14)PXR−2:Orphan nuclear receptor PXR−2(Pregnane X receptor−2、Orphan nuclear receptor PAR−2、Steroid and xenobiotic receptor−2、SXR−2)
(15)CAR:Orphan nuclear receptor NR1I3(Constitutive androstane receptor、CAR、Orphan nuclear receptor MB67)
(16)COUP−TF I:COUP transcription factor 1(COUP−TF1、COUP−TFα、V−erbA related protein EAR−3)
(17)COUP−TF II:COUP transcription factor 2(COUP−TF2、COUP−TFβ、Apolipoprotein AI regulatory protein−1、ARP−1)
(18)ERRα:Steroid hormone receptor ERR1(Estrogen−related receptor, alpha、ERR−alpha、Estrogen receptor−like 1)
(19)ERRβ:Steroid hormone receptor ERR2(Estrogen−related receptor,beta、ERR−beta、Estrogen receptor−like 2、ERR beta−2)
(20)ERRγ:Estrogen−related receptor gamma(Estrogen receptor related protein 3、ERR gamma−2)
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)配列番号1に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトPXRとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(c)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(d)配列番号2に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトVDRとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(e)配列番号3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(f)配列番号3に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトRXRαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(g)配列番号4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(h)配列番号4に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトRXRαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(i)配列番号5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(j)配列番号5に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトSRC1として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(k)配列番号6に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(l)配列番号6に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、RNA不安定化配列として機能するポリヌクレオチド。
(m)配列番号7に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(n)配列番号7に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ターミネーター配列として機能するポリヌクレオチド。
(o)配列番号8に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(p)配列番号8に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ターミネーター配列として機能するポリヌクレオチド。
成分 配合量
ドロップアウトパウダー (注1) 1.3g
窒素源(Yeast nitrogen base、注2) 1.7g
(NH4)2SO4 5.0g
炭素源(グルコースまたはガラクトース) 20.0g
水 1000mL
(注1)ドロップアウトパウダー組成
成分 配合量 成分 配合量
アデニン 2.5g L−メチオニン 1.2g
L−アルギニン 1.2g L−フェニルアラニン 3.0g
L−アスパラギン酸 6.0g L−セリン 22.5g
L−グルタミン酸 6.0g L−スレオニン 12.0g
L−ヒスチジン 1.2g L−チロシン 1.8g
L−リジン 1.8g L−バリン 9.0g
ウラシル 1.2g
(注2)窒素源:Yeast Nitrogen W/O Amino Acid &
Ammonium Sulfate (Difco社製)
成分 配合量(最終濃度)
Na2HPO4 60mM
NaH2SO4 40mM
MgCl2 1mM
KCl 10mM
ジチオスレイトール(Dithiothreitol) 2mM
サルコシル(注3) 0.20%
(注3)N−Lauroylsarcosine sodium salt
本例では、下記の手順によりヒトPXR遺伝子、ヒトRXRα遺伝子、RNA不安定化配列および酵母cyc1遺伝子のターミネーター配列を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
まず、酵母チトクロームC遺伝子のプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミド(pYT−β;BioTechniques(1996)20、568−574)を準備した。一方、PXRの応答配列であるDR−3を含む、下記のリン酸化合成オリゴDNA(配列番号9)およびその相補鎖DNA(配列番号10)を作製した。作製したこれらのオリゴDNAを、94℃で1分間を1サイクルでアニーリングした。アニーリング後、DR−3が1個アニーリングしたものを精製して、前記プラスミドpYT−βのSpeIサイトに挿入した。DR−3が1個挿入されたプラスミドをpYT−β−DR3×1とした。
DR3Nh:5´−ctagcagatgaactttatgaactgttt−3´(配列番号9)
DR3Xb:5´−ctagaaacagttcataaagttcatctg−3´(配列番号10)
まず、酵母ura3遺伝子、gal1/gal10双方向性プロモーターを有するプラスミドpUdp3を準備した。前記gal1/gal10双方向性プロモーターは、プラスミドYEpLacから、BamHIサイトとSmaIサイトで切り出した。プラスミドpUC19のEcoRIサイトに、前記酵母ura3遺伝子を挿入後、BamHIサイトとSmaIサイトの間に前記gal1/gal10双方向性プロモーターを挿入し、前記プラスミドpUdp3を得た。つぎに、前記プラスミドpUdp3に、酵母cyc1遺伝子のターミネーター配列を挿入したプラスミドpUdp5を作製した。前記酵母cyc1遺伝子のターミネーター配列は、酵母W303aより抽出したゲノムDNAよりPCR法にて増幅した。用いたプライマー(配列番号11および12)およびPCRの条件を以下に示す。
PolAfHd:5´−tatgtcaagcttacattcacgccctc−3´(配列番号11)
PolArBs:5´−cttctcaagctaggtcttcagtataatg−3´(配列番号12)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、各プライマー各0.3μM、ゲノムDNA 0.5μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、54℃で20秒、68℃で30秒のサイクルを35サイクル実施した。
HOup:5´−agcttgtatattagtttaaaaagttgtatgtaat−3´(配列番号13)
HOdn:5´−agctattacatacaactttttaaactaatataca−3´(配列番号14)
ヒトPXRおよびRXRαの各cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)を、ヒト肝がん細胞HepG2から抽出したmRNAを用いて、RT−PCR法により増幅した。用いたプライマー(配列番号15〜18)及びPCRの条件を以下に示す。
PXRfRbSp:5´−ttccaactagtaaaacatggaggtgagacccaaag−3´(配列番号15)
PXRrHd:5´−ccttcaagcttctcagctacctgtgatgccgaac−3´(配列番号16)
RXRaRbKpnF:5´−aaaggggtacctcaaaaatggacaccaaacatttcctgcc−3´(配列番号17)
RXRaEcr:5´−cttaagaattctaagtcatttggtgcggc−3´(配列番号18)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、プライマー各0.3μM、cDNA 1μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、58℃で20秒、68℃で3分のサイクルを40サイクル実施した。
挿入したcDNA cDNA切断用制限酵素 プラスミド切断用制限酵素
PXR SpeI、HindIII XbaI、HindIII
RXRα KpnI、EcoRI KpnI、EcoRI
SRC1cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)を、ヒト精巣cDNA(クロンテック社製)よりPCR法を用いて増幅した。用いたプライマー(配列番号19および20)及びPCRの条件を以下に示す。
hSRC1xhR:5´−gagcattcctctagtctgtagtc−3´(配列番号20)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、プライマー各0.3μM、cDNA 1μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、56℃で20秒、68℃で5分のサイクルを40サイクル実施した。
SRC−1eRxh2:5´−agggccctcgagactctagtctgtag−3´(配列番号22)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、プライマー各0.3μM、PCR産物(cDNA) 1μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、56℃で20秒、68℃で5分のサイクルを20サイクル実施した。
まず、酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303a株に、塩化リチウム法にて、前記pYT−β−DR3×1プラスミド DNAを導入した。このときの形質転換酵母選択培地は、後述する前培養培地にロイシンを100mg添加したものである。
本例の形質転換酵母について、PXRのmRNA量を測定した。
まず、本例の形質転換酵母を、下記組成の前培養用の培地にて18時間前培養を行った。培養の結果、濁度(Abs595nm)が1.0程度に形質転換酵母が増殖した。
成分 配合量
ドロップアウトパウダー(前記注1) 1.3g
窒素源(Yeast nitrogen base、前記注2) 1.7g
(NH4)2SO4 5.0g
グルコース 20.0g
水 1L
つぎに、96穴プレートを用い、1ウェルあたり以下の構成で、リガンド溶液、前培養した菌体液および本培養用培地を混合し、30℃で18時間、静置培養を行った。
菌体液(O.D.1〜1.5):5μL
本培養用培地:下記組成の培地100μL
成分 配合量
ドロップアウトパウダー(前記注1) 1.3g
窒素源(Yeast nitrogen base、前記注2) 1.7g
(NH4)2SO4 5.0g
グルコース 2.0g
ガラクトース 18.0g
水 1L
さらに、前記本培養後の形質転換酵母を、遠心して集菌後、ソルビトールバッファー(1M ソルビトール、0.1M EDTA)に懸濁し、30℃で30分振とうした。振とうした菌体は、再度遠心して集菌後、RNeasy mini kit(Quiagen社製)を用いて、トータルRNA(total RNA)を抽出した。前記トータルRNAの抽出操作は、キット添付の操作書に従って行った。抽出したトータルRNAを用いて、cDNAを合成した。前記cDNAの合成は、以下の条件で行った。
5mM DTT、0.5mM dNTP、RNase inhibitor 20unit、2.5μM oligo−dT primer(oligo−dT、タカラバイオ社製)または random 6mer(Rd6、タカラバイオ社製)、SuperScriptIII RT(Invitrogen社)200unit、2μg yeast total RNAを反応液20μL中に含む。
25℃で10分、50℃で30分、55℃で30分の条件で反応させた。
PXRrHd2: 5′−ttctcagctacctgtgatgccgaac−3′(配列番号24)
1×CYBR Premix Ex Taq(TAKARA社製)、プライマー各0.5μM、1μL cDNA(またはスタンダードとしてプラスミドDNA)を反応液25μL中に含む。
94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30分のサイクルを45サイクル実施した。
mRNA定量における検量線作成用のスタンダードとして、プラスミドpUdp3PXR/RXRαを作製した。前記プラスミドpUdp3PXR/RXRαは、前記プラスミドpUdp8に代えて、前記プラスミドpUdp3を用いたこと以外は、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαと同様にして作製した。前記プラスミドpUdp3PXR/RXRα DNAは、1pg/mL〜1μg/mLの濃度に希釈した。得られたcDNAサンプルおよび前記スタンダードについて、同時に、リアルタイムPCRによる測定を行った。
本例の形質転換酵母について、リガンドへの応答性を測定した。
本例の形質転換酵母は、前述と同様に、前培養および本培養を行った。
前記本培養の後、各ウェルから培養液を5μLずつ採取し、新たな96穴プレートの各ウェルに移し、下記組成の測定試薬を100μL加えた後、37℃で30分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、前記反応液のβ−ガラクトシダーゼ活性および菌体量を測定した。前記β−ガラクトシダーゼ活性は、o−ニトロフェノールの生成量から算出するため、405nmにおける反応液の吸光度を測定した。また、前記菌体量は、620nmにおける吸光度を測定した。分析結果は、405nmの吸光度/620nmの吸光度の比を算出し、リガンド非添加(溶媒である10mM DMSOのみを添加)での値を1とした誘導率で示した。
成分 配合量(最終濃度)
Na2HPO4(注4) 60mM
NaH2SO4(注4) 40mM
MgSO4 1mM
KCl 10mM
ジチオスレイトール(Dithiothreitol) 2mM
サルコシル(前記注3) 0.40w/v%
ONPG(o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド) 1mg/mL
(注4)Na2HPO4およびNaH2SO4を混合後、pH7.5に調整
(1)レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、前記酵母cyc1遺伝子のターミネーター配列および前記RNA不安定化配列を含まない、前記プラスミドpUdp3を用いた。前記プラスミドpUdp3は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドpUdp3PXR/RXRαを用いた。
本例の形質転換酵母において、SRC1プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαに代えて、前記プラスミドpUdp3PXR/RXRαを用いたこと以外は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母における、PXRのmRNA量測定は、実施例1と同様にして行った。
本例の形質転換酵母について、実施例1と同様に、リガンド応答性を測定した。
(1)レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、前記RNA不安定化配列を含まず、かつ前記酵母cyc1遺伝子のターミネーター配列に代えて、酵母ADH遺伝子のターミネーター配列を挿入した、プラスミドpUdp4を用いた。前記酵母ADH遺伝子のターミネーター配列の挿入は、以下のように行った。
scADH3UTRfEc:5´−ctaaataagcgaattccttatgatttatg−3´(配列番号25)
scADH3UTRrMf:5´−tgcaggcaattgctcggcatgccggtag−3´(配列番号26)
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドは、前記プラスミドpUdp8に代えて、前記プラスミドpUdp4を用いたこと以外は、実施例1と同様にして作製した。前記プラスミドpUdp4を用いて作製した本例の動物核内受容体発現プラスミドを、プラスミドpUdp4PXR/RXRαとした。
本例の形質転換酵母において、SRC1プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαに代えて、前記プラスミドpUdp4PXR/RXRαを用いたこと以外は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、PXRのmRNA量測定は、実施例1と同様にして行った。
本例の形質転換酵母について、実施例1と同様に、リガンドへの応答性を測定した。
(1)レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、前記RNA不安定化配列を含まない、前記プラスミドpUdp5を用いた。前記プラスミドpUdp5は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドは、前記プラスミドpUdp8に代えて、前記プラスミドpUdp5を用いたこと以外は、実施例1と同様にして作製した。前記プラスミドpUdp5を用いて作製した本例の動物核内受容体発現プラスミドを、プラスミドpUdp5PXR/RXRαとした。
本例の形質転換酵母において、SRC1プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαに代えて、前記プラスミドpUdp5PXR/RXRαを用いたこと以外は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、PXRのmRNA量測定は、実施例1と同様にして行った。
本例の形質転換酵母について、実施例1と同様に、リガンド応答性を測定した。
(1)レポータープラスミドの作製
本例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドとしては、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαの、RXRαのC末端のHelix12を欠失させたプラスミドpUdp8PXR/RXRαTを用いた。前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαTは、以下のように作製した。
RXR443R: 5′−ggtgtcaatgggtgtctacccgatgagctt−3′(配列番号28)
0.25mM dNTP、3μL Quick solution、pfu ultra polymerase 10unit(以上Stratagene社製)、0.25μM 各プライマー、10ng プラスミドDNAを反応液50μL中に含む。
94℃で50秒、60℃で50秒、68℃で7分のサイクルを18サイクル実施した。
本例の形質転換酵母において、SRC1プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαに代えて、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαTを用いたこと以外は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母について、以下のようにしてリガンド応答性を測定した。
本例の形質転換酵母は、実施例1と同様にして、前培養を行った。
本例の形質転換酵母は、実施例1と同様にしてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。前記測定の結果を、下記表5、表6および図1に示す。表5は、前記リファンピシンをリガンドとして用いた測定結果であり、表6は、前記9−cisレチノイン酸をリガンドとして用いた測定結果である。図1において、横軸は、各リガンドの濃度(μM)であり、縦軸は、リガンド非添加での値を1とした誘導率である。
(1)レポータープラスミドの作製
本実施例の形質転換酵母において、レポータープラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本実施例の形質転換酵母において、発現量調整プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本実施例の形質転換酵母において、動物核内受容体発現プラスミドは、前記核内受容体遺伝子PXRに代えて、核内受容体遺伝子VDRを発現可能に導入したこと以外は、実施例2と同様に作製した。本実施例における前記動物核内受容体発現プラスミドを、プラスミドpUdp8VDR/RXRαTとした。前記プラスミドpUdp8VDR/RXRαTは、前記ヒトVDRの増幅および導入時に用いたプライマーおよび制限酵素以外は、実施例2と同様に作製した。以下に、前記用いたプライマー(配列番号29および30)および制限酵素を示す。
VDRfXb:5´−ctccttctagaatggaggcaatggcggccagcac−3´(配列番号29)
VDRrSp:5´−gctgtactagtcaggagatctcattgccaaacac−3´(配列番号30)
挿入したcDNA cDNA切断用制限酵素 プラスミド切断用制限酵素
VDR SpeI、XbaI XbaI
本実施例の形質転換酵母において、SRC1プラスミドは、実施例1と同様に作製した。
本実施例の形質転換酵母は、前記動物核内受容体発現プラスミドとして、前記プラスミドpUdp8PXR/RXRαに代えて、前記プラスミドpUdp8VDR/RXRαTを用いたこと以外は、実施例1と同様に作製した。
本例の形質転換酵母について、以下のようにしてリガンド応答性を測定した。
本例の形質転換酵母は、実施例1と同様にして、前培養を行った。
本例の形質転換酵母は、実施例1と同様に、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。前記測定の結果を、下記表7および図2に示す。図2において、横軸は、活性型ビタミンD3の濃度(μM)であり、縦軸は、リガンド非添加での値を1とした誘導率である。
Claims (22)
- 動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、
前記動物核内受容体が、RXRα核内受容体と二量体を形成する、RXRαヘテロ二量体型核内受容体であり、
前記動物核内受容体遺伝子として、RXRα核内受容体遺伝子およびRXRαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を発現可能に含み、
前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するRNA不安定化配列を含む形質転換酵母。 - 前記RNA不安定化配列が、前記RXRαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を調節するRNA不安定化配列である請求項1記載の形質転換酵母。
- 前記RXRα核内受容体が、C末端のHelix12領域を欠失させたRXRα核内受容体である請求項1または2に記載の形質転換酵母。
- さらに、ターミネーター配列を含む請求項1から3のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子である請求項1から4のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 前記ヒト転写共役因子遺伝子が、ヒトSRC1遺伝子である請求項5記載の形質転換酵母。
- 前記動物核内受容体遺伝子および前記RNA不安定化配列を常染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子を第1のプラスミドに有し、
前記動物転写共役因子遺伝子を第2のプラスミドに有し、
前記第1のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含む請求項1から6のいずれか一項に記載の形質転換酵母。 - 前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項1から7のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 前記形質転換酵母が、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である請求項1から8のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される請求項1から9のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、請求項1から10のいずれか一項に記載の形質転換酵母を使用することを特徴とする分析方法。 - 前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する請求項11記載の分析方法。
- 前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合が、0を超え60重量%以下の範囲である請求項12記載の分析方法。
- 前記形質転換酵母が、予め、グリセロール存在下で保存されていた酵母である請求項11から13のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母である請求項11から14のいずれか一項に記載の分析方法。
- 検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
(a)培地と、
(b)請求項1から10のいずれか一項に記載の形質転換酵母と、
(c)発色基質と
を備える分析キット。 - 前記培地が、グルコースおよびガラクトースを含む培地である請求項16記載の分析キット。
- 動物核内受容体遺伝子を含むベクターであって、
前記動物核内受容体遺伝子として、RXRα核内受容体遺伝子およびRXRαへテロ二量体型核内受容体遺伝子を含み、
さらに、前記動物核内受容体遺伝子の発現量を調節するRNA不安定化配列を含むベクター。 - 前記RNA不安定化配列が、前記RXRαへテロ二量体型核内受容体遺伝子の発現量を調節するRNA不安定化配列である請求項18記載のベクター。
- 前記RXRα核内受容体が、C末端のHelix12領域を欠失させたRXRα核内受容体である請求項18または19に記載のベクター。
- さらに、ターミネーター配列を含む請求項18から20のいずれか一項に記載のベクター。
- レポーター遺伝子を含むベクター、動物転写共役遺伝子を含むベクターおよび請求項18から21のいずれか一項に記載のベクターを含有するベクターセット。
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