JP2008263956A - 形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母である。図1のグラフに示すように、本発明の形質転換酵母を使用すれば、動物核内受容体のリガンドを高感度で分析可能である。前記転写共役因子としては、例えば、ヒトSRC1が使用でき、前記レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を使用できる。
【選択図】 図1
Description
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、前記本発明の形質転換酵母を使用することを特徴とする。
(a)培地と、
(b)本発明の形質転換酵母と、
(c)発色基質と
を備える。
(2)TRβ:Thyroid Hormone Receptor beta
(3)RARα:Retinoic Acid Receptor alpha
(4)RARβ:Retinoic Acid Receptor beta
(5)RARγ:Retinoic Acid Receptor gamma
(6)PPARα:Peroxisome proliferator activated receptor alpha(PPAR−alpha)
(7)PPARδ:Peroxisome proliferator activated receptor delta(PPAR−delta、PPAR−beta、Nuclear hormone receptor 1、NUC1)
(8)PPARγ1:Peroxisome proliferator activated receptor gamma 1(PPAR−gamma1)
(9)PPARγ2:Peroxisome proliferator activated receptor gamma 2(PPAR−gamma2)
(10)Rev−erbα:Orphan nuclear receptor NR1D1(V−erbA related protein EAR−1、Rev−erbA−alpha)
(11)Rev−erbβ:Orphan nuclear receptor NR1D2(Rev−erb−beta、EAR−1R、Orphan nuclear hormone receptor BD73)
(12)RORα:Nuclear receptor ROR−alpha(Nuclear receptor RZR−alpha)
(13)RORβ:Nuclear receptor ROR−beta(Nuclear receptor RZR−beta)
(14)RORγ:Nuclear receptor ROR−gamma(Nuclear receptor RZR−gamma)
(15)LXRβ:Oxysterols receptor LXR−beta (Liver X receptor beta、Nuclear orphan receptor LXR−beta、Ubiquitously−expressed nuclear receptor、Nuclear receptor NER)
(16)LXRα:Oxysterols receptor LXR−alpha(Liver X receptor alpha、Nuclear orphan receptor LXR−alpha)
(16)FXR:Bile acid receptor(Farnesoid X−activated receptor、Farnesol receptor HRR−1、Retinoid X receptor−interacting protein 14、RXR−interacting protein 14)
(17)VDR:Vitamin D3 receptor(VDR、1,25−dihydroxyvitamin D3 receptor)
(18)PXR−1:Orphan nuclear receptor PXR−1(Pregnane X receptor−1、Orphan nuclear receptor PAR−1、Steroid and xenobiotic receptor−1、SXR−1)
(19)PXR−2:Orphan nuclear receptor PXR−2(Pregnane X receptor−2、Orphan nuclear receptor PAR−2、Steroid and xenobiotic receptor−2、SXR−2)
(20)CAR:Orphan nuclear receptor NR1I3(Constitutive androstane receptor、CAR、Orphan nuclear receptor MB67)
(21)HNF4α:Hepatocyte nuclear factor 4−alpha(HNF−4−alpha、Transcription factor 14)
(22)HNF4γ:Hepatocyte nuclear factor 4−gamma(HNF−4−gamma)
(23)RXRα:Retinoic acid receptor RXR−alpha
(24)RXRβ:Retinoic acid receptor RXR−beta
(25)RXRγ:Retinoic acid receptor RXR−gamma
(26)TR2:Nuclear Hormone Receptor TR2(Orphan nuclear receptor TR2)
(27)TR4:Orphan nuclear receptor TR4(Orphan nuclear receptor TAK1)
(28)TLX:Orphan nuclear receptor NR2E1(Nuclear receptor TLX、Tailless homolog、Tll、hTll)
(29)PNR:Photoreceptor−specific nuclear receptor(Retina−specific nuclear receptor)
(30)COUP−TF I:COUP transcription factor 1(COUP−TF1、COUP−TFα、V−erbA related protein EAR−3)
(31)COUP−TF II:COUP transcription factor 2(COUP−TF2、COUP−TFβ、Apolipoprotein AI regulatory protein−1、ARP−1)
(32)EAR−2:Orphan nuclear receptor EAR−2(V−erbA related protein EAR−2、COUP−TFγ)
(33)ERα:Estrogen receptor(ER、Estradiol receptor、ER−alpha)
(34)ERβ:Estrogen receptor beta(ER−beta)
(35)ERRα:Steroid hormone receptor ERR1(Estrogen−related receptor, alpha、ERR−alpha、Estrogen receptor−like 1)
(36)ERRβ:Steroid hormone receptor ERR2(Estrogen−related receptor,beta、ERR−beta、Estrogen receptor−like 2、ERR beta−2)
(37)ERRγ:Estrogen−related receptor gamma(Estrogen receptor related protein 3、ERR gamma−2)
(38)GRα:Glucocorticoid receptor alpha
(39)GRβ:Glucocorticoid Receptor beta
(40)MR:Mineralocorticoid receptor(MR)
(41)PRα:Progesterone receptor alpha
(42)PRβ:Progesterone receptor beta
(43)AR:Androgen receptor(Dihydrotestosterone receptor)
(44)NGFI−Bα:Orphan nuclear receptor HMR(Early response protein NAK1、TR3 orphan receptor)
(45)NGFI−Bβ:Orphan nuclear receptor NURR1(Immediate−early response protein NOT、Transcriptionally inducible nuclear receptor)
(46)NGFI−Bγ:Nuclear hormone receptor NOR−1(Neuron−derived orphan receptor 1、Mitogen induced nuclear orphan receptor)
(47)SF−1:Steroidogenic factor 1(STF−1、SF−1、Steroid hormone receptor AD4BP、Fushi tarazu factor homolog 1、FTZ−FIα)
(48)LRH−1:Orphan nuclear receptor NR5A2(Alpha−1−fetoprotein transcription factor、Hepatocytic transcription factor、B1−binding factor、hB1F、CYP7A promoter binding factor、FTZ−FIβ)
(49)GCNF:Germ cell nuclear factor(Orphan nuclear receptor NR6A1、Retinoid receptor−related testis specific receptor、RTR)
(50)DAX1:Orphan nuclear receptor DAX−1
(51)SHP:Small heterodimer partner(Orphan nuclear receptor SHP)
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)配列番号1に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトARとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(c)配列番号2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(d)配列番号2に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトGRとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(e)配列番号3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(f)配列番号3に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトRXRαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(g)配列番号4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(h)配列番号4に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトERβとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(i)配列番号5に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(j)配列番号5に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトTRαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(k)配列番号6に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(l)配列番号6に記載の塩基配列の少なくとも1つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトSRC1として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
成分 配合量
ドロップアウトパウダー (注1) 1.3g
窒素源(Yeast nitrogen base、注2) 1.7g
(NH4)2SO4 5.0g
炭素源(グルコースまたはガラクトース) 20.0g
水 1000mL
(注1)ドロップアウトパウダー組成
成分 配合量 成分 配合量
アデニン 2.5g L−メチオニン 1.2g
L−アルギニン 1.2g L−フェニルアラニン 3.0g
L−アスパラギン酸 6.0g L−セリン 22.5g
L−グルタミン酸 6.0g L−スレオニン 12.0g
L−ヒスチジン 1.2g L−チロシン 1.8g
L−リジン 1.8g L−バリン 9.0g
ウラシル 1.2g
(注2)窒素源
Yeast Nitrogen W/O Amino Acid & Ammonium Sulfate (Difco社製)
成分 配合量(最終濃度)
Na2HPO4 60mM
NaH2SO4 40mM
MgCl2 1mM
KCl 10mM
ジチオスレイトール(Dithiothreitol) 2mM
サルコシル(注3) 0.20%
(注3)N−Lauroylsarcosine sodium salt
酵母チトクロームC遺伝子のプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミド(pYT−β;BioTechniques(1996)20、568−574)を準備した。GRおよびARに応答する配列としてGREを使用し、RXRαに応答する配列としてDR1を使用し、ERβに応答する配列としてEREを使用し、TRαに応答する配列としてIR0を使用した。GRE、DR1、EREもしくはIR0を含む下記のリン酸化合成オリゴDNA(配列番号7、9、11および13)およびその相補鎖DNA(配列番号8、10、12および14)を作製した。これらのオリゴDNAをアニーリングした。アニーリングは、94℃で1分間を1サイクルで実施した。アニーリング後、GREは、pYT−βのBgl IIサイトに挿入した。DR1は、pYT−βのSpeIサイトに挿入した。EREは、pYT−βのSpeI−SalIサイトに挿入した。IR0は、pYT−βのSpeIサイトに挿入した。GREが連続して8個アニーリングしたものを精製して、pRW95−3のBgl IIサイトに挿入した。同様に、DR1が連続して4個アニーリングしたものを精製して、pRW95−3のSpeIサイトに挿入した。EREが1個アニーリングしたものを精製して、pRW95−3のSpeI−SalIサイトに挿入した。IR0が連続して5個アニーリングしたものを精製して、pRW95−3のSpeIサイトに挿入した。そして、GREが連続して8個挿入されたプラスミドをpYT−βGREcs8とし、DR1が4個挿入されたプラスミドをpYT−βDR1×4とし、EREが1個挿入されたプラスミドをpYT−βERE×1とし、IR0が5個挿入されたプラスミドをpYT−βIR0×5とした。
GREcsfBg:5´−gatctttgagaacaaactgttcttaaat−3´(配列番号7)
GREcsrBc:3´−aaactcttgtttgacaagaatttactag−5´(配列番号8)
RXRE−DR1Nh:5´−ctagcaggtcagaggtcagatgct−3´(配列番号9)
RXRE−DR1Xb:3´−gtccagtctccagtctacgagatc−5´(配列番号10)
ERE−SpeI:5´−ctagttagcaggtcacagtgacctacgcg−3´(配列番号11)
ERE−SalI:3´−aatcgtccagtgtcactggatgcgcagct−5´(配列番号12)
IR0XbaF:5´−ctagatctcaggtcatgacctttcatcca−3´(配列番号13)
IR0SpeR:3´−tagagtccagtactggaaagtaggtgatc−5´(配列番号14)
GR、AR、RXRα、ERβ、TRαの各cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)をヒト精巣cDNA(クロンテック社製)よりpolymerase chain reaction法(PCR法)にて増幅した。用いたプライマー(配列番号15〜24)及びPCRの条件を以下に示す。
GRfRbBm:5´−tcgaggatccaacaaaatggactccaaagaatcattaact−3´(配列番号15)
GRrXh:5´−attcttctcgaggcagtcacttttgatgaaac−3´(配列番号16)
ARfRbBm:5´−tcgaggatccaacaaaatggaagtgcagttagggctggg−3´(配列番号17)
ARrXh:5´−agggggctcgagctggggtggggaaatagg−3´(配列番号18)
RXRaRbKpnF:5´−aaaggggtacctcaaaaatggacaccaaacatttcctgcc−3´(配列番号19)
RXRaEcr:5´−cttaagaattctaagtcatttggtgcggc−3´(配列番号20)
ERbetafXb:5´−gcctcttctagaaaggtgttttctcagc−3´(配列番号21)
ERbetarHd:5´−acgcttaagcttgtgacctctgtgggcc−3´(配列番号22)
TRaRbSpF:5´−gggcactagtaacaaaatggaacagaagccaagca−3´(配列番号23)
TRaHdR:5´−ggccaagcttgctttagacttcctgatcctcaaag−3´(配列番号24)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、プライマー各0.3μM、cDNA 1μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、58℃で20秒、68℃で3分のサイクルを40サイクル実施した。
挿入したcDNA cDNA切断用制限酵素 YEpLac切断用制限酵素
GR BamHI、XhoI BamHI、SalI
AR BamHI、XhoI BamHI、SalI
RXRα KpnI、EcoRI KpnI、EcoRI
ERβ XbaI、HindIII XbaI、HindIII
TRα SpeI、HindIII XbaI、HindIII
SRC1cDNAのオープンリーディングフレーム(ORF)を、ヒト精巣cDNA(クロンテック社製)よりPCR法を用いて増幅した。用いたプライマー(配列番号25および26)及びPCRの条件を以下に示す。
hSRC1xhR:5´−gagcattcctctagtctgtagtc−3´(配列番号26)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、プライマー各0.3μM、cDNA 1μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、56℃で20秒、68℃で5分のサイクルを40サイクル実施した。
SRC−1eRxh2:5´−agggccctcgagactctagtctgtag−3´(配列番号28)
1μM MgSO4、0.2μM dNTP、プライマー各0.3μM、PCR産物(cDNA) 1μL、5% DMSO、KOD−Plus−(東洋紡社製)1unitを反応液50μL中に含む。
94℃で40秒、56℃で20秒、68℃で5分のサイクルを20サイクル実施した。
前記pAUR101GR、pAUR101AR、pAUR101RXRα、pAUR101ERβ、pAUR101TRαを、制限酵素EcoO65Iで処理して直鎖状とし、以下のように酢酸リチウム法にて宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体への組込みを行った。宿主株として、酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303a株を使用した。
前記形質転換酵母を、下記に示す前培養用の培地にて24時間前培養を行った。培養の結果、濁度(Abs595nm)が1.0程度に形質転換酵母が増殖した。
成分 配合量
ドロップアウトパウダー(前記注1) 1.3g
窒素源(Yeast nitrogen base、前記注2) 1.7g
(NH4)2SO4 5.0g
ウラシル 0.02g
グルコース 20.0g
水 1L
96穴プレートを用い、1ウエルあたり以下の構成で、リガンド溶液、前培養した菌体液および本培養培地を混合し、30℃で18時間、静置培養を行った。
菌体液(O.D.1〜1.5):5μL
本培養培地:下記組成の培地100μL
成分 配合量
ドロップアウトパウダー(前記注1) 1.3g
窒素源(Yeast nitrogen base、前記注2) 1.7g
(NH4)2SO4 5.0g
ウラシル 0.02g
グルコース 2.0g
ガラクトース 18.0g
水 1L
前記本培養の後、各ウエルから培養液を5μLずつ採取し、新たな96穴プレートの各ウエルに移し、下記の測定試薬を100μL加えた後、37℃で30分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、前記反応液のβ−ガラクトシダーゼ活性および菌体量を測定した。前記β−ガラクトシダーゼ活性は、o−ニトロフェノールの生成量から算出するため、405nmにおける反応液の吸光度を測定した。また、前記菌体量は、595nmにおける吸光度を測定した。分析結果は、405nmの吸光度/595nmの吸光度の比を算出し、リガンド非添加(溶媒であるDMSOのみを添加)での値を1とした誘導率で示した。これらの結果を、下記の表3、図1および図2に示す。図1において、(A)が、GR導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、(B)が、AR導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、(C)が、RXRα導入形質転換酵母の結果を示すグラフである。また、図2において、(D)が、ERβ導入形質転換酵母の結果を示すグラフであり、(E)が、TRα導入形質転換酵母の結果を示すグラフである。各グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度(log M)であり、縦軸は、前記誘導率である。また、各グラフにおいて、実線で示したSRC+は、SRC導入酵母の結果であり、点線で示したSRC−は、SRC非導入酵母の結果である。
成分 配合量(最終濃度)
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5、注4) 100mM
MgCl2 1mM
KCl 10mM
ジチオスレイトール(Dithiothreitol) 2mM
サルコシル(前記注3) 0.4%
ONPG 1mg/mL
(注4)60mM Na2HPO4および40mM NaH2SO4を用いて調製
Claims (14)
- 動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、前記動物核内受容体に直接結合して前記レポーター遺伝子の転写を活性化する動物転写共役因子遺伝子を発現可能に含む形質転換酵母。
- 前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体であり、前記動物転写共役因子がヒト転写共役因子である請求項1記載の形質転換酵母。
- 前記ヒト転写共役因子遺伝子が、ヒトSRC1遺伝子である請求項2記載の形質転換酵母。
- 前記動物核内受容体遺伝子を常染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子を第1のプラスミドに有し、
前記動物転写共役因子遺伝子を第2のプラスミドに有し、
前記第1のプラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた動物核内受容体応答配列を含む請求項1から3のいずれか一項に記載の形質転換酵母。 - 前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項1から4のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 前記形質転換酵母が、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である請求項1から5のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 検体に含まれる動物核内受容体リガンドの分析に使用される請求項1から6のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
- 検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、動物核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ動物核内受容体リガンドと動物核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを包含し、
前記形質転換酵母として、請求項1から7のいずれか一項に記載の形質転換酵母を使用することを特徴とする方法。 - 前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、前記培地が、炭素源としてガラクトースおよびグルコースを含有する請求項8記載の方法。
- 前記ガラクトースおよび前記グルコースの合計に対する前記グルコースの重量割合が、0を超え60重量%以下の範囲である請求項9記載の方法。
- 前記形質転換酵母が、予め、グリセロール存在下で保存されていた酵母である請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母である請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 検体に含まれる動物核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
(a)培地と、
(b)請求項1から7のいずれか一項に記載の形質転換酵母と、
(c)発色基質と
を備える分析キット。 - 前記培地が、グルコースおよびガラクトースを含む培地である請求項13記載の分析キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008051962A JP2008263956A (ja) | 2007-03-29 | 2008-03-03 | 形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キット |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007087649 | 2007-03-29 | ||
JP2008051962A JP2008263956A (ja) | 2007-03-29 | 2008-03-03 | 形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キット |
Publications (1)
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JP2008051962A Pending JP2008263956A (ja) | 2007-03-29 | 2008-03-03 | 形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キット |
Country Status (1)
Country | Link |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007060943A (ja) * | 2005-08-30 | 2007-03-15 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ahレセプター転写促進能増強細胞及びその利用 |
-
2008
- 2008-03-03 JP JP2008051962A patent/JP2008263956A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007060943A (ja) * | 2005-08-30 | 2007-03-15 | Sumitomo Chemical Co Ltd | Ahレセプター転写促進能増強細胞及びその利用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6013008769; 大気環境学会年会講演要旨集 vol.40, 1999, pp.90-93 * |
JPN6013033323; J. Mol. Endocrinol. vol.23, no.3, 1999, pp.255-275 * |
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