JP5183420B2 - マルトース結合タンパク質を使用した生理活性ポリペプチドの固定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＢＰ）をリンカーに使用して生理活性ポリペプチドを固体基質の疎水性表面に固定させる方法、および前記方法によって生理活性ポリペプチドが固定された生物活性固体基質に関するものである。

タンパク質の固定は、診断やバイオセンサーあるいは酵素反応器などのために非常に有用に使用されている。タンパク質の固定化方法では、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）のような架橋剤を使用した化学的架橋、疎水性結合を使用した物理的吸着、アミン反応性基を使用した化学的カップリングなどが知られている。このような方法の最大の問題点としては、固定させようとするタンパク質あるいはポリペプチドの活性を維持することにより化学的架橋やカップリングする方法では、新しい化学的結合が形成されたり標的タンパク質の化学的性質が変化したりすることによって活性が阻害され得ることがあり、物理的吸着方法では、標的タンパク質が直接疎水性表面に吸着される場合に、タンパク質構造の変化を伴って変性を誘発し得るという問題点がある。このような問題点を解決するために、固定させようとするポリペプチドにリンカーを結合させて、このリンカーを媒介にする固定化方法が報告されている（非特許文献１〜３）。リンカーを生理活性ポリペプチドに結合させる代表的な方法は、遺伝工学技術を使用して組換え融合タンパク質を合成するものである。

例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＧＳＴ）のような酵素を使用して、表面に酵素を認識するグルタチオン分子をあらかじめ結合させて、エリサ法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）に活用する方法が知られている（非特許文献４）。しかし前記方法は、ポリスチレンのように反応性がない疎水性表面には、グルタチオンのような物質を結合しにくいという短所がある。

一方、疎水性ドメインを有するリンカーを使用してタンパク質の効率的な吸着と同時に変性を防いで、吸着後にも目的タンパク質の生物学的機能が維持され、それを細胞培養用表面として使用する方法が開発された。疎水性結合による融合タンパク質の固定化のためのリンカーとしては、免疫グロブリンのＦｃドメイン（非特許文献５、非特許文献３）、ハイドロフォビン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ）のような疎水性が強いタンパク質などを使用する（非特許文献６）。前記方法は、吸着させようとする表面に別途の前処理をしないで、簡単に使用することができるという長所を有している。

例えば、ＥＧＦ−Ｆｃあるいはカドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）−Ｆｃをポリスチレン培養容器に固定化して、溶液性ＥＧＦあるいはゼラチンが吸着した表面で上皮腫瘍細胞または胚芽幹細胞を培養すると、これら細胞は生化学的および細胞生物学的に異なった挙動を示すということが報告されている（非特許文献５、非特許文献３）。しかし、このようにＦｃを使用する場合には、Ｆｃのカルボキシル末端は疎水性表面との物理的吸着に必要とされ、Ｆｃのアミノ末端に標的とする生理活性ポリペプチドを結合させなければならないので、生理活性ポリペプチドのカルボキシル末端が活性に必須な場合には使用が制限される。その他にも、生理活性ポリペプチドのカルボキシル基末端を、連結部位に使用する多様な結合方法も開発された。一例として、特許文献１は、ハイドロフォビンを使用して酵素などを疎水性表面に結合させるタンパク質固定化方法を開示している。しかし、前記で言及された疎水性結合を誘導する融合タンパク質のリンカー部分は、大部分が動物およびカビ由来のものであり、大腸菌で発現させて精製する場合は、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形成など多くの短所を有している。

以上のことに鑑みて、本発明者等は、前記の従来技術の問題点を解決するために鋭意研究努力した結果、大腸菌で発現されるタンパク質として、マルトースとの優れた結合能力と発現および精製が容易であるという長所を有する、マルトース結合タンパク質を使用して生理活性ポリペプチドとの融合タンパク質を製造して、前記融合タンパク質をマルトース結合タンパク質の疎水性ドメイン（非特許文献７）を使用して、ポリスチレンのような疎水性表面に単純な物理的吸着によって固定させた後、固定された融合タンパク質の生理活性ポリペプチド部分が、生物学的活性を維持していることを確認することにより、本発明を完成した。
米国特許公開第２００４０２３５０５０号 Ｌｅｅ Ｊ．Ｍ．等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７年，第７９巻，２６８０−２６８７頁 Ｏｇｉｗａｒａ Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００６年，第３４５巻，２５５−２５９頁 Ｎａｇａｏｋａ Ｍ．等，ＰＬｏＳ ＯＮＥ、２００６年，第１巻，ｅ１５頁 Ｓｅｈｒ Ｐ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．,２００１年，第２５３巻，１５３−１６２頁 Ｏｇｉｗａｒａ Ｋ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５年，第２７巻，１６３３−１６３７頁 Ｑｉｎ Ｍ．等，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆａｃｅｓ，２００７年，第６０巻，２４３−２４９頁 Ｆｏｘ Ｊ．Ｄ．等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１年，第１０巻，６２２−６３０頁

本発明の目的は、大腸菌での発現および精製が容易であり、疎水性ドメインを有するマルトース結合タンパク質を使用して、特定の成長因子またはサイトカインのような生理活性ポリペプチドを、前処理過程なしに簡単な物理的吸着によって固体基質の疎水性表面に固定化する方法、および前記方法によって製造された生理活性ポリペプチドが固定された生物活性固体基質を提供することである。

前記目的を達成するために本発明は、
１）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のカルボキシル末端に、生理活性ポリペプチドが融合された融合タンパク質を得る工程、および
２）前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程とを含む、生理活性ポリペプチドを固体基質に固定化させる方法を提供する。

また本発明は、前記固定化方法によって生理活性ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質をリンカーに使用して固体基質の疎水性表面に固定されている、生物活性固体基質を提供する。

同時に本発明は、マルトース結合タンパク質の、前記生物活性固体基質の製造のための使用を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、
１）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のカルボキシル末端に、生理活性ポリペプチドが融合された融合タンパク質を得る工程、および
２）前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程とを含む、生理活性ポリペプチドを固体基質に固定化させる方法を提供する。

前記方法において、工程１）は、マルトース結合タンパク質をコードする塩基配列のカルボキシル末端に生理活性ポリペプチドをコードする塩基配列を融合した後、その融合遺伝子断片を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で形質転換して発現させた後、精製することにより、マルトース結合タンパク質−生理活性ポリペプチドの融合タンパク質を得る工程である。

前記マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌の細胞膜を横切って原形質膜空間に位置したタンパク質で、細胞内でマルトースまたはマルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）のような糖類の移動に関与するペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）タンパク質である。マルトース結合タンパク質は、有用な外来タンパク質を融合タンパク質形態に生産するために主に使用され、細胞内の遺伝子ｍａｌＥから解読されて作られ、クローニングされたｍａｌＥ遺伝子の下流に外来タンパク質の遺伝子を挿入して細胞内で発現させると、２個のタンパク質が結合した融合タンパク質を手軽に大量生産することができる。特に、発現させようとするタンパク質の大きさが小さい場合や、他の宿主細胞内ではその安全性が低下する外来タンパク質の場合、このようにマルトース結合タンパク質を使用して融合タンパク質形態で細胞内で発現させることが有利である。前記のようにｍａｌＥ遺伝子が結合された遺伝子から発現される外来タンパク質は、マルトース結合タンパク質がマルトースに結合親和力を有するという特性を利用して分離することができる。例えば、マルトースが多重化された形態であるアミロース（ａｍｙｌｏｓｅ）がコーティングされた樹脂と細胞破砕液とを反応させて、反応させた樹脂を数回洗浄して汚染した他のタンパク質を除去した後、高濃度のマルトースを添加して競争させることによって、所望のタンパク質のみを簡単に溶出させることができる。このように、マルトース結合タンパク質を使用すると、所望するタンパク質を細胞内で大量発現させた後、非常に容易に分離精製することができるので、マルトース結合タンパク質と結合した融合タンパク質を発現させるシステムは、全世界的に目的とする外来タンパク質を生産するのに多く使用されている。

前記方法において、工程１）は、前記のようなマルトース結合タンパク質の特性を使用して、マルトース結合タンパク質と目的とする生理活性ポリペプチドとの融合タンパク質を生産する工程であり、具体的に（ｉ）目的とする生理活性ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質のカルボキシル末端に融合された融合タンパク質を、暗号化する融合遺伝子断片を得る工程、（ｉｉ）前記融合遺伝子断片を含む発現ベクターを製造する工程、（ｉｉｉ）前記発現ベクターで形質転換された形質転換微生物を製造する工程、および（ｉｖ）前記形質転換微生物から融合タンパク質を発現および精製する工程を含むことができる。

まず、マルトース結合タンパク質をコードする塩基配列のカルボキシル末端に、目的とする生理活性ポリペプチドをコードする塩基配列を融合して、融合遺伝子断片を製造する。

本発明によると、マルトース結合タンパク質のカルボキシル末端には、融合タンパク質の製造のために、目的とする生理活性ポリペプチドが結合される一方、表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端は、以後の工程で疎水性表面への物理的吸着に使用される。

本発明に適合した生理活性ポリペプチドの適用範囲は、特異的な生物学的活性を有したり、目的とする一つ以上の分子に結合したりすることができる任意のポリペプチドであり、そのアミノ末端が生物学的活性に必須ではないポリペプチドを含むことができる。このようなタンパク質としては、抗原、抗体、酵素、構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、付着タンパク質（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）または調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）などを含むことができるが、これに限定されるものではない。

生理活性ポリペプチド遺伝子は、人体医学的または産業的に重要性があり、組換え生産の必要性がある人体を含んだ多様な動植物および微生物来由の遺伝子から分離されたり化学的に合成されたりするものであり、前記のポリペプチドをコードする遺伝子である。このような生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子で、これらの生物学的活性を示す一部または全体塩基配列が、マルトース結合タンパク質のカルボキシル末端の転写解読枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）部位に結合されて、融合遺伝子断片が製造される。

前記のように製造された融合遺伝子断片を発現させるために、これを大腸菌用発現ベクターに挿入して組換え発現ベクターを製造する。前記大腸菌用発現ベクターには、外来遺伝子を大腸菌内で発現させることができるベクターなら、制限なしに使用することができる。

本発明の実施例では、生理活性ポリペプチドで血管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）を重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した後、増幅されたＶＥＧＦ遺伝子をマルトース結合タンパク質遺伝子を有するベクターにクローニングして、マルトース結合タンパク質のカルボキシル末端にＶＥＧＦ遺伝子が連結された融合遺伝子を含む発現ベクターを製造する。

本発明による組換え発現ベクターを使用して大腸菌を形質転換させた後、形質転換された大腸菌を培養してマルトース結合タンパク質−生理活性ポリペプチドの融合タンパク質を発現させる。ここで培養は、培養液のＯＤ_６００値が０．３〜０．６になった時に、ＩＰＴＧを最終濃度２〜４ｍＭで添加して、２〜６時間程度さらに培養することが好ましい。
その後、発現された融合タンパク質を大腸菌培養液から分離精製する。ここで、使用することができる分離精製方法としては、マルトースを特異的に結合することができる物質、例えばアミロース樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用することができる。

前記方法において、工程２）は、得たマルトース結合タンパク質−生理活性ポリペプチドの融合タンパク質を疎水性表面に固定させる工程であり、前記固定化は、融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質のアミノ末端に位置した表面に露出した疎水性ドメインをリンカーに使用した、疎水性表面との物理的吸着によって達成される。

具体的に、前記融合タンパク質を適合した緩衝溶液、例えばリン酸塩緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）、ツイーン２０／ＰＢＳ、トリス−ＨＣｌ緩衝溶液、重炭酸塩緩衝溶液（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）などに１ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した後、この希釈液を疎水性表面に添加して、４〜２５℃で１〜２４時間反応させて、マルトース結合タンパク質のアミノ末端に位置した疎水性ドメインと前記疎水性表面との物理的吸着によって、融合タンパク質を疎水性表面に固定させる。

本発明に適合した疎水性表面は、シラン化された表面（ｓｉｌａｎｉｚｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）表面、炭化水素でコーティングされた表面（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｃｏａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ）、高分子（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステル含有生分解性高分子など）表面、または金属（例えば、ステンレススチール、チタン、金、白金など）表面であることが可能であるが、これらに限定されない。

このように疎水性表面に固定された融合タンパク質は、細胞認識に重要な生理活性ポリペプチド部分が外側に露出しているので、細胞膜に存在する受容体に容易に結合して細胞の機能を調節するのに重要な役割を担当することができる。また、疎水性表面に固定された融合タンパク質の生理活性ポリペプチドは、本来の生物学的活性、例えば酵素活性、触媒活性、抗原特性または調節機能をそのまま維持している。本発明で「生物学的活性を維持する」と言うのは、マルトース結合タンパク質に融合された生理活性ポリペプチドが融合された後にも、本来の生物学的活性または機能を５０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上維持することを意味する。融合された生理活性ポリペプチドは、本来の生物学的活性または機能の８０％以上を維持することがさらに好ましく、最も好ましいのは９０％以上を維持することである。

本発明の実施例では、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質形態で発現、精製された生理活性ポリペプチドが、本来の生物学的活性または機能を９９％以上維持する。

また本発明は、前記固定化方法によって、生理活性ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質をリンカーに使用して固体基質の疎水性表面に固定されている、生物活性固体基質を提供する。

同時に本発明は、マルトース結合タンパク質の前記生物活性固体基質の製造のための使用を提供する。

前記生物活性固体基質は、特定生物学的活性を有する生理活性ポリペプチドが前記固体基質の表面の外部に露出していて、目的とする分子または細胞受容体との相互作用が容易いなだけではなく、前記表面にどのような生物学的活性を有する生理活性ペプチドを固定させるのかによって、多様な目的に使用することができる。本発明による生物活性固体基質の最も一般的な用途は、細胞培養に使用することである。すなわち、前記固定化方法によって、特定細胞の培養に求められる生理活性ポリペプチドを、マルトース結合タンパク質を使用して疎水性材質の細胞培養容器基質に固定させて、前記培養容器に細胞を培養すると、細胞と生理活性ポリペプチドとの相互作用が直接的に成立して、培養を円滑に成立させることができる。このように、生理活性ポリペプチドが固定された生物活性固体基質に細胞を培養するようになれば、融合された生理活性ポリペプチドの生物学的活性によって細胞内信号伝達の変化をもたらし、細胞の形態および機能変化の誘導が可能なだけでなく、幹細胞の分化研究、組織工学のような再生医療分野、細胞センサーまたは細胞チップ研究に有用に使用することができる。

また、本発明による生物活性固体基質を使用した細胞培養方法は、マルトース結合タンパク質によって疎水性表面に固定されて外部に露出した生理活性ポリペプチドが、直接細胞接着に関与するようにしたり、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンなどのような天然細胞の外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）を一緒に吸着させて細胞接着に使用したり、固定された生理活性ポリペプチドを細胞の信号伝逹に使用することなどに活用することができる。

また、本発明の生物活性固体基質は、診断装備などに適用することができる。例えば、診断しようとする生理活性ポリペプチドを疎水性材質からなるストリップ（ｓｔｒｉｐｓ）またはマイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）の表面にマルトース結合タンパク質をリンカーに使用して固定させると、バイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）として有用に使用することができる。

前述したように、マルトース結合タンパク質を使用して生理活性ポリペプチドを固定することで生物活性固体基質を製造することは、固定された生理活性ポリペプチドと異なるポリペプチドとの相互作用に対する研究を可能にする。したがって、高性能スクリーニング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、固相抽出（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）またはクロマトグラフィー精製などに適用することができる。

本発明による生理活性ポリペプチドの固定化方法は、原形質膜空間タンパク質であるマルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインをリンカーに使用して、生理活性ポリペプチドの生物学的活性はそのまま維持しながら、簡単な物理的吸着によって固体基質の疎水性表面に固定させることができ、このような生理活性ポリペプチドが固定された固体基質は、多様な細胞の培養、幹細胞の分化研究、組織工学のような再生医療分野、細胞センサーまたは細胞チップ研究などに非常に有用に使用することができるという長所を有する。

以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。

これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨にしたがって、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、通常の知識を有する当業者にとって自明であろう。

＜参考例１＞制限酵素を使用したＤＮＡの切断および切片の回収
使用した制限酵素と緩衝溶液は、エンザイノミックス（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）社から購入したし滅菌された１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｂｅ）に、普通反応体積が２０〜３０μｌになるようにして、３７℃の反応温度で４〜５時間反応させた。制限酵素反応に使用した１０×緩衝溶液の組成を、下記に示す：
１）１０×エンザイノミックス緩衝溶液ＥｚバッファーI：１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２５℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２５％ トリトンＸ−１００、および
２）１０×エンザイノミックス緩衝溶液ＥｚバッファーII：１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２５℃）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）。

ＤＮＡ切片の回収は、電気泳動されたアガロースゲルをＵＶ透過照明装置（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ａｖｅｇｅｎｅ）で照射して所望する切片を切断した後、ゲル抽出キット（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用して分離した。

＜参考例２＞細菌性アルカリフォスファターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理
細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理時に使用したＢＡＰ溶液は、フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）社から購入し、滅菌された１．５ｍｌエッペンドルフチューブに普通反応体積が５０μｌになるようにして、６０〜６５℃の反応温度で１時間反応させた。ＢＡＰ反応には、１Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用した。

＜参考例３＞ライゲーション反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ライゲーション反応は、ＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１、タカラ）を使用してベクター（ｖｅｃｔｏｒ）と挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）の割合を１：３程度で混合して反応体積を１０〜２０μｌになるようにして、１６℃で少なくとも１２時間以上反応させた。

＜参考例４＞大腸菌形質転換
形質転換のための大腸菌宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＴＢ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用した。前記細胞を６０ｍｌの液体培地（１０ｇ／ｌバクト・トリプトン［ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ］、５ｇ／ｌ 酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ）に接種した後、吸光度（ＯＤ_６００）値が０．４〜０．６になるまで３７℃振盪培養した。前記培養された細胞を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注して、遠心分離を通じて細胞を得た。得られた細胞に５０ｍＭ ＣａＣｌ_２を３００μｌずつ添加して弱くボルテキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した後、再度遠心分離を通じて細胞を収穫した。前記得られた細胞に、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２を３００μｌずつ添加して細胞を均一に分散させた後、０℃で３０分間静置させた。前記静置液を再度遠心分離して上澄み液は捨てた後、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２に１５％グリセロールを添加した冷たい溶液を、残った細胞に１５０μｌずつ添加して均一に分散させて冷凍保管した。

＜参考例５＞オリゴヌクレオチドの合成
目的とする生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅するために、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）に使用されるプライマー対は、バイオニア（Ｂｉｏｎｅｅｒ）社のオリゴヌクレオチド合成サービスを使用して製作した。

＜参考例６＞重合酵素連鎖反応
鋳型５０ｎｇと正方向および逆方向プライマーそれぞれ１０μＭに蒸留水を添加して、総体積が１０μｌになるようにした後、ホットスタートＰＣＲプレミックス（Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）に添加した。温度循環器（Ｔ−ｇｒａｄｉｅｎｔ ｔｈｅｒｍｏ ｂｌｏｃｋ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を使用して、前記反応混合物を９５℃で１分間変性させた後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および６８℃で１分間の反応を３１回反復して、最終的に７２℃で５分間増幅させた。前記増幅された反応産物をＰＣＲ精製キット（ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）を使用して精製して、アガロースゲルに電気泳動した後、ＵＶトランスイルミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）（Ａｖｅｇｅｎｅ）を照射して所望する切片を切断した。回収されたゲル切片からゲル抽出キット（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用して増幅されたＤＮＡを分離した。

＜参考例７＞細胞培養
ＨＥＫ２９３ヒト胚芽腎臓細胞から由来した２９３／ＫＤＲ細胞は、ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）受容体を発現するように作られた細胞である。２９３／ＫＤＲ細胞はシブテック（Ｓｉｂｔｅｃｈ）社から５回継代培養された状態で購入した。細胞培養には、ＤＭＥＭ液体培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン）（ Ｄ−グルコース ４５００ｍｇ／ｌ 、Ｌ−グルタミン、 ピルビン酸ナトリウム １１０ｍｇ／ｌ 、１０％ＦＢＳ）に、０．３７５μｇ／ｍｌのピュロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ）を添加した培地を使用して、３７℃で５％のＣＯ_２を添加しながらインキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ）で培養した。培地は、２日間隔で新しいものと交換して、細胞がＴ−フラスコに７０〜８０％程度生育した後に継代した。

＜参考例８＞７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）の製造
ミニプロテアン３電気泳動セット（Ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ ３ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｅｔ）（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、７．５％ポリアクリルアミドゲルを製造した。まず、１．０ｍｍのガラスプレートをフレームに固定させて、キャスティングフレーム（ｃａｓｔｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を形成した。５０ｍｌのコニカルチューブに蒸留水４．９４ｍｌと１．５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝溶液を２．５ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液を２．５ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ、ＡＰＳ）５０μｌおよびＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）１０μｌを添加してよく混合した後、前記１．０ｍｍガラスプレートに４．５ｍｌずつ入れて解像度ゲル（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｇｅｌ）を作製した。その後、ゲルが乾かないように５００μｌの蒸留水を注入した後、解像度ゲルが完全に固まるとゲルの上の蒸留水を除去した。スタッキングゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）を製造するために、５０ｍｌのコニカルチューブに蒸留水３．０５ｍｌ、０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝溶液 １．２５ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液 ０．６７ｍｌ、１０％ＡＰＳ ２５μｌおよびＴＥＭＥＤ ５μｌを添加してよく混合した後、１．０ｍｍガラスプレートに最後まで注いで、１５ウェル（２０μｌ）鋳型を挿入した後、固めた。ポリアクリルアミドゲルに使用された試薬の組成を下記に示す：
１）１．５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝溶液：トリス塩基 １８．１７ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％ ＳＤＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２ ｍｌ、蒸留水 ８０ｍｌ，（ｐＨ８．８）、
２）０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝溶液：トリス塩基 ６．０６ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％ ＳＤＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２ｍｌ、蒸留水 ８０ｍｌ，（ｐＨ６．８）、および
３）３０％ アクリルアミド溶液：２９％ アクリルアミド（Ｓｉｇｍａ）、１％ ビス−アクリルアミド（Ｓｉｇｍａ）。

＜参考例９＞ビオチンカップリング（ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）
タンパク質のビオチンカップリングは、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン化キット（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して行った。反応体積が０．５〜２ｍｌ、タンパク質の濃度が１〜１０ｍｇ／ｍｌになるようにリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）でタンパク質を希釈した後、１０ｍＭ スルホ−ＮＨＳ−ビオチン溶液をビオチン処理されるタンパク質の分子量によって計算して添加して、１時間常温で反応させた。一方、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン化キット内に含まれている脱塩スピンカラム（ｄｅｓａｌｔ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）に１５ｍｌのコニカルチューブを結合させて、１０００×ｇで２分間遠心分離（ハニル）を行った後、コニカルチューブに集められた溶液を除去した。その後、脱塩スピンカラムにＰＢＳ ２．５ｍｌを添加して、１０００×ｇで２分間遠心分離をして脱塩スピンカラムを洗浄した。前記洗浄過程を２回繰り返し実施した。このように準備した脱塩スピンカラムに新しい１５ｍｌのコニカルチューブを結合させた後、前記ビオチン処理された反応物を添加して、１０００×ｇで２分間遠心分離を行ってビオチンが結合されたタンパク質を分離した。

＜実施例１＞組換えタンパク質を発現するプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ−ＶＥＧＦの製造
＜１−１＞ＶＥＧＦ遺伝子がクローニングされたプラスミドの製造
ＶＥＧＦ遺伝子がクローニングされたプラスミドを製造するため、配列番号１の塩基配列を有する正方向プライマーＶＥＧＦ−Ｆ（ＥｃｏＲＩ）および配列番号２の塩基配列を有する逆方向プライマーＶＥＧＦ−Ｒ（ＨｉｎｄIII）を合成した。前記プライマー対を使用して、ヒト血管平滑筋（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ、ＶＳＭ）細胞から抽出した全体遺伝子を鋳型に、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、血管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）１６５部分のみを増幅した。

ｐＧＥＭ−ＴベクターシステムI（Ｐｒｏｍｅｇａ）に含まれている２×ライゲーション緩衝溶液（ｒａｐｉｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）５μｌに、前記で増幅されたＶＥＧＦ遺伝子断片４ｎｇ、ｐＧＥＭ−Ｔベクター５０ｎｇおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）１μｌを添加した後、総体積が１０μｌになるように蒸留水を添加して、常温で１時間放置した後、続いて１６℃で１２時間反応させた。反応が終結した後、連結物を大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＴＢ１に形質転換させて、それから目的とする遺伝子がクローニングされた組換えプラスミドを選別して、ｐＧＥＭ−ＶＥＧＦと命名した。

＜１−２＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合遺伝子がクローニングされたプラスミドの製造
リンカーとしてマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とＶＥＧＦ遺伝子とを融合させるために、前記実施例＜１−１＞で製造された組換えプラスミドｐＧＥＭ−ＶＥＧＦを、エンザイノミックス緩衝溶液ＥｚバッファーI、緩衝溶液ＥｚバッファーII中で、制限酵素ＥｃｏＲIとＨｉｎｄIIIで切断した後、アガロースゲル上でＶＥＧＦ遺伝子切片を分離した。以後のライゲーション反応を容易に行うために、分離したＶＥＧＦ遺伝子をＢＡＰで処理した。ＢＡＰ処理は、緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、Ｂｉｏｎｅｅｒ）７．５μｌおよびＢＡＰ溶液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１μｌを入れた後、最終体積が５０μｌになるようにＶＥＧＦ遺伝子を添加して、６５℃で１時間反応させた。反応物をアガロースゲルで電気泳動した後、ＵＶトランスイルミネーター（Ａｖｅｇｅｎｅ）で照射して所望する部分を切断した後、ゲル抽出キット（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎｅ）を使用してＶＥＧＦ遺伝子断片を分離した。

一方、ライゲーション反応に使用されるＭＢＰ遺伝子を有しているベクターｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、エンザイノミックス緩衝溶液ＥｚバッファーI、緩衝溶液ＥｚバッファーIIで制限酵素ＥｃｏＲIとＨｉｎｄIIIで切断した後、アガロースゲル上でＭＢＰ遺伝子含有ベクター切片を分離した。

前記で分離したＶＥＧＦ遺伝子９μｌ、切断したベクター切片ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ ３μｌおよびＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１、タカラ）に含まれた酵素溶液I（ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ I）１２μｌを混合して、総体積が２０μｌになるように蒸留水を加えた後、１６℃で１６時間反応させた。反応が終結した後、接合物を大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＴＢ１に形質転換させて、それからＭＢＰとＶＥＧＦの融合遺伝子がクローニングされた組換えプラスミドをスクリーニングして、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ−ＶＥＧＦと命名した。

＜実施例２＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の発現および精製
＜２−１＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の発現誘導
ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を発現する組換えプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ−ＶＥＧＦを、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＴＢ１に形質転換させて、３７℃のＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）固体培地で一日の間培養した。翌日、培地の上に形成されたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を採取して、６０μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含む３ｍｌのＲＢ（ｒｉｃｈ ｍｅｄｉｕｍ＋グルコース）液体培地に接種して、３７℃で約２時間培養した。そこに、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度３ｍＭになるように添加して、再び３７℃で２時間さらに培養した。培養が終わった後、１ｍｌの培養液を採取して、遠心分離機を通じて細胞沈殿物を得た。前記細胞沈殿物に２０μｌの１×試料ローディング緩衝溶液（ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を添加してよく混合した。前記混合物を９５℃で５分間沸かしてから常温に冷却させた後、１５μｌを取って１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動が終結した後、ポリアクリルアミドゲルをクマシブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）で染色して、抗−ＭＢＰ抗血清（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したウエスタンブロットを通じて、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の発現有無を観察した。

＜２−２＞水溶性融合タンパク質の発現および精製
前記実施例＜２−１＞で組換えプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ−ＶＥＧＦに形質転換された大腸菌細胞を、アンピシリンが６０μｇ／ｍｌ添加されたＲＢ培地に接種した後、３７℃で一晩中培養した。前記培養液１０ｍｌを１ｌのＲＢ培地に添加して、３７℃で継続振盪培養し、培養液の吸光度が６５０ｎｍの波長で約０．６程度になった時、３ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを添加した。ＩＰＴＧを添加して約２時間後に培養を停止した後、培養液を４０００×ｇで２０分間遠心分離（Ｃｏｍｂｉ−５１４Ｒ、ハニル）して細胞沈殿物を集めた。前記細胞沈殿物に緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ ２０ｍｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １１．７ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２ｍｌ）５０ｍｌを添加して懸濁させた後、最終濃度が１ｍＭになるようにＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）とＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を添加した。前記細胞混合物の精製に先立って、−２０℃での冷凍および解凍を繰り返して細胞破砕が容易に起きるようにした。その後、細胞混合物を冷却浴内で超音波粉砕機（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｏｄｅｌ ５００ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）を使用して、１０％出力で約１０秒間超音波処理して細胞を破砕した後、３０秒間冷却浴内に放置した。前記のような過程を２回反復して細胞を完全に破砕した。このように得た細胞均質液を、９０００×ｇで１時間遠心分離（Ｃｏｍｂｉ−５１４Ｒ、ハニル）して、可溶性タンパク質が溶解している上澄み液を得た後、緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ ２０ｍｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １１．７ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２ｍｌ）で５倍希釈した。

一方、大腸菌形質転換体から発現されたＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を分離するために、アミロース樹脂（ａｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーを準備した。このカラムをあらかじめ約８×ベッドボリューム（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）の緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ ２０ｍｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １１．７ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２ｍｌ）で洗浄して平衡化させた。平衡化されたアミロース樹脂親和性クロマトグラフィーに、前記で得た可溶性タンパク質が溶解している上澄み液を分当たり１ｍｌの速度でローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した。続いて、１２×ベッドボリューム以上の緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ ２０ｍｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １１．７ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２ｍｌ）をカラムに流して、樹脂に吸着されないタンパク質を除去した。その次に、１０ｍＭ マルトース溶出緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ ２０ｍｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １１．７ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２ｍｌ、１０ｍＭ マルトース）を添加して、樹脂に吸着されていたタンパク質を分当たり１ｍｌの速度で溶出させて回収した。その後、回収されたタンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動（Ｂｉｏ−ｒａｄ）して、精製されたタンパク質の概算の分子量と純度を確認した。その結果、精製されたタンパク質の純度は９５％以上で、概算の分子量は６０，０００Ｄａ程度と示された。

前記タンパク質試料を、希釈膜（ＭＷＣＯ１２−１４，０００）（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）に入れてＰＢＳで３日間希釈させた後、マルトースが除去されたタンパク質のみを収得した。その後、遠心分離ろ過器（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ＭＷＣＯ ５，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、４０００×ｇで４５分間遠心分離（Ｃｏｍｂｉ−５１４Ｒ、ハニル）してタンパク質を濃縮した。前記過程によって最終的に濃縮されたタンパク質を、ＭＢＰ−ＶＥＧＦと命名した。

図１は、アミロースレジンにローディングする前のＭＢＰ単独（ライン１）およびＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質（ライン３）と、アミロースレジンにローディングした後に精製されたＭＢＰ単独（ライン２）およびＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質（ライン４）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示したもので、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質が、ＭＢＰ単独より高い分子量を有することが確認されて、大腸菌形質転換体から融合タンパク質が発現されたことが分かった。

＜実施例３＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の活性測定
＜３−１＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質による２９３／ＫＤＲのリン酸化
ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の活性を測定するために、まず２９３／ＫＤＲを培養した後、６−ウェルに５×１０^５の細胞濃度で移植した。２９３／ＫＤＲ細胞は、２９３ＨＥＫ（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ）にＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦ受容体）を過発現させた細胞で、ＶＥＧＦのリン酸化試験などに使用されている。細胞移植６時間後、０．０５％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ウェルジン）が添加されたＤＭＥＭ液体培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン）に培地を交換した。それから１６時間経過後、前記培地を分析培地（ａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、ウェルジン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、Ｓｉｇｍａ、５ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、Ｓｉｇｍａ、０．０５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ））に交換して、１０分間培養器（Ｔｈｅｒｍｏ）で培養した。

一方、２９３／ＫＤＲ細胞を刺激するためにＶＥＧＦ１６５（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １６５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および製造されたＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を、それぞれ０、１、５、１０、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度で分析培地に希釈した。続いて希釈されたＶＥＧＦおよびＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を、前記で培養された２９３／ＫＤＲ細胞に１．５ｍｌずつ濃度別にそれぞれのグループに添加した後、３７℃培養器（Ｔｈｅｒｍｏ）で１０分間培養した。ＶＥＧＦおよびＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質によって刺激された細胞を氷に浸した後、冷たいＰＢＳで２回洗浄した。続いて細胞を破砕するために、ＲＩＰＡ（Ｒａｄｉｏ−Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｉｅｒｃｅ）緩衝溶液に１ｍＭ オルトバナジン酸塩ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ ピロリン酸塩ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｓｉｇｍａ）および２５ｍＭ フッ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ）を混合した後、１００μｌの混合液を前記細胞反応液に添加してスクラッパー（ｓｃｒａｐｅｒ、ＳＰＬ）を使用して細胞を回収した。回収された各グループの細胞を１時間氷に浸した後、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離（ｍｉｃｒｏ １７ＴＲ、ハニル）して上澄み液のみを採取して、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）タンパク質測定方法を使用して定量した。それぞれの試料を５×試料緩衝溶液（０．６ｍｌ １Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５ｍｌ ５０％ グリセロール、２ｍｌ １０％ ＳＤＳ、０．５ｍｌ ２−メルカプトエタノール、１ｍｌ １％ブロモフェノールブルー、０．９ｍｌ 蒸留水）に添加して、蒸留水で各試料の最終濃度を同一に合わせた後、１．５ｍｌ エッペンドルフチューブに入れて４℃で冷蔵保管した。

図２は、細胞を破送する前の細胞形態を観察した結果で、図２のＡは細胞に分析培地を添加する前の細胞形態で、Ｂは分析培地を、ＣはＭＢＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、ＤはＭＢＰ−ＶＥＧＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）を、ＥはＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を１０分間処理した後の細胞形態である。分析培地とＭＢＰを処理した群（ＢおよびＣ）では、細胞形態が処理する前の形態と類似に伸長した状態であるが、ＭＢＰ−ＶＥＧＦとＶＥＧＦを処理した群（ＤおよびＥ）では細胞が丸い形態に変化したことが分かった。このような結果は、本発明によってＶＥＧＦがＭＢＰとの融合タンパク質形態に発現されて精製されても、本来のＶＥＧＦ活性をそのまま維持していることを示すものである。

＜３−２＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質による２９３／ＫＤＲのリン酸化シグナル変化
前記実施例＜３−１＞で準備した試料を９５℃で１０分間加熱した後、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離（ｍｉｃｒｏ １７ＴＲ、ハニル）して、ふたに気化された試料を集めた。ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析のために７．５％ ポリアクリルアミドゲルを製造して、前記ゲルに前記試料をそれぞれ２０μｌずつローディングした後、電気泳動（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を実施した。一方、ニトロセルロース膜とろ過紙を１０×トリス／グリシン緩衝溶液（２５ｍＭ トリス、１９２ｍＭ グリシン、ｐＨ８．３、Ｂｉｏ−ｒａｄ）２０ｍｌとＭｅＯＨ ４０ｍｌおよび蒸留水１４０ｍｌを混合した溶液に２０分間浸けて活性化させた。

その後、半乾燥伝達システム（Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、前記で電気泳動されたポリアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜に伝達した。前記ニトロセルロース膜を５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）で４℃で８時間処理して遮断させた後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ−ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、トリス ３ｇ、ツイーン２０ ０．５ｍｌ）緩衝溶液で１０分間３回洗浄した。その後、１次抗体であるホスホチロシン：ビオチン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ：ｂｉｏｔｉｎ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と単一クローン抗−ホスホチロシン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ）を５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）に１：２０００に希釈した後、前記洗浄されたニトロセルロース膜に１０ｍｌずつ添加して、８時間４℃で反応させた。前記ニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で１０分間３回洗浄した後、５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）に１：１００００に希釈された２次抗体（Ｍｏｕｓｅ−Ｐｉｅｒｃｅ）と、ストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｓｉｇｍａ）とを１０ｍｌずつ添加して、１時間常温で反応させた。前記ニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で１０分間３回洗浄した後、ウェストフェムト最大敏感性基質（Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｉｅｒｃｅ）に含まれているルミノール／エンハンサー溶液（Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と、過酸化溶液（Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とを、それぞれ５００μｌずつ混合した溶液を添加して、常温で５分間反させた。反応が終結した後、前記ニトロセルロース膜をイメージ分析機（ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｌａｓ ３０００、フジフィルム）で分析して、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質による２９３／ＫＤＲ細胞のリン酸化シグナルを確認した。

その結果、図３に示したように、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質で処理した細胞では、ＶＥＧＦだけで処理した細胞群と類似して２２０ＫＤａ付近から濃度依存的にリン酸化が起きることを分かった。このようなリン酸化様相は、ＶＥＧＦによって処理された２９３／ＫＤＲ細胞で本実施例に使用された抗体によって示されるリン酸化様相と同一である（Ｂａｃｋｅｒ ＭＶ等、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６年，第２７巻，５４５２−５４５８頁）。その他にも、１３０ＫＤａ付近で細胞内のリン酸化が濃度依存的に増加することを確認することができた。

＜実施例４＞ポリスチレン表面でのＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の固定化に対する生化学的分析
本発明によるＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質が、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）のような疎水性表面に固定化される程度を調べるため、まず、下記のようにＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質をビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）で処理した。具体的に、１ｍｇ／ｍｌのＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質１８５μｌに、１０ｍＭ スルホ−ＮＨＳ−ビオチン溶液１６μｌを入れた後、最終体積が０．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加して、１時間常温で反応させた。一方、＜参考例１０＞に記述した方法で脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を洗浄した後、前記反応物を１５ｍｌコニカルチューブを結合した洗浄された脱塩スピンカラムに入れて、１０００×ｇで２分間遠心分離してビオチン処理されたＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を得た。

１０〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ濃度のビオチン処理されたＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を１００μｌずつ、ポリスチレン製の９６ウェル（非−組織培養用、Ｆａｌｃｏｎ）に加えて、常温で４時間処理して、ＰＢＳ２００μｌで３回洗浄した。その後、ポリスチレン表面にＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の非特異的結合を防止するために、１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）２００μｌを入れて常温で２時間処理した後、０．０５％ ツイーン２０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）含有ＰＢＳ２００μｌで５回洗浄した。

前記のＭＢＰ−ＶＥＧＦが固定された９６ウェルに、ストレプタビジンペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｓｉｇｍａ）がＰＢＳに１：１０，０００に希釈された溶液を１００μｌ添加して、常温で１時間反応させた後、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ２００μｌで５回洗浄した。続いて、前記９６ウェルに安定化された過酸化水素（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と安定化されたテトラメチルベンジジン（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１：１で混合した溶液１００μｌを添加してアルミホイルで包んだ後、２０分間反応させた。２０分後、２Ｎ硫酸溶液５０μｌを前記ウェルに添加して反応を停止させた。前記９６ウェルをマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定して、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質がポリスチレン表面に固定化された程度を確認した。

その結果、図４に示されたように、ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＶＥＧＦが１０〜１，０００ｎｇ／ｍｌの範囲で、濃度依存的に疎水性ポリスチレン表面に吸着されることが分かった。しかし、前記範囲を逸脱した高い濃度では、このような生化学的方法で固定化された程度を分析するのに限界があった。

＜実施例５＞ポリスチレン表面でのＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の固定化に対する物理学的分析
前記実施例４の生化学的方法では、高濃度でＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質の固定化程度を測定するのに限界があることを確認して、物理学的方法である水晶振動子微量秤（ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、ＱＣＭ）を使用して、高濃度で前記融合タンパク質が疎水性表面に吸着する程度を調査した。ＱＣＭは、水晶振動子（ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ）に物質が吸着した時に振動数の減少が生じて、このような振動数の減少を検出して吸着されたタンパク質の量を測定する方法である。本実験で水晶振動子は、０．５％ポリスチレン／トルエン溶液をスピンコーティングした後、使用した。試料は、ＭＢＰおよびＭＢＰ−ＶＥＧＦを、それぞれ１、１０、５０、１００および５００μｇ／ｍｌの濃度で緩衝溶液（１Ｍ トリス−ＨＣｌ ２０ｍｌ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １１．７ｇ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２ｍｌ）に希釈して準備した。水晶振動子に前記緩衝溶液を１時間流して平衡化させた後、準備したそれぞれの指標を１５分間流して水晶振動子にＭＢＰおよびＭＢＰ−ＶＥＧＦが吸着するようにした後、再び緩衝溶液を流して吸着されないタンパク質を除去した。その後、タンパク質吸着前と比べて吸着後の水晶振動子の振動数減少を測定して、吸着した重さをソルベリー式（Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ ｅｑｕａｔｉｏｎ、Δｆ＝−ΔｍＣ／ｎ）（Ｈｏｏｋ Ｆ、Ｒｏｄａｈｌ Ｍ．等、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．，１９９８年，第１４巻，７２９−７３４頁）に代入して算出した。

その結果、図５に示されように、本発明によるＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質が、１〜５００μｇ／ｍｌの高濃度でも濃度依存的に疎水性ポリスチレン表面に吸着して、このような濃度によるタンパク質の吸着がログ関数的増加を示すラングミュアタイプ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｔｙｐｅ）の吸着挙動と類似に単層に吸着することを確認した。

＜実施例６＞ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質による２９３／ＫＤＲ細胞の形態変化
ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質による２９３／ＫＤＲ細胞の形態変化を調査するため、まず、前記＜実施例２＞で抽出したＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質を無菌作業台（Ｓａｎｙｏ）で０．２２μｍ注射器フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してろ過した後、０．１、１および１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌずつポリスチレン材質の９６ウェルプレート（非−組織培養用、Ｆａｌｃｏｎ）に添加した後、プレート表面にコーティングされるように無菌作業台中で４時間放置した。その後、前記９６ウェルをＰＢＳ２００μｌで３回洗浄し、２９３／ＫＤＲ細胞とＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質がコーティングされたウェル表面との非特異的結合を防止するために、一部のウェルには１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ）２００μｌを添加して無菌作業台内で２時間処理した後、ＰＢＳ２００μｌで３回洗浄した。

ＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質がコーティングされた９６ウェルに、ウェル当たり２９３／ＫＤＲ細胞を２×１０^４の濃度で移植した。ここで、使用された培地は、ＤＭＥＭ（ウェルジン）無血清培地を使用した。移植された細胞は、３７℃培養器（Ｔｈｅｒｍｏ）で４５時間培養した後、位相差顕微鏡（ニコン社）を使用してこれらの形態変化を観察した。

図６および図７は、それぞれ本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質が固定されたポリスチレン疎水性表面において、ＢＳＡ存在下および不在下に培養された２９３／ＫＤＲ細胞の形態変化を観察した結果である。図６に示されたように、細胞の非特異的な結合を防止するためにＭＢＰ−ＶＥＧＦが吸着された表面にＢＳＡを処理した場合に、ＭＢＰ−ＶＥＧＦが吸着されない表面（図６のＡ）では細胞が凝固した丸い（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）形態を維持していて、吸着されたＭＢＰ−ＶＥＧＦの濃度が増加するに比例して細胞に偽足が形成されながら細長い形態に生育することを確認することができた（図６のＢ〜Ｄ）。

一方、図７に示されたように、ＭＢＰ−ＶＥＧＦが吸着した表面にＢＳＡを処理しない場合に、ＭＢＰ−ＶＥＧＦが吸着されない表面（図７のＡ）では細胞がよく接着して広くひろがった形態に生育したが、ＭＢＰ−ＶＥＧＦが吸着した表面では図６のＢ〜Ｄと類似に細胞が細長に偽足を生成しながら生育することを確認した。このような結果は、本発明によるＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質のＶＥＧＦが、細胞の形態形成に影響を及ぼしていることを示すものである。

以上、本発明の具体的な内容を詳しく記述したように、通常の知識を有する当業者において、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であるだけであり、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの均等物によって定義される。

本発明によって組換えられたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）とのＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。 本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質で処理された２９３／ＫＤＲ細胞で処理濃度による細胞の形態変化を観察した結果である。 本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質で処理された２９３／ＫＤＲ細胞でリン酸化シグナルの変化を観察した結果である。 本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質がポリスチレン疎水性表面に固定化される程度を生化学的に分析した結果である。 本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質がポリスチレン疎水性表面に固定化される程度を物理学的に分析した結果である。 本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質が固定されたポリスチレン疎水性表面でＢＳＡ存在下で培養された２９３／ＫＤＲ細胞の形態変化を観察した結果である。 本発明のＭＢＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質が固定されたポリスチレン疎水性表面でＢＳＡ不在下で培養された２９３／ＫＤＲ細胞の形態変化を観察した結果である。

Claims (12)

1. １）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のカルボキシル末端に、アミノ末端が生物学的活性に必須ではない血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）が融合された融合タンパク質を得る工程、および
   ２）前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程、
   を含む、前記血管内皮細胞成長因子を細胞培養用の固体基質に固定化させることによる、細胞培養に使用する生物活性固体基質の製造方法。
2. 工程１）の融合タンパク質が、
   （ｉ）前記血管内皮細胞成長因子がマルトース結合タンパク質のカルボキシル末端に融合された融合タンパク質を、暗号化する融合遺伝子断片を得る工程、
   （ｉｉ）前記融合遺伝子断片を含む発現ベクターを製造する工程、
   （ｉｉｉ）前記発現ベクターで形質転換された形質転換微生物を製造する工程、および
   （ｉｖ）前記形質転換微生物から融合タンパク質を発現および精製する工程、
   を含む工程によって得られることを特徴とする、請求項１記載の製造方法。
3. 工程（ｉｉ）の発現ベクターが、大腸菌用発現ベクターであることを特徴とする、請求項２記載の製造方法。
4. 工程（ｉｉｉ）の形質転換微生物が、大腸菌であることを特徴とする、請求項２または３に記載の製造方法。
5. 工程（ｉｖ）の融合タンパク質が、マルトース特異的なアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
6. 工程２）の疎水性表面が、シラン化表面、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）表面、炭化水素でコーティングされた表面、高分子表面および金属表面からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
7. 高分子が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）、ポリテトラフルオロエチレン、およびポリエステル含有生分解性高分子からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする、請求項６記載の製造方法。
8. 金属が、ステンレススチール、チタン、金および白金からなる群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする、請求項６記載の製造方法。
9. 工程２）の物理的吸着が、融合タンパク質と疎水性表面とを４〜２５℃で１〜２４時間反応させて成立することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
10. 工程２）の融合タンパク質の形態において、疎水性表面に固定された前記血管内皮細胞成長因子が、疎水性表面の外部に向くように露出することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
11. 請求項１の製造方法によって、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）が、マルトース結合タンパク質をリンカーに使用して固体基質の疎水性表面に固定されており、該血管内皮細胞成長因子のアミノ末端は生物学的に必須ではない、細胞培養用の生物活性固体基質。
12. マルトース結合タンパク質の、請求項１１に記載の細胞培養用の生物活性固体基質の製造のための使用。