JP2012245013A - 細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】マルトース結合タンパク質(MBP)のカルボキシル末端に、生理活性ポリペプチドが融合された融合タンパク質を得る工程、および前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程を含む、生理活性ポリペプチドを固体基質に固定化させる方法。および前記方法によって生理活性ポリペプチドが固定された、生物活性固体基質を提供する。
【選択図】図1
Description
1)マルトース結合タンパク質(MBP)のカルボキシル末端に、生理活性ポリペプチドが融合された融合タンパク質を得る工程、および
2)前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程とを含む、生理活性ポリペプチドを固体基質に固定化させる方法を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、
1)マルトース結合タンパク質(MBP)のカルボキシル末端に、生理活性ポリペプチドが融合された融合タンパク質を得る工程、および
2)前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程とを含む、生理活性ポリペプチドを固体基質に固定化させる方法を提供する。
その後、発現された融合タンパク質を大腸菌培養液から分離精製する。ここで、使用することができる分離精製方法としては、マルトースを特異的に結合することができる物質、例えばアミロース樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)を使用することができる。
<参考例1>制限酵素を使用したDNAの切断および切片の回収
使用した制限酵素と緩衝溶液は、エンザイノミックス(Enzynomics)社から購入したし滅菌された1.5mlエッペンドルフチューブ(eppendorf tube)に、普通反応体積が20〜30μlになるようにして、37℃の反応温度で4〜5時間反応させた。制限酵素反応に使用した10×緩衝溶液の組成を、下記に示す:
1)10×エンザイノミックス緩衝溶液EzバッファーI:100mM トリス−HCl(pH7.5、25℃)、50mM NaCl、10mM MgCl2、0.025% トリトンX−100、および
2)10×エンザイノミックス緩衝溶液EzバッファーII:10mM トリス−HCl(pH7.5、25℃)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM ジチオトレイトール(dithiothreitol)。
<参考例2>細菌性アルカリフォスファターゼ(bacterial alkaline phosphatase)処理
細菌性アルカリフォスファターゼ(BAP)処理時に使用したBAP溶液は、フェルメンタス(Fermentas)社から購入し、滅菌された1.5mlエッペンドルフチューブに普通反応体積が50μlになるようにして、60〜65℃の反応温度で1時間反応させた。BAP反応には、1M トリス−HCl緩衝溶液(pH8.0)(Bioneer)を使用した。
<参考例3>ライゲーション反応(ligation reaction)
ライゲーション反応は、DNAライゲーションキット(DNA Ligation Kit Ver2.1、タカラ)を使用してベクター(vector)と挿入物(insert)の割合を1:3程度で混合して反応体積を10〜20μlになるようにして、16℃で少なくとも12時間以上反応させた。
<参考例4>大腸菌形質転換
形質転換のための大腸菌宿主細胞には、E.coli K12 TB1(New England Biolabs)を使用した。前記細胞を60mlの液体培地(10g/lバクト・トリプトン[bacto−tryptone]、5g/l 酵母抽出物、10g/l NaCl)に接種した後、吸光度(OD600)値が0.4〜0.6になるまで37℃振盪培養した。前記培養された細胞を1.5mlエッペンドルフチューブに分注して、遠心分離を通じて細胞を得た。得られた細胞に50mM CaCl2を300μlずつ添加して弱くボルテキシング(vortexing)した後、再度遠心分離を通じて細胞を収穫した。前記得られた細胞に、50mM CaCl2を300μlずつ添加して細胞を均一に分散させた後、0℃で30分間静置させた。前記静置液を再度遠心分離して上澄み液は捨てた後、50mM CaCl2に15%グリセロールを添加した冷たい溶液を、残った細胞に150μlずつ添加して均一に分散させて冷凍保管した。
<参考例5>オリゴヌクレオチドの合成
目的とする生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子を増幅するために、重合酵素連鎖反応(PCR)に使用されるプライマー対は、バイオニア(Bioneer)社のオリゴヌクレオチド合成サービスを使用して製作した。
<参考例6>重合酵素連鎖反応
鋳型50ngと正方向および逆方向プライマーそれぞれ10μMに蒸留水を添加して、総体積が10μlになるようにした後、ホットスタートPCRプレミックス(Hot Start PCR Premix、Bioneer)に添加した。温度循環器(T−gradient thermo block、Applied Biometra)を使用して、前記反応混合物を95℃で1分間変性させた後、94℃で30秒、55℃で30秒、および68℃で1分間の反応を31回反復して、最終的に72℃で5分間増幅させた。前記増幅された反応産物をPCR精製キット(PCR purification kit、Bioneer)を使用して精製して、アガロースゲルに電気泳動した後、UVトランスイルミネーター(transilluminator)(Avegene)を照射して所望する切片を切断した。回収されたゲル切片からゲル抽出キット(gel extraction kit、Qiagene)を使用して増幅されたDNAを分離した。
<参考例7>細胞培養
HEK293ヒト胚芽腎臓細胞から由来した293/KDR細胞は、ヒトVEGFR−2(KDR/Flk1)受容体を発現するように作られた細胞である。293/KDR細胞はシブテック(Sibtech)社から5回継代培養された状態で購入した。細胞培養には、DMEM液体培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、ウェルジン)( D−グルコース 4500mg/l 、L−グルタミン、 ピルビン酸ナトリウム 110mg/l 、10%FBS)に、0.375μg/mlのピュロマイシン(Puromysin、Sigma)を添加した培地を使用して、37℃で5%のCO2を添加しながらインキュベーター(Thermo)で培養した。培地は、2日間隔で新しいものと交換して、細胞がT−フラスコに70〜80%程度生育した後に継代した。
<参考例8>7.5%ポリアクリルアミドゲル(polyacrylamide gel)の製造
ミニプロテアン3電気泳動セット(Mini−protean 3 Electrophoresis Set)(Bio−rad)を使用して、7.5%ポリアクリルアミドゲルを製造した。まず、1.0mmのガラスプレートをフレームに固定させて、キャスティングフレーム(casting frame)を形成した。50mlのコニカルチューブに蒸留水4.94mlと1.5M トリス−HCl緩衝溶液を2.5ml、30%アクリルアミド溶液を2.5ml、10%過硫酸アンモニウム(ammonium persulfate、APS)50μlおよびTEMED(N,N,N’、N’−テトラメチルエチレンジアミン)10μlを添加してよく混合した後、前記1.0mmガラスプレートに4.5mlずつ入れて解像度ゲル(resolution gel)を作製した。その後、ゲルが乾かないように500μlの蒸留水を注入した後、解像度ゲルが完全に固まるとゲルの上の蒸留水を除去した。スタッキングゲル(stacking gel)を製造するために、50mlのコニカルチューブに蒸留水3.05ml、0.5M トリス−HCl緩衝溶液 1.25ml、30%アクリルアミド溶液 0.67ml、10%APS 25μlおよびTEMED 5μlを添加してよく混合した後、1.0mmガラスプレートに最後まで注いで、15ウェル(20μl)鋳型を挿入した後、固めた。ポリアクリルアミドゲルに使用された試薬の組成を下記に示す:
1)1.5M トリス−HCl緩衝溶液:トリス塩基 18.17g(Invitrogen)、20% SDS(Amersham Pharmacia Biotech)2 ml、蒸留水 80ml,(pH8.8)、
2)0.5M トリス−HCl緩衝溶液:トリス塩基 6.06g(Invitrogen)、20% SDS(Amersham Pharmacia Biotech)2ml、蒸留水 80ml,(pH6.8)、および
3)30% アクリルアミド溶液:29% アクリルアミド(Sigma)、1% ビス−アクリルアミド(Sigma)。
<参考例9>ビオチンカップリング(biotin coupling)
タンパク質のビオチンカップリングは、スルホ−NHS−ビオチン化キット(sulfo−NHS−biotinylation kit、Pierce)を使用して行った。反応体積が0.5〜2ml、タンパク質の濃度が1〜10mg/mlになるようにリン酸塩緩衝溶液(phosphate buffered saline、PBS)でタンパク質を希釈した後、10mM スルホ−NHS−ビオチン溶液をビオチン処理されるタンパク質の分子量によって計算して添加して、1時間常温で反応させた。一方、スルホ−NHS−ビオチン化キット内に含まれている脱塩スピンカラム(desalt spin column)に15mlのコニカルチューブを結合させて、1000×gで2分間遠心分離(ハニル)を行った後、コニカルチューブに集められた溶液を除去した。その後、脱塩スピンカラムにPBS 2.5mlを添加して、1000×gで2分間遠心分離をして脱塩スピンカラムを洗浄した。前記洗浄過程を2回繰り返し実施した。このように準備した脱塩スピンカラムに新しい15mlのコニカルチューブを結合させた後、前記ビオチン処理された反応物を添加して、1000×gで2分間遠心分離を行ってビオチンが結合されたタンパク質を分離した。
VEGF遺伝子がクローニングされたプラスミドを製造するため、配列番号1の塩基配列を有する正方向プライマーVEGF−F(EcoRI)および配列番号2の塩基配列を有する逆方向プライマーVEGF−R(HindIII)を合成した。前記プライマー対を使用して、ヒト血管平滑筋(vascular smooth muscle、VSM)細胞から抽出した全体遺伝子を鋳型に、重合酵素連鎖反応(PCR)を行って、血管内皮細胞成長因子(vascular endothelial growth factor、VEGF)165部分のみを増幅した。
<1−2>MBP−VEGF融合遺伝子がクローニングされたプラスミドの製造
リンカーとしてマルトース結合タンパク質(MBP)とVEGF遺伝子とを融合させるために、前記実施例<1−1>で製造された組換えプラスミドpGEM−VEGFを、エンザイノミックス緩衝溶液EzバッファーI、緩衝溶液EzバッファーII中で、制限酵素EcoRIとHindIIIで切断した後、アガロースゲル上でVEGF遺伝子切片を分離した。以後のライゲーション反応を容易に行うために、分離したVEGF遺伝子をBAPで処理した。BAP処理は、緩衝溶液(1M トリス−HCl、pH8.0、Bioneer)7.5μlおよびBAP溶液(Fermentas)1μlを入れた後、最終体積が50μlになるようにVEGF遺伝子を添加して、65℃で1時間反応させた。反応物をアガロースゲルで電気泳動した後、UVトランスイルミネーター(Avegene)で照射して所望する部分を切断した後、ゲル抽出キット(gel extraction kit、Qiagene)を使用してVEGF遺伝子断片を分離した。
<実施例2>MBP−VEGF融合タンパク質の発現および精製
<2−1>MBP−VEGF融合タンパク質の発現誘導
MBP−VEGF融合タンパク質を発現する組換えプラスミドpMAL−c2X−VEGFを、大腸菌E.coli K12 TB1に形質転換させて、37℃のLB(Luria−Bertani)固体培地で一日の間培養した。翌日、培地の上に形成されたコロニー(colony)を採取して、60μg/ml濃度のアンピシリンを含む3mlのRB(rich medium+グルコース)液体培地に接種して、37℃で約2時間培養した。そこに、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を最終濃度3mMになるように添加して、再び37℃で2時間さらに培養した。培養が終わった後、1mlの培養液を採取して、遠心分離機を通じて細胞沈殿物を得た。前記細胞沈殿物に20μlの1×試料ローディング緩衝溶液(sample loading buffer)を添加してよく混合した。前記混合物を95℃で5分間沸かしてから常温に冷却させた後、15μlを取って10%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動が終結した後、ポリアクリルアミドゲルをクマシブルー(coomassie brilliant blue)で染色して、抗−MBP抗血清(New England Biolabs)を使用したウエスタンブロットを通じて、MBP−VEGF融合タンパク質の発現有無を観察した。
<2−2>水溶性融合タンパク質の発現および精製
前記実施例<2−1>で組換えプラスミドpMAL−c2X−VEGFに形質転換された大腸菌細胞を、アンピシリンが60μg/ml添加されたRB培地に接種した後、37℃で一晩中培養した。前記培養液10mlを1lのRB培地に添加して、37℃で継続振盪培養し、培養液の吸光度が650nmの波長で約0.6程度になった時、3mMの最終濃度でIPTGを添加した。IPTGを添加して約2時間後に培養を停止した後、培養液を4000×gで20分間遠心分離(Combi−514R、ハニル)して細胞沈殿物を集めた。前記細胞沈殿物に緩衝溶液(1M トリス−HCl 20ml、pH7.5、NaCl 11.7g、0.5M EDTA 2ml)50mlを添加して懸濁させた後、最終濃度が1mMになるようにEDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)とPMSF(phenylmethanesulphonyl fluoride)を添加した。前記細胞混合物の精製に先立って、−20℃での冷凍および解凍を繰り返して細胞破砕が容易に起きるようにした。その後、細胞混合物を冷却浴内で超音波粉砕機(Fisher Scientific Model 500 Sonic Dismembrator)を使用して、10%出力で約10秒間超音波処理して細胞を破砕した後、30秒間冷却浴内に放置した。前記のような過程を2回反復して細胞を完全に破砕した。このように得た細胞均質液を、9000×gで1時間遠心分離(Combi−514R、ハニル)して、可溶性タンパク質が溶解している上澄み液を得た後、緩衝溶液(1M トリス−HCl 20ml、pH7.5、NaCl 11.7g、0.5M EDTA、2ml)で5倍希釈した。
<実施例3>MBP−VEGF融合タンパク質の活性測定
<3−1>MBP−VEGF融合タンパク質による293/KDRのリン酸化
MBP−VEGF融合タンパク質の活性を測定するために、まず293/KDRを培養した後、6−ウェルに5×105の細胞濃度で移植した。293/KDR細胞は、293HEK(human embryonic kidney cell)にVEGFR2(VEGF受容体)を過発現させた細胞で、VEGFのリン酸化試験などに使用されている。細胞移植6時間後、0.05%のFBS(fetal bovine serum、ウェルジン)が添加されたDMEM液体培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、ウェルジン)に培地を交換した。それから16時間経過後、前記培地を分析培地(assay medium、DMEM、ウェルジン、25mM HEPES pH7.2、Sigma、5mM Na3VO4、Sigma、0.05%BSA(bovine serum albumin、Sigma))に交換して、10分間培養器(Thermo)で培養した。
<3−2>MBP−VEGF融合タンパク質による293/KDRのリン酸化シグナル変化
前記実施例<3−1>で準備した試料を95℃で10分間加熱した後、15,000rpmで1分間遠心分離(micro 17TR、ハニル)して、ふたに気化された試料を集めた。ウエスタンブロット(western blotting)分析のために7.5% ポリアクリルアミドゲルを製造して、前記ゲルに前記試料をそれぞれ20μlずつローディングした後、電気泳動(Bio−rad社)を実施した。一方、ニトロセルロース膜とろ過紙を10×トリス/グリシン緩衝溶液(25mM トリス、192mM グリシン、pH8.3、Bio−rad)20mlとMeOH 40mlおよび蒸留水140mlを混合した溶液に20分間浸けて活性化させた。
<実施例4>ポリスチレン表面でのMBP−VEGF融合タンパク質の固定化に対する生化学的分析
本発明によるMBP−VEGF融合タンパク質が、ポリスチレン(polystyrene)のような疎水性表面に固定化される程度を調べるため、まず、下記のようにMBP−VEGF融合タンパク質をビオチン(biotin)で処理した。具体的に、1mg/mlのMBP−VEGF融合タンパク質185μlに、10mM スルホ−NHS−ビオチン溶液16μlを入れた後、最終体積が0.5mlになるようにPBSを添加して、1時間常温で反応させた。一方、<参考例10>に記述した方法で脱塩スピンカラム(Pierce)を洗浄した後、前記反応物を15mlコニカルチューブを結合した洗浄された脱塩スピンカラムに入れて、1000×gで2分間遠心分離してビオチン処理されたMBP−VEGF融合タンパク質を得た。
<実施例5>ポリスチレン表面でのMBP−VEGF融合タンパク質の固定化に対する物理学的分析
前記実施例4の生化学的方法では、高濃度でMBP−VEGF融合タンパク質の固定化程度を測定するのに限界があることを確認して、物理学的方法である水晶振動子微量秤(quartz crystal microbalance、QCM)を使用して、高濃度で前記融合タンパク質が疎水性表面に吸着する程度を調査した。QCMは、水晶振動子(quartz crystal)に物質が吸着した時に振動数の減少が生じて、このような振動数の減少を検出して吸着されたタンパク質の量を測定する方法である。本実験で水晶振動子は、0.5%ポリスチレン/トルエン溶液をスピンコーティングした後、使用した。試料は、MBPおよびMBP−VEGFを、それぞれ1、10、50、100および500μg/mlの濃度で緩衝溶液(1M トリス−HCl 20ml、pH7.5、NaCl 11.7g、0.5M EDTA 2ml)に希釈して準備した。水晶振動子に前記緩衝溶液を1時間流して平衡化させた後、準備したそれぞれの指標を15分間流して水晶振動子にMBPおよびMBP−VEGFが吸着するようにした後、再び緩衝溶液を流して吸着されないタンパク質を除去した。その後、タンパク質吸着前と比べて吸着後の水晶振動子の振動数減少を測定して、吸着した重さをソルベリー式(Sauerbrey equation、Δf=−ΔmC/n)(Hook F、Rodahl M.等、Langmuir.,1998年,第14巻,729−734頁)に代入して算出した。
<実施例6>MBP−VEGF融合タンパク質による293/KDR細胞の形態変化
MBP−VEGF融合タンパク質による293/KDR細胞の形態変化を調査するため、まず、前記<実施例2>で抽出したMBP−VEGF融合タンパク質を無菌作業台(Sanyo)で0.22μm注射器フィルター(Millex GV、Millipore)を使用してろ過した後、0.1、1および10μg/mlの濃度で100μlずつポリスチレン材質の96ウェルプレート(非−組織培養用、Falcon)に添加した後、プレート表面にコーティングされるように無菌作業台中で4時間放置した。その後、前記96ウェルをPBS200μlで3回洗浄し、293/KDR細胞とMBP−VEGF融合タンパク質がコーティングされたウェル表面との非特異的結合を防止するために、一部のウェルには1%BSA(bovine serum albumin、Sigma)200μlを添加して無菌作業台内で2時間処理した後、PBS200μlで3回洗浄した。
Claims (11)
- 1)マルトース結合タンパク質(MBP)のカルボキシル末端に、生理活性ポリペプチドが融合された融合タンパク質を得る工程、
2)前記融合タンパク質を、マルトース結合タンパク質の表面に露出した疎水性ドメインを含むアミノ末端と固体基質の疎水性表面との物理的吸着によって、前記疎水性表面に固定させる工程、および、
3)前記融合タンパク質が固定された前記疎水性表面において細胞を培養する工程、
を含む、細胞培養方法。 - 工程1)の融合タンパク質が、
(i)目的とする生理活性ポリペプチドが、マルトース結合タンパク質のカルボキシル末端に融合された融合タンパク質を、暗号化する融合遺伝子断片を得る工程、
(ii)前記融合遺伝子断片を含む発現ベクターを製造する工程、
(iii)前記発現ベクターで形質転換された形質転換微生物を製造する工程、および
(iv)前記形質転換微生物から融合タンパク質を発現および精製する工程、
を含む工程によって得られることを特徴とする、請求項1記載の細胞培養方法。 - 工程(ii)の発現ベクターが、大腸菌用発現ベクターであることを特徴とする、請求項2記載の細胞培養方法。
- 工程(iii)の形質転換微生物が、大腸菌であることを特徴とする、請求項2または3に記載の細胞培養方法。
- 工程(iv)の融合タンパク質が、マルトース特異的なアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されることを特徴とする、請求項2〜4のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 工程2)の疎水性表面が、シラン化表面、カーボンナノチューブ(CNT)表面、炭化水素でコーティングされた表面、高分子表面および金属表面からなる群から選択されるいずれか1種であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 高分子が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン(登録商標)、ポリテトラフルオロエチレン、およびポリエステル含有生分解性高分子からなる群から選択されるいずれか1種であることを特徴とする、請求項6に記載の細胞培養方法。
- 金属が、ステンレススチール、チタン、金および白金からなる群から選択されるいずれか1種であることを特徴とする、請求項6に記載の細胞培養方法。
- 工程2)の物理的吸着が、融合タンパク質と疎水性表面とを4〜25℃で1〜24時間反応させて成立することを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 工程2)の融合タンパク質の形態において、疎水性表面に固定された生理活性ポリペプチドが、疎水性表面の外部に向くように露出することを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記生理活性ポリペプチドは血管内皮細胞成長因子(VEGF)であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれかに記載の細胞培養方法。
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