JP5160872B2 - 多孔質足場 - Google Patents

Description

本発明は、組織工学に使用するための足場製造のための、ポロゲン抽出を利用した多孔質足場製造法に関する。さらに詳しくは、可溶性の磁性ポロゲンを抽出することによる多孔質足場の孔構造の制御に関する。

近年、臓器疾患を有する患者数が増加しているにも関わらず、臓器提供者（ドナー）が不足していることから臓器の代替物としての人工組織を作り出す組織工学が注目されている。組織工学を実用的なものにするために、自然な組織成長を考慮に入れた足場が開発されなければならない。

製造が容易で費用がかからず、孔の相互接続性及び孔のサイズにおける一貫性を考慮に入れた、かつ足場形成後のフレームワークの容易な除去を可能にする、機能的な組織工学的足場を製作するための経済的な方法が必要とされている。

多孔質足場を開発する技術として、これまでに電界紡糸（非特許文献１）、三次元印刷（非特許文献２）、ソフトリソグラフィー（非特許文献３）、ポロゲン抽出（非特許文献４）といった手法が用いられている。その中でもポロゲン抽出は、ポロゲンの粒子サイズがそのまま孔のサイズに置き換わることと、任意形状の鋳型に応用できるため、多孔質ポリマーの簡便な製造方法としてよく使われている。
Ｋｉｄｏａｋｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：２６：３７ ２００５ Ｔｈｅｒｒｉｈａｕｌｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １７：３９５ ２００５ Ｋｉｎｇ，Ｋ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １６：２００７ ２００４ Ｇａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １２：９１７ ２００６

しかし、特許文献１、２を代表例とするこれまでのポロゲン抽出による多孔質足場の造形では、ポロゲンの操作性がなかったことから、足場中の孔の密度と配置場所を制御することができなかった。また、孔の連結性を高める手段として加温あるいは加湿により隣接したポロゲンの接点部分を結合させる方法が提案されているが、温度や湿度の条件を忠実に定める必要があった。
特許公表２００５−５２３７３９ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００６０２４６１２１

本発明では多孔質足場を実現するにあたり、下記のような課題を解決することを目的とする。
（１）溶性の磁性ポロゲンを用いて、磁場によってポロゲンの集合体を作り、これをフレームワークとしてポリマーに転写する。
（２）足場内部の隣接した孔の連結性を向上させる。
（３）足場内部の孔密度と孔の配置場所を制御する。
課題（１）は従来のポロゲン抽出による方法では達成することができない。課題（２）は細胞間の相互作用を促進し、酸素及び栄養分を供給するための経路を形成するために重要である。課題（３）は、多孔質足場内部に局所的な孔配置が求められる場合に重要である。上記の課題を解決することができれば、多孔質足場の新しい製造方法として、また組織工学的足場としての多孔構造体として役立てることができる。

上記の課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって、
（１）可溶性の磁性ポロゲンを磁場によって配置した後に、当該磁性ポロゲンの周囲をポリマー溶液で満たして、ポリマーを硬化させる転写工程と、
（２）当該磁性ポロゲンを、硬化後のポリマーの外部に溶出する溶出工程と、
を備えることを特徴とし、多孔質足場内部に連結された孔構造を得ることができる。

請求項２に記載の発明は、請求項１記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって、
当該磁場は、強度の空間分布を調整することが可能であり、従って当該磁性ポロゲンの密度分布に空間的な勾配を持たせることを可能とする
ことを特徴とし、多孔質足場内部に多孔度の空間的な勾配を持たせることができる。

請求項３に記載の発明は、請求項１から請求項２記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって、
当該磁場は、強度の空間分布を調整することが可能であり、従って当該磁性ポロゲンを特定のパターン上に配置することが可能である
ことを特徴とし、多孔質足場内部に孔のパターン化を可能にする。

請求項４に記載の発明は、請求項１から請求項３記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって、
当該ポリマーは、生体適合性を有すること
を特徴とし、多孔質生体適合性足場を得ることができる。

請求項５に記載の発明は、請求項１から請求項４記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって、
当該ポリマーは、生分解性を有すること
を特徴とし、多孔質生分解性足場を得ることができる。

請求項６に記載の発明は、請求項１から請求項５記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって、
前記転写工程の前に、さらに
（３）可溶性の磁性ポロゲンを製造する準備工程
を備えることを特徴とし、所望のポリマーに応じて任意の磁性ポロゲンを用いることができる。

提案する多孔質足場の製造方法によれば、磁力によってポリマー転写のためのフレームワークとしてのポロゲンの集合体を得ることができる。また、磁場によってポロゲンが最密に充填されたフレームワークを形成し、多孔質足場内部の孔の連結性を高められる。連結された孔を生成できることは、組織工学的足場として用いたときに細胞間の相互作用を助長し、多孔質足場の全体への酸素及び栄養分の供給を助け、従って組織の再生を促進できるという点で有用である。

さらには、磁場強度に勾配を持たせることで、磁性ポロゲンの集合の度合いを調節し、従って足場内部の多孔度に勾配を持たせることができる。これによって、多孔質足場内部で多孔度の高い部分と低い部分での組織の成長速度を比較することもできる。

用語の定義

この明細書における各用語は以下のように定義される。

「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」とは、人工組織を作る際の土台を意味し、この内部ないし表面ないしその両方で細胞が接着・増殖・分化することによって組織を形成する。

「ポロゲン」とは、硬化後のポリマーの内部に無数の孔を形成するために、硬化前のポリマーにあらかじめ混ぜておく溶出用の粒子を意味する。ポロゲンとして、水溶性の食塩や砂糖などが使われる。

「フレームワーク」とは、ポリマーを転写する際の鋳型を意味する。具体的には、ポロゲンが集合することによってできる可溶性の鋳型を意味する。

「ポリマー溶媒」とは、溶質としてのポリマーを溶かしている液体を意味する。ポリマー溶媒にポリマーが溶解したものをポリマー溶液と呼ぶ。

本発明の一つの実施例として、生体内への移植を目的とした組織工学的足場が考えられる。多孔質足場内部の連結された孔は、細胞を収容し、細胞間のシグナル伝達を助長し、細胞への酸素及び栄養分を供給するという点で組織の再生を促進する。組織工学的足場として使用する場合、多孔質ポリマーの表面、内部、あるいはその両方には再生を目的とする組織を構成する細胞が播種され、多孔質ポリマー全体に細胞が３次元的に増殖した後に生体内に移植される。対象とする再生組織の例として骨、肝臓、血管、皮膚が挙げられる。

参考までに、図１は磁性ポロゲンの造形手順の一例を示すものである。磁性微粒子の粉末２を含んだ液状のポロゲン材料１を、界面活性剤を含んだ溶媒３の中に混入して攪拌することによって、乳化作用により磁性微粒子の粉末を含んだ磁性ポロゲン４が生成する。分散した磁性ポロゲン粒子を含む溶媒を急冷し、溶媒を洗浄液５によって洗浄した後、洗浄液中でふるい６にかけることによって目的のサイズの磁性ポロゲンを得る。多孔質足場内部に目的のサイズの孔を配置するために、ふるい６の網目のサイズを調節することによって所望の直径範囲に収まった磁性ポロゲン４を得ることができる。

参考までに、図２は内部に連結された孔構造を有する多孔質足場の製造手順の一例を示すものである。磁性ポロゲン４を磁場発生源８によって基板７表面に誘導し、ポリマー溶液を粒子の集合体に転写した後に硬化させ、最後にポロゲン粒子を溶出し磁性微粒子粉末を洗浄することによって、ポリマー９の内部に孔１０を得る。磁界は、ネオジウム磁石、フェライト磁石を始めとする磁石によって発生しても良いし、他の任意の磁場発生装置によって生成されてもよい。基板７には、硬化後のポリマーの剥離が容易であるならば、いかなる材料を用いても良い。例えば、基板７としてシリコンウェーハを用いることも考えられる。

参考までに、図３は内部に多孔度の空間的な勾配を有する多孔質足場の造形手順の一例を示すものである。磁性体１２を非磁性体１１のブロックの内部に埋め込んだものの下に磁場発生源８を置き、磁性体１２の上にのみ局所的に磁場強度の強い箇所を作る。磁性ポロゲンは磁場強度の強い磁性体１２の上部に集合し、磁性体の中央部から端部に向かうにつれて粒子密度が下がる。これによって、ポリマーを転写しフレームワークを溶出した後の多孔質足場の内部には多孔度の空間的な勾配が形成される。

参考までに、図４は内部にパターン化された孔を有する多孔質足場の造形手順の一例を示すものである。磁性体１２を所望の間隔で複数枚、非磁性体１１のブロックの内部に埋め込んだものの下に磁場発生源８を置き、磁性体１２のうえにのみ局所的に磁場強度の強い箇所を作る。磁性ポロゲン４は磁場強度の強い磁性体１２の上部に集合し、離散的なパターンを形成する。ポリマーを転写しフレームワークを溶出した後の多孔質足場の内部には、パターン化された孔が形成される。

任意の材料をポロゲンとして用いてよい。ポロゲンの材料は、各々の多孔質足場造形に使用するポリマー溶媒によって容易に溶出せず、一方でポロゲン溶出用の溶媒に対して可溶でなければならない。例えばポリマーとしてＰＬＣＬ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｉｐｓｉｌｏｎ−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）を、ポリマー溶媒としてクロロホルムを使用する場合、食塩や砂糖はクロロホルムに容易に溶けないためポロゲン材料として用いることができる。

ポロゲンに磁性を持たせる手段として、例えばポロゲンの内部に磁性微粒子を包含させることが考えられる。磁性微粒子の製法、形状は問わないが、サイズはポロゲンのサイズ以下であることが望ましい。磁性微粒子の例として、フェライト粉末（Ｆｅ_３Ｏ_４）などが挙げられる。

磁性ポロゲンの製造方法は制限しない。光造形法、積層造形法、乳化（エマルション）を含むいかなる製法において製造されても良い。磁性ポロゲンの形状は、それらが最密に充填されたときに空隙を形成するように球形であることが望ましい。

乳化によって磁性ポロゲンを製造する場合、界面活性剤には例えばＳｐａｎ８０やレシチンなどの界面活性剤が使用されても良い。

多孔質足場製造に使用するポリマーの種類は限定しないが、組織工学的足場として細胞の分化・増殖を妨げない限りにおいて、任意の材料を使用できる。多孔質足場の製造に使用する材料として、例えば生体適合性ポリマーであるＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を用いる場合、原液と硬化用触媒の混合によってポリマー溶液を生成し、ポリマー溶液をフレームワークの隙間に浸透させ、時間の経過とともに硬化させる。ポリマーの硬化後にフレームワークを溶出することによって多孔質生体適合性足場を得る。原液と重合化用の触媒の混合比率は制限しない。重合化用の触媒の混合比率を上げることで、多孔質生体適合性足場のヤング率を上げることができる。

多孔質足場の造形には生分解性ポリマーを用いることもできる。生分解性ポリマーの例として、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンを用いることもできるし、あるいは上記の生分解性ポリマーのいかなる２種類の組み合わせによる共重合体を使用しても良い。生分解性ポリマーを使用する場合、一般的にはクロロホルムを始めとする有機溶媒にポリマーを溶かしたものをポリマー溶液として用いる。ポリマー溶液をフレームワークの隙間に浸透させ、溶媒の揮発及びポロゲン抽出によって硬化した多孔質生分解性足場を得る。ポリマー溶液中のポリマーの溶解度を上げることで、多孔質生分解性足場のヤング率を上げることができる。

発明の実施例

可溶性の磁性ポロゲンとして、本実施例ではフェライト粉末を混入した果糖粒子を用いた。以下、磁性ポロゲンとしての磁性果糖粒子の作成方法を記述する。市販の果糖粉末を１２０℃まで加熱することによって、果糖の液体を得ることができる。１２０℃に加熱された果糖の液体に、磁性微粒子として例えばフェライトの粉末を混入する。フェライトの粉末を含んだ果糖の液体を、界面活性剤を含んだ鉱油に混入し、１２０℃のまま容器全体を攪拌する。このとき、乳化作用によりフェライト粉末を含んだ球形の磁性果糖粒子が鉱油中に分散する。容器全体を氷浴で４℃まで急冷することによって、磁性果糖粒子は球形を保ったまま安定して鉱油中に分散する。上記の洗浄液としてノルマルヘキサンを用いることで、鉱油を洗浄した後、ノルマルヘキサンの液中でふるいにかけることによって磁性果糖粒子の直径を目的とする範囲に定めることができる。最後にノルマルヘキサンを揮発させることにより、可溶性の磁性ポロゲンとしての磁性果糖粒子を得ることができる。

磁性果糖粒子の直径は５０μｍから１ｍｍの間までに調節できる。従って、多孔質ポリマー中の孔のサイズも５０μｍから１ｍｍの間に定められる。

図４において、磁性体として厚み２００μｍの薄鋼板を、非磁性体としてアクリルを材料として用いた。薄鋼板の間隔は１０ｍｍとし、磁性ポロゲンとしての磁性果糖粒子の直径は１５０−３００μｍとした。磁場発生源として表面磁束密度０．１３Ｔの円盤型ネオジウム磁石を置くことで、磁性果糖粒子を磁性体の上に局所的に集合させることに成功した。

多孔質生体適合性足場を製造するためのポリマーとして、本実施例ではＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）を用いた。ＰＤＭＳの原液と硬化用触媒を１０：１の比率で混ぜた溶液をポリマー溶液として用いる。上記の磁性果糖粒子の直径を４２５−５００μｍに統一したものを磁性ポロゲンとして用い、磁性ポロゲンによって形成されるフレームワークの間隙にポリマー溶液を浸透させる。硬化用触媒の作用によって硬化したＰＤＭＳとフレームワークの複合体を得た後、水によって果糖を溶出しフェライト粉末を洗浄することで多孔質生体適合性足場を得ることができる。

多孔質生分解性足場を製造するためのポリマーとして、本実施例ではＰＬＣＬを用いた。例えばＰＬＣＬを１０％の重量比でクロロホルムに溶かしたものをポリマー溶液に用いる。上記の磁性果糖粒子の直径を４２５−５００μｍに統一したものを磁性ポロゲンとして用い、磁性ポロゲンによって形成されるフレームワークの間隙にポリマー溶液を浸透させる。クロロホルムを揮発させることによってＰＬＣＬとフレームワークの複合体を得た後、水によって果糖を溶出しフェライト粉末を洗浄することで多孔質生分解性ポリマーを得ることができる。

磁性ポロゲンの造形手順図 磁場とポロゲン抽出による多孔質ポリマーの造形手順図 パターン化された孔を内部に有する多孔質ポリマーの造形手順図 パターン化された孔を内部に有する多孔質ポリマーの概念図（上面図）

符号の説明

１． 液状のポロゲン
２． 性微粒子の粉末
３． 溶媒
４． 磁性ポロゲン
５． 洗浄液
６． ふるい
７． 基板
８． 磁場発生源
９． ポリマー
１０． 孔
１１． 非磁性体
１２． 磁性体

Claims (6)

1. 組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって，
   （１）可溶性の磁性ポロゲンを磁場によって配置した後に，当該磁性ポロゲンの周囲をポリマー溶液で満たして，ポリマーを硬化させる転写工程と，
   （２）当該磁性ポロゲンを，硬化後のポリマーの外部に溶出する溶出工程と，
   を備えることを特徴とする，組織工学的足場としての多孔構造体の製造方法
2. 請求項１記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって，
   当該磁場は，強度の空間分布を調整することが可能であり，従って当該磁性ポロゲンの密度分布に空間的な勾配を持たせることを可能とする
   ことを特徴とする，請求項１記載の組織工学的足場としての多孔構造体の製造方法
3. 請求項１から請求項２記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって，
   当該磁場は，強度の空間分布を調整することが可能であり，従って当該磁性ポロゲンを特定のパターン上に配置することが可能である
   ことを特徴とする，請求項１から請求項２記載の組織工学的足場としての多孔構造体の製造方法
4. 請求項１から請求項３記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって，
   当該ポリマーは，生体適合性を有すること
   を特徴とする，請求項１から請求項３記載の組織工学的足場としての多孔構造体の製造方法
5. 請求項１から請求項４記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって，
   当該ポリマーは，生分解性を有すること
   を特徴とする，請求項１から請求項４記載の組織工学的足場としての多孔構造体の製造方法
6. 請求項１から請求項５記載の組織工学的足場としての多孔構造体を得る方法であって，
   前記転写工程の前に，さらに
   （３）可溶性の磁性ポロゲンを製造する準備工程
   を備えることを特徴とする，請求項１から請求項５記載の組織工学的足場としての多孔構造体の製造方法