JP5155309B2

JP5155309B2 - 患者の循環液中のＭＭＰ−７の測定を利用した転移した膀胱ガンを診断およびモニターするためのｉｎｖｉｔｒｏ方法

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Publication number: JP5155309B2
Application number: JP2009514694A
Authority: JP
Inventors: ブルーノ・ダルブール; ゲアネ・サーキシアン
Original assignee: セザンヌ・エス・アー・エス
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2007-06-12
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Description

本発明は、膀胱ガン転位（危険性）の測定のための、および、膀胱ガン患者における転移の早期診断のための、マーカーとしての循環（血清）MMP-7の使用に関する。本発明は、また、膀胱ガンの評価をモニターするため、および、膀胱ガン治療の効率を求めるための、循環MMP-7の測定に関する。

（膀胱ガン）
一般名「膀胱ガン(bladder cancer)」は、3つの一般的な疾患グループ（表在性、浸潤性および転移性）に分けることができる様々な疾患を表す膀胱ガン(urinary bladder cancer)のために使用される。「膀胱ガン」は、発生率と死亡率の両方で、男性で四番目に多いガンであり、女性では八番目に多いガンである（Cohen SC et al., Urol. Clin. N. Am (1992) 19, 421-428; Boring CC et al., CA Cancer J. Clin (1994) 44, 7-26）。膀胱ガンの症例の90％以上が、移行上皮ガン（TCC）であり、約5％が、扁平上皮ガン（SCC）であり、2％未満が腺ガンである。

診断では、約75％の患者が、表在性膀胱ガンを有し、25％が浸潤性（筋肉層への浸潤）または転移性（リンパ節もしくは他の器官、通常は肺、骨もしくは肝臓）疾患を有する。表在性膀胱ガンが、頻度が高く再発を生じるが、再発した腫瘍の大部分が表在領域に留まる。しかしながら、5-30％の表在性腫瘍は、浸潤性疾患に進行する。浸潤性腫瘍は、移転するより高い危険性を有する。非治療の転移性疾患については、2年の生存率が5％未満である。

現在、膀胱ガンの主な診断手法は、それぞれ膀胱鏡検査および膀胱切除の間に取られた膀胱壁に由来する生検の尿細胞診および組織学的検査である。尿細胞診は、高い特異性を有する「究極の判断基準」であるが、よく分化したガンにおいては、より低い感度である。膀胱ガンにおいては、しばしが再発するので（症例の70％以下）、患者は定期的な膀胱鏡検査が必要である（Stein et al., J Urol (1998) 160, 654-659）。膀胱鏡検査は、高価で、患者に不快感を生じさせる侵襲的な方法である。それ故、膀胱鏡検査よりも侵襲性が低く、細胞診よりも効率的であり、膀胱ガンのフォローアップのためにも使用することができる診断方法に対する需要が存在する。

膀胱ガンの段階および悪性度（TNM-stratification）が、現在、治療の決定を行い、膀胱ガン患者の予後を評価するための最も有用な手段である。しかしながら、同じ段階に分けられた腫瘍の生物学的挙動と、「生物学的な潜在性」においては著しい差異が存在するので、どの表在性腫瘍が再発し、どの腫瘍が遠隔転移を生じるかを予測することは極めて困難である（Syrigos KN et al., Hybrid Hybridomics (2004) 23(6), 335-42）。

膀胱ガン転位の診断は、主に、X線画像、超音波検査、コンピューター断層撮影（CT）および核磁気共鳴（MRI）を含む様々なイメージング手法に基づく。超音波検査は、最も単純であり、最も非侵襲的であり、最も安価であるが、操作者の力量に依存する。CTおよびMRIも、非侵襲的であり、これらの手法の感度は最近では改善されてきている。しかしながら、これらの手法は、時間がかかり、コストもかかってしまう。

それ故、原発性膀胱ガンの患者における転移の早期診断のための、患者から得られた生物学的流体サンプル、より具体的には、血液、血清または血漿サンプルを使用した、高感度なin vitro試験に対する需要が存在する。生物学的なマーカーであって、その病態生理学的な濃度が、生物学的流体中において、膀胱ガンの転移型と顕著に相関しているが、膀胱ガンの他の型とは相関していないか、少なくとも同じ程度には相関していない生物学的マーカーは、疾患の進行の評価に有益な助けとなる。それは、侵襲的な試験の使用を制限し、より迅速な治療に適応させる助けとなりうる。

しかしながら、膀胱ガンの有望なバイオマーカーに関する最も科学的な研究は、組織サンプルを用いて実施されてきた。細胞診/膀胱鏡検査が、膀胱ガンをモニターし治療するための標準的な方法であり、何度も行う手術的な生検が、一般的な患者管理の欠くことのできない部分であることを考えると、膀胱ガンの生検は、病理学的検査および転写(mRNA)レベルでの遺伝子発現の分子生物学的検査にとって、むしろ容易に利用できる。分子生物学の研究の目的は、構成的に発現する核酸配列、および、疾患の進行の間にその発現が変化する配列を同定することである。膀胱ガンについては、変化する遺伝子発現の広範囲な試験結果が、US 6,936,417 B2に報告されている。ハイスループットマイクロアレー手法を用いた、このような研究の更なる結果が、US 2004/0076955 A1において報告されている。しかしながら、変化する遺伝子発現のパターン、例えば、腫瘍細胞における転写物(RNA)の疾患に関連する変化した発現は、必ずしも、そして予想通りにはタンパク質レベルを反映していないことがよく知られている。測定したmRNA比率と関連するタンパク質の比率との間の「一対一」の関係が存在するという仮定は、正しくないことが示されてる（例えば、Amit Mehra et al., Insights into the Relation Between mRNA and Protein Expression Patterns: I. Theoretical Considerations, Biotechnol. Bioeng. 2003, 84, 822-833; Clemens, M.J., Bommer U.A., "Translational control: the cancer connection", Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999,31, 1-23を参照）。言いかえれば、転写産物レベルの発現が増加することは、「翻訳としてのその後の工程、起こりうる必要な翻訳後修飾および分泌が生じ、対応するタンパク質が最終的に、対応する組織において、または切断形態で、周囲の生物学的な流体に見出される」ということを意味しない。生物学的流体におけるmRNAとその翻訳産物（タンパク質）の濃度との間の一対一の関係を成り立たなくする、更なる予測不能とする因子は、例えば、生物学的流体における分泌型タンパク質の安定性の欠落の可能性、ならびに、分解または関連する受容体および他の生物学的バインダーおよび基質への結合によるそのクリアランス速度である。

分子生物学的研究に基づけば、大部分の分子が、膀胱ガン中でディファレンシャルに発現し、発ガンの病態生理学的メカニズムに関与している可能性のあるものとして、同定され、それらの幾つかが、膀胱ガンの診断、再発および予後のための潜在的なマーカーとして、より詳細に調べられている。尿は、全ての型の膀胱ガンと最も直接的に接触している体液なので、大部分の研究は、尿中の有望なバイオマーカー分子の測定を目的としている。

TCCの検出および監視のための、選択したバイオマーカー（具体的には膀胱ガン抗原[BTA-Stat、BTA-TRAK]、核マトリクスタンパク質[NMP-22]、フィブリン/フィブリノーゲン分解産物[FDP]）の尿アッセイの有用性は、現在、盛んに研究されている。しかしながら、これらの試験は、高い偽陽性および偽陰性比率がもたらされる。テロメアーゼおよびマイクロサテライト分析に基づく他のより新規なアッセイの評価のための臨床試験が、進展中である（Jichlinski P, Curr Opin Urol. (2003) 13(5), 351-355; Simon MA et al., Crit Rev Oncol Hematol (2003) 47(2), 91-107）。

しかしながら、現在のところ、試験してきた尿試験の全てが、膀胱ガンを効率的に診断および監督するために、細胞診およびイメージング手法に信頼を持って置き換わる可能性を有することが示されていない。

（マトリックスメタロプロテアーゼ）
その発現が様々な型の膀胱ガンにおいて変化することが見出されている生体分子としては、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）および前記メタロプロテアーゼの活性に影響を及ぼす組織性インヒビター(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase: TIMP)がある（SUMI T et al.: “Expression of matrix metalloproteinases in human transitional cell carcinoma of the urinary bladder”, Oncol Rep. 2003, Mar-Apr; 10(2); 345-349; FURUKAWA A at al.: “Role of the matrix metalloproteinase and tissue inhibitors of metalloproteinase families in noninvasive and invasive tumors transplanted in mice with severe combined immunodeficiency”, Urology 1998, May; 51(5): 849-853を参照）。

マトリックスメタロプロテアーゼは、機能的且つ構造的に関連した分子のグループを形成し、慣用名に加えて、文字MMPおよび数字（例えば、MMP-xx）からなる体系的な略図によって特徴づけられる。ヒトにおいては、このファミリーの16のメンバーが同定されており（Kleiner et al., (1999) Cancer Chemother Pharmacol., 1999; 43 Suppl: S42-15）、非ヒト種であると考えられる場合は、MMPの数は、更に高くなる（Hideaki Nagase et al., (1999), J. Biol. Chem. 274, pp. 21491-21494によるミニレビューには20のファミリーメンバーがリストされている）。

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP：マトリキシンとも呼ばれる）は、細胞外マトリクスを破壊する機能を有する亜鉛およびカルシウム依存性エンドペプチダーゼのファミリーを構成する。

MMPは、骨および組織再構築、子宮吸収(uterine resorption)、トロンボプラスト着床(trophoblast implantation)、血管形成、胚発生および正常な創傷治癒を含む様々な正常な生理学的方法において関与している（Kleiner and Stetler-Stevenson, Cancer Chemother Pharmacol. (1999) 43 Suppl: S42-51; Nagase, H. et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 2191）。過剰に存在する場合、MMPは、また、歯周炎（Reynolds and Meikle, J R Coll Surg Edinb. (1997) 42(3): 154-60）、関節炎、アテローム性動脈硬化、組織の潰瘍、腫瘍細胞の浸潤、および転移（Birkedal-Hansen et al., Crit Rev Oral Biol Med. (1993) 4(2): 197-250)を含む数々の疾患に関連するECMの破壊の促進に関与していると考えられている。

マトリックスメタロプロテアーゼは、細胞外マトリクスの分解を媒介することによって、腫瘍浸潤に重要な役割を果たしているとことが知られている（Shiomi T et al., Cancer Metastasis Rev. (2003) 22(2-3), 145-152)。

たとえば、MMP-2およびMMP-9型のメタロプロテアーゼは、腎細胞ガン(RCC)腫瘍組織内で上昇することが報告されており、その発現レベルは、腫瘍の攻撃性と相関していることが示唆されている（Kugler et al., J Urol. 1998 Nov; 160(5): 1914-8）。

Lein M et alは、MMP-9が、RCCの患者の腫瘍組織において上昇するのに対して、MMP-2が、腫瘍組織と正常な組織との間で差異がなかったことを見出した（Int J Cancer. 2000 Mar 15; 85(6): 801-4）。

Sherief et alは、腎細胞ガンの患者に由来する尿中で、正常に分泌した細胞外マトリクス(ECM)タンパク質の分解を誘導する、マトリックスメタロプロテアーゼの酵素活性の上昇を検出することが可能であることを示した。減少した尿中のECMタンパク質は、SDS-PAGEに続く、3つの型のECMタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。酵素マトリックスメタロプロテアーゼ活性は、フルオレセインがコンジュゲートしたコラーゲンIV基質を使用して測定した（Sherief MH, J Urol. (2003) 169(4), 1530-4）。

酵素学的な測定においては、MMPは直接的には測定されていない。このような測定においては、酵素の活性を測定するのみであるので、観察された酵素活性に起因するMMPの型に関する信頼できる結論を導くことができない。

マトリックスメタロプロテアーゼの病態生理学的な役割を扱う他の研究の結果が、例えば、ICHIKAWA Y et al.: “Detection of regional lymph node metastases in colon cancer by using RT-PCR for matrix metalloproteinase 7, matrilysin", Clin Exp Metastasis. 1998 Jan; 16(1): 3-8; MASAKI T et al.: "Matrilysin (MMP-7) as a significant determinant of malignant potential of early invasive colorectal carcinomas", British Journal of Cancer (2001) 84, 1317-1321; KUEFER R et al.: "The role of an 80 kDa fragment of E-cadherin in the metastatic progression of prostate cancer", Clin Cancer Res. 2003 Dec 15; 9(17): 6447-6452; またはMEADE-TOLLIN LC et al.: “Differential expression of matrix metalloproteinases in activated c-ras-Ha-transfected immortalized human keratinocytes”, Br J Cancer. 1998 Mar; 77(5): 724-30などの出版物において報告されている。

その発現が研究されているマトリックスメタロプロテアーゼとしては、MMP-7（マトリリシン）があり、MMP-7は、また、膀胱ガン組織に関しても論じられている（例えば、Sumi T et al.（上記参照）およびFURUKAWA A et al.（上記参照）を参照）。

SUMI ET et al.（上記参照）は、MMP-7の発現を、特異的な抗体を用いた免疫染色により、移行上皮ガン（TCC）組織サンプルで評価した試験の結果を報告している。MMP-7は、TCC中で発現しており、より悪性度が低い腫瘍に比べて高い悪性度の腫瘍においてより強く発現する傾向を有していた。しかしながら、進行した段階と悪性度が低い段階との間のMMP-7の発現の顕著な差異は見出されなかった。著者らは、膀胱の悪性度が高いTCC組織におけるMMP-7発現の増加は、腫瘍浸潤および転移と関与する可能性があると指摘した。

FURUKAWA et al.（上記参照）は、非浸潤性腫瘍ラインに比べて浸潤性膀胱腫瘍ラインにおいてはMMP-2遺伝子発現が顕著により高いことを報告している。しかしながら、MMP-7（マトリリシン）の発現は、いずれの腫瘍ラインにおいても検出されなかった。

US 6,936,417 B2においては、MMP-7（マトリリシン）の発現は、浸潤性TCCと相関しておらず、浸潤性TCC-関連遺伝子として記載されていない。加えて、マトリリシン遺伝子の転写レベルは、正常の尿路上皮から表皮性腫瘍へ、更には浸潤性TCCへの移行を表す3つの異なる生検プールを比較した場合、膀胱ガンの進行の間には増加していなかった。

数々のマトリックスメタロプロテアーゼの発現が様々なガン組織において変化するという観察により、Stanley Zucker et al.のグループは、異なるガンの形態の患者の血漿においてMMPレベルを試験することとなった: ZUCKER S et al.: “Measurement of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in blood and tissues. Clinical and experimental applications”, Ann NY Acad Sci. 1999 June 30: 878: 212-27、およびZUCKER S et al.: “Measurement of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) in blood and urine: potential clinical applications”, Adv Clin Chem. 2004; 38: 37-85。

著者らは、前記した2つの論文のうちの最初の論文において、ガンの患者の血漿中のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）を評価した。彼らは、とりわけ、膀胱ガンの患者においては、MMP-7（マトリリシン）の血漿レベルが増加することを報告している。患者の病理学的状態および腫瘍の悪性度は、本論文においては特定していない。加えて、膀胱ガンの患者におけるMMP-7測定アッセイの臨床上の有用性を疑問視している。マトリリシン（MMP-7）が、腫瘍発達の初期に、すなわち腫瘍が浸潤性または転移性であることが分かっていない時点で、すでに存在しているという事実を勘案して、著者らは、マトリリシンは、転移に関与することはできず、MMP-7は、転移性膀胱ガンの診断および予後についての有益なマーカーに相当しないことを示唆している。

前記した第二の論文においては、著者らは、血液および尿におけるMMPおよびメタロプロテアーゼの組織性インヒビター（TIMP）の測定の将来有望な発展および応用について包括的なレビューを提供している。彼らは、膀胱ガンの診断および予後に有用である可能性があるものとして、メタロプロテアーゼの表を掲載しているが、このメタロプロテアーゼの表の中には、転移性膀胱ガンの診断のための候補としては、MMP-7を否定している。

ガンの進行におけるMMP-7の重要性に関しては、相反する論文が存在する。

幾つかの研究では、MMP-7の組織中の過剰発現と、膀胱および大腸ガンにおける転移との間の可能性ある相関性を示唆している。

一方、浸潤性膀胱TCCにおけるマトリリシン遺伝子の転写レベルが、正常な尿路上皮および移行上皮ガンの転写レベルと同程度であることが報告されている（US 6,936,417 B2）。同じように、Meade-Tllin et al.（上記参照）は、良性および悪性の腫瘍細胞の両方において、マトリリシンの分泌が増加していることを開示している。Kuefer et al.（上記参照）は、マトリリシンが、局所性前立腺ガンと比較して、転移性ガンにおいて顕著に過小発現することを報告している。

US 6,936,417 B2 US 2004/0076955 A1

Cohen SC et al., Urol. Clin. N. Am (1992) 19, 421-428 Boring CC et al., CA Cancer J. Clin (1994) 44, 7-26 Stein et al., J Urol (1998) 160, 654-659 Syrigos KN et al., Hybrid Hybridomics (2004) 23(6), 335-42 Amit Mehra et al., Insights into the Relation Between mRNA and Protein Expression Patterns: I. Theoretical Considerations, Biotechnol. Bioeng. 2003, 84, 822-833 Clemens, M.J., Bommer U.A., "Translational control: the cancer connection", Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999,31, 1-23 Jichlinski P, Curr Opin Urol. (2003) 13(5), 351-355 Simon MA et al., Crit Rev Oncol Hematol (2003) 47(2), 91-107 SUMI T et al.: "Expression of matrix metalloproteinases in human transitional cell carcinoma of the urinary bladder", Oncol Rep. 2003, Mar-Apr; 10(2); 345-349 FURUKAWA A at al.: "Role of the matrix metalloproteinase and tissue inhibitors of metalloproteinase families in noninvasive and invasive tumors transplanted in mice with severe combined immunodeficiency", Urology 1998, May; 51(5): 849-853 leiner et al., (1999) Cancer Chemother Pharmacol., 1999; 43 Suppl: S42-15 Hideaki Nagase et al., (1999), J. Biol. Chem. 274, pp. 21491-21494 Kleiner and Stetler-Stevenson, Cancer Chemother Pharmacol. (1999) 43 Suppl: S42-51 Nagase, H et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 2191 Reynolds and Meikle, J R Coll Surg Edinb. (1997) 42(3): 154-60 Birkedal-Hansen et al., Crit Rev Oral Biol Med. (1993) 4(2): 197-250 Shiomi T et al., Cancer Metastasis Rev. (2003) 22(2-3), 145-152 Kugler et al., J Urol. 1998 Nov; 160(5): 1914-8 Sherief MH, J Urol. (2003) 169(4), 1530-4 ICHIKAWA Y et al.: "Detection of regional lymph node metastases in colon cancer by using RT-PCR for matrix metalloproteinase 7, matrilysin", Clin Exp Metastasis. 1998 Jan; 16(1): 3-8 MASAKI T et al.: "Matrilysin (MMP-7) as a significant determinant of malignant potential of early invasive colorectal carcinomas", British Journal of Cancer (2001) 84, 1317-1321 KUEFER R et al.: "The role of an 80 kDa fragment of E-cadherin in the metastatic progression of prostate cancer", Clin Cancer Res. 2003 Dec 15; 9(17): 6447-6452 MEADE-TOLLIN LC et al.: "Differential expression of matrix metalloproteinases in activated c-ras-Ha-transfected immortalized human keratinocytes", Br J Cancer. 1998 Mar; 77(5): 724-30 ZUCKER S et al.: "Measurement of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in blood and tissues. Clinical and experimental applications", Ann NY Acad Sci. 1999 June 30: 878: 212-27 ZUCKER S et al.: "Measurement of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) in blood and urine: potential clinical applications", Adv Clin Chem. 2004; 38: 37-85

それ故、MMP-7の発現と、腫瘍の悪性挙動における潜在的な役割との間の関係は、議論の余地がある。

発明者は、尿生殖路のガンにおけるMMP-7（マトリリシン）の役割および重要性についてのより徹底的な研究の構想において、他の形態の膀胱ガンと明白に異なり、転移形態の膀胱ガンと循環液（血液、血清、血漿）におけるMMP-7のレベルの明確且つ診断上有意な相互関係を見出し、このような知見は、大変驚くべきことであり、前記した従来技術によっては先例のないことであった。

本発明が基づく知見は、循環マトリリシンのレベルが、前記で論じた従来技術の診断方法の欠陥の少なくとも幾つかを克服することができるパラメーターを構成し、高い優位性を持って、膀胱ガン患者の転移の予測の判断材料または検出するものとして使用することができることを示唆している。同じように、循環MMP-7のレベルを、膀胱ガン患者の浸潤性腫瘍を検出し、膀胱ガンの進行をモニターするのに使用することができる。

結果として、請求項１によれば、本発明は、ヒト患者における転移性膀胱ガンの検出、早期検出、モニターおよび/または予後のためのバイオマーカーとしての、場合によっては、少なくとも1つの更なる確立された請求項１０に記載の腫瘍マーカーの測定/評価と組み合わせた、循環マトリックスメタロプロテアーゼ7(MMP-7)ならびに/またはMMP-7免疫応答性を有する前駆体および断片の使用を提供する。

更に、本発明は、請求項２によれば、患者の循環液に由来するサンプルにおいて、そのレベルが転移性膀胱ガンの存在および/または重篤度の指標であるバイオマーカーを測定すること、ならびに、測定したバイオマーカーのレベルを、転移性膀胱ガンの存在または重篤度と関連付けることによる、ヒト患者における転移性膀胱ガンを診断またはモニターするためのin vitro方法であって、前記測定したバイオマーカーが、測定可能なMMP-7免疫応答性として直接的に測定されるMMP-7である、方法を提供する。

このような方法の幾つかの適したまたは好ましい実施態様を、請求項3から9に記載する。

以下の実施例において、より詳細に説明するように、本発明者は、転移性が認められていない38人の膀胱ガンの患者の集団において、少ない割合（18.4％）のみのMMP-7が、カットオフ値を上回ることを実証した。一方、本発明においては、同じカットオフ値を使用して、膀胱ガン患者において、循環MMP-7と転移との間の明確な相関関係が存在する。

本出願において報告された結果に基づけば、MMP-7は、患者へガン治療を著しく適応するための、膀胱ガンの転移の検出を可能とする新規の血清/血漿マーカーの候補である。

膀胱ガンの患者においてMMP-7レベルを測定することは、膀胱ガンの進行およびフォローアップをモニターするのに、そして、ガン治療の効率を求めるのに有用且つ役立ちうる。

それ故、本発明は、その態様の1つにおいて、膀胱ガン患者に由来する血液および/または血清および/または血漿サンプルを、MMP-7について定期的に分析し、このようなサンプル中のMMP-7のレベルを、好ましくは正常なヒトコントロールの同じサンプルタイプまたは非転移性膀胱ガンの患者のサンプル中のMMP-7のレベルと比較することを含む、膀胱ガン患者における転移を診断または検出するin vitro方法であって、正常なヒトコントロールまたは非転移性膀胱ガンの患者に対する、前記患者のMMP-7レベルの増加が、転移した膀胱ガンと関連している、方法を提供する。

原発性膀胱ガンの患者における増加したMMP-7のレベル場合は、前記の方法は、アジュバント療法の効率を求めるのに使用され、膀胱ガン患者に由来する血液および/または血清および/または血漿サンプル中のMMP-7および/またはプロ-MMP-7の濃度を測定することによる、定期的なin vitro試験を実施することを含み、基礎レベルに戻ったMMP-7および/またはプロ-MMP-7の血清濃度は、治療効果を示す。

そのほかの態様においては、本方法は、また、転移性の膀胱ガンの患者のための治療の効果を求めるためにも使用され、膀胱ガン患者に由来する血液および/または血清および/または血漿サンプル中のMMP-7および/またはプロ-MMP-7の濃度を測定することによる、定期的なin vitro試験を実施することを含み、MMP-7および/またはプロ-MMP-7のレベルが減少したことは、治療に対する鋭敏性または成功を示す。

本方法は、また、膀胱ガンの患者において浸潤性腫瘍を検出するためにも使用することができ、各試験が、表在性膀胱ガンを示す患者に由来する血液または血清および/または血漿サンプル中のMMP-7の濃度を測定することを含む、定期的なin vitro試験を実施することを含み、試験間のMMP-7濃度の増加は、患者において浸潤性となった腫瘍を示す。

他の態様によれば、本発明は、転移性膀胱ガンの診断に潜在的に相関している1を超えるバイオマーカーの測定の統計学的分析のためのコンピュータープログラムを使用した、
少なくとも1つの更に確立された腫瘍マーカーの測定と組み合わせた共マーカー（co-marker）としての、膀胱ガンであることが疑われる患者の循環液中における、MMP-7、MMP-7の前駆体および/またはMMP-7免疫応答性を有するMMP-7の断片の測定を包含する。例示のみとして、前記少なくとも1つの更に確立された腫瘍マーカーは、CEA、AFP、TPA、CYFRA 21-1、CA 19-9、CA 125、CA 72-4(TAG-72)、CA 15-3、CA 549、hCG、MCA、NSE、PSA、SCC、LDH(乳酸脱水素酵素)およびPAL(アルカリホスファターゼ)からなる群から選択することができる。

本発明を、例示目的のみで、臨床での測定および図に基づいて、更に説明する。

図1は、実施例で記載したアッセイを用いた、膀胱ガンの患者の血清中のMMP-7レベルの測定についての標準曲線である。図2は、転移性が認められていない原発性膀胱ガンの患者、転移性膀胱ガンの患者および健康なコントロールの血清中のMMP-7レベルの測定結果を図示したものである。図3Aは、転移性膀胱ガンの患者の血清中のMMP-7レベルの増加の測定の臨客観的な診断の有効性（感度vs特異性）を示すROC（Receiver-Operating Characteristics）曲線である。図3Bは、転移性が認められていない原発性膀胱ガンの検出のための血清MMP-7レベルの測定の、芳しくない診断の値（感度vs特異性）を示すROC（Receiver-Operating Characteristics）曲線である。

（材料および方法）
[血清サンプル]
全ての血清サンプルを、原発性膀胱ガンであると診断された患者（n=38）、転移性膀胱ガンであると診断された患者（n=60）、または（各個人にインフォームドコンセントを行った後の）正常なボランティアドナー（n=111）のいずれから取り出した様々なヒトの血液サンプルから単離した。

[イムノアッセイ]
Human MMP-7 Quantikine ELISA Kit(DMP700)(R&D Systems Europe Ltd. Abingdon UK)を使用して、R&D Systemsのプロトコールに従って、アッセイを実施した。

アッセイは、定量サンドイッチ酵素イムノアッセイ手法を使用した。MMP-7に特異的なモノクローナル抗体を、マイクロプレートに事前にコーティングした。標準およびサンプルを、ウェルにピペッティングし、MMP-7を固定化した抗体によって結合させた。非結合の物質を洗浄除去した後、酵素が結合したMMP-7特異的ポリクローナル抗体を、ウェルに加えた。洗浄して、非結合の抗体-酵素試薬を取り除いた後、基質溶液をウェルに加え、最初の段階において結合したトータルのMMP-7（プロMMP-7および/または活性MMP-7）の量に応じて、発色させた。発色を停止させ、発色の程度を、FLUOstarマイクロプレートリーダー（BMG Labtechnologies, GmbH, Offenburg, Germany）によって450nmの吸光度で測定した。

アッセイは、製造元R&D Systemsが規定したアッセイプロトコールに従って、実施した。

（測定および結果）
[ａ）標準曲線および膀胱ガン(BC)の患者の血清中のMMP-7レベルの測定]
標準曲線は、組み換えヒトMMP-7（Quantikine kit standards）を使用して得た。組み換えヒトMMP-7は、キャリブレーター希釈液RD6-28（Quantikine kit）中で希釈し、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5および10ng/mlのMMP-7標準濃度を得た。

10ng/mlより濃いMMP-7濃度のサンプルは、キャリブレーター希釈液RD6-28（Quantikine kit）を用いて希釈し、アッセイのダイナミックレンジ内の濃度を有するサンプルを調製した。

標準またはサンプル（50μl）およびアッセイ希釈液（100μl）を、マイクロタイタープレートのウェルに加えた。横方向の軌道のシェーカー上で室温で2時間インキュベーション後、各ウェルを、洗浄バッファー（400μl）を用いて4回洗浄した。200μlのMMP-7コンジュゲートを、各ウェルに加え、シェーカー上で室温で2時間マイクロタイタープレートのインキュベーションを行った。4回の洗浄工程および各ウェルへの基質溶液（200μl）の添加後に、マイクロプレートを30分間室温でインキュベートした。反応を、停止溶液（50μl）を用いて停止させ、各ウェルの吸光度を、FLUOstarマイクロプレートリーダーを用いて450nmで測定した。

正常なヒトの血清（n=111）をコントロールサンプルとして使用した。標準曲線を図1に示す。

転移性膀胱ガンの患者（BC転移）は、転移性膀胱ガンが認められていない原発性膀胱ガンの患者（BC）および正常なコントロールと比較して、顕著に高いレベルの血清MMP-7を有していた（表1および図2）。

[b)統計学的分析およびROC曲線]
臨床的感度対臨床的特異性の図表を、ROC(Receiver-Operating Characteristics)曲線によって表わす。

臨床的感度および臨床的特異性の計算については、95%信頼区間を、2項分布に基づいて測定した（Besnard et Morin, In: Immunostat, Paris Edition Nucleon, 227-251 (1997)）。

カットオフ値4.78ng/mlを使用したところ、転移性膀胱ガンと健康な対象との間の区別については、血清MMP-7濃度は、75%の感度および94.6%の特異性を有していた（表1および図3a）。しかしながら、同じカットオフ値を使用すると、転移が認められていない原発性膀胱ガンにおけるMMP-7測定の臨床的感度は、たった18．4%であった（表1および図3b）。

ROC分析によって計算したAUC(Area under curve)値は、転移性膀胱ガンおよび転移が認められていない原発性膀胱ガンについては、それぞれ、0.932および0.596であった（図3aおよび3b）。0.932のAUCを有する試験は正確であるのに対して、0.596のAUCを有する試験は、偶然も同然である。

これらのデータによって、循環MMP-7（血清または血漿中のMMP-7）を、任意に他の腫瘍マーカーまたは他の臨床パラメーターと組み合わせて、膀胱ガン転位（危険性）の測定（検出）および膀胱ガン患者における転移の早期診断のためのマーカーとして、使用することができることが証明された。

Claims

ヒト患者における転移性膀胱ガンの検出、早期検出、モニターおよび/または予後のためのバイオマーカーとしての、循環マトリックスメタロプロテアーゼ7（MMP-7）、循環MMP-7の前駆体（プロ-MMP-7）、および／またはMMP-7免疫応答性を有する循環MMP-7の断片の使用であって、前記のMMP-7、プロ-MMP-7、および／またはMMP-7免疫応答性を有するMMP-7断片のレベルの増加が、転移性膀胱ガンの悪性挙動と正に相関している、使用。
ヒト患者の循環液に由来するサンプルにおいて、そのレベルが転移性膀胱ガンの存在および/または重篤度の指標であるバイオマーカーを測定すること、ならびに、測定したバイオマーカーのレベルを、転移性膀胱ガンの存在または重篤度と関連付けることによる、前記患者における転移性膀胱ガンを診断またはモニターするための、in vitro方法であって、前記測定されるバイオマーカーが、測定可能なMMP-7免疫応答性として直接的に測定されるMMP-7であり、前記MMP-7のレベルの増加が、転移性膀胱ガンの悪性挙動と正に相関している、方法。
膀胱ガンの患者から得られた血清または血漿サンプルにおいて、選択した連続的な時間間隔でMMP-7免疫応答性のレベルを測定することを含む、前記患者における、転移性膀胱ガンの進行をモニターするための方法であって、経時的なMMP-7の測定レベルの変化が、転移性膀胱ガンの進行の指標である方法として実施される、請求項２に記載の方法。
前記患者から得られた血清または血漿サンプルにおいて、選択した連続的な時間間隔でMMP-7免疫応答性のレベルを測定することを含む、転移性膀胱ガンの治療の効果を測定するための方法であって、測定間のMMP-7の測定レベルの減少が、治療の効果を示す方法として実施される、請求項２に記載の方法。
MMP-7免疫応答性を、特定のリガンドアッセイ手法を用いて選択的に測定する、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
MMP-7免疫応答性を、MMP-7に特異的に結合する少なくとも1つの特異的なリガンドを使用するアッセイを用いて測定する、請求項５に記載の方法。
測定されるMMP-7免疫応答性が、MMP-7それ自身および/またはその酵素前駆体形態（プロ-MMP-7）および/またはMMP-7免疫応答性を有するMMP-7断片の存在に起因しうる、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
転移性膀胱ガンの診断に潜在的に相関している1を超えるバイオマーカーの測定の統計学的分析のためのコンピュータープログラムを使用して、MMP-7およびMMP-7免疫応答性のそれぞれの測定結果が、診断目的用に、少なくとも1つの更なる確立された腫瘍マーカーの測定結果と組み合わせられる、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも1つの更なる確立された腫瘍マーカーが、CEA、AFP、TPA、CYFRA 21-1、CA 19-9、CA 125、CA 72-4(TAG-72)、CA 15-3、CA 549、hCG、MCA、NSE、PSA、SCC、LDH、PALからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
ヒト患者における転移性膀胱ガンの検出、早期検出、モニターおよび/または予後のための、循環マトリックスメタロプロテアーゼ7（MMP-7）、循環MMP-7の前駆体（プロ-MMP-7）および／またはMMP-7免疫応答性を有する循環MMP-7の断片の、確立された腫瘍マーカーと組み合わせての共バイオマーカーとしての使用であって、前記のMMP-7、プロ-MMP-7、および／またはMMP-7免疫応答性を有するMMP-7断片のレベルの増加が、転移性膀胱ガンの悪性挙動と正に相関している、使用。