JP5154221B2 - 中温性海洋細菌由来のエクソポリサッカリド(eps)の硫酸化脱重合誘導体、その調製方法、及び組織再生におけるその使用 - Google Patents
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Description
−100000g/mol以下の低分子量の脱重合誘導体を得るために、前記天然EPSのフリーラジカル脱重合からなる工程;
−その後、硫酸化ポリサッカリド誘導体の全重量に対して10から45重量%の間のスルフェート基置換の度合いを有する硫酸化ポリサッカリド誘導体を得るのに十分な量で少なくとも一つの硫酸化剤の添加を含む、任意に凍結乾燥した脱重合誘導体の硫酸化からなる工程であって、その後任意に透析される工程。
−好ましくは反応体積の1/10に等しい割合で水を添加し、例えば水酸化ナトリウム(3M)のような塩基性化剤で反応媒体のpHを9に調節する;または
−好ましくは、塩化ナトリウム飽和アセトンまたはメタノールの存在下で沈降し、次いで水中に沈降物を溶解する。
−20から70重量%、好ましくは30から60重量%、より好ましくは38から57重量%の中性モノサッカリド;
−5から60重量%、好ましくは6から50重量%、より好ましくは8から42重量%の酸性モノサッカリド;
−0から1重量%のアミノ糖。
−0から5重量%、好ましくは0から1重量%の中性モノサッカリド;
−20から50重量%、好ましくは25から40重量%、より好ましくは30から32重量%の酸性モノサッカリド;
−20から50重量%、好ましくは25から40重量%、より好ましくは30から35重量%のアミノ糖;
−0から15重量%、好ましくは4から8重量%、より好ましくは5から6重量%のN−アセチル化基。
方法:
Wiehelman K等(Anal. Biochem. 1988, 175: 231-237)に記載されたBCA(ビシンコニン酸)法によって、タンパク質含量を測定した。
(1)HE 800 DRは、低分子量ポリサッカリド誘導体に対応する;
(2)HE 800 DRSは、低分子量硫酸化ポリサッカリド誘導体に対応する;
(3)HE 800 DRNSは、低分子量N−脱アセチル化及び硫酸化ポリサッカリド誘導体に対応する。
(i)DRSシリーズについては、フリーラジカル脱重合(DR)からなる第一の工程及び硫酸化工程を適用する;並びに
(ii)DRNSシリーズについては、フリーラジカル脱重合(DR)からなる第一の工程、引き続きN−脱アセチル化工程(N)及び硫酸化工程(S)を適用する。
熱水起源のHE 800の海洋細菌から得られる500mgのEPSを、EP 975 791に記載された方法に従って生産し、凍結乾燥する。天然EPSを100mlの水に一晩ゆっくりと再水和し、被覆したガラスリアクターに導入する。16mg/mlで酢酸銅の溶液の形態で、金属触媒を反応媒体に添加する。媒体の温度を60℃とする。反応を通じて磁性攪拌を維持する。10Nの濃縮水酸化ナトリウムで7.5から8の間のpHに反応媒体を供する。反応媒体のpHをモニターし、水酸化ナトリウム溶液の添加を通じて調節する。
1gのポリサッカリド誘導体当たり1gのホウ化水素ナトリウムを少量の水中に溶解し、次いで直接リアクターに添加する。反応は、環境温度で2から20時間の期間攪拌しながら実施する。10Nの酢酸に添加によりそれを停止する。銅による黒っぽい沈降物が反応の間で形成される。
還元反応の間で形成された沈降物を除去するため、3μmのガラスマイクロ繊維からなるフィルターを備えたブフナー漏斗を通じて、前記ポリサッカリド誘導体を含む溶液を濾過する。次いで、0.4meq/mlの容積を有するChelex(登録商標)樹脂に前記ポリサッカリド誘導体を含む溶液を通過させることにより、残余の銅を除去する。4〜5ml/分の流速で、事前に不動態化した200mlの樹脂のカラム(25×400mm)を通じて、前記ポリサッカリド誘導体を含む溶液を濾過する。排出液では、前記ポリサッカリド誘導体を含む溶液は酸性のpH10を有する。
1000g/molのPall膜を備えたPellicon 2限外濾過システム(Millipore)を通じて、前記ポリサッカリド誘導体を含む溶液を限外濾過する。溶液の伝導度(4〜5mS)を限外濾過を通じて測定する。濾液が100μS未満の安定値に達した際に、溶液を中性pHに戻す。次いで濃縮して凍結乾燥する(CIRP凍結乾燥器)。一度凍結乾燥されたら、得られたポリサッカリド誘導体を特徴付けする。
原理:N−及びO−スルフェート基の観点でオシド単位を同時に置換する目的で、ポリサッカリドHE 800 DRをN−脱アセチル化する。HE800誘導体のN−脱アセチル化の工程を、大量の製品に対して実施する。
259mgのEPS HE 800 DRを10mlの水中に溶解し、磁性攪拌を備えた丸底フラスコに配置する。263mgのNaBH4を1.25mlの水中に溶解し、次いでEPS HE 800 DRの溶液に添加する。混合物の温度が80℃に達した際に、1.25mlの10N NaOHを添加する。溶液の最終濃度は、12.5mlの全体積について、水酸化ナトリウムに対して1Nであり、NaBH4に対して2%である。
塩の形態のポリサッカリドの調製
50mgのEPSを20mlのH2Oに溶解する。前記ポリサッカリド誘導体を、Dowex樹脂カラムでの溶出によりH+形態に配置する。溶出は水で実施し、pHが酸性、好ましくは5未満を維持する限り、溶出物を回収する。所望の塩基(ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、水酸化ナトリウム)で、pHを迅速に6.5に調節する。次いで塩の形態のポリサッカリド誘導体を凍結乾燥する。
環境温度で2時間、次いで45℃の温度で2時間、穏やかに攪拌しながら(250rpm)で100mlの無水DMF中に、塩の形態のポリサッカリド誘導体を溶解する。
得られた各種のEPS HE 800誘導体の分子量(ピークの極大値で測定したクロマトグラフィーによる分子量;Mw:重量平均分子量;Mn:数量平均分子量)及び多分散度(I=Mw/Mn)を、Superdex(登録商標)200カラムまたはSuperdex(登録商標)Peptideカラム(AMERSHAM)を使用して、0.1ml/分の流速で0.1M水性酢酸アンモニウムで、Biotechシステムでの高速立体排除クロマトグラフィー(HPSEC)により測定した。以下のポリサッカリドスタンダードでカラムを平衡化した:プルラン:758000−5900g/mol(Polymer Laboratories, Interchim)、市販されていないスタンダードポリサッカリド:4000;3000;及び1500g/mol;メレジトース:522g/mol(FLUKE)、スクロース:342g/mol;グルコース:180g/mol(SIGMA)。この結果をAramis(登録商標)ソフトウェア(Varian, France)を使用して分析する。
(1)GY 785 DRは、脱重合工程の後に得られる低分子量ポリサッカリド誘導体に対応する;
(2)GY 785 DRSは、脱重合工程、引き続き硫酸化工程の後に得られる低分子量ポリサッカリド誘導体に対応する。
前述の工程において上記得られた400mgの硫酸化EPS GY 785を95mlの水に溶解した。溶解後、36mgの酢酸銅一水和物(10−3M)を含む2mlの触媒溶液を添加した。次いでリアクターの温度を60℃にもたらし、1Mの水酸化ナトリウムの添加によりpHを7.5に調節する。過酸加水の0.115%(v/v)溶液を1ml/分の流速で添加し、1M水酸化ナトリウムの添加によりpHを約7.5に調節した。1時間後反応を停止した。
特許FR 2 755 142の実施例1に記載された方法により、熱水起源のAlteromonas infernusの海洋細菌によって生産された500mgのEPS GY 785凍結乾燥物を、環境温度で2時間、次いで45℃の温度で2時間穏やかに攪拌(250rpm)しながら、100mlの無水DMFに溶解した。
(1)HYD 721 DRは、脱重合工程の後に得られる低分子量ポリサッカリド誘導体に対応する;
(2)HYD 721 DRSは、本発明に係る化学的硫酸化によって硫酸化された低分子量ポリサッカリド誘導体に対応する。
増殖アッセイで使用される硫酸化ポリサッカリド誘導体は、実施例2及び3のプロトコールに従って調製され特徴づけされた。
100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2μg/mlのフンギゾンを含み、10%の胎児ウシ血清(FCS)を補ったダルベッコMEM Glutamax I培養培地において、ウェル当たり10000細胞の密度で二つの培養皿に細胞を接種する。
再構成化または格子状結合組織は、中和の後、重合して線維芽細胞を含むゲルを形成する酸可溶性I型コラーゲンからなる。コラーゲン線維の重合のより好適な制御を有するため、格子の調製は冷蔵条件下で実施される。
7.1.プロトコール
ウェル当たり40000細胞の密度で、細胞を培養皿に蒔き、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2μg/mlのフンギゾンを含み、胎児ウシ血清(FCS)を補ったダルベッコMEM Glutamax I培養培地でコンフルエンスにする。
図5のグラフは、IL−1βの存在下または不存在下で、低分子量硫酸化ポリサッカリド誘導体の存在下で線維芽細胞を培養すると、MMP−2分泌が阻害されることを示す。
図6は、HE 800 DRNSの添加が、線維芽細胞によるMMP−3の分泌を穏やかに減少することを示し、この分泌はベースライン(写真a)か、または炎症性サイトカインIL−1βによって誘導される(写真b)。写真(a)は、血清を含まない培地(レーン1)及び10μg/mlのEPS誘導体を含む血清を含まない培地(レーン2)における48時間インキュベーションされたコンフルエントな線維芽細胞を示す;写真(b)は、100U/mlのIL−1βを含む血清を含まない培地(レーン1)及び10μg/mlのEPS誘導体と100U/mlのIL−1βを含む血清を含まない培地(レーン2)における48時間インキュベーションされたコンフルエントな線維芽細胞を示す。
1:コントロール=非処理培養物
2:100U/mlのHE 800 DRNSで処理された培養物。
8.1.原理
補体は、伝統的な経路、代替的な経路、及びマンノース結合レクチン(MBL)経路の3の異なる種類の活性化経路によって活性化でき、各種のメカニズムを解して、C3及びC5を活性化できるC3/C5コンベルターゼという同一の基質を有する酵素の形成を生ずる。活性化反応は、カスケードとして生ずる:一つの成分は、次の成分の活性化を誘導する酵素活性を獲得する等。
9.1.プロトコール
粉砕した骨髄物質から間質細胞を得て、この粉砕物質を遠心分離して細胞ペレットを回収する。10%ウマ血清、10%胎児ウシ血清、200nM L−グルタミン(4ml)、100×MEMビタミン(Gibco brl)(4ml)、7.5%Na2HCO3(4ml)、50×必須アミノ酸とL−グルタミン(Gibco brl)(4ml)、100×ピルビン酸ナトリウム(4ml)、100×非必須アミノ酸(Gibco brl)(1.6ml)を含む、全体を1×McCoy培地(Gibco brl)で希釈した500mlの培地からなる培養培地に細胞を再懸濁する。
Claims (25)
- Alteromonas属、Pseudoalteromonas属またはVibrio属の海洋細菌によって分泌される海洋天然エクソポリサッカリド(EPS)の低分子量硫酸化ポリサッカリド誘導体を含む、真皮及び歯肉の結合組織の疾患の治療において使用するための、創傷治癒活性を有する製薬組成物または医薬であって、前記低分子量硫酸化ポリサッカリド誘導体が、
−25000g/mol以下の分子量、2未満の多分散指数、及び10から45重量%の間のスルフェート基置換度を有し、
−以下の工程:
−100000g/mol以下の低分子量の脱重合誘導体を得るために、前記天然EPSのフリーラジカル脱重合からなる工程;
−その後、硫酸化ポリサッカリド誘導体の全重量に対して10から45重量%の間のスルフェート基置換度を有する硫酸化ポリサッカリド誘導体を得るのに十分な量で少なくとも一つの硫酸化剤の添加を含む、脱重合誘導体の硫酸化からなる工程
を含む方法によって得られる、製薬組成物または医薬。 - 前記方法が、以下のうちの1つ以上の工程:
硫酸化の前の脱重合誘導体の凍結乾燥、硫酸化の前の脱重合誘導体の還元、硫酸化の前の脱重合誘導体のN−脱アセチル化、硫酸化の後の硫酸化ポリサッカリド誘導体の凍結乾燥、硫酸化の後の硫酸化ポリサッカリド誘導体のN−脱アセチル化、硫酸化の後の硫酸化ポリサッカリド誘導体の透析、及びこれらのあらゆる組合せ
をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の製薬組成物または医薬。 - 前記フリーラジカル脱重合が、Cu++、Fe++、及びCr+++イオン、並びにCr2O7 2−アニオンから選択される金属触媒の存在下で、過酸化物及び過酸から選択される酸化剤の溶液を、前記天然EPSに加えることによって実施されることを特徴とする、請求項1に記載の製薬組成物または医薬。
- 前記酸化剤が、0.1から0.5重量%の間の濃度を有する過酸化水素の溶液であり、1000分のV1ml/分から10分のV1ml/分の間の流速で添加され、ここでV1は過酸化水素の溶液が添加される天然EPSを含む反応媒体の容積であることを特徴とする、請求項3に記載の製薬組成物または医薬。
- 少なくとも一つの前記硫酸化剤が、硫酸ピリジン、硫酸トリエチルアミン、硫酸ジメチルホルムアミド、または硫酸トリメチルアミンの錯体から選択されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 少なくとも一つの前記硫酸化剤が、前記脱重合誘導体の質量の4から6倍を占める量で添加され、乾燥形態または無水溶媒中の溶液中である脱重合化誘導体に添加されることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 前記Alteromonas属の海洋細菌がGY785株であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 前記Alteromonas属またはPseudoalteromonas属の海洋細菌が、HYD 657、HYD 708、HYD 721、HYD 1545、HYD 1644、ST 716、及びMS 907から選択されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 前記Vibrio属の海洋細菌がHE800株の細菌であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 前記Alteromonas属またはPseudoalteromonas属の海洋細菌によって分泌される前記天然EPSが、
−20から70重量%の中性モノサッカリド;
−5から60重量%の酸性モノサッカリド;及び
−0から1重量%のアミノ糖
を含むオシド組成を有することを特徴とする、請求項8に記載の製薬組成物または医薬。 - 前記Vibrio属の海洋細菌によって分泌される前記天然EPSが、
−0から5重量%の中性モノサッカリド;
−20から50重量%の酸性モノサッカリド;
−20から50重量%のアミノ糖;及び
−0から15重量%のN−アセチル化基
を含むオシド組成を有することを特徴とする、請求項9に記載の製薬組成物または医薬。 - 前記天然EPSが、0から15重量%のタンパク質含量を有することを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 二次元培養物、または再構成化された真皮及び歯肉の結合組織における線維芽細胞の増殖を刺激するために使用されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 真皮及び歯肉の結合組織の再構成化及びリモデリングを促進するために使用されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 真皮及び歯肉の結合組織の線維芽細胞による炎症前サイトカイン、インターロイキン1β及び/またはTNF−αの分泌を阻害するために使用されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 真皮及び歯肉の結合組織の線維芽細胞による炎症前サイトカイン、ゼラチナーゼA(MMP−2)及びストロメリシン1(MMP−3)の分泌を阻害することを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 真皮及び歯肉の結合組織に影響する、感染性、新生物性、または自己免疫疾患のような炎症性疾患の治療のために使用されることを特徴とする、請求項1から16のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 筋線維芽細胞の損傷に対する線維芽細胞の増殖を刺激することを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の製薬組成物または医薬。
- 真皮及び歯肉の結合組織の過栄養性創傷治癒工程または線維症疾患の予防または治療のために使用されることを特徴とする、請求項18に記載の製薬組成物または医薬。
- 真皮及び歯肉の結合組織の組織または細胞治療における、細胞の異種集団中の他のサブ集団の損失に対して、間葉細胞となることが企図される骨髄細胞の増殖を選択的に刺激するために使用されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の誘導体の製薬組成物または医薬。
- いずれかの適切な賦形剤と組み合わせた、請求項1から12のいずれか一項に規定する低分子量硫酸化ポリサッカリド誘導体を少なくとも一つ含む製薬組成物または医薬。
- FGF(線維芽細胞増殖因子)、TGFβ、BMP(骨形態形成タンパク質)、またはCTGF(結合組織増殖因子)である、前記製薬組成物中に存在する一つ以上の増殖因子と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項21に記載の製薬組成物または医薬。
- 注射可能な形態で存在することを特徴とする、請求項21または22に記載の製薬組成物または医薬。
- いずれかの適切な賦形剤と組み合わせた、請求項1から12のいずれか一項に規定する低分子量硫酸化ポリサッカリド誘導体を少なくとも一つ含むことを特徴とする、化粧品または皮膚科学的組成物。
- ゲル、クリーム、軟膏、エマルション、または溶液の形態で存在することを特徴とする、請求項21、22、または24に記載の組成物。
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