JP5144605B2 - マルチカラーリアルタイムpcr用の改良されたシステム - Google Patents
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Description
本発明は、リアルタイムPCRの分野に関する。特に、本発明は、多重リアルタイムPCRを行うためのシステムに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNAの増幅は、分子生物学において基本的な技術である。PCRによる核酸分析は、試料の調製、増幅、および産物の分析を必要とする。これらの工程は、通常、順次に行われるが、増幅および分析は同時に行い得る。DNA色素または蛍光プローブは、増幅前にPCR混合物に加えることができ、これを用いて、増幅の間にPCR産物を分析することができる。試料の分析は、同一機器内の同一試験管内での増幅と同時に行われる。この組み合わされたアプローチは試料の取扱を減少させ、時間を節約し、かつそれに続く反応のための産物の汚染の危険性を大いに低下させる。なぜなら、さらなる分析のためにその閉じた容器から試料を取り去る必要がないからである。増幅と産物分析とを組み合わせる概念は「リアルタイム」PCRとして知られるようになった。例えば、米国特許第6,174,670号参照。
いくつかのタイプのリアルタイム検出サーモサイクラーが当該分野で公知である。
一般に、増幅されたDNAのリアルタイム検出用の異なるフォーマットが存在し、そのうち以下のものが周知であり、当該分野で通常に用いられる。
二本鎖増幅産物の量は、通常、分析する試料に元来存在する核酸の量を超えるので、適当な波長での励起に際して、二本鎖DNAに結合した場合にのみ増強された蛍光を示す二本鎖DNA特異的色素を用いることができる。好ましくは、SybrGreenIIのように、例えば、PCR反応の効率に影響しない色素のみを用いることができる。
一本鎖ハイブリダイゼーションプローブは2つの成分で標識される。第一の成分が適当な波長の光で励起されると、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、吸収されたエネルギーは第二の成分、いわゆるクエンチャーに移される。PCR反応のアニーリング工程の間に、ハイブリダイゼーションプローブは標的DNAに結合し、それに続く伸長期の間にTaqポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光成分およびクエンチャーは、相互に空間的に分離され、かくして、第一の成分の蛍光発光を測定することができる(米国特許第5,538,848号)。
また、これらのハイブリダイゼーションプローブは第一の成分で、およびクエンチャーで標識され、標識は、好ましくは、プローブの両端に位置する。プローブの第二の構造の結果として、双方の成分は溶液中で空間的に近傍にある。標的核酸へのハイブリダイゼーションの後、双方の成分は、適当な波長の光での励起の後、第一の成分の蛍光発光を測定することができるように相互に分離される(米国特許第5,118,801号)。
この検出フォーマットは、5’または3’末端いずれかにおける単一の蛍光色素で標識された単一のオリゴヌクレオチドよりなる(WO 02/14555)。2つの異なる設計は、以下のオリゴ標識に用いることができる:G-消光プローブおよびニトロインドール−脱消光プローブ。
FRETハイブリダイゼーションプローブテストフォーマットは、全ての種類の均一なハイブリダイゼーションアッセイで特に有用である(Matthews, J.A.,およびKricka, L.J., Analytical Biochemistry 169(1988)1-25)。それは、同時に用いられ、増幅された標的核酸の同一ストランドの隣接部位に相補的な2つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブの対によって特徴付けられる。双方のプローブは異なる蛍光成分で標識される。適当な波長の光で励起されると、第一の成分は吸収されたエネルギーを、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に従って、第二の成分に移動させ、そのため、双方のハイブリダイゼーションプローブが検出される標的分子の隣接位置に結合すると、第二の成分の蛍光発光を測定することができる。
〔1〕−−蛍光化合物を含む反応容器の方に光を放射し得る少なくとも1つの光源、
−反応容器から光を受容するように配置され、光繊維束に伝達するために該光を均一に分布させ得る光パイプ
を含む励起ユニット;
−少なくとも5つの別個の蛍光検出実体を含む検出ユニット、該検出実体の各々は、互いに少なくとも25nm異なる中央検出波長を有する;
−少なくとも5つの複数の光繊維束、該束の各々は、光パイプからの均一に分布した光を受容するように配置され、該光を該蛍光検出実体に伝達する;
−加熱および冷却するための手段;ならびに
−反応混合物を含むための複数の反応容器
を含んでなるリアルタイムPCR機器であって、該複数の検出実体が、少なくとも5つの異なる蛍光化合物の最大蛍光発光を同時に検出し得、該励起ユニットおよび検出ユニットは、別々のハウジングに位置する、リアルタイムPCR機器、
〔2〕1つの光源を含む〔1〕記載のリアルタイムPCR機器、
〔3〕該中央検出波長が一群の波長の範囲から選択され、該群が520〜540nm、545〜565nm、570〜590nm、600〜620nm、630〜650nm、660〜680nmおよび700〜720nmからなる、〔1〕記載の機器
に関する。
かくして、新しい発明は、適用可能な検出フォーマットの拡大およびマルチカラー特徴を伴うリアルタイムPCRシステムに関する。該システムは、多重/マルチカラー検出用の特定の試薬混合物、ならびに多数の検出ユニットを含む光学検出システムを備えた改良されたリアルタイムPCR機器を含む。光学システムは、励起源、および多数検出フォーマット用の検出チャネル、例えば:SybrGreenI、多重FRETハイブリダイゼーションプローブ、および多重TaqManプローブを提供するように設計される。
・少なくとも1つの光源、好ましくはLED、
・少なくとも4つ、好ましくは5〜6つの蛍光ディテクター実体、該実体の各々は、少なくとも25nm、好ましくは少なくとも30nm相互に異なる中央検出波長を有し、
該ディテクター実体は:
・少なくとも3つ、好ましくは4つ、最も好ましくは5つの異なる標識をされたFRETハイブリダイゼーションプローブ対の最大蛍光発光を同時に検出すること、
・少なくとも2つの異なる標識をされたTaqManハイブリダイゼーションプローブの最大蛍光発光を同時に検出すること、ならびに
・SybrGreenIの最大蛍光発光を検出すること
ができることを特徴とし、
・加熱および冷却のための手段、
・反応混合物を含有するための多数の反応容器;
を含むことを特徴とする。
a) 前記開示のように反応混合物を提供し、
b) 該多数標的配列の増幅が起こり得るように、該反応混合物をサーモサイクリングプロトコルに付し、
c) 複数の増幅サイクルの後、FRETハイブリダイゼーションプローブの該対の各々のハイブリダイゼーションを少なくとも1回モニタリングすることを含む、
多数標的DNA配列を増幅し、検出するための対応する方法にも関する。
A) 機器
第一の態様において、本発明によるシステムはリアルタイムPCRに適した機器を含む。任意に、該機器は融解曲線解析、すなわち、ハイブリダイゼーションプローブまたはds DNA結合色素のようなDNA結合実体の温度依存性結合のモニタリングにも適する。
・少なくとも1つの光源、好ましくは発光ダイオード、
・少なくとも4つ、好ましくは5〜6つの蛍光ディテクター実体、該実体の各々は少なくとも25nm、好ましくは少なくとも30nm相互に異なる中央検出波長を有し、
該ディテクター実体は、
・少なくとも3つ、好ましくは4つ、最も好ましくは5つの異なる標識をされたFRETハイブリダイゼーションプローブ対の最大蛍光発光を同時に検出すること、
・少なくとも2つの異なる標識をされたTaqManハイブリダイゼーションプローブの最大蛍光発光を同時に検出すること、および
・SybrGreenIの最大蛍光発光を検出すること
ができることを特徴とし、
・加熱および冷却のための手段、ならびに
・反応混合物を含有するための多数の反応容器;
を含むことを特徴とする。
a) 多重実験に組み込まれて実行されるようになる各蛍光実体につきキャリブレーター溶液を提供すること、
b) 異なるチャネルの間のクロストークの温度の依存性量を測定するためにディテクターチャネルの各々において該溶液の各々の温度依存性蛍光をモニタリングすること、および
c) 補正値を含む色補正データ組を生じさせること;
によって達成される。
本発明の意味では、用語「多重PCR」は、2つ以上の異なる増幅産物が、同一PCR反応において2対以上の対の増幅プライマーを用いることによって生成されることを特徴とするPCR反応として理解される。
・十分な溶解性、およびオリゴヌクレオチド(oligonkleotide)にカップリングされる可能性
・PCRサーモサイクリング条件下での色素の安定性
・十分かつ再生可能な発光強度および量子収率
・発光強度の、低い温度依存性
・異なる化学的条件下で実質的にスペクトルシフトがないこと
・異なるオリゴヌクレオチド配列にカップリングした場合に実質的にスペクトルシフトがないこと
・区別されるスペクトル発光最大
・FRETプロセスを行うのに適したパートナー色素の利用可能性
さらなる側面において、本発明は、前記開示のシステム、機器および組成物の全ての異なる態様を用いることによって、多重PCRを行う方法に関する。
・本発明による組成物または反応混合物を提供する工程、
・該多数標的配列の増幅が起こり得るように、該反応混合物をサーモサイクリングプロトコルに供する工程、および、
・複数の増幅サイクルの後にFRETハイブリダイゼーションプローブの該対の各々のハイブリダイゼーションを少なくとも1回モニタリングする工程;
を含む、多数標的DNA配列を増幅し、検出する方法に関する。
・ポリメラーゼ連鎖反応に適用できる緩衝液
・デオキシヌクレオシド三リン酸
・鋳型依存性DNAポリメラーセ、好ましくは熱安定性、
・少なくとも1対または数対の増幅プライマー。
・ポリメラーゼ連鎖反応に適用できる緩衝液、
・デオキシヌクレオシド三リン酸
・鋳型依存性DNAポリメラーゼ、好ましくは熱安定性、
・少なくとも1対または多数の対の増幅プライマー。
出願日において本発明者らによって知られた発明の最良の形態は以下の通りである。
(I) フルオレセインドナー色素は555nmチャネルへの高いクロストークを示し、かくして、PCRプロセスの間に潜在的FRETアクセプター色素の増加するシグナルをマスキングする。
(II) 555nmにおいて発光するFRETアクセプター色素は470nm LEDによってそれ自体が直接的に励起され、かくして、検出感度を有意かつ結果的に降下させるバックグラウンド蛍光を増加させる。
第V因子DNA断片の増幅については、4つの異なる100μlリアルタイムPCR反応混合物は以下の通りに設定した:
第V因子遺伝子を含む106コピーのプラスミド
3mM MgCl2
各々500nM プライマー
200nM 配列AによるFRET 3’ハイブリダイゼーションプローブ
200nM 各々、配列B1、B2、B3またはB4によるFRET 5’ハイブリダイゼーションプローブ。
プライマー第V因子、フォワード:
5’-GAG AGA CAT CGC CTC TGG GCT A-3’ (22量体)(配列番号:1)
プライマー第V因子、リバース:
5’-TGT TAT CAC ACT GGT GCT AA-3’ (20量体)(配列番号:2)
A: 3’フルオレセイン標識ハイブリダイゼーションプローブ
5’-AAT ACC TGT ATT CCT CGC CTG TC-3’ (23量体)(配列番号:3)
B1: 5’Red610ハイブリダイゼーションプローブ
5’-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3’(36量体)
B2: 5’Red640ハイブリダイゼーションプローブ
5’-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3’(36量体)
B3: 5’Cy5ハイブリダイゼーションプローブ
5’-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3’(36量体)
B4: 5’Red705ハイブリダイゼーションプローブ
5’-AGG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCT ATT-3’(36量体)
(B1〜B4:配列番号:4)
N-アセチル−トランスフェラーゼイソ酵素をコードするヒトNAT-2遺伝子の断片を含む特異的プラスミドの479bp断片を、特異的プライマーで増幅し、FRETハイブリダイゼーションプローブの4つの異なる特異的対を用い、蛍光によって検出した。3つのプローブはフルオレセインで3’末端が標識されたが、4つの検出プローブはLight-Cycler-Red 610、640、705またはCy5のいずれかで5’標識されて、リン酸化によって3’末端が修飾された。この実験設定の略図を図6に示す。図面から推定できるように、4つの異なる標識をされたFRETアクセプタープローブがあったが、検出部位は3つだけあった。この結果、2つの検出プローブのアニーリングが競合した。
5’-TGC CTT GCA TTT TCT GCT T-3’ (19量体)(配列番号:5)
プライマーリバース:
5’-GAG TTG GGT GAT ACA TAC A-3’ (19量体)(配列番号:6)
3’-フルオレセインHybProbe 1:
5’-GAA ATT CTT TGT TTG TAA TAT ACT GCT CTC TC-Fluos-3’ (32量体)
(配列番号:7)
5’-Red610 HybProbe 1a:
5’-Red610-TGA TTT GGT CCA CGT ACC-3’ (18量体)
(配列番号:8)
5’-Red640 HybProbe 1b:
5’-Red640-TGA TTT GGT CCA AGT ACC C-3’(19量体)
(配列番号:9)
3’-フルオレセインHybProbe 2:
5’-GTT GGA GAC GTC TGC AGG TAT GTA TTC ATA GAC TCA A-Fluos-3’(37量体)(配列番号:10)
5’-Red705 HybProbe 2:
5’-Red705-ATC TTC AAT TGT TCG AGG TT-3’(20量体)
(配列番号:11)
3’-フルオレセインHybProbe 3:
5’-ATT TCC TTG GGG AGA AAT CTC GTG CCC A-Fluos-3’(28量体)
(配列番号:12)
5’-RedCy5 HybProbe 3:
5’-Cy5-ACC TGG TGA TGA ATC CCT TAC TAT TTA GAA TAA GGA AC-3’(37量体)(配列番号:13)
本発明の最良の形態によるLightCycler機器は、デュアルカラーTaqManアッセイの感受性検出のための全ての手段を提供した。確立されたTaqMan色素FAMおよびHEXは470nm LEDでよく励起され、機器の色補正機能を用いた後は、高い感度でもって530nmおよび560nm検出チャネルで異なって同定できた。本発明による機器へのデュアルカラーTaqManアッセイプロトコルの移行は、単純に、確立されたアッセイ条件にBSAを補充することによって行った。
[1]少なくとも3、好ましくは4〜5、最も好ましくはちょうど4対のFRETハイブリダイゼーションプローブを含み、ハイブリダイゼーションプローブの各対は、FRETドナー部分、および550〜710nmの発光最大を有するFRETアクセプター部分を保持するFRETアクセプタープローブを保持するFRETドナープローブからなる、マルチカラーリアルタイムPCRを行うための組成物または反応混合物。
[2]少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくはちょうど4つのFRETドナー部分が同一である、[1]記載の組成物または反応混合物。
[3]全てのFRETドナー部分が同一である、[1]記載の組成物または反応混合物。
[4]少なくとも3つ、好ましくは4つ、最も好ましくはちょうど4つのFRETドナー部分がフルオレセインである、[1]記載の組成物または反応混合物。
[5]全てのFRETドナー部分がフルオレセインである、[1]記載の組成物または反応混合物。
[6]少なくとも1つのさらなるFRETドナー部分がAtto425およびWI343からなる群から選択される、[1]〜[5]いずれか記載の組成物または反応混合物。
[7]1つのFRETアクセプター部分がLC-Red 705、Cy5.5およびJA286からなる群から選択される、[1]〜[6]記載いずれかの組成物または反応混合物。
[8]少なくとも1つ、2つまたは3つのFRETアクセプター部分が、Cy5、LC-Red 640およびLC-Red 610からなる群から選択される、[1]〜[7]いずれか記載の組成物または反応混合物。
[9]1つのFRETアクセプター部分が、Rh6GおよびTAMRAからなる群から選択される、[1]〜[8]いずれか記載の組成物または反応混合物。
[10]・リアルタイムPCR機器および
・[1]〜[9]いずれか記載の組成物または反応混合物
を含む、マルチカラーリアルタイムPCRを行うためのシステム。
[11]該リアルタイムPCR機器が
・少なくとも1つの光源、好ましくはLED
・それぞれが少なくとも25、好ましくは少なくとも30nm互いに異なる中央検出波長を有する少なくとも4つ、好ましくは5〜6つの蛍光検出実体
を含み、
該検出実体が
・少なくとも3つ、好ましくは4つ、最も好ましくは5つの異なる標識をされたFRETハイブリダイゼーションプローブ対の最大蛍光発光を同時に検出すること、
・少なくとも2つの異なる標識をされたTaqManハイブリダイゼーションプローブの最大蛍光発光を同時に検出すること、および
・SybrGreenI最大蛍光発光検出すること
ができることで特徴づけられ、
・加熱および冷却のための手段
・反応混合物を含むための複数の反応容器
を含む、[10]記載のシステム。
[12]該リアルタイムPCR機器がちょうど1つの光源を含むことで特徴付けられる、[11]記載のシステム。
[13]複数の標的DNA配列を増幅および検出するための方法であって、
a) [1]〜[9]いずれか記載の組成物または反応混合物を提供する工程、
b)該反応混合物を、該複数の標的配列の増幅が起こり得るようにサーモサイクリングプロトコールに供する工程、
c)複数の増幅サイクルの後にFRETハイブリダイゼーションプローブの該対のそれぞれのハイブリダイゼーションを少なくとも1回モニタリングする工程
を含む方法。
[14]ハイブリダイゼーションが、温度依存的な様式で少なくとも1回モニタリングされる、[13]記載の方法。
[15]・少なくとも1つの光源、好ましくはLED
・それぞれが互いに少なくとも25、好ましくは少なくとも30nm異なる中央検出波長を有する5〜6つの蛍光検出実体
を含み、該検出実体が
・少なくとも3つ、好ましくは4つ、最も好ましくは5つの異なる標識をされたFRETハイブリダイゼーションプローブ対の最大蛍光発光を同時に検出すること
・少なくとも2つの異なる標識をされたTaqManハイブリダイゼーションプローブの最大蛍光発光を同時に検出すること、および
・SybrGreen Iの最大蛍光発光を検出すること
ができることで特徴付けられ、
・加熱および冷却するための手段
・反応混合物を含むための複数の反応容器
を含む、リアルタイムPCR機器。
[16]ちょうど1つの光源を含む、[15]記載のリアルタイムPCR機器。
[17]該中央検出波長が一群の波長の範囲から選択されることで特徴付けられ、該群が520〜540nm、545〜565nm、570〜590nm、600〜620nm、630〜650nm、660〜680nmおよび700〜720nmである、[15]または[16]記載の機器。
Claims (3)
- −−蛍光化合物を含む反応容器の方に光を放射し得る少なくとも1つの光源、
−反応容器から光を受容するように配置され、光繊維束に伝達するために該光を均一に分布させ得る光パイプ
を含む励起ユニット;
−少なくとも5つの別個の蛍光検出実体を含む検出ユニット、該検出実体の各々は、互いに少なくとも25nm異なる中央検出波長を有する;
−少なくとも5つの複数の光繊維束、該束の各々は、光パイプからの均一に分布した光を受容するように配置され、該光を該蛍光検出実体に伝達する;
−加熱および冷却するための手段;ならびに
−反応混合物を含むための複数の反応容器
を含んでなる、少なくとも5つの異なる標識をされたFRETハイブリダイゼーションプローブ対の最大蛍光発光を同時に検出するためのリアルタイムPCR機器であって、該複数の検出実体が、少なくとも5つの異なる蛍光化合物の最大蛍光発光を同時に検出し得、該励起ユニットおよび検出ユニットは、別々のハウジングに位置する、リアルタイムPCR機器。
- 1つの光源を含む請求項1記載のリアルタイムPCR機器。
- 該中央検出波長が一群の波長の範囲から選択され、該群が520〜540nm、545〜565nm、570〜590nm、600〜620nm、630〜650nm、660〜680nmおよび700〜720nmからなる、請求項1記載の機器。
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EP1909108B1 (en) * | 2005-03-10 | 2019-05-29 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifiying analytes |
US7709249B2 (en) | 2005-04-01 | 2010-05-04 | 3M Innovative Properties Company | Multiplex fluorescence detection device having fiber bundle coupling multiple optical modules to a common detector |
US7507575B2 (en) | 2005-04-01 | 2009-03-24 | 3M Innovative Properties Company | Multiplex fluorescence detection device having removable optical modules |
US7527763B2 (en) | 2005-07-05 | 2009-05-05 | 3M Innovative Properties Company | Valve control system for a rotating multiplex fluorescence detection device |
DE502005008746D1 (de) * | 2005-07-21 | 2010-02-04 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Quantifizierung methylierter DNA |
US7754148B2 (en) | 2006-12-27 | 2010-07-13 | Progentech Limited | Instrument for cassette for sample preparation |
US7727473B2 (en) | 2005-10-19 | 2010-06-01 | Progentech Limited | Cassette for sample preparation |
US8637436B2 (en) | 2006-08-24 | 2014-01-28 | California Institute Of Technology | Integrated semiconductor bioarray |
US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
US7629124B2 (en) * | 2006-06-30 | 2009-12-08 | Canon U.S. Life Sciences, Inc. | Real-time PCR in micro-channels |
WO2008014485A2 (en) | 2006-07-28 | 2008-01-31 | California Institute Of Technology | Multiplex q-pcr arrays |
US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
JP5367365B2 (ja) * | 2006-11-30 | 2013-12-11 | アークレイ株式会社 | Sult1a1遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むsult1a1遺伝子増幅用試薬およびその用途 |
CN102046807B (zh) | 2008-04-24 | 2014-11-26 | 3M创新有限公司 | 利用小波变换分析核酸扩增曲线 |
DK2337860T3 (en) * | 2008-10-15 | 2016-08-29 | Axolabs Gmbh | A method for the detection of oligonucleotides |
WO2010062556A1 (en) | 2008-10-27 | 2010-06-03 | Qiagen Gaithersburg Inc. | Fast results hybrid capture assay and system |
CN104404134B (zh) * | 2009-04-03 | 2017-05-10 | 莱弗斯基因股份有限公司 | 多重核酸检测方法和系统 |
WO2010118541A1 (en) * | 2009-04-15 | 2010-10-21 | Biocartis Sa | OPTICAL DETECTION SYSTEM FOR MONITORING rtPCR REACTION |
CN102414327B (zh) | 2009-05-01 | 2015-04-08 | 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 | 用于在样品中检测rna剪接形式的非靶向扩增方法 |
JP2012528571A (ja) * | 2009-05-29 | 2012-11-15 | サイシス ダイアグノスティックス | 先進的病原体検出およびスクリーニング |
CA2773320C (en) | 2009-09-14 | 2018-02-20 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media |
JP5709897B2 (ja) * | 2009-12-24 | 2015-04-30 | シージーン アイエヌシー | 偽シグナルが排除されるターゲット核酸配列のリアルタイムマルチプレッキシング検出 |
JP5876834B2 (ja) | 2010-01-04 | 2016-03-02 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 固定された組織サンプルからの核酸またはタンパク質の回収のための方法、組成物、およびキット |
US9689047B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-06-27 | Qiagen Gaithersburg Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
US9605303B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-03-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample |
US9248422B2 (en) | 2010-02-23 | 2016-02-02 | Luminex Corporation | Apparatus and methods for integrated sample preparation, reaction and detection |
KR101882940B1 (ko) | 2010-02-23 | 2018-07-30 | 루미넥스 코포레이션 | 일체화된 샘플 제조, 반응 및 검출을 위한 장치 및 방법 |
AU2011255638B2 (en) | 2010-05-19 | 2016-08-25 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
EP2576840B1 (en) | 2010-05-25 | 2018-10-17 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
GB201020827D0 (en) * | 2010-12-08 | 2011-01-19 | Fotech Solutions Ltd | Distrubuted optical fibre sensor |
IT1403792B1 (it) * | 2010-12-30 | 2013-10-31 | St Microelectronics Srl | Analizzatore per analisi biochimiche e metodo per la determinazione di concentrazioni di sostanze fluorescenti in una soluzione |
US9361427B2 (en) * | 2011-02-01 | 2016-06-07 | The Regents Of The University Of California | Scar-less multi-part DNA assembly design automation |
JP2014511182A (ja) | 2011-02-24 | 2014-05-15 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー. | Hpv核酸を検出するための材料及び方法 |
WO2012116308A1 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector |
CA3106132C (en) * | 2011-05-12 | 2023-08-29 | Ande Corporation | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of str loci |
EP2525211B1 (en) | 2011-05-16 | 2018-01-03 | F. Hoffmann-La Roche AG | Instrument and method for detecting analytes |
JP5817369B2 (ja) * | 2011-09-13 | 2015-11-18 | ソニー株式会社 | スペクトル解析装置及び微小粒子測定装置、並びにスペクトル解析あるいはスペクトルチャート表示のための方法及びプログラム |
CA2854165C (en) | 2011-11-03 | 2022-11-22 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and method for immobilizing, isolating, and concentrating cells using carboxylated surfaces |
CN114717296A (zh) * | 2012-02-03 | 2022-07-08 | 加州理工学院 | 多路生化测定中信号的编码和解码 |
IN2015DN01609A (ja) | 2012-08-03 | 2015-07-03 | California Inst Of Techn | |
EP2883039A1 (en) | 2012-08-10 | 2015-06-17 | Streck Inc. | Real-time optical system for polymerase chain reaction |
JP6501714B2 (ja) | 2012-12-05 | 2019-04-17 | ジェネポック・インコーポレイテッドGenepoc Inc. | 光学調査装置 |
WO2014210593A1 (en) | 2013-06-28 | 2014-12-31 | Streck, Inc. | Devices for real-time polymerase chain reaction |
US10718012B2 (en) | 2013-10-14 | 2020-07-21 | Agency For Science, Technology And Research | Non-motorized optical multiplexing for the simultaneous detection of DNA target amplicons in a polymerase chain reaction solution |
US9170198B2 (en) * | 2013-12-19 | 2015-10-27 | Luminex Corporation | Crosstalk reduction |
PL3656474T3 (pl) * | 2014-03-28 | 2024-03-18 | Curiosity Diagnostics Sp. Z O.O. | Urządzenie do jednoczesnego i jednolitego cyklicznego zmieniania temperatury próbek i jego zastosowania |
BE1022048B1 (nl) * | 2014-04-11 | 2016-02-10 | Ugentec Bvba | Methoden voor fluorescentie data correctie |
US9708647B2 (en) | 2015-03-23 | 2017-07-18 | Insilixa, Inc. | Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays |
US9499861B1 (en) | 2015-09-10 | 2016-11-22 | Insilixa, Inc. | Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification |
WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
CN109642252A (zh) | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
KR102301305B1 (ko) * | 2016-06-30 | 2021-09-13 | 주식회사 씨젠 | 핵산 증폭용 튜브 및 핵산 증폭용 반응 용기 |
EP3592865A1 (en) * | 2017-03-07 | 2020-01-15 | Illumina, Inc. | Single light source, two-optical channel sequencing |
US11976337B2 (en) | 2017-03-24 | 2024-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Methods for detection of influenza in samples |
BR112020017959A2 (pt) | 2018-03-02 | 2020-12-22 | Life Technologies Corporation | Novas combinações de extintor e corante repórter |
EP3937780A4 (en) | 2019-03-14 | 2022-12-07 | InSilixa, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR TIMED FLUORESCENCE-BASED DETECTION |
CN113308354B (zh) * | 2021-05-28 | 2022-02-15 | 深圳市尚维高科有限公司 | 一种多色荧光定量pcr仪光路系统及处理方法 |
CN117999481A (zh) | 2021-10-26 | 2024-05-07 | 卡里布生物科学公司 | 核酸外切酶偶联实时核酸内切酶活性测定 |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
US7081226B1 (en) * | 1996-06-04 | 2006-07-25 | University Of Utah Research Foundation | System and method for fluorescence monitoring |
US5750409A (en) | 1991-11-18 | 1998-05-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pentacyclic compounds and their use as absorption or fluorescent dyes |
CA2129787A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-02-28 | Russell G. Higuchi | Monitoring multiple amplification reactions simultaneously and analyzing same |
US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
US5869255A (en) * | 1994-02-01 | 1999-02-09 | The Regents Of The University Of California | Probes labeled with energy transfer couples dyes exemplified with DNA fragment analysis |
US5654419A (en) * | 1994-02-01 | 1997-08-05 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent labels and their use in separations |
DE69519783T2 (de) * | 1994-04-29 | 2001-06-07 | Perkin Elmer Corp | Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation |
US5563588A (en) * | 1994-08-02 | 1996-10-08 | Belfer; Bruce D. | Fiber optic traffic signal light system having a shutter control |
WO1996037767A1 (en) * | 1995-05-26 | 1996-11-28 | Optical Analytic Inc. | Wide angle scattering detector |
DE19521231A1 (de) | 1995-06-10 | 1996-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue Oxazinfarbstoffe und ihre Verwendung als Fluoreszenzmarker |
US5837196A (en) * | 1996-01-26 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
ATE295427T1 (de) * | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
EP0906449B1 (en) * | 1996-06-04 | 2004-03-03 | University Of Utah Research Foundation | System and method for carrying out and monitoring polymerase chain reactions |
US5853992A (en) * | 1996-10-04 | 1998-12-29 | The Regents Of The University Of California | Cyanine dyes with high-absorbance cross section as donor chromophores in energy transfer labels |
US6027709A (en) | 1997-01-10 | 2000-02-22 | Li-Cor Inc. | Fluorescent cyanine dyes |
MA24525A1 (fr) | 1997-04-14 | 1998-12-31 | Procter & Gamble | Particule detergente |
AUPO652997A0 (en) * | 1997-04-30 | 1997-05-29 | Kindconi Pty Limited | Temperature cycling device and method |
US6369893B1 (en) * | 1998-05-19 | 2002-04-09 | Cepheid | Multi-channel optical detection system |
DE69904043T2 (de) | 1998-05-19 | 2003-07-31 | Cepheid Sunnyvale | Mehrkanaliges optisches detektionssystem |
US6140054A (en) | 1998-09-30 | 2000-10-31 | University Of Utah Research Foundation | Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes |
US6197520B1 (en) | 1999-08-13 | 2001-03-06 | University Of Utah Research Foundation | Solution-based color compensation adjusted for temperature and electronic gains |
CA2417986C (en) | 2000-08-11 | 2013-11-26 | University Of Utah Research Foundation | Single-labeled oligonucleotide probes |
US6870165B2 (en) * | 2001-10-19 | 2005-03-22 | Biocal Technology, Inc. | Multi-color multiplexed analysis in a bio-separation system |
US7635588B2 (en) * | 2001-11-29 | 2009-12-22 | Applied Biosystems, Llc | Apparatus and method for differentiating multiple fluorescence signals by excitation wavelength |
CA2507240C (en) * | 2002-12-06 | 2011-05-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Multiplex assay detection of pathogenic organisms |
ATE550099T1 (de) | 2003-04-04 | 2012-04-15 | Hoffmann La Roche | Verbessertes system für mehrfarbige echtzeit-pcr |
-
2004
- 2004-04-01 AT AT04725021T patent/ATE550099T1/de active
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-
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