JP5143018B2 - 中皮腫診断剤、中皮腫診断キットおよび中皮腫診断方法 - Google Patents
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Description
まず、1994年、ヤマグチ(Yamaguchi)らにより、ヒト膵臓癌細胞HPC−Y5上清から、MPF
(Megakaryocyte potentiating factor)と呼ばれるタンパク質が精製されたことが報告され(文献1)、さらに1995年、コジマ(Kojima)らにより、ヒト膵臓癌細胞HPC−Y5のcDNAからMPFがクローニングされたことが報告された(文献2)。
(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV
(配列番号1のアミノ酸配列の34〜51番目:配列番号2)
(b)GFPCAE
(配列番号1のアミノ酸配列の68〜73番目:配列番号3)
(c)PQACTH
(配列番号1のアミノ酸配列の134〜139番目:配列番号4)
(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG
(配列番号1のアミノ酸配列の211〜229番目:配列番号5)
cDNA等のほ乳類由来のErc/MPF/mesothelin cDNAをプローブとしてヒト腫瘍細胞株等のcDNAライブラリーからクローニングすることによっても得られる。
(b)GFPCAE
(配列番号1のアミノ酸配列の68〜73番目:配列番号3)
(c)PQACTH
(配列番号1のアミノ酸配列の134〜139番目:配列番号4)
(a)SRTLAGETGQEAAPLDGV
(配列番号1のアミノ酸配列の34〜51番目:配列番号2)
(b)GFPCAE
(配列番号1のアミノ酸配列の68〜73番目:配列番号3)
(c)PQACTH
(配列番号1のアミノ酸配列の134〜139番目:配列番号4)
(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG
(配列番号1のアミノ酸配列の211〜229番目:配列番号5)
モノクローナル抗体の作製(1):
(1)免疫用抗原の作製
全長のヒトErc/MPF/mesothelin
cDNA(Accession No. AY743922)を鋳型として、配列番号1で表される31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのアミノ酸配列の35番から295番目までの領域に対応するヌクレオチド(配列番号6の塩基配列の103〜885番目)を、以下に示したプライマーNo.5’−3およびNo.3’−3を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)により増幅させた。次に上記で得られたオリゴヌクレオチドにGST(Glutathione S-transferase)タグをコードする配列を、またC末側領域にヒスチジン(Histidine)タグをコードする配列を付加して、これらGST−31kDa分泌型mesothelin−His領域を、pGEX−6P−1(Amershambiosciences社製)に挿入し、発現ベクターとし、これを大腸菌に組み込んで融合タンパク質として発現させた。
プライマーNo.5’−3(配列番号7):
5’−ACGGGATCCAGGACCCTGGCTGGAGAGACA−3’
プライマーNo.3’−3(配列番号8):
5’−AAGCTCGAGCCGCCGGAACCGCGGCCGGA−3’
免疫用抗原として、上記(1)において得られたタンパク質を用い、1週間、または2週間おきに50μl(50μg)を投与し、マウスを免疫した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、X63−Ag8−653をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献(J. Immunol. 146:3721-3728)に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化された31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinに反応する細胞を選択することにより行った。
異性の確認
上記(2)で得られたモノクローナル抗体7E7および16K16が31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinを認識することを、COS−1細胞あるいはCHO細胞に強制発現させたErc/MPF/mesothelinタンパク質等のサンプルを用いたウェスタンブロッティングにより確認した。それぞれのサンプルにはウェスタンブロッティングを行う前に、2−メルカプトエタノール(2Me)を加えて還元状態とした。ウェスタンブロッティングは常法(例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂)に従い行った。
モノクローナル抗体7E7および16K16の抗原認識部位の探索:
31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端領域を6アミノ酸づつ欠損する一連の融合タンパク質を作製し、それとモノクローナル抗体7E7および16K16を反応させ、抗原認識部位の探索をした。
ポリクローナル抗体の作製(1):
(1)免疫用抗原の作製
ヒト31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列(d)を有するペプチドは、HPLCクロマトグラフィー精製した状態の品を伊藤ハム株式会社より購入した。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
(d)CPGPLDQDQQEAARAALQG
(配列番号1のアミノ酸配列の211〜229番目:配列番号5)
(1)で作製したペプチド100μgとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫1週間後に、抗原100μgとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で3回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したELISA法で確認した後、全採血を行い1,500rpmで15分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を211抗体と名づけた。
ポリクローナル抗体の作製(2):
(1)免疫用抗原の作製
ヒト31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列(a)のC末側に更にシスティン(C)を付けたアミノ酸配列を有するペプチドは、HPLCクロマトグラフィー精製した状態の品を伊藤ハム株式会社より購入した。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
(a)SRTLAGETGQEAAPLDGVC
(配列番号1のアミノ酸配列の34〜51番目:配列番号2)
(1)で作製したペプチド100μgとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫1週間後に、抗原100μgとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で3回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したELISA法で確認した後、全採血を行い1,500rpmで15分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を34抗体と名づけた。
ポリクローナル抗体の作製:
(1)免疫用抗原の作製
ヒト31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列(e)のC末側に更にシスティン(C)を付けたアミノ酸配列を有するペプチドは、HPLCクロマトグラフィー精製した状態の品をオウスペップ(Auspep Corporation)社より購入した。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
(e)RQPERTILRPRFRR
(配列番号1のアミノ酸配列の282〜295番目:配列番号9)
(1)で作製したペプチド100μgとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫1週間後に、抗原100μgとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で3回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したELISA法で確認した後、全採血を行い1,500rpmで15分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を4抗体と名づけた。
次に、(2)で得られたポリクローナル抗体4が31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinを認識することを確認するために、ポリクローナル抗体4を用いてCOS−1細胞に強制発現させたErc/MPF/mesothelinタンパク質等について、前述のように常法に従いウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの結果を図5に示した。サンプルは実施例1(3)で用いたものと同じである。この図によるとこの抗体4がErc/MPF/mesothelinを強制発現させたサンプルに対して反応性を有することが確認された。
施 例 5
中皮腫患者胸水中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelin量の
測定:
実施例1、3、4および参考例1で作製したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を組み合わせて実施例6および参考例2で述べる方法を用いてELISA系を構築し、それを用いて中皮腫患者胸水中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelin濃度を測定した。その結果を図6に示した。
ELISA測定系(7E7−16K16キット)の作製:
(1)標準物質の作製
抗体作製時に用いた抗原タンパク質(31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelin−His)を基準にして、COS−1細胞で発現させた31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの濃度を測定し、ELISA測定系の標準物質とした。
実施例1で得られたモノクローナル抗体16K16とHRPとの結合物は以下のように作製した。必要量のHRPを蒸留水に溶かし、NaIO4で酸化させた後、pH4.4の1mM酢酸緩衝液に一晩透析した。また、モノクローナル抗体16K16の1−10mgもpH9.5の0.1M炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析した16K16抗体とHRPを抗体1mgに対してHRPが0.4mgになるように混合し、室温で2時間反応させた。次いで、これにNaBH4を加え氷中で2時間反応させた後PBSに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、モノクローナル抗体16K16とHRPとの結合物を作製した。
サンドイッチELISA法の構築は以下のようにして行った。まず、10μg/mlの7E7抗体を100μlずつ96wellのELISA用プレートに加えた。次いで、これを4℃で一晩反応させた後、1%BSA/PBS/NaN3溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチELISA用プレートとした。また、上記(2)で作成したモノクローナル抗体16K16とHRPとの結合物を標識抗体とした。
ELISA測定系(7E7−4キット)の作製:
(1)ポリクローナル抗体4とHRPとの結合物の作製
参考例1で得られたポリクローナル抗体4とHRPとの結合物を実施例6の(2)と同様にして作製した。
実施例1で得られたモノクローナル抗体7E7と参考例1で得られたポリクローナル抗体4を用いたサンドイッチELISA法の構築は以下のようにして行った。まず、10μg/mlのモノクローナル抗体7E7を100μlずつ96wellのELISA用プレートに加えた。次いで、これを4℃で一晩反応させた後、1%BSA/PBS/NaN3溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチELISA用プレートとした。また、上記(1)で作製したポリクローナル抗体4とHRPとの結合物を標識抗体とした。
peroxidase)標識した4抗体を加え4℃、30分間反応(2次反応)、洗浄後、テトラメチルベンジジン(Tetra Methyl Benzidine (TMB))を含む基質液を加え室温30分間放置、反応停止液(1NのH2SO4)を加え反応停止後、波長450nmでの吸光度を測定し、標準物質から作成した検量線を用いて検体中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelin濃度を算出した。
各種患者血清の測定:
実施例6で作製したELISA測定系(7E7−16K16キット)を用いて、中皮腫患者27例、胸膜肥厚患者28例、良性胸膜炎およびびまん性胸膜肥厚患者6例、アスベスト暴露経験有りおよび肺繊維症11例、およびその他の鑑別疾患(肺がんを含む)8例の血清中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの濃度を次のようにして測定した。また、比較として参考例2で作製したELISA測定系(7E7−4キット)を用いて同様の測定を行った。
健常人血清および血漿の測定:
実施例6で作製したELISA測定系(7E7−16K16キット)を用いて、健常人52例の血清、およびEDTA血漿中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの濃度を次のようにして測定した。
血清および血漿中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの安
定性の確認:
実施例6で作製したELISA測定系(7E7−16K16キット)を用いて、健常人5例(a〜e)の血清またはEDTA血漿中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの安定性を次のようにして測定した。
中皮腫患者胸水中の各種分泌型Erc/MPF/mesothelin断片の存在
の検出:
実施例9において、31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinは血清中において分解されて断片化しうることを示した。すなわち、採血後および血清分離後の放置時間(3時間以上)の間に31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端領域が分解され、欠損してしまったために、その領域を認識する抗体を利用している測定キットでは測定されなくなってしまう。その結果、目的のタンパク質(31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelin)はあたかも存在していないかのような測定結果が出てしまうことになる。しかし、血液中には分解される前の分子が存在しているはずであり、そのような検査では間違った結果を与えてしまうことになる。よって、適正な認識部位を持つ抗体を用いることは非常に重要なことである。そこで、そのことを確認するために、血液のままあるいは血清に分離した状態で室温に3時間以上放置した状態と同等の状態になると考えられる採取後室温で放置されていた中皮腫患者胸水を用いて実施例および参考例で作製したモノクローナル抗体7E7およびポリクローナル抗体34、211、4によるウェスタンブロッティングを以下の方法で行った。
と混合し、還元剤を用いて結合させたものをカラムに充填した。次にこのカラムと強酸性溶液、高塩濃度溶液等を利用して中皮腫患者胸水の分画を行った。具体的には、中皮腫患者胸水を、ポリクローナル抗体4を結合させたカラムに通し、吸着したもの(C末抗体カラム吸着画分)と吸着しなかったものに分けた。その後前記カラムに吸着しなかったものをポリクローナル抗体34を結合させたカラムに通し、吸着したものと吸着しなかったもの(N末、C末抗体カラム非吸着画分)に分けた。更に前記カラムに吸着したものをモノクローナル抗体7E7を結合させたカラムに通し、吸着したもの(7E7抗体カラム吸着画分)と吸着しなかったもの(7E7抗体カラム非吸着画分)に分けた。この各画分をサンプルとして、モノクローナル抗体7E7およびポリクローナル抗体34、211、4によるウェスタンブロッティングを行った。その結果を図14に示した。
外科的手術施行後のモニタリング:
悪性の中皮腫であると診断され外科的手術を施行した患者について、術前術後に採血を行い、血清を分離し、実施例6で作製したELISA測定系(7E7−16K16キット)および、参考例2で作製したELISA測定系(7E7−4キット)を用いて31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelin濃度を測定した。
各種患者血清の測定:
実施例7と同様にして、中皮腫患者39例、健常者102名、アスベスト関連疾患患者/アスベスト暴露経験者201例(胸膜プラーク患者98例、暴露経験者83例、石綿症患者6例、良性アスベスト胸膜炎患者14例)、肺癌患者45例、その他の鑑別疾患患者8例の血清中の31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinの濃度を測定した。
Claims (5)
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端のアミノ酸が15〜155個欠失したペプチドを認識する第1の抗体を含有する第1の試薬と、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端のアミノ酸が15〜155個欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第1の抗体と認識部位が異なる第2の抗体を含有する第2の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端のアミノ酸が155個欠失したペプチドを認識する第1の抗体を含有する第1の試薬と、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端のアミノ酸が155個欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第1の抗体と認識部位が異なる第2の抗体を含有する第2の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
- 請求項1又は請求項2に記載の抗体である第1の抗体を含有する第1の試薬と、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端のアミノ酸が15〜155個欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第1の抗体と認識部位が異なる第2の抗体を含有する第2の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
- 請求項1又は請求項2に記載の抗体である第1の抗体を含有する第1の試薬と、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる31kDa分泌型Erc/MPF/mesothelinのC末端のアミノ酸が155個欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第1の抗体と認識部位が異なる第2の抗体を含有する第2の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
- 以下の(a)〜(e)のいずれか1つの組合せの抗体を含有することを特徴とする中皮腫診断キット:
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体、及び配列番号3に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体、及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体;
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体;
(d)配列番号3に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体、及び配列番号4に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体;又は
(e)配列番号3に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体、及び配列番号5に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体。
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