JP5131652B2

JP5131652B2 - ポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物及び３次元架橋方法、並びにこれを用いたヒドロゲル、薬物送達システム

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Publication number: JP5131652B2
Application number: JP2006284419A
Authority: JP
Inventors: 亨大谷
Original assignee: Toyama Prefecture
Current assignee: Toyama Prefecture
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2026-10-18
Also published as: JP2008100941A

Description

本発明は、ポリグリセロールデンドリマー（以下、ＰＧＤと称する。）を化学架橋した３次元架橋方法及び３次元架橋物に関するものである。さらに、本発明は、ＰＧＤの３次元架橋物を用いたヒドロゲル及び薬物送達システムに関する。

デンドリマーとは、ギリシャ語の“dendra”（樹木）を語源とするもので、規則正しく分岐した構造を有する高分子である。前記デンドリマーは、そのユニークな構造から、近年、分子エレクトロニクス、薬物キャリア等、多くの分野において研究が進められている。例えば、アミドアミン（以下、ＰＡＭＡＭと称する。）のデンドリマーが１９８５年にＴｏｍａｌｉａらによって報告され（例えば非特許文献１を参照）、その後、市販されるに至り、非常に多くの研究例が報告されるようになってきている。

近年では、バイオマテリアルとして生体との相互作用や体内動態が検討されるようになってきており、例えば細胞毒性に関する報告がなされている（例えば非特許文献２を参照）。さらには、ＰＡＭＡＭデンドリマー表面を生体適合性の高いポリエチレングリコール(以下、ＰＥＧと称する。)で化学修飾すること（例えば非特許文献３を参照）や、生体適合性を考慮したポリエーテル−エステルデンドリマー（例えば非特許文献４等を参照）が提案されている。

また、デンドリマーではないが、ハイパーブランチ型ポリグリセロール（以下、ＨｙＰＧと称する。）も注目を集めており、その製品化にまで至っている（例えば非特許文献５を参照）。最近ではＨｙＰＧにメタクリル基などの二重結合を導入し、ラジカル重合の原理に基づく３次元架橋する方法が提案され（例えば非特許文献６を参照）、その基礎的物性について検討がなされている。ただし、ＨｙＰＧはその構造が均一ではなく、分子量分布も比較的広いため、医薬品としての応用に鑑みた場合には実用化の点で懸念が残る。

一方、難水溶性薬物の溶解性を改善する技術としては、薬物の結晶微粒子を分散させ、水溶性高分子を噴霧・コーティングする方法（例えば特許文献１を参照）、薬物と流動化剤を混合して水溶性高分子含有水溶液を用いて造粒する方法（例えば特許文献２を参照）、親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロック共重合体を難水溶性薬物とともに有機溶媒中へ溶解し、水中油エマルジョンから有機溶媒を除去したポリマーミセルを形成する方法（例えば特許文献３を参照）、２−メタクリエオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とメタクリル酸n-ブチル（ＢＭＡ）との共重合体水溶液に可溶化させる方法（例えば特許文献４を参照）等が知られている。

しかしながら、前述の特許文献１〜４に記載される発明では、その大部分が溶液状に難水溶性薬物を可溶化するに留まっており、生体適合性に優れたヒドロゲルを代表とする３次元架橋体のデバイス化によって可溶化からその後の放出制御に至る一連の機能を網羅できる薬物送達システムを実現することは難しいものと考えられる。とりわけ、抗ガン剤の経口投与の実現には、可溶化した抗ガン剤を小腸から効率よく吸収されるために、約２時間程度で放出する制御が必要とされているが、このような制御を特許文献１〜４に記載される発明で実現することは難しい。

このような状況の中、前述のデンドリマーの１種であるＰＧＤの薬物送達システムへの応用についての研究も進められている。ＰＧＤは、Ｈａｇｇらによって初めて合成されたデンドリマーであり、分子量分布が極めて小さく、均一な構造を有するという特徴を有している。既に、世代数３〜５のＰＧＤの合成法が確立され（例えば非特許文献７を参照）、そのナノサイズＰＧ構造によって難水溶性薬物であるパクリタキセル（商品名タキソール）を溶解することが知られている。例えば、ＰＧＤの場合、パクリタキセルの溶解性が、製薬業界にて使用されているポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）と比較して著しく向上することが明らかとなっている（例えば非特許文献７、８を参照）。
Polym. J., 17, 117 (1985) J. Controlled Release, 65, 133(2000) Bioconjugate Chem., 11, 910 (2000) J. Am. Chem.Soc.123, 2905 (2001) J. Am. Chem. Soc., 122, 2954(2000) Biomaterials, 27, 5471 (2006) Bioconjugate Chem., 15, 1221 (2004) J. Controlled Release, 93, 121(2003) 大谷亨ら，ハイドロトロピックデンドリマーによる水中でのタキソール構造の長期安定化と３次元デバイス化の検討，高分子学会医用高分子シンポジウム講演要旨集，２００５年８月１日，34th，p.47-48 特開平７−２９１８５４号公報特開２００５−８２５０３号公報特開２００１−２２６２９４号公報特開２００３−１３７８１６号公報

前述のように、ＰＧＤは難水溶性薬物の溶解性向上に寄与しているが、その水溶液を希釈すると同時にパクリタキセルが析出し、沈殿を生ずるという現象が発生する。この現象は、パクリタキセルを利用した癌治療への応用に鑑みた場合には好ましいものではなく、希釈条件においてもＰＧＤが局所的に集合し、パクリタキセルが溶解した状態で徐放される製剤が望まれる。

本発明は、前述のような実情に鑑みて提案されたものであり、難水溶性薬物を溶解することが可能で、希釈によって難水溶性薬物が析出、沈殿することがなく、しかも例えば経口投与に適した放出制御が可能な新規な３次元架橋物及び３次元架橋方法、さらにはヒドロゲルを提供することを目的とする。また、本発明は、難水溶性薬物を数時間程度で薬物放出することが可能な新規な薬物送達システムを提供することを目的とする。

本発明者は、前述の目的を達成するために、長期に亘り種々の研究を重ねてきた。その結果、ポリグリセロールデンドリマーを３次元架橋した３次元架橋物のヒドロゲルにおいて、そのナノ構造が例えば難水溶性薬物の溶解に最適であり、さらに難水溶性薬物の放出についても、例えば経口投与において要求される放出時間に制御可能であることを見出すに至った。

本発明は、このような知見に基づいて案出されたものである。すなわち、本発明の３次元架橋物は、本発明のポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋方法３次元架橋方法によって製造されたものであり、ポリグリセロールデンドリマーがエチレングリコールジグリシジルエーテルまたはポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルによって架橋されている。

本発明のポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋方法は、ポリグリセロールデンドリマーと、架橋剤であるポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルとを、ジメチルスルホキシド中で３次元架橋反応させることを特徴とする。本発明は、前記３次元架橋反応をジメチルスルホキシド中で行う際に、ジメチルアミノピリジンを触媒として使用することを特徴とする。

本発明のヒドロゲルは、前記３次元架橋方法によって製造されたポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物が、水またはエタノールのいずれかないしは両方を分散媒として膨潤していることを特徴とする。また、本発明のヒドロゲルは、前記３次元架橋方法によって製造されたポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物が、水及びエタノールを分散媒として膨潤しており、かつ、パクリタキセルが溶解され分散されていることを特徴とする。本発明の薬物送達システムは、前記ヒドロゲルを経口投与し、前記パクリタキセルを生体内で放出させることを特徴とする。

本発明の３次元架橋物は、ポリグリセロールのナノサイズのデンドリマーを３次元架橋したものであり、水やエタノール等の分散媒によって膨潤し、ヒドロゲルを構成する。このヒドロゲルのゲルマトリックス中には、ＰＧＤとの相互作用によって難水溶性薬物が界面活性剤等を用いることなく取り込まれ、溶解・分散される。この時、例えば難水溶性薬物を溶解したヒドロゲルを水等によって希釈しても、難水溶性薬物が析出したり沈殿したりすることがない。また、難水溶性薬物を取り込んだヒドロゲルにおいては、数時間内での薬物放出が可能である。

本発明の３次元架橋物を用いたヒドロゲルにおいては、難水溶性薬物を溶解することが可能である。この難水溶性薬物を溶解したヒドロゲルにおいては、希釈によって難水溶性薬物が析出、沈殿することがなく、しかも例えば経口投与に適した数時間程度での放出制御が可能である。したがって、本発明の３次元架橋物及びヒドロゲルを薬物送達システムに応用することで、経口投与時等に要求される数時間内での管腔内薬物放出が可能な新たな薬物送達システムを構築することが可能である。

以下、本発明を適用したポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物、３次元架橋方法、ヒドロゲル、薬物送達システムについて説明する。

本発明の３次元架橋物は、ポリグリセロールデンドリマーを架橋剤を用いて３次元架橋したものである。ポリグリセロールデンドリマーは、中心分子とデンドロンと称される側鎖部分とから構成されるもので、前記中心分子及び側鎖部分のいずれもがポリグリセロールにより構成される。

また、デンドリマーは、デンドロン部分（側鎖部分）の分岐回数が世代と言い表され、様々な世代の高分子が知られているが、本発明の３次元架橋物においては、ポリグリセロールデンドリマーとしていずれの世代のデンドリマーも使用することが可能である。具体的に例示するならば、化１に示す第３世代（デンドロン部分の分岐数３）のポリグリセロールデンドリマー（ＰＧＤ−Ｇ３と称する。）、化２に示す第４世代（デンドロン部分の分岐数４）のポリグリセロールデンドリマー（ＰＧＤ−Ｇ４と称する。）、化３に示す第５世代（デンドロン部分の分岐数５）のポリグリセロールデンドリマー（ＰＧＤ−Ｇ５と称する。）等を挙げることができる。これらの中では、ＰＧＤ−Ｇ３及びＰＧＤ−Ｇ４が好適である。

架橋剤については、グリシジル基を有する化合物を用いる。具体的には、化４に示すエチレングリコールジグリシジルエーテルや、化５に示すポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル等を用いることができる。

前記ポリグリセロールデンドリマーと架橋剤を反応させることで３次元架橋が行われるが、前記３次元架橋反応は、水酸化ナトリウム水溶液中、あるいはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行う。なお、ジメチルスルホキシド中で３次元架橋反応を行う場合には、触媒を併用することが好ましい。使用する触媒としては、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等を挙げることができる。

以上により合成される３次元架橋物は、水やエタノールによって膨潤され、ヒドロゲルを構成する。このヒドロゲルにおいては、使用する３次元架橋物を合成する際の条件（例えば、ポリグリセロールデンドリマーと架橋剤の比率等）によって膨潤比率を調整することが可能である。

前記ヒドロゲルにおいては、難水溶性薬物を界面活性剤等を用いることなく溶解・分散することが可能である。前記ヒドロゲル中において、ＰＧＤと難水溶性薬物分子が相互作用し、溶解した状態を保持するためと考えられる。

前記ヒドロゲルに溶解・分散可能な難水溶性薬物としては、例えばパクリタキセル（商品名タキソール）等を挙げることができる。パクリタキセルは、イチイ科の植物の針葉または小葉からの抽出物を原料として合成される抗腫瘍剤であり、癌細胞分裂を阻害して抗腫瘍活性を発揮する。

本発明のヒドロゲルにおいては、前記パクリタキセル等の難水溶性薬物をナノ構造を有するヒドロゲルマトリックス中に速やかに取り込むことができ、例えばこれを水等で希釈しても難水溶性薬物が析出したり沈殿したりすることがない。また、ヒドロゲルに取り込まれる難水溶性薬物の量は、例えば前記膨潤比率により調整することが可能である。ヒドロゲルの膨潤比率にほぼ比例した量の難水溶性薬物が取り込まれる。

前記ヒドロゲルに取り込まれた難水溶性薬物は、ヒドロゲルから除放させることが可能である。この場合、例えばヒドロゲルに用いる３次元架橋物におけるＰＧＤの世代、使用する架橋剤、３次元架橋条件等を調整することにより、難水溶性薬物の放出時間を調整することが可能であり、例えば経口投与時等に要求される数時間での管腔内薬物放出を実現することが可能である。

したがって、前述の難水溶性薬物を溶解・分散したヒドロゲルを用いることで、経口投与に適した薬物送達システムを構築することが可能である。すなわち、前述の３次元架橋物が水またはエタノールを分散媒として膨潤され、且つ難水溶性薬物が溶解・分散されたヒドロゲルを投与し、前記難水溶性薬物を生体内で放出させることで、経口投与に適した薬物送達システムが実現される。

以下、本発明を適用した実施例について、具体的な実験結果を基に説明する。

エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）により架橋されたＰＧＤ−Ｇ３３次元架橋物のヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）の調製
以下の２方法により、架橋剤としてＥＧＤＧＥを使用してＰＧＤ−Ｇ３の３次元架橋物を合成し、ヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）を調製した。

（Ａ）ＮａＯＨ水溶液中での調製
ＰＧＤ−Ｇ３とＥＧＤＧＥとを、サンプルボトル内(モールドサイズ：１４ｍｍ×３．５ｍｍ)に入れ、１ＭＮａＯＨ水溶液中、６０℃、一昼夜反応させ、３次元架橋して３次元架橋物（Ｇ３−ＥＧ）を合成した。反応式を化６に示す。これを水またはエタノールで膨潤してヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）を作製した。作製したヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）の合成条件及び膨潤特性を表１に示す。なお、表１には、合成時の溶媒の種類、ＥＧＤＧＥ濃度、ＰＧＤ−Ｇ３濃度、ＰＤＧ−Ｇ３の１分子中の水酸基の数とＥＧＤＧＥの比率（ＥＧＤＧＥ／ＯＨ基）、水による膨潤比率、エタノールによる膨潤比率を示した。膨潤比率は、下記の数式に基づいて算出した。
膨潤比率（ｑ）＝Ｗｓ／Ｗｄ
Ｗｓ：膨潤したヒドロゲルの重量
Ｗｄ：乾燥したヒドロゲルの重量

（Ｂ）ＤＭＳＯ中での調製
ＰＧＤ−Ｇ３とＥＧＤＧＥとを、サンプルボトル内(モールドサイズ：１４ｍｍ×３．５ｍｍ)に入れ、触媒としてジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、６０℃、一昼夜反応させ、３次元架橋した。反応式を化７に示す。これを水またはエタノールで膨潤してヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）を作製した。作製したヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）の合成条件及び膨潤特性を表１に示す。

例えば水溶性多糖類のヒドロキシル基は、ＮａＯＨ水溶液中、あるいはＤＭＡＰのような触媒剤の存在下、ＤＭＳＯ中で、グリシジルエーテルによって修飾されることが知られている。ＰＧＤは、ヒドロキシル基を多く含んでいるので、前述の各方法は、ＰＧＤの３次元架橋、さらにはこれを膨潤してヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）とするのに適した方法と言える。

ここで、表１に示すように、ＰＤＧＧ３とＥＧＤＧＥの濃度を変更して合成を行った。この際、１ＭＮａＯＨ水溶液におけるＥＧＤＧＥの溶解度には限度があるので、ＥＧＤＧＥとＰＧＤ−Ｇ３のヒドロキシル基の比率が増加した時に、反応混合物に１ＭＮａＯＨを加えた。これにより、ＰＧＤ−Ｇ３の濃度が減少する。水中での膨潤比率は、ＥＧＤＧＥの濃度が上がり、ＰＧＤ−Ｇ３の濃度が下がれば上昇する。ＤＭＳＯ／ＤＭＡＰ条件をゲルの調製に用いれば、ＥＧＤＧＥとＰＧＤ−Ｇ３の両方の濃度が上がる。表１に示すように、ＥＧＤＧＥの濃度が高いので、ヒドロゲル４の膨潤比率が最も小さい値となった。また、ヒドロゲル４を除き、全てのヒドロゲルは円板状の形態を維持し得る硬度を有していた。これらのヒドロゲルはエタノールで膨潤することから、パクリタキセルを溶解・分散可能であると考えられる。

ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ）により架橋されたＰＧＤ−Ｇ３３次元架橋物のヒドロゲル（Ｇ３−ＰＥＧ）の調製
ＰＧＤ−Ｇ３とＰＥＧＤＧＥ（Ｍｎ＝５２６）とを、サンプルボトル内(モールドサイズ：１４ｍｍ×３．５ｍｍ)に入れ、触媒としてジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、６０℃、一昼夜反応させ、３次元架橋した。反応式を化８に示す。これを水またはエタノールで膨潤してヒドロゲル（Ｇ３−ＰＥＧ）を作製した。作製したヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）の合成条件及び膨潤特性を表２に示す。なお、Ｇ３−ＥＧの場合と同様、ＮａＯＨ水溶液中での反応も試みたが、ヒドロゲルを得ることはできなかった。

ヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）及びヒドロゲル（Ｇ３−ＰＥＧ）へのパクリタキセルの導入
ゲルの初期重量を把握するため、乾燥したヒドロゲルを秤取した。パクリタキセルをエタノール（１ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、このパクリタキセルエタノール溶液中にヒドロゲルを加えた。その後、２日間放置し、ゲルの膨潤が平衡に達するようにした。

２日後にヒドロゲルをパクリタキセル溶液から回収し、乾燥するまで温度３７℃に保たれたオーブン中で放置した。ヒドロゲルが乾燥した後、アセトニトリルを加え、ゲル内に取り込まれたパクリタキセルを再度抽出した。抽出後、パクリタキセルの濃度をＨＰＬＣで測定し、ヒドロゲル内のパクリタキセル濃度を算出した。各ヒドロゲル内のパクリタキセル（ＰＴＸ）量を表３に示す。

パクリタキセル量は、概ねヒドロゲルのエタノールによる膨潤比率に比例している。パクリタキセルの溶解性を確認するために、パクリタキセルを導入したヒドロゲルを水中に入れ、１日放置した。ヒドロゲルは透明状態を維持していたので、パクリタキセルは水中で結晶化せずにヒドロゲル内に溶解・分散状態が維持されたものと考えられる。

エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）により架橋されたＰＧＤ−Ｇ４３次元架橋物のヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）の調製
ＰＧＤ−Ｇ４とＥＧＤＧＥとを、サンプルボトル内(モールドサイズ：１４ｍｍ×３．５ｍｍ)に入れ、１ＭＮａＯＨ水溶液中、６０℃、一昼夜反応させ、３次元架橋して３次元架橋物（Ｇ４−ＥＧ）を合成した。反応式を化６に示す。これを水またはエタノールで膨潤してヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）を作製した。作製したヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）の合成条件及び膨潤特性を表４に示す。

なお、ＰＧＤ−Ｇ４を用いた場合には、ＥＧＤＧＥ及びＰＧＤの濃度が同じであるにもかかわらず、各ヒドロゲルの膨潤比率は、ヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）の膨潤比率よりも若干小さかった。これは、ヒドロキシル基の密度が高いため、ナノレベルの超分岐構造がより多く形成されたことによるものと推測される。

ヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）へのパクリタキセルの導入
パクリタキセルのヒドロゲルへの導入や抽出は、ヒドロゲル（Ｇ３−ＥＧ）やヒドロゲル（Ｇ３−ＰＥＧ）の場合と同様にして行った。各ヒドロゲル内に溶解・分散されたパクリタキセル（ＰＴＸ）量を表５に示す。

パクリタキセル量は、概ねヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）のエタノールによる膨潤比率に比例している。パクリタキセルの溶解性を確認するために、パクリタキセルを導入したヒドロゲルを水中に入れ、１日放置した。ヒドロゲルは透明状態を維持していたので、パクリタキセルは水中で結晶化せずにヒドロゲル内に溶解・分散状態が維持されたものと考えられる。

赤外顕微鏡イメージングからパクリタキセルのゲル中での分布
図１はＰＤＧ３次元架橋物のヒドロゲルマトリックスの赤外顕微鏡写真であり、図２はパクリタキセル（ＰＴＸ）の当該ヒドロゲル中における分散状態を示す赤外顕微鏡写真である。これらの写真から、ゲルマトリックス中にパクリタキセルが分散して存在していたことがわかり、ヒドロゲル中においてＰＧＤとパクリタキセル分子が相互作用し、溶解した状態を保持しているものと推測された。

ヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）からの放出挙動
パクリタキセル含有ヒドロゲル（ヒドロゲルＮｏ．１２）をシンク状態を満たす水溶液に浸し、３７℃にて撹拌しながら経時的に放出されたパクリタキセル量をＨＰＬＣにより定量したところ、図３に示すように、９０分間で約６０％のパクリタキセルが放出された。通常、ポリエチレングリコールーポリ乳酸（ＰＥＧ−ＰＬＡ）ブロック共重合体等のミセルの疎水場に分配・保持されたパクリタキセルの場合、放出に１日〜２日を要するので、前記ヒドロゲルを用いることで、経口投与時等に要求される数時間内での管腔内薬物放出が可能であることがわかった。

ＰＤＧ３次元架橋物のヒドロゲルマトリックスの赤外顕微鏡写真である。パクリタキセル（ＰＴＸ）のヒドロゲル中における分散状態を示す赤外顕微鏡写真である。ヒドロゲル（Ｇ４−ＥＧ）におけるパクリタキセル放出量の経時変化を示す特性図である。

Claims

ポリグリセロールデンドリマーと、架橋剤であるポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルとを、ジメチルスルホキシド中で３次元架橋反応させることを特徴とするポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋方法。
前記３次元架橋反応をジメチルスルホキシド中で行う際に、ジメチルアミノピリジンを触媒として使用することを特徴とする請求項１記載のポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋方法。
請求項１または２記載の３次元架橋方法によって製造されたポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物。
請求項１または２記載の３次元架橋方法によって製造されたポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物が、水またはエタノールのいずれかないしは両方を分散媒として膨潤していることを特徴とするヒドロゲル。
請求項１または２記載の３次元架橋方法によって製造されたポリグリセロールデンドリマーの３次元架橋物が、水及びエタノールを分散媒として膨潤しており、かつ、パクリタキセルが溶解され分散されていることを特徴とするヒドロゲル。
請求項５記載のヒドロゲルを経口投与し、前記パクリタキセルを生体内で放出させることを特徴とする薬物送達システム。