JP5076149B2 - 貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 - Google Patents
貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5076149B2 JP5076149B2 JP2008516548A JP2008516548A JP5076149B2 JP 5076149 B2 JP5076149 B2 JP 5076149B2 JP 2008516548 A JP2008516548 A JP 2008516548A JP 2008516548 A JP2008516548 A JP 2008516548A JP 5076149 B2 JP5076149 B2 JP 5076149B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- protein
- amino acid
- acid sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8217—Gene switch
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
Description
(a1)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(a2)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
(a3)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNA又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
(b1)配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b2)配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
(b3)配列番号:3に記載の塩基配列からなるDNA又はその一部の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するタンパク質
糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有するタンパク質であって、上記(a1)〜(a3)から選択される1種又は2種以上の第1のタンパク質及び上記(b1)〜(b3)から選択される1種又は2種以上の第2のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制可能な植物体を作製する作製工程を備える、生産方法が提供される。
糖誘導性プロモーターの作動抑制活性を有するタンパク質であって、上記(a1)〜(a3)から選択される1種又は2種以上の第1のタンパク質及び上記(b1)〜(b3)から選択される1種又は2種以上の第2のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制可能に植物体を改変する工程を備える、改変方法が提供される。
糖の存在下、上記いずれかに記載の植物体において前記貯蔵物質を生産させる工程を備える、生産方法が提供される。
本発明を適用する植物体としては、高等植物であれば特に限定しないで、単子葉植物及び双子葉植物に適用することができる。本発明の実施例で用いるシロイヌナズナのほか、ダイズ、ピーナッツ、ごま、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワー(油脂貯蔵植物)、バレイショ、サツマイモ(デンプン貯蔵植物)などの双子葉植物やイネ、ムギ、キビなどの単子葉植物が挙げられるが、双子葉植物が好ましい。また、植物体としては、デンプン貯蔵植物、油脂貯蔵植物及びタンパク質貯蔵植物などに分類できるが、油脂貯蔵植物に好ましく適用できる。以上のことから、本発明を適用するのに好ましい植物としては、ピーナッツ、ごま、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワーなどの双子葉植物である油脂貯蔵植物が挙げられる。また、サツマイモ、バレイショなどの双子葉植物であるデンプン貯蔵植物も好ましい。なお、本発明において貯蔵物質としては、特に限定されないで、油脂、タンパク質、デンプンなどのいずれであってもよい。好ましくは油脂である。さらに、適用する植物体における貯蔵物質のみならず、外来遺伝子によりコードされ当該植物において産生可能な他の植物体又は他の生物由来のタンパク質等であってもよい。
本発明の植物体の生産方法は、上記したように植物体に対して交配のほか遺伝子操作を実施して前記2以上の遺伝子の発現を抑制可能な植物体を作製する作製工程を備えている。また、植物体における貯蔵物質の蓄積プログラムの改変する方法は、本発明の植物体を生産する方法において実施する上記作製工程の一部である、前記2以上の遺伝子の発現を抑制可能に植物体を改変する改変工程を含んでいる。なお、植物体の改変工程は、交配または遺伝子操作により最終的に種子や植物個体を再生するまでに至らない範囲の交配操作または遺伝子操作のみを行う工程を含んでいる。
本発明の植物体において、前記2以上の遺伝子の発現を抑制することで、糖誘導的に胚形成プログラム又は貯蔵物質の蓄積プログラムが開始される。これらのプログラムの開始により、少なくとも胚形成が開始され維持されるかあるいは貯蔵物質の合成・蓄積が開始され維持される。後述する実施例において示すように、シロイヌナズナにおいては、発芽時に胚形成及び油脂の合成及び蓄積が開始され、カルス培養では、油脂を合成蓄積するとともに植物ホルモン刺激なくても胚形成状態を維持することができる。したがって、本発明の植物体を成長または増殖させることで植物の貯蔵物質を生産することができる。
本発明の植物貯蔵物質の生産促進剤は、前記2以上の遺伝子の発現を抑制する核酸コンストラクトである。こうした各種核酸コンストラクトについては、すでに述べたとおりであり、遺伝子操作により植物体に導入し、形質転換植物体を得ることにより、植物貯蔵物質の蓄積・生産を促進できる。
(材料及び方法)
1.植物材料
植物材料としてはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana (L.) Heynhold, Col-0 ecotype、以下単に野生型という。)を用いた。また、野生型をバックグラウンドとする突然変異株ΔHSI2(hsi2-2)はABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)、SALK institute (La Jolla, CA)から入手した。さらに、ΔHSI2-L1(hsl1-1)は、HSI2-L1(HSL1)遺伝子の12番目のエクソンにT-DNAが挿入された変異株系統(SALK_059568)をSALK Instituteから入手した。
0.025% TritonX-100、5% NaClOからなる滅菌溶液で種子の表面を殺菌し、滅菌水で3〜5回洗浄後、特に断らない限りGamborg B-5ビタミン( 100mg/l ミオイノシトール、10mg/l チアミン塩酸塩、1mg/l ニコチン酸、1mg/l ピリドキシン塩酸塩; Gamborg et al., 1968)、2.5mM Mes-KOH (pH 5.7-5.8)、1%ショ糖を含むMS無機塩 (Murashige and Skoog, 1962)の培地に0.3%のジェライトを加えて固化させたプレート上に播種した。種子の休眠を打破する為に4℃、暗下で2〜5日間のインキュベート後、22℃、40-50 E/m2sの強さの連続光下のグロースキャビネット(SANYO社製)に移して生育させた。
吸水処理後5日目の幼植物体全体を、水・エタノール・酢酸・ホルマリン混液(20:18:1:1,v/v)のFAAで16時間4℃で固定し、エタノール濃度を段階的に上げて脱水した。その後、Technobit 7100(Kulzur Wehrheim, Germany)を用いてそのプロトコールに従って包理した。タングステンナイフを装備したRM2125RTロータリーミクトローム(Leica, Wein, Austria)を用いて包理したサンプルを0.5μmの厚さに切断し、カバーグラス上で乾燥させた。その後、0.05%のトルイジンブルー(Merck, Darmstadt, Germany)で1分間、室温で染色した後、速やかに水で5分間洗浄し、顕微鏡(BX60, Olympus, Tokyo)で観察した。
ジェノタイピングのためのゲノムDNAの抽出Δhsi2(hsi2-2)及びΔhsi2-L1(hsl1-1)のT-DNAの挿入位置の決定は、以下のとおり行った。
ゲノムDNAの抽出は40 μlの0.4N NaOHを入れたマイクロチューブ(安井機械)に植物体から切り取った本葉を1枚いれ、磁性体メタルコーンを加えてマルチビーズショッカー(安井機械)で5秒間の破砕を2回行った。破砕液に200 μlの100mM Tris-HCl (pH 8.0)を加えて中和し、4℃、2,000rpmで遠心分離した後の上清をゲノムDNA溶液としてPCR反応に用いた。DNAシーケンシング用のゲノムDNAはCTAB法で抽出し、PCR反応における鋳型DNAの純度をあげた。すなわち、2gの植物体を凍結破砕した後、5 mlのCTAB buffer (1.42 M NaCl,20 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM Tris-HCl(pH8), 0.25mMポリビニルピロリドン, 52.9mM臭化セチルトリメチルアンモニウム)を加え55℃で30分間インキュベートした後、5 mlのクロロホルムを加え室温で30分間浸透し、3,000 rpmで10分間遠心分離しその上清を精製DNA溶液としPCR反応に使用した。
T-DNA挿入変異株ΔHSI2(hsi2-2)及びΔHSI2-L1(hsl1-1)のT-DNA挿入位置の決定は、上記のビーズショッカーを使用した方法でゲノムDNAを抽出した後、HSI2遺伝子特異的プライマー、HSI-L1(HSL1)遺伝子特異的プライマー及びT-DNA特異的プライマーを用いて行った。図2にHSI2遺伝子及びHSI2-L1(HSL1)遺伝子上のT-DNA挿入位置とプライマーの位置を示す。
S08-f; 5’-GTATCACCAGCCTGTAGCATCATGGAC-3’(配列番号:7)
S08-r; 5’-AGGCAGCTAATGCTGGAGACATGCAG-3’(配列番号:8)
S08-f;5’-GTATCACCAGCCTGTAGCATCATGGAC-3’(配列番号:7)
PL11; 5’-TTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAG-3’(配列番号:9)
S05-f;5'-AAGCATCACACTGCACCCATTGCT-3'(配列番号:10)
S05-r;5'-TCGGAACATTGGGACTAAGAGCAAG-3'(配列番号:11)
S05-f;5'-AAGCATCACACTGCACCCATTGCT-3'(配列番号:10)
PL11; 5’-TTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAG-3’(配列番号:9)
T-DNA挿入位置決定等を明らかにするために行ったDNAシークエンスにはApplied Biosystems社製Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1を用いてシークエンス反応を行い、同社製キャピラリー・シーケンサーABI Prism 3100を用いてシークエンス反応産物を電気泳動する事でDNA配列を明らかにした。
野生型とKK株の吸水処理後4日目の幼植物体から全RNAを抽出し、Agilent's Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit(Agilent Technology, Palo Alto, CA)を用い、そのプロトコールに従いCy3、Cy5でラベルしたcRNAプローブを作成し、Agilent Arabidopsis3oligo Microarrayに対してハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイ解析は、2回の独立したRNA抽出物につきそれぞれハイブリダイゼーションを行った。計2回のハイブリダイゼーション後のシグナル検出と解析及び標準化は、Feature Extractor(Version A.7.5.1.; Agilent Technology)を用いた。マイクロアレイの生データとcRNAのラベリング、ハイブリダイゼーション実験の詳細は公開マイクロアレイデータベースArrayexpress(http://www.ebi.ac.uk/rayexpress )にアクセッション番号E-MEXP-542として登録した(ただし、本件特許出願時において未公開である)。
定量的RT-PCR (Real-time RT-PCR)のための一本鎖cDNAは5 μgの全RNAからオリゴ(dT)20プライマーを用いSUPERSCRIPT III (Invitrogen)によって作製し、Rnase-free水によって10倍に希釈した。Real-time RT-PCRは25 μl 反応溶液中5 μlの希釈したcDNA鋳型溶液、12.5 μlのCybergreen dye set 混合溶液 (Bio-Rad)、0.5 μlずつの遺伝子特異的プライマー(最終濃度 200nM)で行った。反応条件は95℃ 5分(95℃ 15秒、60℃ 15秒、72℃ 30秒) X 40サイクルで行った。相対的mRNAレベルはCt法にもとづいて算出した。ACT2を内部標準遺伝子として用いた。各反応に用いたプライマーセットを以下に示す。なお、oleosin S3、At2S3、LEC1、LEC2は、Mendoza et al.,(2005)に記載の配列を用いた。
Forward; 5’- CTGTTGACTACGAGCAGGAGATGGA -3’ (配列番号:12)
Reverse ; 5’- GACTTCTGGGCATCTGAATCTCTCA -3’ (配列番号:13)
HSI2
Forward; 5’- CTTCCATATCAGCTTGAAACTCTC -3’ (配列番号:14)
Reverse; 5’- TGGCTCAAGACGCCAGTGATGTTT -3’ (配列番号:15)
HSI2-L1(HSL1)
Forward; 5’- ATGAGGCTTCTCCAAGCTGCAGCGT -3’ (配列番号:16)
Reverse ; 5’- GAACCGTGTTCTGTGCTGACCATAT -3’ (配列番号:17)
LHCB2:4
・5'-GTAA AGGT CCGA TCGA AAAT CTGT-3'(配列番号:18)
・5'-TTAT CCGA TCAA ACTC TATT TTCCG-3'(配列番号:19)
Oleosin S3
・Forward; 5’ - AGGCAGATTGCTAAAGCTGCAAC - 3’(配列番号:20)
・Reverse; 5’ - ACTGTGATGAGAGCCGGG -3’(配列番号:21)
At2S3
・Forward; 5’ - AGCAAAACATGGCTAACAAGCTCT - 3’(配列番号:22)
・Reverse; 5’ - CTGGCATCTCTGTCTTGGACCT - 3’(配列番号:23)
LEC1
・Forward; 5’ - ACCAGCTCAGTCGTAGTAGCC -3’(配列番号:24)
・Reverse; 5’ - GTGAGACGGTAAGGTTTTACGCATGAT - 3’(配列番号:25)
LEC2
・Forward; 5’ - CTCTCTCTCTCTCCGGGAAA - 3’(配列番号:26)
・Reverse; 5’ - CCATCTGCTCCACCGGGTAT - 3’(配列番号:27)
WRI1
Forward; 5’ - TCTTTGGGACAAAAGCTCTTGGAATTCGAT - 3’(配列番号:28)
Reverse; 5’ - TACGTATGTGCTGCTGCTTCTTCACT -3’(配列番号:29)
SDS-Polyacrylamide Gel Erectrophoresis(SDS-PAGE)とolesosin S4と12S
Globulin抗体を用いたウェスタンブロッティングはShimada et al.,( J. Biol. Chem. 278: 32292-32299, 2003)に従って行った。野生型乾燥種子、幼植物体及び切り取った胚軸を50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.05%SDS、5%メルカプトエタノール、10%グリセロールを含む抽出用緩衝液中で破砕した。この破砕液を95℃、5分間インキュベート後、15000rpmで10分間遠心した。その上清を、SDS-PAGE並びに引き続き、ポリジフルオロビニリデンのメンブレン(0.45mm; Nihon Millipore,Tokyo)にセミドライ式転写装置(Bio-Rad)を用いて転写した。転写後のメンブレンを、5%(w/v)スキムミルクを含む20mM Tris-HCl(pH7.5)、0.14M NaCl,0.05%(w/v)Toriton-X100からなる緩衝液中でインキュベートし、抗12S globulin抗体(20000倍希釈)若しくは抗oleosin S4抗体(10000倍希釈)で1時間インキュベートした。その後、西洋ワサビ過酸化水素標識抗ウサギIgG抗体(5000倍希釈;GE Healthcare Bio-science、 Piscataway, NJ)を二次抗体として用いた。シグナルはECL Western Blotting Detection Reagent(GE Healthcare Bio-science)を用いて検出した。
Fat Red 7Bを用いた組織染色は、Brundrett et al.,(1991)の方法に従って行った。ポリエチレングリコール(平均分子量400D、Sigma, St.Louis, MO)に、0.1%(w/v)Fat Red 7B(Sigma)を1時間90℃で溶解させ、等量の90%(v/v)グリセロールと混合させたものを染色液とした。この染色液中に組織標品を1時間、室温でインキュベートした。その後、水で数回洗浄した後、グリセロールでスライドグラス上にマウントし顕微鏡(SZX12、OLYMPUS)下で観察した。
トリアシルグリセロール(TAG)を分析するために、20mgの組織をクロロホルム・メタノール混液(2:1(v/v))1ml中で破砕し、15000rpmで5分間遠心した。その上清を乾固させ、20μlのクロロホルムに再溶解した。この脂質標品をシリカゲル60F254 HPTLCシート(Merck)にスポットし、ヘキサン・ジエチルエーテル・酢酸混液(4:1:0.05、v/v)の展開溶液を用いて展開した。精製グリセロールトリリノレン酸(Sigma)をTAGの標準標品として同時に展開した。展開後のHPTLCシートに硫酸を塗布して120℃、5分間加熱して脂質を視覚化した。
HSI2-L1(HSL1)遺伝子の12番目のエクソンにT-DNAが挿入された変異株系統(SALK_059568)から、T-DNAホモ挿入系統をゲノミックPCRにより選抜した。ホモ挿入系統は、野生型と比較してHSI2-L1 (HSL1) mRNA量が顕著に低下していた。この結果に基づいて、このT-DNA挿入変異株系統をΔHSI2-L1(hsl1-1)とした。ΔHSI2-L1(hsl1-1)植物体は、目立った異常はなく野生型株同様の生育を示した。
二重変異株の幼植物体の成長を観察するため、Δhsi2-/-/Δhsi2-l1+/-及びΔhsi2+/-/Δhsi2-l1−/-の後代植物体の種子を1%スクロース含有寒天培地で発芽させた。シロイヌナズナの野生型では吸水処理後3日目には根毛が発達し(図4右列最上段)、緑化した子葉が5日目には展開し(図4右列2段目)、さらに7日目には根が相当程度伸張する(図4右列3段目)。また、野生型の胚軸は凹凸は観察されない(図4右列最下段)。これに対して、KK株は、根毛の発達と子葉の展開について顕著な遅延が観察されるため(図4左列最上段、2段目)、吸水処理後3〜5日で他の遺伝子型の幼植物体を区別することができた。さらに、KK株は吸水処理後5日目に胚軸が肥大し(図4左列2段目)、吸水処理後7日目には胚軸は淡黄色となり凸凹した表面を有するようになった(図4左列3段目)。さらに、9日目には、肥大化し凸凹のある胚軸は黄色に色づいたカルス様となるとともに、この段階でほとんどのKK株は成長を停止した(図4左列4段目及び最下段)。加えて8〜15%のKK変異株において子葉が3枚になる個体が現れた。このことは、KK株は、発生においてなんらかの欠損を持っていることを示唆した。
ΔHSI2(hsi2-2)及びΔHSI2-L1(hsl1-1)についての二重欠損により発現レベルの影響を受ける遺伝子を調べるため、野生型とKK株についてマイクロアレイ解析を行った。KK変異株の胚軸の肥大化が生じない吸水処理後4日目の幼植物体から全RNAを抽出し、材料及び方法の6.マイクロアレイ解析の記載に従って操作した。シロイヌナズナの37685の遺伝子に対応するプローブが固定化された2枚のアレイ(Agilent Arabidopsis3 oligo Microarray)において、野生型よりもKK株が2倍以上の発現量であった遺伝子が856個存在し、発現量が30倍以上であった遺伝子も40個存在した。一方、KK株において発現量が低下した遺伝子も存在した。KK株において発現量が30倍上昇した遺伝子群を図5に示し、発現量が1/5以下に低下した遺伝子群を図6に示す。
KK株幼植物体において種子登熟・胚発生期に重要な役割を果たす転写因子群の発現が吸水処理後4日目以降においてどのように変化しているかを調べた。すなわち、野生型とKK株の吸水処理後4,5,7,9日目の幼植物体から全RNAを抽出して、材料と方法の7.定量的リアルタイムRT-PCRによる発現解析に従い操作した。図7Aには、1%スクロース含有培地における結果を示す。また、培地のスクロース濃度を変えて5日目の幼植物体からRNAを分離して定量的リアルタイムRT-PCRを実施した。結果を図7Bに示す。
マイクロアレイ解析によりKK株では幼植物体においても後期胚発生型の遺伝子発現プロファイルを示していた(実施例3)。そこで、KK株幼植物体で種子貯蔵タンパク質が蓄積しているかどうかをSDS-PAGEによって調べた。スクロースを含まない培地及びスクロース1%を含有する培地でそれぞれ吸水処理後、4、7及び9日目の野生型とKK株の幼植物体からタンパク質を抽出し、前述の材料と方法の8.SDS-PAGEとウェスタンブロッティングに従い操作した。また、野生型とKK株の幼植物体に種子特異的な貯蔵物質である脂質が蓄積されているかどうかについて同9.FAT RED 7B染色に従い操作して調べた。さらに、この染色がトリアシルグリセロール(TAG)によるものであるかどうかを、前記材料及び方法の10.脂質分析に従い操作して調べた。SDS-PAGE等におけるコントロールとしては、野生型の乾燥種子から抽出したタンパク質サンプルを用いた。これらの結果を図8A〜図8Cに示す。
KK株では胚発生後期の細胞状態が幼植物体にも現れ、胚軸がカルス様になることから、植物成長を制御している植物ホルモンであるサイトカイニンやオーキシンによってシュートの再分化能を獲得すると考えられた。このため、野生型とKK株の種子を0.86μMのインドール酢酸と2.5μMのN6-(Δ2-イソペンテニル)―アデニンを含むSIM培地(shoot inducing medium)に播種し植物体を観察した。結果を図9に示す。
春化処理後の7日目の幼植物体(野生型(Col-0株)及びKK変異株)及び乾燥種子(野生型)、各20 mgの組織からクロロホルム:メタノール混液(2:1, v/v) 1 mlで脂質を抽出後、15,000 rpmで5分間遠心分離した。上清を乾固させ、250μlのメタノール、2% C15=0Me を15μL加え再溶解させた。再溶解させた試料100μlに900μlのメタノール、1ml 10% HCl(in メタノール)を添加し80℃、1時間でメタノリシス化を行った。メタノリシス化後、1.5mlのn-Hexaneを加え撹拌し、n-Hexane層を回収しN2条件下で乾固させた。乾固させた試料を500μlのn-Hexaneに再溶解させ、GC2010(島津製作所)を用いたガスクロマトグラフィーにより脂肪酸メチルエステルの脂肪酸含有量を定量した。結果を、図12に示す。
Claims (22)
- 植物体であって、
少なくとも、以下の第1のタンパク質及び第2のタンパク質をコードする遺伝子の発現が不可逆的に抑制されており、
前記第1のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質であり、
前記第2のタンパク質は、配列番号4で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しておりかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質であり、
糖誘導的に胚発生又は貯蔵物質の蓄積を開始する、植物体。 - 前記第1のタンパク質及び前記第2のタンパク質をコードする遺伝子が破壊されている、請求項1に記載の植物体。
- 糖誘導的に胚発生後期型の遺伝子発現を示す、請求項1又は2に記載の植物体。
- 糖誘導的に貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子及び該貯蔵物質関連タンパク質をコードする遺伝子を正に制御する転写因子遺伝子から選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現量が増大し、光合成関連遺伝子から選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現量が減少する遺伝子発現を示す、請求項1〜3のいずれかに記載の植物体。
- 糖誘導的に貯蔵物質を産生する、請求項1〜4のいずれかに記載の植物体。
- 前記貯蔵物質は種子における貯蔵物質である、請求項1〜5のいずれかに記載の植物体。
- 前記貯蔵物質は油脂を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の植物体。
- 植物個体の全体又は一部である、請求項1〜7のいずれかに記載の植物体。
- 前記植物個体は、糖誘導的に本来の貯蔵器官以外の部位で貯蔵物質を蓄積する、請求項8に記載の植物体。
- 胚軸に前記貯蔵物質を集積する幼植物個体である、請求項8又は9に記載の植物体。
- 種子である、請求項1〜7のいずれかに記載の植物体。
- 前記種子は、糖誘導的に発芽後の幼植物個体の胚軸に前記貯蔵物質を蓄積する、請求項11に記載の植物体。
- 前記植物体は培養組織である、請求項1〜7のいずれかに記載の植物体。
- 前記培養組織はカルスである、請求項13に記載の植物体。
- 植物細胞である、請求項1〜7のいずれかに記載の植物体。
- 前記植物体は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)又は該植物種由来である、請求項1〜15のいずれかに記載の植物体。
- 植物体の生産方法であって、
第1のタンパク質及び第2のタンパク質をコードする遺伝子の発現が不可逆的に抑制された植物体を作製する工程、
を備え、
前記第1のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質であり、
前記第2のタンパク質は、配列番号4で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しておりかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有する第2のタンパク質であり、
前記植物体は、糖誘導的に胚発生又は貯蔵物質の蓄積を開始する植物体である、生産方法。 - 前記作製工程は、前記第1のタンパク質及び前記第2のタンパク質のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現が不可逆的に抑制された植物個体の交配による種子の作出を含む、請求項17に記載の生産方法。
- 前記作製工程は、前記タンパク質をコードする遺伝子を破壊する遺伝子操作を含む、請求項17又は18に記載の生産方法。
- 植物体の貯蔵物質集積プログラムの改変方法であって、
第1のタンパク質及び第2のタンパク質をコードする遺伝子の発現が不可逆的に抑制された植物体を作製する工程、
を備え、
前記第1のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質であり、
前記第2のタンパク質は、配列番号4で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しておりかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有する第2のタンパク質であり、
前記植物体を糖誘導的に胚発生又は貯蔵物質の蓄積を開始するように改変する、改変方法。 - 植物貯蔵物質の生産方法であって、
糖の存在下、請求項1〜16のいずれかに記載の植物体において前記貯蔵物質を生産させる工程を備える、生産方法。 - 第1のタンパク質をコードする遺伝子を破壊する核酸コンストラクトと、
第2のタンパク質をコードする遺伝子を破壊する核酸コンストラクトと、
を含み、
前記第1のタンパク質は、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質であり、
前記第2のタンパク質は、配列番号4で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と95%以上の同一性のアミノ酸配列を有しておりかつ植物細胞においてサツマイモスポラミン最小プロモーターにより作動可能に連結された遺伝子の発現を抑制する活性を有するタンパク質であり、
植物体に糖誘導的に胚発生又は貯蔵物質の蓄積を開始させる、植物貯蔵物質生産促進剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008516548A JP5076149B2 (ja) | 2006-05-23 | 2006-10-10 | 貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006142455 | 2006-05-23 | ||
JP2006142455 | 2006-05-23 | ||
PCT/JP2006/320222 WO2007135755A1 (ja) | 2006-05-23 | 2006-10-10 | 貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 |
JP2008516548A JP5076149B2 (ja) | 2006-05-23 | 2006-10-10 | 貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007135755A1 JPWO2007135755A1 (ja) | 2009-09-24 |
JP5076149B2 true JP5076149B2 (ja) | 2012-11-21 |
Family
ID=38723069
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008516548A Active JP5076149B2 (ja) | 2006-05-23 | 2006-10-10 | 貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8148606B2 (ja) |
JP (1) | JP5076149B2 (ja) |
WO (1) | WO2007135755A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2762204A1 (en) * | 2009-05-28 | 2010-12-02 | National Research Council Of Canada | Increased seed oil and abiotic stress tolerance mediated by hsi2 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7446241B2 (en) * | 2002-07-30 | 2008-11-04 | Texas Tech University | Transcription factors, DNA and methods for introduction of value-added seed traits and stress tolerance |
-
2006
- 2006-10-10 US US12/227,530 patent/US8148606B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-10-10 JP JP2008516548A patent/JP5076149B2/ja active Active
- 2006-10-10 WO PCT/JP2006/320222 patent/WO2007135755A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007135755A1 (ja) | 2007-11-29 |
JPWO2007135755A1 (ja) | 2009-09-24 |
US20110065941A1 (en) | 2011-03-17 |
US8148606B2 (en) | 2012-04-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tsuwamoto et al. | Arabidopsis EMBRYOMAKER encoding an AP2 domain transcription factor plays a key role in developmental change from vegetative to embryonic phase | |
RU2185439C2 (ru) | Способ получения растения подсолнечника, способ получения семян подсолнечника и рекомбинантная плазмида | |
US8952216B2 (en) | Plant promoter operable in basal endosperm transfer layer of endosperm and uses thereof | |
US10793868B2 (en) | Plants with increased seed size | |
AU2010237615B2 (en) | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof | |
CN111630174A (zh) | 遗传修饰植物的再生 | |
Chen et al. | High throughput Agrobacterium tumefaciens-mediated germline transformation of mechanically isolated meristem explants of cotton (Gossypium hirsutum L.) | |
JP7453657B2 (ja) | 受精を介さず種子植物の胚乳発生を誘導する核酸分子及びベクター、並びに受精を介さず胚乳を発生しうる組換え種子植物及びその作製方法 | |
HUE031906T2 (en) | A method for producing fertile plants by BBM induction during transformation | |
Khoudi et al. | Optimization of regeneration and transformation parameters in tomato and improvement of its salinity and drought tolerance | |
JP2009534019A (ja) | サトウダイコンの抽薹を制御するトランスジェニック植物およびそのための方法 | |
Padilla et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of'Brewster'('Chen Tze') litchi (Litchi chinensis Sonn.) with the PISTILLATA cDNA in antisense | |
EP2220243A1 (en) | Transformation of crambe abyssinica | |
AU2007237251A1 (en) | Method to produce sterile male flowers and partenocarpic fruits by genetic silencing, associated sequences and vectors containing said sequences | |
JP5076149B2 (ja) | 貯蔵物質の蓄積に関連するプログラムが改変された植物体及びその利用 | |
Wang et al. | Heterologous expression of Arabidopsis ERS1 causes delayed senescence in coriander | |
JP2009542193A (ja) | 植物中のデンプン貯蔵に関する改善 | |
EP1590367A2 (en) | Control of plant growth and developmental processes | |
JP4997508B2 (ja) | イネの粒長を制御するLk3遺伝子およびその利用 | |
JP3605633B2 (ja) | 新規植物遺伝子、該遺伝子を利用した植物改変方法および該方法により得られる植物体 | |
AU2013257385B2 (en) | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof | |
US9714429B2 (en) | Regulatory sequence of cupin family gene | |
AU2015204312A1 (en) | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof | |
Gupta et al. | Compliance with ethical standards 18 | |
CA2827836A1 (en) | Plant protease |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091006 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120403 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120604 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120731 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5076149 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |