JP5062634B2 - 塩基配列設計方法 - Google Patents
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Description
なお、本出願は、2006年3月9日出願の日本国出願番号特願2006−64816を基礎とする優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。
本発明は、所定の翻訳系を用いて発現させる遺伝子の塩基配列設計方法であって、その遺伝子のコドン配列を、学習データにおけるコドン配列の規則性に適合させることを特徴とする。以下、具体的に説明する。なお、本明細書で「コドン配列」とは、「三組みコドンの並び」のことをいうものとする。また、「コドン配列の規則性」とは、「現れることが期待される確率が最も高いコドン配列」を意味するものとする。
を最大化するようなパラメータの組 {πa, sab, da(ci)} を求める。(ここで、πaはスタートコドン(Met)出力前における状態aの初期確率、sabは状態 a から状態 bへの状態遷移確率、da(ci)は状態 a で コドンci が観測される出力確率である。)
1. 初期値π1, sab, da(ci)を設定する。
2. 学習データ上の遺伝子gにおいてi番目のコドンで状態aから状態bへの遷移確率γi(a,b,g)を、i,a,b全ての組み合わせに関して学習データから演算する。
具体的には、以下の式を計算する(ここで、Lは遺伝子gの全コドン数、ci Lはi番目からL番目(つまり最後まで)のコドンを意味する文字列、Sは状態 a から状態 bへの状態遷移に対応したsabに関して全ての状態遷移に対応したsab、Dはコドンciに対応したda(ci)に関して全てのコドンに対応したda(ci)である。)
3. γi(a,b,g)からπ1, sab, da(ci)を計算して再定義する。
具体的には、以下の式を計算する。
4.各パラメータが安定しなければ2へ戻る。
となる。
まず、(i)に関しては明らかであって、ここでの目的が、発現させる遺伝子のコドン配列を決めることであるため、目的とすべきアミノ酸配列はあらかじめ決まっており、i番目に、アミノ酸aiに対応しないコドンciを使用している塩基配列を選択できない(ii)に関しても明らかといえるが、以下、帰納法にて厳密に証明する。
上記塩基配列設計方法を自動化するために、コンピュータに実行させることができるようにプログラム化する。こうして作成されたプログラムも、本発明の権利範囲内である。
(1)S.cerevisiaeのadh1遺伝子及びadh2遺伝子の塩基配列の設計
本実施例では、翻訳系として大腸菌JM109を用いた。この細胞株は、大腸菌K12株に由来する菌株であるため、学習データとして、ゲノムデータベースDDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)のE.coli K12 MG1655の塩基配列データを利用した。この翻訳系で発現させる遺伝子として、Saccharomyces cerevisiae由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子adh1(adh1w、配列番号1)及びadh2(adh2w、配列番号2)を用いた。
好適化したadh1遺伝子(adh1c、配列番号3)及びadh2遺伝子(adh2c、配列番号4)を以下のように合成した。
反応液: 0.2 mM dNTP 5μl
primer mix 0.5μl
Pfu Ultra (Stratagene) 0.25μl
Pfu Ultra用10×buffer 5μl
滅菌水 39.25μl
反応液: テンプレート 1μl
0.2 mM dNTP 5μl
プライマー(配列番号57)(250μM) 0.5μl
プライマー(配列番号31)(250μM) 0.5μl
Pfu Ultra (Stratagene) 1μl
Pfu Ultra 用10×buffer 5μl
滅菌水 36μl
PCR産物をアガロースゲルで精製し、EcoRIで切断後、pUC19のEcoRI部位に挿入した。塩基配列を決定することにより、正しい配列を有していることを確認した。また、adh2cに関しては、adh1cと同様に設計したプラスミドの合成をoperon社に合成委託したが、基本的には、adh1cと同様に合成することができる。
一方、adh1w及びadh2wは、S.cerevisiae YPH 499から抽出したゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行い、各クローンを得た。なお、PCRは、それぞれの遺伝子に対するプライマーペア(adh1wに対しては、配列番号58と59のプライマーペア、adh2wに対しては配列番号60と61のプライマーペア)を用い、94℃2分の変性反応後、94℃30秒−53℃30秒−72℃60秒を30サイクル行い、72℃10分の伸長反応を行った。
プライマー(大文字はクローニングのために付加した制限酵素サイトを示す):
adh1w増幅用forwardプライマー(配列番号58):
GGAATTCatgtctatcccagaaactcaaaaaggtgtt
adh1w増幅用reverseプライマー(配列番号59):
GGAATTCttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
adh2w増幅用forwardプライマー(配列番号60):
GGAATTCatgtctattccagaaactcaaaaagccatt
adh2w増幅用reverseプライマー(配列番号61):
GGAATTCttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
反応液: テンプレート 1μl
0.2 mM dNTP 5μl
フォワードプライマー(250μM) 0.5μl
リバースプライマー(250μM) 0.5μl
Pfu Ultra (Stratagene) 1μl
Pfu Ultra 用10×buffer 5μl
滅菌水 36μl
PCR産物をアガロースゲルで精製し、EcoRIで切断後、pUC19のEcoRI部位に挿入した。塩基配列を決定することにより、正しい配列を有していることを確認した。
このようにして得られたadh1c、adh2c、adh1w及びadh2wがEcoRI部位に挿入されたプラスミドを鋳型とし、PCRを行った。なお、PCRは(3)と同様の条件で行なったが、プライマーは各遺伝子を特異的に増幅するプライマーペア(adh1cに対しては、配列番号62と63のプライマーペア、adh2cに対しては配列番号64と65のプライマーペア、adh1wに対しては、配列番号66と67のプライマーペア、adh2wに対しては配列番号68と69のプライマーペア)を用いた。
プライマー(大文字はクローニングのために付加した制限酵素サイトを示す):
pCold用adh1c増幅用forwaordプライマー(配列番号62)
CCGGAATTCatgagcattccggaaacgcaaaaaggtgtg
pCold用adh1c増幅用reverseプライマー(配列番号63)
AACTGCAGttatttgctggtatccaccacatagcggcc
pCold用adh2c増幅用forwaordプライマー(配列番号64)
CCGGAATTCatgagcattccggaaacccagaaagcgattatt
pCold用adh2c増幅用reverseプライマー(配列番号65)
AACTGCAGttatttgctggtatccaccacatagcggcc
pCold用adh1w増幅用forwaordプライマー(配列番号66)
CCGGAATTCatgtctatcccagaaactcaaaaaggtgttatc
pCold用adh1w増幅用reverseプライマー(配列番号67)
AACTGCAGttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
pCold用adh2w増幅用forwaordプライマー(配列番号68)
CCGGAATTCatgtctattccagaaactcaaaaagccattatc
pCold用adh2w増幅用reverseプライマー(配列番号69)
AACTGCAGttatttagaagtgtcaacaacgtatctacc
PCR産物をアガロースゲルで精製し、EcoRI及びPstIで切断後、低温発現誘導型のベクターであるpColdIII及びpColdIV(タカラバイオ社)のEcoRI-PstI部位に挿入した。このようにして作製したプラスミド(表1)をJM109に形質転換した。
まず、各プラスミドを有するE.coli JM109株及びインサートを有さないpUC19を有するJM109株を3 ml LB液体培地にて、37 ℃ 12 時間程度、撹拌しながら前培養した。その後の本培養は、以下のようにベクターによって操作が異なる。
基質溶液: ピロリン酸ナトリウム 85mM
セミカルバジド塩酸塩 6.5mM
グリシン 18mM
エタノール 550mM
NAD+ 1.75mM
Claims (9)
- 所定の翻訳系を用いて発現させる遺伝子の塩基配列設計方法であって、
入力装置が、遺伝子の塩基配列をコンピュータに入力する工程と、
前記コンピュータが、入力された前記遺伝子の塩基配列から得られるコドン配列を、学習データにおける、バウム・ウエルチ アルゴリズムを用いて計算されたコドン配列の規則性に、隠れマルコフモデルを用いて適合させる工程と、
出力装置が、適合させた前記遺伝子の塩基配列を出力する工程と、
を含むことを特徴とする塩基配列設計方法。 - 前記学習データが、前記翻訳系が由来する生物種の遺伝子プールであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記学習データが、所定の翻訳系において、すでに発現レベルが所定レベル以上であることが明らかになっている遺伝子プールであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記コンピュータが、さらに、適合させた前記遺伝子の塩基配列を、適合させる際に用いた前記学習データに、データとして追加する工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記翻訳系が細胞内にあることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記翻訳系がin vitroタンパク合成系内にあることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 所定の翻訳系を用いて発現させるための遺伝子の塩基配列を設計するためのプログラムであって、
コンピュータに請求項1〜6のいずれか1項の方法を実行させるプログラム。 - 請求項7に記載のプログラムを記録した、コンピュータで読み取り可能な記録媒体。
- 所定の翻訳系を用いて発現させるための遺伝子の塩基配列設計システムであって、
(i) 遺伝子の塩基配列をコンピュータに入力するための入力装置、
(ii) 前記入力装置によって入力された前記遺伝子の塩基配列から得られるコドン配列を、学習データにおける、バウム・ウエルチ アルゴリズムを用いて計算されたコドン配列の規則性に、隠れマルコフモデルを用いて適合させるためのコンピュータ、および
(iii) 適合させた前記遺伝子の塩基配列を出力するための出力装置
を備えた塩基配列設計システム。
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