JP5051380B2 - 人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法 - Google Patents
人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5051380B2 JP5051380B2 JP2008097554A JP2008097554A JP5051380B2 JP 5051380 B2 JP5051380 B2 JP 5051380B2 JP 2008097554 A JP2008097554 A JP 2008097554A JP 2008097554 A JP2008097554 A JP 2008097554A JP 5051380 B2 JP5051380 B2 JP 5051380B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- membrane
- artificial
- test substance
- membrane permeability
- permeability
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Description
また一方で、医薬品開発のコストは増大し、医薬品開発競争は激化していることから、脂質膜透過性のin vitroでの評価には、生体における実際の消化管吸収性との高い相関性はもちろんのこと、さらに低コスト性や迅速性も求められている。したがって、これらの要望を満たす脂質膜透過性の評価方法が、医薬品の開発を低コストかつ効率的評価を進める上で望まれてきた。
in vitroで用いる脂質膜透過の評価方法としては、従来、CaCo−2やMadin−Darby canine kidney(MDCK)などの単層細胞膜系を用いる方法、あるいは実験動物からの摘出臓器を用いる方法が用いられてきた(非特許文献1,2および3)。しかしながらこれらの方法は、長時間の細胞培養あるいは大量の動物の犠殺を必要とし、コスト、スループットおよび倫理上の問題などから、大規模スクリーニング系としては不十分である。
これに対し、脂質膜透過をin vitroで低コストかつ迅速に評価可能な方法として、前記のような生物由来の脂質膜ではなく、フィルターに脂質などを保持した人工脂質膜を用いる方法も知られるようになってきた。特に、Parallel Artificial Membrane Permeation Assay(以下PAMPA法)は広く利用されており(非特許文献4、5、6、7、8)、また、PAMPA法に利用可能で更なる改良を加えた人工脂質膜も報告されている(特許文献1、2、非特許文献9、10)。
しかしながら、これら既存の人工脂質膜を用いた方法では、被験物質の透過性が低いために、特に低透過性物質の評価に難点があった。また、in vivoでの生体膜透過性との相関が悪い、測定時間が長い、データの解析方法が難解である、多種類の脂質を溶解する必要がある、或いは試験の準備が非常に煩雑などの課題もあった。
Fujikawa M.et al.;Bioorg.Med.Chem.,13,4721−4730,2005 Bohet H.et al.;J Curr.Top Med.Chem.,1(5),367−383,2001 Tian.R.;Pharm.Res.;19(6):802−809,2002 Kansy M.et al.;J.Med.Chem.,41、1007−1010,1998 Sugano K.et al.;Int.J.Pharm.,257,245−251,2003 Wohnsland F.et al.;J.Med.Chem.,44,923−930,2001 Scmmidt D.et al.;Millopore Application Note,Lit. No. AN1725EN00,millipore Corporation,2002 Scmmidt D. et al.;Millopore Application Note,Lit. No. AN1729EN00,millipore Corporation,2003 Ruell J.A.;Eur.J.Pharm.Sci.;22,365−374,2004 Chen X.et al."A Novel Design of Artificial Membrane for Improving the PAMPA Model" Pharm Res.,2008年1月10日オンライン公開
すなわち、本発明は以下によって構成されるものである。
1)
式(I)
[式中、XとYの比率が99:1乃至1:99であり、nは2乃至10の整数、Rは水素原子又はOR1(式中、R1は水素原子、C1-8アルキル基又はC6-14アリール基を表す。)を意味する。]で表される繰り返し単位を有し、分子量が5000乃至500000である高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする被験物質の膜透過性測定方法。
2)
式(I)のXとYの比率が1:2乃至1:3であり、nが4であり、Rが水素原子であり、かつ高分子化合物の分子量が20000乃至200000の範囲であることを特徴とする1)に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
3)
(1)人工膜の一方面に被験物質を含む溶液が接するように配置する工程、(2)当該人工膜の他方面に前記被験物質を含まない溶液が接するように配置する工程、(3)所定時間に当該人工膜及び溶液を一定温度に保つ工程、(4)前記一方面側及び/または前記他方面側の前記被験物質の量を測定する工程、及び(5)測定された量に基づき前記被験物質の膜透過性を評価する工程を含むことを特徴とする1)又は2)に記載の被験物質の膜透過性測定方法。
4)
3)に記載の「人工膜及び溶液」を収容する容器から構成される膜透過性測定キット。
5)
3)に記載の膜透過性測定方法により得られた被験物質の膜透過性のデータに基づき、所望の被験物質を選択することを特徴とする被験物質のスクリーニング方法。
6)
被験物質が医薬品用途の薬剤である5)に記載のスクリーニング方法。
本発明の方法における人工膜は、多孔質の支持体に高分子化合物を添加することにより構築される。このような支持体の形態としては、例えばシート状あるいは膜状の円形或いは四角形であることが望ましい。大きさは、円形の場合、直径0.01〜4cm、好ましくは0.05〜2cm、さらに好ましくは0.1〜1cmのものが用いられる。厚さは、好ましくは10〜200μm、さらに好ましくは20〜100μmのものが用いられる。材質としては、例えば、ガラスファイバー、ポリカーボネート、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリエーテル・サルフォン、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)が使用できるが、より好ましくは、PVDFが使用される。孔径は、好ましくは0.01〜20μm、より好ましくは0.05〜10μm、さらに好ましくは0.1〜5μm、最も好ましくは0.1〜1μm程度のものが用いられる。
式(I)
当該高分子化合物の共重合成分である2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、例えば、2−ブロモエチルホスホリルジクロリドと2−ヒドロキシエチルメタクリレートを反応させ、2−メタクリロイルオキシエチル2’−ブロモエチルリン酸(MBP)を得、このMBPをトリメチルアミンのメタノール溶液中で反応させて得ることができる。一方の共重合成分であるメタクリル酸エステルの具体的な例としては、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ペンチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸トリデシル、メタクリル酸2−エトキシエチル、メタクリル酸2−エトキシプロピル、メタクリル酸2−フェノキシエチル、メタクリル酸2−ブトキシエチル、メタクリル酸3−ヒドロキシプロピル、メタクリル酸3−メトキシプロピル、メタクリル酸3−フェノキシプロピル、メタクリル酸4−ヒドロキシブチル、メタクリル酸4−メトキシブチル、メタクリル酸4−フェノキシブチル等が挙げられる。この中では、メタクリル酸ブチルが最も好ましい。
「人工脂質膜の調製」
式(I)に示される2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体であり、XとYの比率が3:7であり、nが4であり、Rが水素原子であり、分子量が約10万であるPUREBRIGHT MB-37-100T(市販品;日油株式会社製)を0.3(g/100mL)の濃度になるようにヘキサノール:ドデカン=1:2(v:v)の混合液に溶解した。得られた溶液の4〜5μLをフィルタープレート(Millipore社製 MultiScreen Filter Plate 疎水性PVDF MAIPN4510、孔径0.45μm)の各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
「膜透過性の測定」
96ウェルプレート(Millipore社製 MultiScreen 96Well Plate 疎水性PVDF MAIPN4510)の各ウェル(容積360μL)を、Hanks‘Balanced Salt Modified(Sigma−Aldrich社製)を9.7g、D−glucoseを3.5g,4−(2−hydroxyethyl)−1−piperazineethanesulfonic acidを2.86g,炭酸水素ナトリウムを0.37gの割合で水1Lに溶解し、0.1N水酸化ナトリウムを用いて、予めpH7.35に調整した溶液(以下、Transport緩衝液と記す)で満たした後、フィルター部に人工脂質膜を形成したフィルタープレートをかぶせた。このとき、ウェルプレートのTransport緩衝液とフィルタープレートの間に気泡が存在しないことを確認した。
10〜50%の割合でジメチルスルフォキシドを含有するTransport緩衝液に、表1に示す被験物質群を各2mMの濃度になるように溶解し、サンプル溶液を調整した。この際、被験物質は医薬品として販売されており、ヒトにおける消化管吸収率が報告されている化合物を選択した。調整された各被験物質のサンプル溶液を、人工脂質膜が形成されたフィルタープレート上に150μL添加し、カバープレート(Millipore社製 MultiScreen 96Well Plate MAIPN4510)を置いて蓋をした。蓋をしてから0.5時間、37℃でインキュベートを行った。カバープレートとフィルタープレートを取り除いた後、ウェルプレートの各ウェルの吸光度を250〜450nm(10〜20nm間隔)でマイクロプレートリーダーを用いて測定した。またこのとき、10倍に希釈した標準液も同時にウェルプレートの空いている箇所に300μLの容量で添加し、試験液と同様に吸光度を測定した。
人工脂質膜に対する被験物質の透過性を示すパラメーターとして、膜透過クリアランス値を、当該分野にて一般的に用いられる原理に基づき、次式により算出した(参考文献:AAPS PharmSci.;1(4):E18、1999)。
膜透過クリアランス値=Cog×Aac/Aog×Vac/1000/1000/T/60/60/S
Cog;10倍に希釈した標準液の初期濃度(この実施例では200μM)
Aog;10倍に希釈した標準液のマイクロプレートリーダーより得られた吸光度
Aac;マイクロプレートリーダーより得られたサンプルの吸光度
T;インキュベーション時間(0.5時間)
Vac;ウェルプレートに添加したトランスポート緩衝液の容積(ここでは200μL)
S;膜表面積(ここでは0.266cm2)
さらに、実施例1〜2および比較例1〜4については、当該分野にて一般的に用いられる統計学的手法によりヒトにおける消化管吸収率と膜透過性クリアランス値の間の相関関係を解析した。すなわち、各化合物のヒトにおける消化管吸収率を縦軸に、得られた膜透過性クリアランス値の片対数値を横軸にとり、非線形最小2乗法により求められた近似直線に基づいて相関係数Rの2乗値である決定係数R2をマイクロソフトエクセル(商品名;マイクロソフト社製)により算出した。決定係数R2は、ヒトにおける消化管吸収率と膜透過性クリアランス値との間の相関性を示す指標であり、1に近いほど両者の間で相関性が優れるものと判断した。その結果を表1に示した。
式(I)に示される2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体であり、XとYの比率が3:7であり、nが4であり、Rが水素原子であり、分子量が約3万であるPUREBRIGHT MB-37-50T(市販品;日油株式会社製)を0.3(g/100mL)の濃度になるようにヘキサノール:ドデカン=1:2(v:v)の混合液に溶解した。得られた溶液の4〜5μLをフィルタープレート(Millipore社製 MultiScreen Filter Plate 疎水性PVDF MAIPN4510、孔径0.45μm)の各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例1と同様の方法にて行った。
Wohnslandらの方法(非特許文献6)に従い、ヘキサデカンをヘキサンに5(g/100mL)の濃度になるように溶解した。得られた溶液の4〜5μLを実施例1と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例1と同様の方法にて行った。
Kansyらの方法をより最適化した方法として、Schmidtらの方法(非特許文献7)が報告されている。本法に従い、lecithinを4(g/100mL)の濃度になるように、ドデカンに溶解した。得られた溶液の4〜5μLを実施例1と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することによりフィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例1と同様の方法にて行った。
Ruell J.A.らの方法(非特許文献9)に従い、1,2−dioleoyl−sn−glycer−3−phosphocholineを2(g/100mL)の濃度になるように、ドデカンに溶解した。得られた溶液の4〜5μLを実施例1と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例1と同様の方法にて行った。
Sugano K.らの方法(非特許文献5)に従い、L−α−phosphatidylcholine,L−α−phosphatidylserine,L−α−phosphatidylethanolamine,L−α−phosphatidylinositol,Cholesterolをそれぞれ、L−α−phosphatidylcholine:L−α−phosphatidylserine:L−α−phosphatidylethanolamine:L−α−phosphatidylinositol:Cholesterol=0.8:0.2:0.8:0.2:1.0の割合で溶解した1,7−octadiene溶液を作成した。得られた溶液の4〜5μLを実施例1と同じフィルタープレートの各ウェルのフィルター部に添加することにより、フィルター部に人工脂質膜を形成した。
形成した人工脂質膜を用いた被験物質の膜透過性の測定は、実施例1と同様の方法にて行った。
1:アテノロール
2:アルプレノロール
3:スルピリド
4:クロザピン
5:プロプラノロール
6:フロセミド
7:塩酸ラニチジン
8:バルサルタン
9:スルファサラジン
10:テルブタリン
11:アシクロビル
12:ピロキシカム
13:ワルファリンナトリウム
14:チモロールマレイン酸
15:メトラゾン
16:ラベタロール塩酸塩
17:メソトレキセート
18:ファモチジン
19:ヒドロクロロチアジド
20:テストステロン
21:クロルプロマジン
22:イミプラミン塩酸塩
23:カルバマゼピン
24:酢酸グアナベンズ
(ヒトにおける消化管吸収率に関する参考文献番号(ref.):参考文献名)
1:Sugano K. et al., Int. J. Pharm., 241, 241−251, 2002
2:国際公開第01/070380号パンフレット
3:Wohnsland et al.,J. Med. Chem., 44, 923−930, 2001
これらのことから、本発明の方法は、0.5時間という短時間で被験物質の膜透過性測定が可能であり、比較例よりも医薬品である被験物質の膜透過性の測定において優れていることが確認できた。
Claims (5)
- 式(I)
[式中、XとYの比率が99:1乃至1:99であり、nは2乃至10の整数、Rは水素原子又はOR1(式中、R1は水素原子、C1−8アルキル基又はC6−14アリール基を表す。)を意味する。]で表される繰り返し単位を有し、分子量が5000乃至500000である高分子化合物を含む人工膜を用いることを特徴とする医薬品の消化管脂質膜透過性測定方法。
- 式(I)のXとYの比率が1:2乃至1:3であり、nが4であり、Rが水素原子であり、かつ高分子化合物の分子量が20000乃至200000の範囲であることを特徴とする請求項1に記載の医薬品の消化管脂質膜透過性測定方法。
- (1)人工膜の一方面に医薬品を含む溶液が接するように配置する工程、(2)当該人工膜の他方面に前記医薬品を含まない溶液が接するように配置する工程、(3)所定時間に当該人工膜及び溶液を一定温度に保つ工程、(4)前記一方面側及び/または前記他方面側の前記医薬品の量を測定する工程、及び(5)測定された量に基づき前記医薬品の膜透過性を評価する工程を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の医薬品の消化管脂質膜透過性測定方法。
- a)請求項3に記載の人工膜、b)請求項3に記載の溶液並びにc)前記人工膜及び前記溶液を収容する容器から構成される消化管脂質膜透過性測定キット。
- 請求項3に記載の消化管脂質膜透過性測定方法により得られた医薬品の膜透過性のデータに基づき、所望の医薬品を選択することを特徴とする医薬品のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008097554A JP5051380B2 (ja) | 2008-04-03 | 2008-04-03 | 人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008097554A JP5051380B2 (ja) | 2008-04-03 | 2008-04-03 | 人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009250727A JP2009250727A (ja) | 2009-10-29 |
JP5051380B2 true JP5051380B2 (ja) | 2012-10-17 |
Family
ID=41311607
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008097554A Expired - Fee Related JP5051380B2 (ja) | 2008-04-03 | 2008-04-03 | 人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5051380B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3954847B2 (ja) * | 2000-03-23 | 2007-08-08 | 中外製薬株式会社 | 脂質膜、膜透過性の測定方法およびスクリーニング方法 |
JP4680361B2 (ja) * | 2000-09-22 | 2011-05-11 | 一彦 石原 | 分離・回収方法 |
JP2005147838A (ja) * | 2003-11-14 | 2005-06-09 | Daiichi Kigyo:Kk | 生体関連物質分離用ゲル膜およびこれを用いた分離方法 |
-
2008
- 2008-04-03 JP JP2008097554A patent/JP5051380B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009250727A (ja) | 2009-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Volpe | Application of method suitability for drug permeability classification | |
DE69821259T2 (de) | Simuliertes biologisches auflösungs- und absorptionssystem | |
Shchelokovskyy et al. | Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers | |
Chen et al. | A novel design of artificial membrane for improving the PAMPA model | |
Holden et al. | Functional bionetworks from nanoliter water droplets | |
Rao et al. | Permeability studies of cellulose acetate free films for transdermal use: Influence of plasticizers | |
US10746644B2 (en) | Vitro method and apparatus for analysing the behaviour of substances in simulated physiological environment | |
US20200354668A1 (en) | Perfusion enabled bioreactors | |
US10228358B2 (en) | Apparatus and method for the assessment of concentration profiling and permeability rates | |
Morton et al. | Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of nano-sized lipid vesicles | |
JP2007118003A (ja) | 透過性測定用の固定化多層人工膜(pampa) | |
CN112041422A (zh) | 具有灌注功能的生物反应器 | |
Corti et al. | Development and evaluation of an in vitro method for prediction of human drug absorption: I. Assessment of artificial membrane composition | |
EP2347242B1 (en) | Two-compartment dissolution apparatus and process | |
DK3221696T3 (en) | SYSTEM FOR THE CURRENT ASSESSMENT OF PHARMACEUTICAL SOLUTION, ABSORPTION AND PERMEATION AND METHODS OF USE THEREOF | |
JP5051380B2 (ja) | 人工膜を用いた膜透過性の評価方法及びスクリーニング方法 | |
Jug et al. | In vitro dissolution/release methods for mucosal delivery systems | |
Ayoub et al. | Formulation and permeation kinetic studies of flurbiprofen gel | |
US6861260B2 (en) | Lipid membrane, method for measuring membrane permeability, and method for screening | |
Huque et al. | Permeability through DOPC/dodecane membranes: measurement and LFER modelling | |
Batchelor et al. | Introduction to biopharmaceutics measures | |
Elezović et al. | In vitro pH dependent passive transport of ketoprofen and metformin | |
Li et al. | The evolving role of the Caco-2 cell model to estimate intestinal absorption potential and elucidate transport mechanisms | |
Mittal et al. | Formulation and evaluation of monolithic matrix polymer films for transdermal delivery of nitrendipine | |
JP4426329B2 (ja) | ムコ多糖積層脂質膜、膜透過性測定用フィルタ、膜透過性測定装置、膜透過性測定用キット、膜透過性評価方法及び被検物質のスクリーニング方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101015 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120201 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120202 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120330 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120523 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120531 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120627 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120710 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150803 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |