JP5050195B2

JP5050195B2 - 神経細胞分化誘導剤

Info

Publication number: JP5050195B2
Application number: JP2006037294A
Authority: JP
Inventors: 榮一合田; 章博田井; 祐佳鎌田
Original assignee: 国立大学法人岡山大学
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2026-02-14
Also published as: JP2007217311A

Description

本発明は炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸を有効成分として含有する神経細胞分化誘導剤に関する。

脳機能の改善薬として実用化されているものには、脳代謝改善薬、脳循環改善薬、脳保護薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬などがあるが、その効果は限定的であり、脳機能を積極的に亢進させるものではない。脳機能亢進物質としては、神経網の形成を促す神経栄養因子である神経成長因子（以下「ＮＧＦ」という。）がよく知られている。しかし、ＮＧＦは分子量がモノマーで13,000、ダイマーで26,000の大きさのタンパク質であり、ＮＧＦを脳室内へ注入すると有効であるが、血液脳関門を通過しないため末梢からの投与や経口投与では効果がない。

神経系が正常に機能するには、ニューロン細胞の成熟と保持が必要である。また、シナプス接合が適正に確立されることによって、異なるニューロン間での連絡が可能となる。また、神経疾患の多くは、ニューロン細胞の特定のクラスの消失、または変性と関連している。神経変性および増殖性疾患の予防および／または治療に有効な方法、並びに使用される化合物として、バルプロ酸誘導体で側鎖を有するカルボン酸を用いる方法が特許文献１に開示されている（特許文献１）。

脳内に移行しやすく経口投与が可能、かつ容易に入手できる低分子量の神経栄養物質が望まれている。このような物質として、６個の二重結合をもつ炭素数２２の直鎖不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が注目されている。マウス結合組織由来の繊維芽細胞樹立株Ｌ−Ｍ細胞に、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡを添加したときにＮＧＦの産生能が増強することが報告されている（特許文献２）。さらに、マウス結合組織由来の繊維芽細胞樹立株Ｌ−Ｍ細胞に、ジアシル型グリセロリン脂質を添加した場合にもＮＧＦを産生することが報告されている（特許文献３）。また、ＤＨＡはＮＧＦなどの作用を増強するものの、単独では効果が弱い（非特許文献１）。

中鎖脂肪酸またはこれを含むトリグリセリドを使用する、アルツハイマー病およびその他の脳疾患の治療方法が報告されている（特許文献４）。特許文献４では、アルツハイマー病でのエネルギー源としてのグルコース利用が低下していることに着目している。中鎖脂肪酸またはこれを含むトリグリセリドの投与により、中鎖脂肪酸が代謝されて生成されるケトン体をエネルギー源として利用しうることによるアルツハイマー病等の改善について言及されているが、中鎖脂肪酸またはこれを含むトリグリセリドが、直接神経細胞に作用することは全く記載されていない。

炭素数１２〜２６の脂肪酸のコリンエステルを脳卒中の治療に用いることが報告されている（特許文献５）。しかしながら、コリンエステルが神経細胞に作用することは開示されていない。さらに、特許文献５において、炭素数４〜３０の天然物由来脂肪酸を薬剤に複合させて、薬物の親油性を増強させることについて言及しているが、上記脂肪酸について、神経細胞に作用することも、脳卒中の治療に使用することも全く開示がない。

その他の脂肪酸としては短鎖脂肪酸に属し、炭素数４の直鎖飽和脂肪酸である酪酸がＮＧＦなどの作用を増強することが報告されているが、これも単独の作用は殆ど認められない（非特許文献２）。

脳機能の低下に起因する症状あるいは疾患の予防又は改善作用を有する組成物として、構成脂肪酸について開示がある（特許文献６）。特許文献６では構成脂肪酸ではアラキドン酸を含むものに限定されている。しかし、アラキドン酸は、ＮＧＦと併用するとＮＧＦの効果を抑制するとの報告があり（非特許文献１）、またアラキドン酸からプロスタグランジンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターが産生されると、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症などのアレルギー症状の悪化につながる危険性がある。
特表平10-505064号公報特開平8-143454号公報特開平6-157338号公報特表2003-531857号公報特表2001-523715号公報特開2003-48831号公報 Ikemoto et al., Neurochem. Res. 22, 671-678, 1997 Suzuki-Mizushima et al., Brain Res. 951, 209-217, 2002

本発明の課題は、脳室内に移行しやすく経口投与が可能であり、かつ容易に入手できる低分子量の神経栄養物質であり、プロスタグランジンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターの産生による影響を殆ど受けることなく、効果的に神経細胞の神経突起を形成し、神経網の形成促進作用を示す物質を有効成分として含有する神経細胞分化誘導剤を提供することである。

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸を培養神経細胞に添加すると、神経細胞の神経突起を形成し、神経網の形成促進作用を有することを見出し、本発明の神経細胞分化誘導剤を完成した。

本発明は、すなわち以下よりなる。
１．炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸を有効成分として含有する神経細胞分化誘導剤。
２．炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸およびデカン酸ならびにこれらの脂肪酸の各メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステル化合物と上記各脂肪酸の薬学上許容しうる塩から選択される前項１に記載の神経細胞分化誘導剤。
３．神経細胞分化誘導剤が、前項２に記載の化合物のうち、１種または複数種を含む神経細胞分化誘導剤。
４．神経成長因子（ＮＧＦ）産生増強剤および／またはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生誘導剤との併用で使用する前項１〜３のいずれか１に記載の神経細胞分化誘導剤。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の神経細胞分化誘導剤を含む医薬組成物。

本発明の神経細胞分化誘導剤に含有される有効成分としての中鎖脂肪酸は、培養神経細胞に直接作用し、神経突起をＮＧＦに匹敵するほど強く伸長させた。中鎖脂肪酸は、血液脳関門を通過しうる大きさであり、経口投与が可能であり、かつ容易に入手できる低分子量の神経栄養物質として機能しうる。中鎖脂肪酸は、母乳、牛乳、乳製品の脂肪分に３〜５％、ヤシ油、パーム核油に５〜１０％含まれており、安全性の高いものであり、プロスタグランジンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターの産生による影響を殆ど受けることなく、効果的に神経細胞の神経突起を形成し、神経網の形成促進作用を示す。
本発明の神経細胞分化誘導剤は、脳賦活剤、神経機能活性化剤としての利用が考えられる。中鎖脂肪酸は、同じく神経突起伸長作用を持つことが知られているＮＧＦやジブチリルサイクリックＡＭＰ（以下、「ジブチリルｃＡＭＰ」という。）と併用すると併用効果を示したことから、多剤との併用効果も期待できる。

本発明において神経細胞分化誘導作用とは、未分化の神経細胞を神経細胞に分化させる作用のほか、神経細胞の神経突起を形成し、伸長させ、神経細胞を直接活性化させ、分化誘導させ、神経網の形成を促す作用をいい、あるいは神経細胞の機能維持にかかる作用などを意味する。このような作用を有する物質として、一般にはＮＧＦがよく知られている。ＮＧＦは、神経組織の成長や機能維持に必要な栄養、成長因子のひとつであり、末梢神経系では、知覚、交感神経または中枢神経系では大細胞性コリン作動性ニューロンの成熟、分化、生命維持に不可欠なものと考えられている。

本発明の神経細胞分化誘導剤は、神経細胞分化誘導作用を有する物質であり、炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸、好ましくは炭素数６〜８の直鎖中鎖脂肪酸を有効成分として含有する。炭素数６〜１０の直鎖中鎖脂肪酸とは、ヘキサン酸（カプロン酸、Ｃ６）、ヘプタン酸（エナント酸、Ｃ７）、オクタン酸（カプリル酸、Ｃ８）、ノナン酸（ペラルゴン酸、Ｃ９）およびデカン酸（カプリン酸、Ｃ１０）が挙げられる。さらに、本発明の有効成分としての中鎖脂肪酸とは、各脂肪酸の他、各脂肪酸のメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル等の化合物および上記各脂肪酸の薬学上許容しうる塩などをも含む概念で用いられる。本発明の神経細胞分化誘導剤は、上記に列挙した化合物のうち、１または複数種を含んでいても良い。

中鎖脂肪酸は、単独でＮＧＦによる神経細胞分化誘導能と同程度の神経細胞分化誘導能が認められる。中鎖脂肪酸のうち、特に、ヘキサン酸（カプロン酸、Ｃ６）、ヘプタン酸（エナント酸、Ｃ７）、オクタン酸（カプリル酸Ｃ８）、ノナン酸（ペラルゴン酸、Ｃ９）およびデカン酸（カプリン酸、Ｃ１０）などの直鎖中鎖脂肪酸について、単独でＰＣ１２細胞の神経突起伸長作用が確認される。

中鎖脂肪酸は、ＮＧＦまたはジブチリルｃＡＭＰとの併用により、より効果的にその機能を発揮しうる。
しかし、ＮＧＦやジブチリルｃＡＭＰは、そのままでは血液脳関門を通過しないため、末梢からの投与や経口投与では効果が得られない。したがって、中鎖脂肪酸と併用可能な薬剤は、末梢からの投与や経口投与が可能であり、ＮＧＦの産生を増強しうる物質、サイクリックＡＭＰ（以下、「ｃＡＭＰ」という。）産生を誘導しうる物質であることが必要である。そこで、強力な分化誘導能を発揮させるために、本発明の神経分化誘導剤は、上記有効成分である中鎖脂肪酸の他、ＮＧＦ産生増強剤および／またはｃＡＭＰ産生誘導剤を含んでいても良いし、含まない場合であっても、併用して使用してもよい。

本発明においてＮＧＦ産生増強剤とは、ＮＧＦの産生を増強しうる物質であれば良く、特に限定されない。例えば、背景技術の欄で説明した特許文献２および３に例示される物質、具体的にはＥＰＡ、ＤＨＡ、ジアシル型グリセロリン脂質などが例示される。ＮＧＦの産生を増強しうる物質であれば、自体公知の物質であってもよく、また今後開発される物質でもよく、市販されている物質に限定されることはない。

ｃＡＭＰ産生誘導剤としては、ｃＡＭＰの産生を増強しうる物質であれば良く、特に限定されない。例えば、脳循環改善薬として用いられるアデノシン三リン酸二ナトリウムが例示され、このものから生成するアデノシンを介してｃＡＭＰ産生を誘導するものが挙げられる。ｃＡＭＰの産生を増強しうる物質であれば、自体公知の物質であってもよく、また今後開発される物質でもよく、市販されている物質に限定されることはない。

本発明の神経細胞分化誘導剤は、経口または非経口のいずれの投与形態でも可能である。経口投与の場合は、カプセル剤、錠剤、粉剤、液剤などの方法で使用することができ、また吸引剤、スプレー剤のような形態でも使用することができる。また非経口投与の場合は、注射剤、輸液剤などの剤型で使用することも可能である。本発明の神経細胞分化誘導剤は、製剤化のために、薬学上許容しうる賦形剤、着色剤、保存剤を添加することもできる。

以下に本発明の理解をより深めるために、実施例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。

（実施例１）各種脂肪酸の神経突起形成作用について（１）
中鎖脂肪酸であるヘキサン酸（カプロン酸、Ｃ６）と、短鎖脂肪酸である酪酸、プロピオン酸、ペンタン酸（吉草酸、Ｃ５）を、神経細胞分化のモデルとして繁用されるラット副腎髄質由来株化細胞ＰＣ１２細胞に添加した時の、神経突起形成能を調べた。

１）培養容器
ＰＣ１２細胞（理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室）の継代培養にはフラスコ（２５ｃｍ^２、Ｎｕｎｃ社）を、神経突起形成実験には９６穴平底カルチャープレート（Ｎｕｎｃ社）を用いた。９６穴平底カルチャープレートはあらかじめ以下の方法でコラーゲンによる表面のコーティングを行い使用した。細胞培養用コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ^（Ｒ），ｔｙｐｅ−１コラーゲン、新田ゼラチン）を１ｍＭＨＣｌで希釈し０．４ｍｇ／ｍｌとし、これを９６穴平底カルチャープレートの各穴に０．０７５ｍｌずつ分注した。室温で１５分間静置し、余剰のコラーゲンを回収後、無菌的に風乾してコラーゲンをプレートにコートした。細胞を蒔く前にこれをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して用いた。

２）培養開始時期の細胞濃度
継代細胞を０．０５％トリプシン溶液（ナカライテスク）でフラスコから剥離し、洗浄した後、４０００細胞／０．１ｍｌ／穴で播種し、培養を開始した。

３）培養液（培地、添加物等）
１０％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ社）、５％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ（万有製薬）及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（明治製菓）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いた。

４）各種脂肪酸の添加濃度
ＰＣ１２細胞の培養開始２２時間後に培養液の交換を行い、その２時間後に以下の各種脂肪酸のナトリウム塩（和光純薬、東京化成または関東化学）の最終濃度が以下となるように培養液に添加した。
酪酸：０、０．５、１、２、３、５ｍＭ、
プロピオン酸：０、３、５、７．５、１０、１５、２０ｍＭ、
ペンタン酸：０、３、５、７．５、１０、１５、２０ｍＭ、
ヘキサン酸：０、３、５、７．５、１０、１５、２０ｍＭ、

５）培養条件
培養は、各脂肪酸添加後、３７±１℃で４８時間、９５％空気と５％ＣＯ_２の気相のインキュベーター内で培養した。

６）ＰＣ１２細胞の神経突起形成率の判定方法
細胞を５％グルタルアルデヒド（和光純薬）で固定し、ギムザ（Ｍｅｒｃｋ社）染色後に顕微鏡下にて観察を行った。細胞体の長径よりも長く伸びた神経様突起をもつ細胞を陽性細胞と判定し、１穴あたり３００〜４００個の細胞について評価した。陽性細胞数の全細胞数に対する百分率を神経突起形成率とした。結果は３穴の平均値±標準偏差で表わした。

その結果、図１に示すように、中鎖脂肪酸であるヘキサン酸（カプロン酸、Ｃ６）は、添加濃度７．５〜２０ｍＭでＰＣ１２細胞に対する強い神経突起形成作用を認め、その効果が短鎖脂肪酸を添加した場合に比べて明らかに優れていた。かかるヘキサン酸の神経突起形成作用は、ＮＧＦに匹敵するほど強いものであった。ＮＧＦ単独での効果は、後述の実施例３においてオクタン酸およびＮＧＦの併用効果を調べたときのＮＧＦ添加量が１０ｎｇ／ｍｌであり、オクタン酸濃度が０の時の結果（図３）を参照することができる。

（実施例２）各種脂肪酸の神経突起形成作用について（２）
中鎖脂肪酸であるヘプタン酸（エナント酸、Ｃ７）、オクタン酸（カプリル酸Ｃ８）、ノナン酸（ペラルゴン酸、Ｃ９）、デカン酸（カプリン酸、Ｃ１０）およびドデカン酸（ラウリン酸、Ｃ１２）について、実施例１に記載の方法と同手法により、ＰＣ１２細胞を培養し、同様に神経突起形成率を調べた。

各脂肪酸のナトリウム塩（和光純薬または東京化成）は、最終濃度が以下になるように培養液に添加した。
ヘプタン酸：０、０．５、１、２、３、４、５、７．５、１０、１２．５ｍＭ、
オクタン酸：０、０．５、１、２、３、４ｍＭ、
ノナン酸：０、０．５、１ｍＭ、
デカン酸：０、０．５ｍＭ、
ドデカン酸：０、０．５ｍＭ

その結果、図２に示すように、炭素数７〜１０の中鎖脂肪酸である上記各種脂肪酸については、ＰＣ１２細胞に対して強い神経突起形成作用を認めた。具体的には、ヘプタン酸では４〜１２．５ｍＭ、オクタン酸では２〜４ｍＭで使用したときに神経突起形成作用を認め、それらの効果は、ＮＧＦに匹敵するほど強いものであった。一方、炭素数１２のドデカン酸の神経突起形成作用は弱かった。

（実施例３）オクタン酸およびＮＧＦの併用効果について
オクタン酸およびＮＧＦを併用した場合と、オクタン酸単独で使用した場合の神経突起形成作用を比較した。
オクタン酸の最終濃度が、０、０．５、１、２、３、４、５ｍＭであり、およびＮＧＦ（和光純薬）の最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように培養液に添加し、実施例１に記載の方法と同手法にてＰＣ１２細胞を４８時間培養した。一方、オクタン酸単独で使用した場合についても同様にＰＣ１２細胞を培養した。上記培養した系について、実施例１に記載の方法と同手法により神経突起形成率を調べ、図３に示した。さらに、培養後のＰＣ１２細胞を固定し、ギムザ染色したものについて顕微鏡観察し、図４に示した。

その結果、オクタン酸とＮＧＦを併用した系では、オクタン酸を単独で使用した場合に比べ、高い神経突起形成率を認め、さらに、顕微鏡観察においてもオクタン酸とＮＧＦを併用した場合に、強い神経突起伸長作用を認めた。

（実施例４）オクタン酸およびジブチリルｃＡＭＰの併用効果について
オクタン酸およびジブチリルｃＡＭＰを併用した場合と、オクタン酸単独で使用した場合の神経突起形成作用を比較した。
オクタン酸の最終濃度が、０、０．５、１、２、３、４、５ｍＭであり、ジブチリルｃＡＭＰのナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ社）の最終濃度が、０．０６２５ｍＭとなるように培養液に添加し、実施例１に記載の方法と同手法にてＰＣ１２細胞を２４時間培養した。一方、オクタン酸単独で使用した場合についても同様にＰＣ１２細胞を培養した。上記培養した系について、実施例１に記載の方法と同手法により神経突起形成率を調べ、図５に示した。

その結果、オクタン酸とジブチリルｃＡＭＰを併用した系では、オクタン酸を単独で使用した場合に比べ、高い神経突起形成率を認めた。

（比較例１）バルプロ酸の神経突起形成作用について
特許文献１に記載のバルプロ酸のナトリウム塩（(CH₃CH₂CH₂)₂CHCOONa、Ｓｉｇｍａ社）について、実施例１に記載の方法と同手法により、ＰＣ１２細胞を培養し、同様に神経突起形成率を調べた。
バルプロ酸の最終濃度が、０、０．５、１、２、３、４、５、１０ｍＭとなるように培養液に添加し、実施例１に記載の方法と同手法にてＰＣ１２細胞を４８時間培養した。
その結果、図６に示すように、バルプロ酸については、ＰＣ１２細胞に対する神経突起形成率は１０％より低く、神経突起形成誘導作用を殆ど示さず、１０ｍＭではむしろ低下傾向を示した。

以上詳述したように、本発明の神経細胞分化誘導剤の有効成分である中鎖脂肪酸は、ＰＣ１２細胞に直接作用し、神経突起をＮＧＦに匹敵するほど強く伸長させた。本発明の神経細胞分化誘導剤に含有される有効成分としての中鎖脂肪酸は、血液脳関門を通過しうる大きさであり、経口投与が可能であり、かつ容易に入手できる低分子量の神経栄養物質として機能しうる。かかる神経細胞分化誘導剤は、脳賦活剤、神経機能活性化剤としての利用が考えられる。中鎖脂肪酸は、神経突起伸長作用を持つことが知られている他の物質、具体的にはＮＧＦやジブチリルｃＡＭＰと併用すると強い作用を示したことから、多剤との併用効果も期待できる。

本発明の神経細胞分化誘導剤の有効成分である中鎖脂肪酸は、母乳、牛乳、乳製品の脂肪分に３〜５％、ヤシ油、パーム核油に５〜１０％含まれており、安全性の高いものである。一方、ＮＧＦと同様な作用を有するものとしては塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が知られている。ｂＦＧＦは床ずれなどの治療薬としてスプレー剤で使用されている。中鎖脂肪酸は安定な液体または固体であり、容易にスプレー中にｂＦＧＦと共に混合でき、ねたきり老人等に多い痴呆症状の進行抑制に利用することが期待できる。

本発明の神経細胞分化誘導剤は、脳神経細胞に対する分化誘導作用、神経網の形成促進作用に基づき、脳神経細胞機能の低下に起因する疾患および症状の予防および改善への利用が期待される。

中鎖脂肪酸および短鎖脂肪酸の、ＰＣ１２細胞の神経突起形成に対する作用を神経突起形成率にて示す図である。（実施例１）中鎖脂肪酸の、ＰＣ１２細胞の神経突起形成に対する作用を神経突起形成率にて示す図である。（実施例２）オクタン酸およびＮＧＦの、ＰＣ１２細胞の神経突起形成に対する併用効果を神経突起形成率にて示す図である。（実施例３）オクタン酸およびＮＧＦの、ＰＣ１２細胞の神経突起形成に対する併用効果を顕微鏡写真にて示す図である。（実施例３）オクタン酸およびジブチリルｃＡＭＰの、ＰＣ１２細胞の神経突起形成に対する併用効果を神経突起形成率にて示す図である。（実施例４）バルプロ酸の、ＰＣ１２細胞の神経突起形成に対する作用を神経突起形成率にて示す図である。（比較例１）

Claims

炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸を有効成分として含有する、アルツハイマー病予防治療剤を除く神経細胞分化誘導剤。
炭素数６〜１０の中鎖脂肪酸が、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸およびデカン酸ならびにこれらの脂肪酸の各メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステルおよびｎ−ブチルエステル化合物と上記各脂肪酸の薬学上許容しうる塩から選択される請求項１に記載の神経細胞分化誘導剤。
神経細胞分化誘導剤が、請求項２に記載の化合物のうち、１種または複数種を含む神経細胞分化誘導剤。
神経成長因子（ＮＧＦ）産生増強剤および／またはサイクリックＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｃＡＭＰ）産生誘導剤との併用で使用する請求項１〜３のいずれか１に記載の神経細胞分化誘導剤。
請求項１〜４のいずれか１に記載の神経細胞分化誘導剤を含む、脳神経細胞機能の低下に起因する疾患および症状の予防および改善の利用のための医薬組成物であって、アルツハイマー病予防治療剤を除く医薬組成物。