JP5035820B2 - 酵母培養培地補添物 - Google Patents
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Description
(項目1) 高糖生地発酵力を増強するための酵母培養培地補添物であって、
a)以下の構造式:
b)上記(a)の化合物をアグリコンとして含む配糖体;および
c)上記(a)の化合物の縮合物、
からなる群から選択される化合物を含有する、補添物。
(項目2) 請求項1に記載の補添物であって、以下の構造式:
(項目3) 酵母培養培地であって、
a)以下の構造式:
b)上記(a)の化合物をアグリコンとして含む配糖体;および
c)上記(a)の化合物の縮合物、
からなる群から選択される化合物を含有する、培養培地。
(項目4) 請求項3に記載の培養培地であって、以下の構造式:
(項目5) 合成培地である、請求項3に記載の培地。
(項目6) 半合成培地である、請求項3に記載の培地。
(項目7) 酵母の増殖方法であって、該方法は、以下:
a)請求項3に記載の酵母培養培地を提供する工程;および
b)該酵母培養培地中で酵母を培養する工程、
を包含する、方法。
(項目8) パン酵母の製造方法であって、該方法は、以下:
a)請求項3に記載の酵母培養培地を提供する工程;
b)該酵母培養培地中でパン酵母を培養する工程;および
c)該培養工程後にパン酵母を回収する工程、
を包含する、方法。
(項目9) 請求項8に記載の方法によって製造された、パン酵母。
(項目10) パンの製造方法であって、以下:
a)請求項9に記載のパン酵母を用いて生地を作製する工程;および
b)該生地を焼成する工程、
を包含する、方法。
(項目11) 請求項10に記載の方法によって製造された、パン。
(項目12) フラボノイド類を含有する、酵母培養培地補添物。
(項目13) 請求項12に記載の酵母培養培地補添物であって、ここで、前記フラボノイド類が、アルブチン、(−)−没食子酸エピガロカテキン、ルテオリン、アピゲニン、ガラクチノール、ペラルゴニジンからなる群から選択される、補添物。
(項目14) フラボノイド類を含有する、酵母培養培地。
(項目15) 請求項14に記載の酵母培養培地であって、ここで、前記フラボノイド類が、アルブチン、(−)−没食子酸エピガロカテキン、ルテオリン、アピゲニン、ガラクチノール、ペラルゴニジンからなる群から選択される、培地。
本明細書において使用する場合、用語「パン」とは、穀粒粉を練って生地を作製し、その生地を焼成することによって産生される食品をいう。
・Yeast Nitrogen Base without amino acids without ammonium sulphate(Difco社、Detroit,MIまたは同等品) 1.7g/L
・硫酸アンモニウム 5g/L、および
・デキストロース 20g/L。
・ビオチン 60μg/L、
・パントテン酸カルシウム 2400μg/L、
・葉酸 12μg/L、
・イノシトール 12000μg/L、
・ナイアシン 2400μg/L、
・p−アミノ安息香酸 1200μg/L、
・塩酸ピリドキシン 2400μg/L、
・リボフラビン 1200μg/L、
・塩酸チアミン 2400μg/L、
・H3BO3 3000μg/L、
・CuSO4 240μg/L、
・KI 600μg/L、
・FeCl2 1200μg/L、
・MnSO4 2400μg/L、
・Na2MoO4 1200μg/L、
・ZnSO4 2400μg/L、
・MgSO4 3g/L、
・CaCl2 600mg/L、
・NaCl 600mg/L、
・KH2PO4 6g/L、
・硫安 5g/L(または尿素2.25g/L)、および
・グルコース 30g/L。
n×y÷x×s
によって計算される量[g]をいう。例えば、元々の精製源である廃糖蜜に糖が35%含まれていると仮定し、100gの廃糖蜜から所定の化合物について3.5gの画分が単離された場合、糖1gあたりの画分の収量は0.1gとなる。従って、合成培地にその画分を「1倍量」添加する場合、添加する糖1グラムあたり0.1gを添加することになる。
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、微生物学、発酵工学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
流加培養の条件は、当該分野において周知である。代表的な流加培養を以下に例示するが、流加培養の条件は、これに限定されない。流加培養条件を適宜変化させることは、当業者が容易になし得ることである。
本発明の培養培地を用いて増殖した酵母は、当該分野において周知の種々の方法によって回収することができる。このような回収方法としては、例えば、遠心分離、自然沈降、濾過(濾紙または合成フィルターなどを用いる)などが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において、発酵能を測定する場合には、例示的に、低糖条件における発酵能(F10)、高糖状態における発酵能(F40)、およびマルトース発酵力(Fm)を指標として用いたが、これら以外の指標も、当業者には周知である。また、パン生地から生じる炭酸ガスを測定して、パン生地の発酵力を測定するファーモグラフという装置を用いる方法もまた、発酵能を測定するために、使用可能である。
低糖条件における発酵能(F10)とは、10%(重量/容量)のスクロース溶液中で、30℃、120分間発酵させた際の炭酸ガス発生量である。
高糖状態における発酵能(F40)とは、40%スクロース溶液中で、30℃、120分間発酵させた際の炭酸ガス発生量である。
マルトース発酵力(Fm)とは、5%マルトース溶液中で、30℃、120分間発酵させた際の炭酸ガス発生量である。この場合、Fmを、Fm(5)とも記載する。
生地糖配合対小麦20〜40%の生地におけるガス発生量をファーモグラフ(ATTO社、東京)により測定する。
パン生地の製造方法としては、例えば、直捏生地法、中種生地法、および、液種生地法が挙げられるが、これに限定されない。
(第1段階:Fr.15の取得方法)
以下の手順で、糖蜜からの有効成分を含む画分を得た:
・オリエンタル酵母社東京工場の調整糖蜜を水で3倍に希釈した
・糖蜜希釈液1LをアンバーライトXAD−2(オルガノ社、東京都江東区新砂一丁目2番8号)に吸着させ、10倍量の水で洗浄後、5倍量の40%メタノールで溶出した
・ロータリーエバポレーターでメタノールを除去した
・メタノール除去後の溶液を限外ろ過(分画分子量5000)に供し、通過した画分をエバポレーターに供して、水分の一部を除去した
・上記溶出画分を、ゲルろ過用のShodex GF−310 HQ(昭光通商(株) 東京都港区芝公園1−7−13)、にて分取した(1ml/分、溶出時間20〜21分)。
・分取した画分中、高糖生地発酵力を示した画分を、Fr.15と称した。
以下の手順で、上記Fr.15画分をさらにODSカラムにて精製した。具体的な精製条件は、以下のとおりである:
・カラム YMC ODS−A 内径4.6×長さ250mm(株式会社ワイエムシィ、京都市下京区五条通烏丸西入醍醐町284番地YMC烏丸五条ビル)。
・移動相 A=0.05%ギ酸、B=アセトニトリル:B 10%(30分)、10%〜80%(70分、直線勾配)
・流速 1.0/分
・検出 PDA(フォトダイオードアレイ検出器、UV210nm)を用いた。
この精製工程の結果を図1に示す。図1に示すように、Q−1からQ−7の7つのピークが検出された。そこで、これらピーク画分の各々を、微量流加培養試験系を用いて評価した。具体的には、以下の手順を用いた:
・Q−1からQ−7のピーク画分について、糖当たりで元の糖蜜に含まれる9.8倍量を合成培地改変YNB(ビオチン 60μg、パントテン酸カルシウム 2.5mg、葉酸 13μg、イノシトール 13mg、ナイアシン 2.5mg、p−アミノ安息香酸 1.3mg、塩酸ピリドキシン 2.5mg、リボフラビン 1.3mg、塩酸チアミン 2.5mg、H3BO3 4mg、CuSO4 240μg、KI 600μg、FeCl2 1.3mg、MnSO4 2.5mg、Na2MoO4 1.3mg、ZnSO4 2.5mg、MgSO4 4g、CaCl2 600mg、NaCl 600mg、KH2PO4 460mg、硫安 5g、グルコース 30g)に初期添加して培養した。培養後得られた菌体の高糖生地発酵力(ml/120分)を測定したところ、Q−5ピーク画分では、合成培地改変YNBの試験区と比較して高糖生地発酵力の上昇効果が観察された。そこで次に、合成培地改変YNBにQ−5ピーク画分(糖当たりで元の糖蜜に含まれる9.8倍量、5.3mg)を添加した場合(表1でのM.YNB+Q−5)と、合成培地改変YNB(表1でのM.YNB)とについて、菌体炭水化物含量;CH(%)、細胞内トレハロース含量;Treh(%)、菌体窒素含量;N(%)を分析した。その結果を、表1に示す。
Q−5のピーク画分を拡大すると、大きなピークの前後に小さいピークが含まれており、従って、Q−5は、完全には精製されていないことが確認された。そこで、Q−5ピーク画分をさらに精製するために、Q−5フラクションをODSカラム(YMC ODS−A 内径4.6mm×長さ250mm)(株式会社ワイエムシィ、京都市下京区五条通烏丸西入醍醐町284番地YMC烏丸五条ビル)を用いて、0.1%ギ酸を含む8%アセトニトル溶液で分離した。Q−5のフラクションで最も大きいピークを、画分Q−5−1として単離した。画分Q−5−1が1.7mg得られた。得られた物質をCD3ODに溶解させてNMR(JOEL ECA600)、ESI−MS(Applied Biosystems API200)、TOF−MS(Applied Biosystems Voyger−DE STR)、FT−IR(JASCO FT/IR−680plus)を用いて測定した。この物質の1H−NMR(CD3OD)測定の結果、図2に示したようにδ3.83とδ3.74に−OMeに由来するケミカルシフトが得られた。また、δ6.71に芳香環に属するプロトンのケミカルシフトが得られた。13C−NMR(CD3OD)測定の結果、図3に示したように芳香環があり、置換基が対象に配置していることが判明した。また、ESI−MS(ポジティブ)を測定したところ図4に示したように、親イオンのマススペクトルは確認できなかったが、m/z 281.1[M+Na]+のマススペクトルや各フラグメントのマススペクトルが得られた。
性状:白色無定型物質
質量分析:ESI−MS(ポジティブ)m/z 281[M+Na] +
赤外吸収スペクトル(cm−1):3411、1593、1125。
核磁気共鳴スペクトル(1H−NMR、600MHz、CD3OD) δ:6.71(2H,s,H−2,6),4.58(1H,d,H−7),3.83(6H,s,H−10,12),3.74(3H,s,H−11),3.66(1H,m,H−8),3.46(2H,dd,H−9)
核磁気共鳴スペクトル(13C−NMR、600MHz、CD3OD) δ:155.1 (C−3,5),140.5(C−1),139.0(C−4),105.9(C−2,6), 78.1(C−8),76.0(C−7),65.0(C−9)。
実施例1において構造決定された化合物が、実際に高糖生地発酵力上昇の原因であることを確認するために、以下の手順で1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールを化学合成し、そしてその活性を確認した。
窒素雰囲気下、200mlフラスコ中の3,4,5−トリメトキシケイ皮酸 5.49gを含むTHF溶液40mlにトリエチルアミン2.38g(23.50mmol)を加え氷浴で−10℃まで冷却した。その溶液にエチルクロロアセテート2.55g(23.50mmol)を滴下し同温度で1時間攪拌した。窒素雰囲気下でろ過し、ろ液を濃縮して次反応に使用した。
第一工程で得られた粗生成物を13.5mlのメタノールに溶解し氷浴で冷却しながら、水素化ホウ素ナトリウム3.33g(88.03mmol)を徐々に加えた。その後、6M−HClを加えて反応を停止させ、クロロホルムで抽出を行った。得られた粗生成物は、ヘキサン:酢酸エチル=10:1のカラムクロマトグラフィーで精製した。その結果、二工程の合計収率は67%であり、3.45gを得た。
50mlのフラスコにOsO4(オスミウム(VIII)オキシド、微小カプセル化;和光純薬製MC)1g、および、第二工程で得られた化合物2.94g(13.11mmol)、および、1−メチルピロリジノンン3.23g(27.53mmol)を仕込みアセトン−H2O−MeCNの1:1:1溶液20mlに懸濁した。室温で1日攪拌した後、ろ過、濃縮し粗生成物を得た。精製はCHCl3:MeOH=10:1のカラムクロマトグラフィーで行い、収率30%で1.02gの目的物を得た。さらに再精製を調製用TLCで行い500mgの目的物を得た。上記合成スキ−ムを、図5に概説する。
(実施例3:1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールの高糖生地発酵力の測定)
Q−5−1画分に含まれる化合物である1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールについて、その高糖生地発酵力を確認した。
1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールの単離をより簡便にするために、以下のように、糖蜜より1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールを高純度かつ豊富に含む画分を同定した。
実施例4で調製した1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオール画分を用いて、1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールを添加した培地を用いて製造されたパン酵母を用いて製造されたパンの特性を確認した。
・p−アミノ安息香酸 56mg、
・ビオチン 2.8mg、
・パントテン酸カルシウム 112mg、
・葉酸 0.6μg、
・イノシトール 560mg、
・ナイアシン 112mg、
・塩酸ピリドキシン 112mg、
・リボフラビン 56mg、
・塩酸チアミン 112mg、
・H3BO3 140mg、
・CuSO4・5H2O 17.5μg、
・KI 28mg、
・FeCl2 56mg、
・MnSO4・5H2O 179mg、
・Na2MoO4・2H2O 66mg、
・ZnSO4・7H2O 199mg、
・MgSO4・7H2O 287g、
・CaCl2 28g、
・NaCl 28g、
・KH2PO4 39.3g、
・尿素 88.7g、および
・グルコース 1400g。
ビタミン・ミネラルの添加量は微量流加培養試験系と糖当たりの量が同一となるようにした。グルコースのみ流加添加し、その他成分は初期添加した。半合成培地では、F2−3を糖当たりで元の廃糖蜜に含まれる量(26.0g)を、M.YNBに初期添加した。また、添加量を元の廃糖蜜の1/5倍量(5.2 g)とした試験についても行った。F2−3は不溶性成分を含むので、水に懸濁後遠心分離し、上清のみを添加した。外国糖蜜(フィリピン、インドネシア、およびタイなどの東南アジア製)の試験区では、糖蜜をM. YNBと糖量が同一となるように流加添加して培養を行った。
・小麦粉 100
・イースト 3(オリエンタル酵母工業、東京都板橋区小豆沢3-6-10)
・食塩 1
・砂糖 25
・脱脂粉乳 3(全国酪農協会、東京都渋谷区代々木1丁目 37−20 )
・ショートニング 10(製品名クスコロワイヤル、ミヨシ油脂株式会社、東京都葛飾区堀切4-66-1)
・水 61
・製パン改良剤 0.1(製品名C-アンティ オリエンタル酵母工業、東京都板橋区小豆沢3-6-10)
製パンの製造工程は、以下のとおりである:
・ミキシング 17分間
・捏上温度 25℃
・フロアタイム 60分間(28℃)
・分割重量 220g(ワンローフ)、50g(コッペパン)
・ベンチタイム 20分間(室温)
・ホイロ発酵 35℃
ワンローフ型上1cmまで
コッペパン75分間
・焼成条件 ワンローフ 上火 175℃ 20分間
下火 190℃
コッペパン 上火 200℃ 9分間
下火 190℃。
表3に培養後得られた菌体を分析した結果を示した。
1−(3,4,5−トリメトキシフェニル)プロパン−1,2,3−トリオールを添加した培地を用いて、微量流加培養系を用いて、実際の工場培養に近い30Lジャー培養系で評価し、半合成培地培養系によるパン酵母を製造し、その製造廃液の環境負荷を評価した。
培養廃液のBODを分析したところ、M.YNBの試験区は外国糖蜜の試験区と比較して約1/5と明らかに低い値を示した(図6)。CODも同様にM.YNBの試験区は外国糖蜜の試験区と比較して約1/12と明らかに低い値を示した。F2−3を添加した試験区はM.YNBの試験区と比較して同等の値を示した。糖蜜に含まれる色素に特有なO.D.470nmの色度を測定したところ、外国糖蜜の試験区と比較してM.YNBの試験区は明らかに低い値を示した。F2−3を添加してもM.YNBの試験区と比較して同等の色度を示した(図7)。以上の結果からF2−3を添加した半合成培地培養系は廃糖蜜培養系と比較して、BOD・COD・色度が明らかに低い値を示し、廃糖蜜培養系と比較して培養廃液の処理コストが大幅に低減できると考えられた。
(実施例7:フラボノイド類)
サトウキビ及び廃糖蜜に豊富に含まれるフラボノイド類がパン酵母培地の補添物として有用化否かについて、実験を行った。実験試料として市販されているフラボノイドを6種購入し、ミニ流加培養法による機能評価を実施した。
フラボノイド類として、アルブチン(フラボノイドではないが配糖体のアグリコン)、(−)−没食子酸エピガロカテキン(フラボノイド、カテキン類)、ルテオリン(フラボノイド、フラボン類)、アピゲニン(フラボノイド、フラボン類)、ガラクチノール(フラボノイドでないが、配糖体)、ペラルゴニジン(フラボノイド、アントシアニン類)を用いて、過去の報告から、廃糖蜜に含まれていると予想される量、および、その10倍量をM.YNBに初期添加して微量流加培養試験を行った。
各フラボノイド類を添加して微量流加培養を行い、得られた菌体を用いて、菌体炭水化物含量;CH(%)、細胞内トレハロース含量;Treh(%)、菌体窒素含量;N(%)、対糖収率(%)、高糖生地発酵力について分析を行った結果を、以下の表4に示した。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
Claims (6)
- 高糖生地発酵力を増強するための酵母培養培地補添剤であって、以下の構造式:
- 高糖生地発酵力を増強するための酵母培養培地補添剤であって、以下の構造式:
- SD培地または改変SD培地に請求項1または2に記載の酵母培養培地補添剤を添加した、酵母培養培地。
- 酵母培養培地であって、以下の構造式:
- 酵母の増殖方法であって、該方法は、以下:
a)請求項3〜4のいずれか一項に記載の酵母培養培地を提供する工程;および
b)該酵母培養培地中で酵母を培養する工程、
を包含する、方法。 - パン酵母の製造方法であって、該方法は、以下:
a)請求項3〜4のいずれか一項に記載の酵母培養培地を提供する工程;
b)該酵母培養培地中でパン酵母を培養する工程;および
c)該培養工程後にパン酵母を回収する工程、
を包含する、方法。
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